TỔNG QUAN
Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ
1.1.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật sắc ký
Sắc ký là kỹ thuật phân tách và phân tích các thành phần trong hỗn hợp, dựa vào sự phân bố khác nhau giữa pha động và pha tĩnh Phương pháp này cho phép xác định và tách biệt các chất một cách hiệu quả.
Pha tĩnh, hay còn gọi là pha cố định, là thành phần chất liệu hoặc dung dịch được giữ cố định trong quá trình sắc ký, có vai trò quan trọng trong việc giữ lại các chất.
- Pha động (mobile phase): là phần khí hay dung dịch đi qua pha tĩnh, pha di động có tác dụng kéo các chất đi
Hai pha trong sắc ký luôn tiếp xúc nhưng không hòa trộn Các chất có ái lực cao với pha tĩnh di chuyển chậm hơn, trong khi các chất có ái lực thấp di chuyển nhanh hơn Đồng thời, các phân tử lớn và nặng sẽ di chuyển chậm hơn trong cột sắc ký và xuất hiện sau các phân tử nhỏ và nhẹ hơn.
1.1.2 Sắc ký khí – khối phổ
Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là một phương pháp phân tích hiệu quả, kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ, giúp xác định các thành phần hoạt chất trong mẫu thử Phương pháp này thường áp dụng cho các mẫu ở dạng hơi hoặc khí.
Sắc ký khí là phương pháp phân tách các thành phần trong mẫu dựa trên ái lực khác nhau với pha tĩnh, trong đó các phân tử nhẹ hơn sẽ xuất hiện trước Bộ phận khối phổ xác định định tính và định lượng các chất bằng cách chọn lọc các phân tử mẹ trước khi ion hóa và phá vỡ thành các mảnh ion Các ion đặc trưng cho mỗi chất được chuyển đến bộ phận lọc, nơi chỉ cho phép các hạt có khối lượng nhất định đi qua Thiết bị cảm biến đếm số lượng hạt cùng khối lượng, và thông tin này được gửi đến máy tính để tính toán tín hiệu và đưa ra kết quả khối phổ.
GC/MS là tiêu chuẩn vàng trong xác định hoạt chất nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, với mỗi chất được nhận diện qua thời gian lưu và các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu, và các chất trong mẫu thử chưa biết GC/MS có khả năng định tính và định lượng các chất ở thể khí với ngưỡng phát hiện đạt mức picrogram.
1.1.2.1 Cấu tạo của hệ thống GC/MS
Hình 1.1 Cấu tạo hệ thống sắc ký khí – khối phổ [19]
1 Nguồn cấp khí 2 Bộ điều khiển khí nén
3 Bơm tiêm mẫu 4 Lò cột
5 Cột 6 Kết nối sắc ký với khối phổ
7 Nguồn ion 8 Bộ phận phân tích khối lượng
9 Đầu dò 10 Hệ thống chân không
11 Bảng điều khiển điện tử
Bộ phận sắc ký khí
2 Bộ điều khiển khí nén
11 Bảng điều khiển điện tử
8 Bộ phân tích ion khối lượng
Cửa tiêm mẫu bao gồm một bơm tiêm mẫu tự động, nơi dung môi chứa hỗn hợp các chất được tiêm vào hệ thống Sau đó, mẫu được cấp khí và điều khiển bằng khí nén, dẫn qua hệ thống sắc ký khí, thường sử dụng khí trơ như heli hoặc hydro Nhiệt độ tại cửa tiêm mẫu được nâng cao để chuyển đổi mẫu từ dạng lỏng sang dạng khí.
Vỏ ngoài: vỏ ngoài của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt (4) Nhiệt độ của lò này dao động từ 40 o C cho đến 320 o C
Cột trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ được tráng bằng polymer đặc biệt, giúp phân tách các chất trong hỗn hợp Quá trình này diễn ra khi hỗn hợp di chuyển dọc theo cột, nơi các thành phần được tách biệt dựa trên ái lực khác nhau với pha tĩnh Sau khi phân tách, các chất sẽ được chuyển qua bộ phận kết nối đến bộ phận khối phổ để phân tích tiếp.
Nguồn ion cung cấp ion cần thiết để ion hóa các sản phẩm trong hỗn hợp sau khi đã được phân tách Các ion mẹ sẽ được chuyển đến bộ phận phân tích khối lượng để tiếp tục quá trình nghiên cứu.
Bắn phá tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử của chất phân tích, và các mảnh ion này được chọn lọc và phát hiện bằng đầu dò khối phổ rất đặc hiệu.
Hệ thống chân không: duy trì áp lực chân không trong bộ phận khối phổ
Bảng điều khiển điện tử: sử dụng để điều khiển hệ thống (11)
1.1.2.2 Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Nguyên lý kỹ thuật theo Honour JW bao gồm thủy phân steroid liên hợp bằng enzym glucuronidase/sulphatase, sau đó tách chiết các steroid tự do và tạo dẫn xuất steroid với methoxyamin và trimethylsilylimidazole (TMSI) Trước khi bơm mẫu vào hệ thống sắc ký khí- khối phổ, steroid cần được tinh sạch Trong máy, steroid được làm bay hơi ở nhiệt độ cao và sau khi phân tách bởi bộ phận sắc ký khí, chúng được vận chuyển đến bộ phận khối phổ Tại đây, các steroid được ion hóa và bắn phá để tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc từng steroid, sau đó được phát hiện bằng đầu dò khối phổ.
