Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung tt

Các nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật đã chỉ ra rằng động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm huyết thanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62.42.02.01

Hà Nội, 2019

Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đức Mạnh

TS Nguyễn Thị Minh Khanh

Viện Công nghiệp thực phẩm

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Phản biện 2: PGS.TS Phan Thanh Tâm Phản biện 3: TS Phạm Hương Sơn

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghiệp thực phẩm, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm

- Trang web của Bộ GD&ĐT

1

MỞ ĐẦU

Kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN [81] Do

đó, các hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm Ngày nay, tình trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổ biến trong cộng đồng Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộng đồng là hết sức cần thiết

Có rất nhiều phương pháp để tạo ra các hợp chất của kẽm như: tổng hợp hóa học, chiết xuất từ tự nhiên, nhờ vi sinh vật… Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học có hạn chế như: dễ sinh ra các sản phẩm phụ, khó kiểm soát, gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người Phương pháp chiết xuất hợp chất kẽm từ tự nhiên an toàn hơn nhưng chi phí sản xuất cao Vì vậy, hiện nay trên thế giới đang tập trung nghiên cứu sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại từ môi trường thành dạng hợp chất hữu cơ và tích lũy trong nấm men Các nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật đã chỉ ra rằng động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm huyết thanh

và hàm lượng kẽm dự trữ trong xương, thịt, các cơ quan nội tạng cao hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ [56] Việc nghiên cứu khoa học để tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu kẽm là cần thiết Những căn cứ và nhu cầu thực tiễn nêu trên là cơ sở

để đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sảnxuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

Nội dung nghiên cứu

 Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập giống VSVCN – Viện Công nghiệp thực phẩm

 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

 Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường

 Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm

 Xây dựng quy trình công nghệ và triển khai sản xuất thử nghiệm bột nấm men giàu kẽm tại Viện CNTP

Những đóng góp mới của luận án

 Phân lập mới được chủng nấm men S cerevisiae A112 có khả

năng tích lũy kẽm hữu cơ cao

 Phân tích được tỉ lệ kẽm hữu cơ và một số dạng kẽm tồn tại trong sinh khối nấm men

 Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm và triển khai sản xuất thử nghiệm tại Viện Công nghiệp thực phẩm Đây là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về sản xuất bột nấm men giàu kẽm, từ việc nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, đến việc thu hồi dịch chiết, tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm

- Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm Nhu cầu kẽm của cơ thể

- Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam

- Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể

2 Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp

3 Khả năng hấp thụ kim loại và cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men

- Khả năng hấp thụ kim loại của nấm men

- Cơ chế, vị trí tích lũy kẽm trong tế bào nấm men

- Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm của nấm men

4 Các phương pháp lên men sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm

- Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation)

- Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation)

5 Các nghiên cứu về nấm men giàu kẽm

6 Các phương pháp phá tế bào nấm men

- Phương pháp cơ học

- Phương pháp phi cơ học

- Sử dụng kết hợp các phương pháp

7 Các sản phẩm chức năng giàu kẽm trên thế giới

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu

- Nguồn phân lập nấm men: 56 mẫu gồm đất nhiễm kim loại nặng, hoa quả chín, dịch lên men rượu gạo, nước thải… được thu thập

từ các địa phương ở Hà Nội, Thái Nguyên

- 96 chủng S.cerevisiae được cung cấp từ Bộ Sưu tập giống VSV –

Viện Công nghiệp Thực phẩm

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng dòng Bal b/c, được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Môi trường phân lập Sabouraud, môi trường giữ giống glucose agar 4°Bx, môi trường hoạt hóa nấm men, môi trường lên men

malt-2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phân tích hàm lượng kẽm tổng bằng AAS [139]

- Phương pháp phân tích các phân đoạn kẽm được thực hiện theo Liu và cộng sự (2015) [89, 104]

- Phương pháp xác định nồng độ protein hoà tan theo phương pháp Lowry [107]

- Phương pháp xác định hoạt độ enzyme [69]

- Phương pháp phân tích các tiêu chuẩn cơ sở về hàm lượng kim loại nặng, chỉ tiêu vi sinh trong bột nấm men giàu kẽm theo AOAC 999.11, AOAC 971.21, TCVN 5667:1992

- Phương pháp sàng lọc các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm [10]

- Phương pháp xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá

trình nhân giống S.cerevisiae A112

- Nghiên cứu các điều kiện phù hợp cho quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

- Phương pháp lên men bổ sung môi trường (fed-batch fermentation) Phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men giàu kẽm

và tạo sản phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột

- Nghiên cứu so sánh sự hấp thu, hoạt tính sinh học kẽm sulphat và chiết xuất nấm men giàu kẽm trên chuột thí nghiệm [172]