Thủy phân steroid niệu diễn ra khi chúng liên hợp với acid glucuronic và acid sulphuric thông qua enzym glucuronidase và arylsulphatase ở nhiệt độ 37°C qua đêm hoặc 55°C trong 3 giờ Cột Bond Elut được hoạt hóa bằng methanol và rửa lại bằng nước cất trước khi cho mẫu vào Các steroid tự do được tách chiết và tinh sạch, giữ lại tại màng lọc của cột, sau đó được rửa giải bằng methanol và làm khô để loại bỏ methanol Để bảo vệ các nhóm chức –OH khỏi phân hủy do nhiệt độ cao trong quá trình hóa hơi, steroid được tạo dẫn xuất với methoxyamine và TMSI Các dẫn xuất này sau đó được bơm vào máy sắc ký khí khối phổ, nơi chúng được vận chuyển trong cột sắc ký bằng khí trơ như heli Sau khi phân tách, steroid được ion hóa dưới tác dụng của dòng điện, tạo ra các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử Trong phương pháp SIM (selected ion monitoring), chỉ các ion chọn lọc mới được phát hiện, với mỗi steroid niệu được biểu diễn bằng một đỉnh trên sắc ký đồ, và thời gian xuất hiện đỉnh được gọi là thời gian lưu Mảnh ion từ phân tử mẹ giúp nhận diện steroid trên sắc ký đồ.
Chuẩn nội (internal standard) được sử dụng trong quá trình phân tích mẫu để điều chỉnh sự mất mát và đảm bảo độ chính xác Mẫu chuẩn được phân tích song song với mẫu bệnh, từ đó xây dựng đường chuẩn để tính nồng độ steroid Thời gian lưu và ion đặc hiệu của các steroid trong mẫu được xác định thông qua phân tích các steroid tinh khiết Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS có nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng phân tách các steroid riêng biệt và phân biệt đồng phân nhờ thời gian lưu khác nhau Các phân tử có cùng trọng lượng được phân biệt qua ion đặc hiệu, mang lại độ nhạy cao và khả năng định lượng mẫu có nồng độ thấp Độ đặc hiệu của phương pháp cũng được nâng cao nhờ phân tích cấu trúc phân tử của các steroid.
Kỹ thuật xét nghiệm này có nhược điểm là thời gian thực hiện lâu hơn so với LC/MS-MS do quá trình thủy phân và tạo dẫn xuất kéo dài Mẫu phải được chuẩn bị hoàn toàn bằng tay, đòi hỏi người thực hiện có kinh nghiệm Số lượng mẫu được xử lý hạn chế vì không thể tự động hóa quy trình chuẩn bị Hơn nữa, kỹ thuật này khó phổ biến và kết quả có thể không chính xác ở mẫu của trẻ sơ sinh do nồng độ steroid trong nước tiểu rất thấp.
Để hạn chế sai số trong quá trình phân tích, cần tối ưu hóa điều kiện phản ứng của enzym glucuronidase bằng cách sử dụng pH phù hợp của dung dịch đệm Việc ổn định steroid tự do sau thủy phân có thể thực hiện bằng vitamin C Trước khi tạo dẫn xuất, cần làm khô hoàn toàn methanol để tránh sự ức chế trong quá trình này; đồng thời, thời gian và nhiệt độ tạo dẫn xuất cũng cần được duy trì ổn định Đối với mỗi steroid niệu, việc lựa chọn ion đặc hiệu là rất quan trọng Đối với các mẫu nước tiểu loãng của trẻ sơ sinh, có thể thực hiện cô đặc bằng cách tách chiết qua cột với một thể tích nước tiểu lớn hơn trước khi tiến hành thủy phân.
Thẩm định phương pháp và thiết lập khoảng tham chiếu
Thẩm định phương pháp là quá trình cung cấp bằng chứng khách quan cho thấy phương pháp dự kiến có thể đáp ứng yêu cầu Việc này cần thực hiện đối với các phương pháp chưa được nhà sản xuất thẩm định hoặc có sự thay đổi Trong khi đó, xác nhận phương pháp là việc xác nhận lại các giá trị mà nhà sản xuất đã công bố Hiện nay, có nhiều thuật ngữ như đánh giá phương pháp, định trị phương pháp, và phê duyệt phương pháp, tất cả đều đề cập đến thẩm định và xác nhận phương pháp.
Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đánh giá sai số kỹ thuật trước khi áp dụng phương pháp mới hoặc sau khi hiệu chỉnh Các phương pháp đo lường bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên và hệ thống, với sai số hệ thống làm sai lệch kết quả so với giá trị thực Để đảm bảo tiêu chuẩn kỹ thuật đáp ứng yêu cầu chất lượng, cần thẩm định phương pháp qua các thực nghiệm phù hợp Đối với phương pháp phân tích hóa sinh, các thông số cần thẩm định bao gồm độ đặc hiệu phân tích, độ nhạy phân tích, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lệch/độ đúng, cũng như độ chính xác Sau khi xác định các thông số thẩm định, cần thiết lập khoảng tham chiếu Việc lựa chọn các thông số này phụ thuộc vào kỹ thuật phòng xét nghiệm, yêu cầu phương pháp, điều kiện và nguồn lực sẵn có.
Hướng dẫn của CLSI khuyến cáo sử dụng 3 thông số sau:
Giới hạn trắng (limit of blank: LOB) là giá trị đo lường cao nhất có thể quan sát được từ mẫu trắng, thường được ước tính bằng công thức giá trị trung bình cộng với 1,65 lần độ lệch chuẩn (SD) của mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà phương pháp định lượng có thể nhận diện trong các điều kiện nhất định.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể đo lường với độ lặp và độ tái lặp chấp nhận được, với CV < 20% Độ lặp, hay còn gọi là độ chụm, thể hiện mức độ gần gũi giữa các kết quả thu được từ các phép thử độc lập trên cùng một mẫu và trong cùng một điều kiện Việc đánh giá độ lặp giúp ước tính sai số ngẫu nhiên do các yếu tố khác nhau trong quá trình thực hiện phương pháp, và đây là bước đầu tiên trong việc đánh giá một phương pháp mới.
Có hai loại độ lặp cần đánh giá trong phân tích: độ lặp ngắn hạn (hay độ lặp trong một lần chạy) và độ tái lặp (độ lặp giữa các lần chạy) Để xác định độ lặp, có thể sử dụng mẫu chuẩn, mẫu nội kiểm hoặc mẫu bệnh phẩm Số lần chạy lặp lại tối thiểu là 20 lần trong một ngày cho độ lặp lại và trên 20 ngày cho độ tái lặp Tính toán độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) từ các kết quả chạy lặp lại, sau đó so sánh CV với tiêu chuẩn cho phép Độ xác thực hay độ chính xác là mức độ gần đúng giữa kết quả đo và giá trị thật, tuy nhiên, giá trị thật thường chỉ là khái niệm lý tưởng khó đạt được trong thực tế.
Thực nghiệm so sánh phương pháp nhằm đánh giá độ chính xác và sai số hệ thống của các phương pháp xét nghiệm Phân tích các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp mới và phương pháp tham chiếu cho phép đánh giá sai số dựa trên sự khác biệt giữa hai phương pháp Nhiều thuật toán thống kê như đồ thị khác biệt, đồ thị so sánh, phân tích hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan có thể được áp dụng để phân tích kết quả Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b mô tả mối quan hệ giữa kết quả của phương pháp cần thẩm định (y) và kết quả của phương pháp tham chiếu (x), trong đó a là độ dốc và b là giao điểm Độ dốc a cho biết sai số tỷ lệ, lý tưởng là 1, trong khi giao điểm b cho biết sai số hằng định, lý tưởng là 0.
Sự khác biệt giữa phương pháp cần thẩm định và phương pháp tham chiếu cần được phân tích kỹ lưỡng Nếu sự khác biệt nhỏ, hai phương pháp có thể được coi là có độ xác thực tương đương, cho phép phương pháp mới thay thế phương pháp tham chiếu Ngược lại, nếu sự khác biệt lớn và không chấp nhận được về mặt y khoa, cần đánh giá để xác định phương pháp nào chính xác hơn Các thực nghiệm đánh giá độ thu hồi và yếu tố nhiễu có thể cung cấp thông tin bổ sung cho quá trình này.
Phòng xét nghiệm thường thiếu phương pháp tham chiếu để so sánh với phương pháp thẩm định, do đó, việc đánh giá độ xác thực có thể thực hiện thông qua chương trình ngoại kiểm Việc so sánh kết quả từ phòng xét nghiệm với kết quả từ chương trình ngoại kiểm là cần thiết Chương trình ngoại kiểm steroid niệu đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá và so sánh kết quả giữa các phòng xét nghiệm trên toàn thế giới.
Thực nghiệm xác định độ thu hồi (recovery experiment)
Sử dụng hai mẫu trong đó mẫu 1 thêm chất chuẩn và mẫu 2 thêm thể tích dung dịch pha loãng chất chuẩn Thể tích thêm vào không quá 10% để tránh ảnh hưởng đến chất nền phân tích và không vượt quá giới hạn tuyến tính của các chất phân tích Phân tích hai mẫu trên, mỗi mẫu được đo lặp lại ít nhất 3 lần để tính độ thu hồi.
Công thức tính nồng độ thu hồi và % thu hồi như sau:
Để tính toán nồng độ chuẩn thêm vào, ta sử dụng công thức: Nồng độ chuẩn thêm vào = Nồng độ chuẩn x thể tích chuẩn thêm vào (mL) Nồng độ thu hồi được xác định bằng cách lấy nồng độ mẫu thêm chuẩn trừ đi nồng độ mẫu thêm nước cất Tỷ lệ thu hồi (%) được tính bằng công thức: Thu hồi (%) = Nồng độ thu hồi / Nồng độ chuẩn thêm vào x 100.
Kết quả thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu của Honour JW cho thấy độ thu hồi đạt khoảng 90%, với độ lặp và độ tái lặp dưới 25% Độ nhạy của các xét nghiệm định lượng steroid khác nhau, và để phát hiện đỉnh trên sắc ký đồ, cần khoảng 10 ng steroid tiêm vào cột sắc ký hoặc 200 pg steroid cho sắc ký khí – khối phổ chọn lọc ion (GC/MS-SIM) [18].
1.2.2 Thiết lập khoảng tham chiếu
Khoảng tham chiếu là phân bố giá trị đặc trưng trong một quần thể sinh học và là yếu tố cuối cùng được xem xét trong quá trình thẩm định phương pháp Mặc dù không quyết định hiệu năng của phương pháp, việc thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu mới cho xét nghiệm là rất quan trọng, nhằm hỗ trợ cho việc diễn giải kết quả xét nghiệm của người bệnh.