- Phương pháp xử lí số liệu

5

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập VSVCN – Viện CNTP

Sàng lọc khả năng tích kẽm từ 96 chủng nấm men từ Sưu tập VSVCN và 25 chủng nấm men từ nguồn phân lập mới Kết quả có 44 chủng thể hiện khả năng tích kẽm thấp dưới 1 mg/g sinh khối khô chiếm tỷ lệ 36,37 %; 54 chủng tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ 44,63% và 23 chủng có khả năng tích lũy kẽm với hàm lượng trên 3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ 19,01 % Trong đó, chủng thể hiện khả năng tích luỹ kẽm cao nhất là chủng nấm men phân lập A112 với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối lên tới 10,95 mg/g, lượng sinh khối đạt 1,02 g/100ml

3.1.1 Nghiên cứu xác định dạng kẽm tồn tại trong sinh khối nấm men giàu kẽm

12 chủng nấm men có khả năng tích kẽm với hàm lượng trên 5mg/g sinh khối được lựa chọn để phân tích định lượng kẽm hữu cơ

và dạng liên kết của kẽm trong sinh khối nấm men

Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm chủng nấm men A112

Bảng 3.1 Hàm lượng kẽm hữu cơ tồn tại trong 12 chủng nấm men

S cerevisiae Sinh khối

(g/100ml)

Hàm lượng kẽm (mg/g) Tỉ lệ kẽm hữu cơ (%) Kẽm liên kết protein (%)

Kẽm liên kết polysacarit (%)

CNTP 4007 0,93 ± 0,08 7,50 ± 0,21 80,43 ± 2,13 9,70 ± 0,19 12,16 ± 0,27 CNTP 4017 0,90 ± 0,09 5,23 ± 0,22 51,56 ± 1,53 8,42 ± 0,17 11,18 ± 0,19 CNTP 4059 0,89 ± 0,09 7,05 ± 0,19 78,64 ± 1,46 14,50 ± 0,21 19,21 ± 0,20 CNTP 4080 0,87 ± 0,08 7,65 ± 0,12 85,86 ± 1,24 6,47 ± 0,09 16,61 ± 0,50

CNTP 4087 0,94 ± 0,11 8,91 ± 0,21 86,86 ± 1,51 15,40 ± 0,18 20,52 ± 0,81

CNTP 4130 0,87 ± 0,09 5,47 ± 0,19 78,92 ± 2,16 11,01 ± 0,26 14,84 ± 0,19 CNTP 4131 0,95 ± 0,13 5,89 ± 0,3 62,65 ± 3,05 14,65 ± 0,18 17,90 ± 0,23 CNTP 4157 0,89 ± 0,09 7,19 ± 0,12 74,98 ± 1,34 9,12 ± 0,23 11,86 ± 0,27 CNTP 4158 0,91 ± 0,09 6,35 ± 0,19 71,12 ± 1,12 6,80 ± 0,85 12,40 ± 0,31

A112 1,02 ± 0,07 10,95 ± 0,13

88,17 ± 1,27 15,86 ± 0,25 28,25 ± 0,16

CO8 0,83 ± 0,08 8,16 ± 0,18 86,05 ± 1,13 12,86 ± 0,25 18,25 ± 0,19 A78 0,71 ± 0,09 6,43 ± 0,17

70,87 ± 2,16 10,81 ± 0,11 15,01 ± 0,18

Như vậy, kẽm phân bố chủ yếu dưới dạng liên kết với hợp chất hữu cơ, dao động từ 51,56 tới 88,17% so với lượng kẽm có trong dịch chiết của các mẫu được phân tích Kết quả này đã chứng minh khả năng chuyển hóa nguồn kẽm vô cơ trong môi trường nuôi cấy, thành dạng kẽm liên kết với hợp chất hữu cơ tích lũy trong tế bào của các chủng nấm men Kẽm dạng hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất trong sinh khối chủng nấm men phân lập A112 đạt giá trị 88,17% Roepcke và cộng

sự (2011) khi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy thu nấm men

giàu kẽm trên chủng Pichia guilliermondii LBP 063 kết quả cho thấy

trên 91% kẽm liên kết với các dạng hợp chất hữu cơ [132] Trong

7

nghiên cứu này, tỉ lệ kẽm hữu cơ cao nhất đạt 88,17% trên chủng

S.cerevisiae A112, giá trị này thấp hơn nghiên cứu của Roepcke và

cộng sự Tuy nhiên, đây cũng là chủng có khả năng tích lũy kẽm hữu

cơ với hàm lượng cao trong sinh khối

Ở mỗi chủng nấm men, dạng kẽm liên kết với phân đoạn polysacarit đều lớn hơn dạng kẽm gắn với phân đoạn protein Kẽm có vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cơ thể Kẽm liên kết với hợp chất hữu cơ có thể được hấp thụ dễ dàng và ứng dụng trong

y học Dạng kẽm liên kết với polysacarit đã được chứng minh có tác dụng giải độc khi bị ngộ độc kim loại nặng [141] Việc phân tích các dạng tồn tại của kẽm có ý nghĩa trong việc làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của dịch chiết nấm men giàu kẽm