Hướng dẫn CLSI EP28A-C3 cung cấp quy trình chi tiết cho việc thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu trong phòng xét nghiệm Việc thiết lập khoảng tham chiếu là cần thiết cho mỗi kỹ thuật xét nghiệm mới, do sự khác biệt về giới tính, tuổi tác, chủng tộc và vùng địa lý giữa các đối tượng Các chuyên gia y tế khuyến cáo rằng mỗi phòng xét nghiệm nên tự thiết lập giá trị tham chiếu cho từng xét nghiệm Bước đầu tiên là lựa chọn quần thể tham chiếu, bao gồm những người khỏe mạnh ít có nguy cơ mắc bệnh, nhằm đảm bảo quần thể này đại diện cho quần thể lớn và phù hợp với các thông tin và nghiên cứu trước đó.
Bước 2 trong quá trình nghiên cứu là lựa chọn đối tượng tham chiếu từ quần thể nghiên cứu thông qua bộ câu hỏi phỏng vấn Bộ câu hỏi này giúp xác định thông tin cá nhân, thói quen và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến xét nghiệm, từ đó xây dựng khoảng tham chiếu và loại bỏ những cá nhân có nguy cơ cao mắc bệnh Các yếu tố cần phỏng vấn bao gồm hút thuốc, uống rượu, mang thai, tiền sử gia đình và các loại thuốc đang sử dụng Có hai phương pháp lấy mẫu để thiết lập khoảng tham chiếu: lấy mẫu trực tiếp từ những người khỏe mạnh đã được sàng lọc và lấy mẫu gián tiếp từ các mẫu đã thu thập cho mục đích khác, như mẫu từ người hiến máu, người khám sức khỏe định kỳ, hoặc người thực hiện xét nghiệm sàng lọc.
Sinh tổng hợp hormon steroid và bệnh rối loạn tổng hợp steroid bẩm sinh 16 1 Tổng hợp hormon steroid
Cholesterol is transported into the mitochondria by the StAR (steroid acute response) protein Inside the mitochondria, cholesterol undergoes a process where a 5-carbon chain is removed by the enzyme desmolase, resulting in the production of pregnenolone, an intermediary compound Pregnenolone then exits the mitochondria and enters the endoplasmic reticulum to synthesize all three groups of steroid hormones.
Nhóm 1 gồm các hormon tham gia chuyển hóa muối nước như DOC, corticosterone, 18OH-corticosterone, aldosterone (nền màu xanh lá cây)
Nhóm 2 gồm các hormon tham gia chuyển hóa glucose như 11- deoxycortisol, cortisol, cortisone (nền màu cam)
Nhóm 3 gồm các hormon sinh dục nam như testosterone, 5α-DHT (nền màu xanh đậm) Hormon sinh dục nữ như oestrone, oestradiol (nền màu hồng)
Một số tiền chất đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ba nhóm hormon, đặc biệt là hormon sinh dục với nền màu xanh nhạt, cùng với tiền chất tổng hợp cortisol như progesterone và 17-OHP, có nền màu vàng.
Các gen CYP21A2, CYP11B1, HSD3B2, CYP11B2, CYP17A1… là gen quy định tổng hợp các enzym 21-OH, 11β-OH, 3β-HSD, 17α-OH…
Các sản phẩm chuyển hóa của steroid trong nước tiểu như THE
(tetrahydrocortisone), THF (tetrahydrocortisol), 5α-THF, THS (tetrahydro-11- deoxicortisol), THA (tetrahydroaldosterone), THB (tetrahydrocorticosterone), An (androsterone), Et (etiocholanolone), PD (pregnanediol), PTL (pregnanetriolone),
Hình 1.2 Sơ đồ sinh tổng hợp các hormon steroid [11]
1.3.2 Bệnh lý rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh
Rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh được chia thành hai nhóm chính Nhóm 1 liên quan đến bất thường trong việc tổng hợp glucocorticoid, dẫn đến tăng sản thượng thận bẩm sinh do tuyến thượng thận không thể sản xuất cortisol Nhóm 2 bao gồm các bất thường trong tổng hợp hormon chuyển hóa muối-nước và glucocorticoid, gây ra tình trạng mất cân bằng nước và điện giải.
Nhóm 3: bất thường tổng hợp hormon sinh dục: giảm tổng hợp androgen hoặc estrogen gây rối loạn phát triển giới tính
Ngoài ra, có thể gặp các bất thường tại thụ thể của hormon steroid gây ra các triệu chứng giống với rối loạn tổng hợp hormon steroid
1.3.2.1 Rối loạn sinh tổng hợp hormon nhóm glucocorticoid gây tăng sản thượng thận bẩm sinh
TSTTBS, lần đầu tiên được mô tả trong y văn vào năm 1865 bởi một nhà giải phẫu người Italia, là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen dẫn đến thiếu hụt một trong năm enzym tham gia tổng hợp cortisol hoặc bất thường protein vận chuyển cholesterol vào ty thể Khi nồng độ cortisol giảm, tuyến yên sẽ tăng tiết ACTH, dẫn đến tăng sinh tế bào tuyến thượng thận và tăng tiết androgen, gây rối loạn phát triển giới tính ở nữ Các thể bệnh của TSTTBS bao gồm nhiều dạng khác nhau.
- TSTTBS do thiếu enzym 21-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 11β-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 3β-HSD type II
- TSTTBS do thiếu enzym 17α-hydroxylase/17,20 lyase
- TSTTBS thể lipid hóa (Lipoid adrenal hyperplasia) do bất thường protein StAR hoặc enzym tách cholesterol khỏi protein vận chuyển P450scc
- Thiếu hụt Cyt P450-oxidoreductase (POR) gây giảm hoạt tính đồng thời một số enzym như 21-OH, 17α-hydroxylase, aromatase
Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển 17-OHP thành 11-deoxycortisol tiền chất để tổng hợp cortisol và xúc tác chuyển progesterone thành 11- deoxycorticosterone tiền chất để tổng hợp aldosterone Thiếu hụt enzym 21-OH thường gặp nhất trong số các rối loạn tổng hợp hormon steroid, gồm thể cổ điển mất muối, thể nam hóa đơn thuần và thể không cổ điển [28]:
Thể mất muối trong TSTTBS cổ điển có triệu chứng thừa androgen từ bào thai và rối loạn nước, điện giải, chiếm khoảng 75% số bệnh nhân Trong khi đó, thể nam hóa đơn thuần không có rối loạn nước, điện giải và chỉ có thừa androgen từ bào thai, chiếm khoảng 25% bệnh nhân Thể khởi phát muộn hay không cổ điển có dấu hiệu thừa androgen xuất hiện muộn sau sinh, không có rối loạn nước-điện giải Hơn 30 triệu trẻ sơ sinh đã được sàng lọc tại hơn 30 quốc gia và vùng lãnh thổ Tần suất mắc thiếu enzym 21-OH thể cổ điển khác nhau theo chủng tộc và vùng địa lý, trung bình ở Hoa Kỳ và châu Âu là khoảng 1:15.000 đến 1:16.000 trẻ sơ sinh sống, trong khi tần suất ở New York là 1:18.170 và ở Emilia, Italia là 1:8.586.
Tần suất mắc TSTTBS cao nhất ở người Yupik Eskimos tại Alaska (1:282) và người dân trên đảo Réunion (1:2.141) Tần suất thiếu enzym 21-OH thể không cổ điển có thể lên đến 3%, trung bình khoảng 1:100 ở người da trắng, cao nhất là 1:27 ở người Ashkenazi Jews và 1:53 ở chủng tộc Tây Ban Nha, thấp hơn ở một số nước châu Âu Mặc dù chi phí phát hiện TSTTBS khá cao, việc sàng lọc và phát hiện sớm đã được thực hiện thường quy tại nhiều quốc gia từ những năm 1980, giúp điều trị kịp thời cho bệnh nhân.
Triệu chứng chính của người thiếu enzym 21-OH cổ điển là nồng độ androgen trong máu tăng cao, dẫn đến các dấu hiệu nam hóa ở trẻ nữ xuất hiện từ khi mang thai và ngay sau sinh Cơ quan sinh dục nữ có sự biến đổi, phì đại âm vật giống dương vật, được phân loại theo thang điểm Prader từ độ I đến V, trong khi các cơ quan sinh dục bên trong như tử cung, vòi trứng và buồng trứng vẫn bình thường Đối với trẻ nam, không có bất thường nào ở bộ phận sinh dục.
Rối loạn nước – điện giải thường gặp trong TSTTBS thể 21-OH cổ điển, với khoảng 75% trường hợp có sự giảm aldosterone, dẫn đến hạ natri và tăng kali Những dấu hiệu mất nước mạn tính có thể xuất hiện, bao gồm giảm cân, da khô và nhăn, thóp lõm, li bì, chậm chạp, thậm chí là hôn mê.
Khoảng 25% bệnh nhân thiếu hụt 21-OH cổ điển chỉ có triệu chứng rối loạn giới tính mà không kèm theo rối loạn điện giải Ở trẻ nữ, các dấu hiệu nam hóa thường xuất hiện ngay sau khi sinh.
Thể không cổ điển và thể khởi phát muộn của tình trạng thừa androgen có thể xuất hiện sau khi sinh Trường hợp đầu tiên của TSTTBS thể khởi phát muộn được ghi nhận vào năm 1957 ở một nữ giới có dấu hiệu rậm lông và mụn trứng cá Ở nam giới, tình trạng này có thể gây ra do testosterone được sản xuất tại tuyến thượng thận, dẫn đến giảm sinh tinh trùng và tinh hoàn kém phát triển.
Xét nghiệm máu có thể phát hiện rối loạn nước-điện giải ở bệnh nhân TSTTBS thể mất muối, với nồng độ natri thấp, kali cao, và hoạt tính aldosterone giảm nhưng hoạt tính hệ renin lại tăng cao Nồng độ cortisol có thể thấp hoặc bình thường tùy vào thời điểm lấy mẫu, trong khi nồng độ ACTH thường tăng ở mọi lứa tuổi Đặc biệt, nồng độ 17-OHP, DHEA, androstenedione và testosterone tăng cao trong máu ở thiếu niên và người trưởng thành mắc thể thiếu hụt 21-OH cổ điển Đối với thể không cổ điển, xét nghiệm cho thấy nồng độ 17-OHP tăng trước và sau 30-60 phút khi thực hiện nghiệm pháp kích thích bằng ACTH.