3.1.2 Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn được

Khuẩn lạc chủng nấm men A112 có kích thước to nhỏ khác nhau, khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bề mặt trơn láng Tế bào nấm men khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét có hình tròn, ovan với kích thước tế bào nằm trong khoảng 5 ÷ 7 × 7 ÷ 11µm Những đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc chủng nấm men A112 về cơ bản có sự

tương đồng với S.cerevisiae CNTP 4087 và một số loài thuộc chi

Saccharomyces [28]

Khuẩn lạc nấm men A112 Tế bào chủng nấm men A112

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng nấm men A112

2 chủng nấm men có khả năng đồng hóa glucose, galactose, sucrose, maltose và không có khả năng đồng hóa D-glucosamine, D-xylose, L-arabinose, D-sorbitol, Lactose, 2-keto-D-gluconate, Sắt citrate Đồng thời, các chủng này đều có khả năng lên men rượu, sinh khí CO2, phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ 25oC - 33oC, pH từ 5-8 Đặc biệt, chủng nấm men A112 có khả năng sinh trưởng được ở điều kiện nhiệt độ lên tới 35oC đặc tính này vô cùng có ý nghĩa trong sản xuất công nghiệp [101]…

3.1.3 Định tên chủng nấm men A112 bằng sinh học phân tử

Kết quả so sánh gen 26S rDNA của chủng A112 cho thấy,

chúng tương đồng 99,25% với chủng S cerevisiae GITA551, trên cây phát sinh chủng loại chủng A112 có quan hệ gần nhất với loài S cerevisiae Như vậy, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí sinh hóa và sinh học phân tử cho thấy chủng nấm men A112 thuộc về loài S cerevisiae Chủng nấm men S.cerevisiae A112 thể hiện đặc tính tốt

nhất về khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nên được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu các điều kiện phù hợp cho cho quá

trình lên men tích lũy kẽm

3.2 Nghiên cứu các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

3.2.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

a Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men S.cerevisiae A112

Muối kẽm nitorat, kẽm clorua và kẽm sunphat được

sử dụng để khảo sát lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Tiến hành thí nghiệm như

9

đã trình bày ở phần phương pháp, kết quả được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích

lũy kẽm trong sinh khối nấm men

Nồng độ

kẽm (g/l)

S.cerevisiae A112 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau Việc

sử dụng muối kẽm sunphat cho khả năng tích lũy và lượng sinh khối khô thu được cao hơn hai muối còn lại Chính vì vậy, chúng tôi chọn muối kẽm sunphat làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp sau

Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy có mối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Nồng độ muối kẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn Tuy nhiên, tác động độc hại của kim loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lại rất rõ rệt khi tăng dần nồng độ muối kẽm

b Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tích lũy kẽm và sự sinh trưởng phát triển của chủng S cerevisiae A112

Ảnh hưởng của glucose tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới quá trình tạo sinh

khối nấm men giàu kẽm

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, glucose không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu kẽm trong sinh khối nhưng lại ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men cũng như khối lượng sinh khối sau lên men Bởi lẽ, glucose là nguồn năng lượng chính cho nấm men đồng hóa và xây dựng cấu trúc tế bào và gia tăng sinh khối Xét về hiệu quả kinh tế, hàm lượng đường glucose ở mức 100g/l là phù hợp cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

c Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tích lũy kẽm và sự sinh trưởng phát triển của chủng S cerevisiae A112

Kết quả trên cho thấy, nồng độ yeast extract bổ sung10g/l là thích hợp nhất cho quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

0 0.4 0.8 1.2 1.6

Khi tăng nồng độ yeast extract từ 5g/l lên tới 10g/l chủng S cerevisiae

A112 có chiều hướng gia tăng hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối

và khối lượng sinh khối sau lên men Cụ thể, ở nồng độ yeast extract

là 10g/l khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối đạt tới 10,41 mg/g, với lượng sinh khối tương ứng là 0,72 g/100ml Tuy nhiên, điều đáng chú

ý là khi bổ sung nguồn dưỡng chất này ở nồng độ cao từ 15 lên tới 20 g/l lại có tác động bất lợi cho quá trình hấp thu kẽm Brady và Ducan (1994) cũng chỉ ra rằng, yeast extract có ảnh hưởng tích cực tới sự phát triển của nấm men và sự hấp thu kẽm trong sinh khối ở nồng độ thích hợp Tuy nhiên, ở nồng độ cao chúng có thể liên kết trực tiếp với ion kim loại trong môi trường nuôi cấy gây giảm hấp thu kẽm trong sinh khối nấm men [33]

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô tới S cerevisiae A112