Xét nghiệm di truyền cho thấy thiếu enzym 21-OH là một bệnh rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh, do đột biến gen lặn trên gen CYP21A1 tại nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3) Các đột biến nặng (null) làm mất hầu như hoàn toàn hoạt tính enzym 21-OH, dẫn đến tình trạng thiếu muối và rối loạn nước điện giải xuất hiện sớm trong tháng đầu đời Đột biến làm giảm hoạt tính enzym còn 1-10% gây ra nam hóa đơn thuần với các dấu hiệu xuất hiện ngay khi sinh, trong khi các đột biến giảm hoạt tính khoảng 30-50% chỉ gây thể không cổ điển Hiện tại, đã có hơn 140 đột biến trên CYP21A2 được phát hiện, nhưng chỉ khoảng 10-12 đột biến là thường gặp.
Enzym 11β-OH đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi 11-deoxycortisol thành cortisol và DOC thành corticosterone tại lớp bó và lớp lưới của vỏ thượng thận Sự thiếu hụt enzym này dẫn đến giảm tổng hợp cortisol, đồng thời làm tăng nồng độ 11-deoxycortisol và DOC Tình trạng thiểu năng thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) do thiếu 11β-OH chiếm từ 5-8% tổng số trường hợp TSTTBS, đứng sau thiếu hụt 21-OH Tần suất xuất hiện TSTTBS cổ điển do thiếu 11β-OH ở trẻ sơ sinh dao động khoảng 1:100.000 đến 1:200.000.
Thiếu 11β-OH thể cổ điển chiếm dưới 5% tổng số người bệnh TSTTBS ở châu Âu, nhưng tần suất này lại cao hơn ở người Moslem và Jewish tại Israel-Trung Đông, với tỷ lệ có thể đạt từ 1:5.000 đến 1:7.000 trẻ sơ sinh, góp phần đến 15% tổng số người bệnh TSTTBS.
Nghiên cứu về rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở Việt Nam 41 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh (TSTTBS) đã được nghiên cứu tại Việt Nam từ những năm 1970, với sự tập trung vào các đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm máu trước năm 1999 Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ em dựa vào các dấu hiệu lâm sàng và nồng độ 17-OHP trong máu, cùng với các chỉ số như progesterone, kali, testosterone, 17-ketosteroid và natri Tuy nhiên, việc sử dụng các tiêu chuẩn không đặc hiệu có thể dẫn đến chẩn đoán nhầm hoặc bỏ sót TSTTBS do nồng độ 17-OHP và testosterone không đủ cao Bệnh nhân TSTTBS cần được theo dõi và điều trị bằng 17-OHP để phát hiện sớm các biến chứng suy thượng thận cấp tính có thể đe dọa tính mạng Từ năm 2006 đến 2010, có 52 bệnh nhân suy thượng thận cấp do TSTTBS được điều trị tại khoa Nội tiết- Chuyển hóa- Di truyền.
Từ năm 1999, nhiều nghiên cứu đã phát hiện các đột biến gen liên quan đến bệnh TSTTBS, bao gồm đột biến mất đoạn 8 nucleotid ở exon 3 trên gen CYP21 và một số đột biến điểm khác Tuy nhiên, việc sử dụng ít cặp mồi để phát hiện các đột biến phổ biến mà chưa tiến hành giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 đã dẫn đến chỉ 24 trong số 43 bệnh nhân (55,8%) được phát hiện có đột biến, trong khi 19 bệnh nhân (44,2%) có triệu chứng TSTTBS nhưng chưa xác định được đột biến gen CYP21.
Vào năm 2017, Vũ Chí Dũng cùng các cộng sự đã công bố kết quả phân tích gen CYP21A2 cho 212 bệnh nhân có đột biến, nhằm chẩn đoán tình trạng thiếu 21-OH Trong số đó, có 11 bệnh nhân được phát hiện mắc hội chứng TSTTBS do thiếu 11β-OH và 3 bệnh nhân thiếu 3β-HSD II.
[13] Một trường hợp TSTTBS do thiếu 21-OH không được chẩn đoán, điều trị sớm và đầy đủ được phát hiện có u vỏ thượng thận [114]
Năm 2012, nghiên cứu của Phạm Thu Nga cho thấy trong số 695 người bệnh rối loạn phát triển giới tính, 51,7% là nữ với nhiễm sắc thể 46,XX, chủ yếu do TSTTBS (91,9%) Trong khi đó, 25% rối loạn phát triển giới tính xảy ra ở người mang nhiễm sắc thể 46,XY, với 8,1% mắc tình trạng không nhạy cảm với androgen.
Từ năm 2012 đến nay, nhiều nghiên cứu đã công bố phát hiện các đột biến gen CYP11B1, đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-OH, trong đó có một số đột biến mới được xác định.
Số lượng bệnh nhân mắc TSTTBS và rối loạn phát triển giới tính đang gia tăng, với khoảng 50-70 ca được khám và điều trị hàng năm tại Bệnh viện Nhi Trung ương Điều này yêu cầu các kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác để theo dõi và phân biệt các thể bệnh khác nhau Mặc dù đã có các phương pháp phân tích gen để chẩn đoán thiếu hụt 21-OH và 11β-OH, nhiều bệnh lý khác, đặc biệt là rối loạn phát triển giới tính ở người mang nhiễm sắc thể 46,XY, như thiếu 5α-reductase type 2 và thiếu 3β-HSD, vẫn chưa được chẩn đoán xác định tại Việt Nam.
II nên phải hợp tác và gửi mẫu phân tích ra nước ngoài như Nhật Bản, Pháp [116],[117]
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
269 trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày tuổi đến 11 tuổi chia làm 4 nhóm tuổi, đảm bảo số mẫu trong mỗi nhóm đạt ≥ 39 [25]:
Nhóm 1: 64 trẻ từ 1 ngày đến 28 ngày tuổi
Nhóm 2: 61 trẻ từ 1 tháng (≥ 29 ngày) đến < 2 tuổi
Nhóm 3: 74 trẻ từ 2 tuổi đến < 8 tuổi
Giới tính: nam và nữ tương đương nhau
Tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu bao gồm trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày đến 11 tuổi, đặc biệt là trẻ sơ sinh đủ tháng theo tiêu chuẩn của WHO (tuổi thai từ 37-42 tuần, cân nặng khi sinh > 2500g) Trẻ phải không có dấu hiệu mắc TSTTBS, RLPTGT (như sạm da, mất nước, bất thường ở bộ phận sinh dục), và gia đình không có tiền sử trẻ mắc các bệnh này Ngoài ra, trẻ không được sử dụng thuốc corticoid trong vòng 1 tháng và phải được sàng lọc qua phiếu điều tra Cuối cùng, trẻ và/hoặc gia đình cần cam kết tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ trong nghiên cứu bao gồm gia đình và trẻ không đồng ý tham gia, trẻ có dấu hiệu lâm sàng nghi ngờ mắc TSTTBS hoặc rối loạn phát triển giới tính, cũng như trẻ đã được chẩn đoán TSTTBS hoặc RLPTGT trong gia đình Những trẻ được điều trị bằng corticoid trong vòng 1 tháng trước khi lấy mẫu cũng sẽ bị loại trừ Mẫu của trẻ sơ sinh được thu thập tại Khoa Sản Bệnh viện Đa khoa tỉnh Vĩnh Phúc, trẻ dưới 2 tuổi tại trung tâm y tế xã hoặc phường, trẻ từ 2-5 tuổi tại các trường mẫu giáo, và trẻ từ 6-11 tuổi tại trường Tiểu học Kim Liên (Đống Đa – Hà Nội).
Khoảng 200 bệnh nhân nghi ngờ mắc rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh dẫn đến tình trạng TSTTBS và RLPTGT đã được các bác sĩ tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền chẩn đoán Các chẩn đoán này được thực hiện tại phòng khám và khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền của Bệnh viện Nhi Trung ương, cũng như tại khoa Phẫu thuật Nhi của Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
Tiêu chuẩn lựa chọn khi có một hoặc nhiều dấu hiệu sau:
Người bệnh TSTTBS: Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm dựa vào tiêu chuẩn của New MI công bố [3]
Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân bao gồm bộ phận sinh dục không rõ ràng, khó phân biệt giới tính do phì đại âm vật, môi lớn nhăn nheo và sẫm màu, không thấy tinh hoàn, cùng với lỗ đái thấp Ở trẻ nam, có dấu hiệu dậy thì sớm như dương vật phát triển nhanh, mọc lông mu, có mùi cơ thể và thay đổi giọng nói Cả nam và nữ đều có triệu chứng sạm da, mất nước, với biểu hiện da khô, thóp lõm, chậm hoặc không tăng cân, có thể giảm cân, nôn mửa và tiêu chảy.
Người bệnh rối loạn phát triển giới tính không do TSTTBS theo phân loại Chicago 2006 [118]:
Người bệnh có thể gặp các triệu chứng bất thường ở bộ phận sinh dục, bao gồm dương vật nhỏ, lỗ đái thấp, ẩn tinh hoàn, không có dương vật, bìu chẻ đôi và có hình dạng giống bộ phận sinh dục nữ Ngoài ra, những người có ngoại hình nam cũng có thể xuất hiện dấu hiệu nữ hóa như phát triển vú và có kinh nguyệt Đối với nữ giới, có thể có dấu hiệu bất thường như vô kinh tiên phát hoặc không có dấu hiệu dậy thì Một số người bệnh có thể có đặc điểm giới tính nam và nữ trên cùng một cơ thể.
Gia đình và/hoặc người bệnh nghi ngờ mắc TSTTBS và RLPTGT chấp thuận và ký phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu (phụ lục 1)
Các đối tượng nghiên cứu không đồng ý tham gia nghiên cứu
Người bệnh rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid mắc phải như Cushing, Addison, hội chứng Conn, khối u tuyến thượng thận.
Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu
- Máy sắc ký khí – khối phổ: GC 7890A –MS 5975 của hãng Agilent Cột sắc ký HP-5MS dài 30m, đường kính trong 0,25 mm, chiều dày film 0,25 àm (Agilent)
Máy hóa sinh tự động Beckman Coulter 2700 được sử dụng để định lượng creatinine trong nước tiểu và đo nồng độ các chất điện giải như natri, kali, và clo trong huyết tương, dựa trên nguyên lý sử dụng điện cực chọn lọc.
- Máy miễn dịch tự động Cobas e601 của hãng Roche dùng trong định lượng cortisol, ACTH, testosterone theo nguyên lý phản ứng miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA
- Manifold để tách chiết ở pha lỏng của steroid niệu sau thủy phân
- Máy lắc IKA vortex Genius 3
- Máy trộn Roller-Mixer của DAIHAN Scientific
- Máy Multivortex của THOMAS Scientific
- Cân phân tích CPA3235 của SARTORIUS để cân hóa chất cần pha
- Máy đo pH dung dịch ORION 3 STAR pH Benchop để đo pH dung dịch đệm acetat 2M dùng trong thủy phân steroid liên hợp trong nước tiểu
- Tủ sấy Manheim của Đức dùng tạo dẫn xuất steroid ở 80 0 C và 110 0 C
- Thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ để loại bỏ methanol trong mẫu sau khi rửa giải loại Dry block heater của Ratek
- Máy ly tâm, tủ lạnh 2-8 o C, -20 o C, pipette, tủ hút hóa chất
- Các trang thiết bị cần thiết trong phòng xét nghiệm: găng tay, khẩu trang
Hệ thống sắc ký khí – khối phổ Agilent, được sử dụng tại khoa Hóa sinh của Bệnh viện Nhi Trung ương, là thiết bị quan trọng cho nghiên cứu này.
2.2.2 Hoá chất và vật tư tiêu hao
Hóa chất định lượng steroid niệu gồm:
- Chất chuẩn steroid niệu (Standard steroid urine) dạng đông khô của SKML (Hà Lan), chứa nồng độ xác định các steroid cần định lượng như An,
Các chuẩn steroid như Et, DHEA, 11keto An, 11OH An, 11OH Et, PD, PT, A’3, THE, THF, 5a-THF, α-cortolone, β-cortolone, α-cortol và β-cortol được sử dụng trong quá trình định lượng steroid Việc xây dựng đường chuẩn này giúp tính toán nồng độ steroid niệu trong mẫu thử một cách chính xác.
- Steroid tinh khiết (pure steroid của Steraloids/Sigma): các steroid tinh khiết
99% được áp dụng để xác định thời gian lưu và các mảnh ion đặc hiệu nhằm phân tích các steroid niệu trong mẫu thử Các steroid tinh khiết được sử dụng bao gồm An, Et, DHEA, 11-OH An, PD, PT, THE, THF, và 5α-THF.
Chuẩn nội Androstanol (5α-ANDROSTAN-3β-OL) của IsoSciences, dạng đông khô với trọng lượng 100mg (mã hóa chất 14283), được sử dụng để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình xét nghiệm Sau khi pha chế với methanol, chuẩn nội này được thêm vào mỗi mẫu thử với một lượng như nhau.
- Acid acetic bình dung tích 2,5L của Merck loại đậm đặc 100% dùng để pha dung dịch đệm acetat 2M (mã số hóa chất 1.00063.2500)
- HCl (hydrochloric acid fuming 37%) của hãng Merck- sản xuất tại Đức Hóa chất dạng dung dịch, chai 1L, (mã hóa chất 1.00317.1000)
- Methanol dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức, (mã hóa chất
10909809 742) Dùng để hoạt hóa cột Bond Elut, rửa giải và pha chuẩn nội, steroid tinh khiết
- Enzym β-Glucuronidase/arylsulphatase của hãng KURA loại dung dịch 10mL hoặc 25mL để thủy phân steroid liên hợp
- Nitrogen có độ tinh khiết rất cao, mã số UN 1066, nồng độ ≥99,999% dùng làm khô sản phẩm steroid sau tách chiết
- Helium có độ tinh khiết cao, mã số UN 1046 dùng để sắc ký khí
- Methoxyamine hydrochloride độ tinh khiết 98%, lọ 5G dạng bột của hãng Sigma Aldrich, (mã 101397955) dùng để tạo dẫn xuất với steroid
- Pyridine dạng dung dịch chai 1L của hãng Sigma Aldrich có độ tinh khiết
≥99,5% (mã hóa chất 33553), sử dụng để pha methoxyamine
- Sodium acetate anhydrous dạng bột, loại 1000G của Merck dùng để pha đệm acetat 2M trong quá trình thủy phân steroid liên hợp
- Sodium -L-ascorbate (vitamin C), (mã hóa chất A4034), lọ 100G dạng bột của hãng Sigma Aldrich có độ tinh sạch ≥98% nhằm ổn định các steroid tự do
- Iso-octan dạng dung dịch 1L của hãng Sigma Aldrich dùng để tách chiết steroid sau khi đã thủy phân và tạo dẫn xuất
- TMSI (n-Trimethylsilylimidazole) dạng dung dịch, lọ 25mL của SUPELCO, sản xuất tại Hoa Kỳ, (mã hóa chất 33068U)
- Nước cất tinh khiết dành cho sắc ký: dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức dùng để pha hóa chất, chất chuẩn
Vật tư tiêu hao bao gồm: Lọ thủy tinh 2 mL có nắp, ống nghiệm thủy tinh chịu nhiệt loại 7mL và 10mL của Kimax hoặc Pirex
Cột Bond-Elut C18 dùng để tách chiết, tinh sạch các steroid tự do
Bảng 2.1: Các sản phẩm steroid niệu được định lượng
Steroid niệu Thời gian lưu (phút)
5α-THF 24,1 562 472 α-Cortolone 24,4 449 359 β-Cortol 24,5 343 243 β-Cortolone 24,8 449 359 α-Cortol 25,1 343 243
THS là steroid có trong mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để bán định lượng THS trong mẫu thử do mẫu chuẩn không có nồng độ cho THS
- Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khỏe mạnh và người bệnh nghi mắc TSTTBS, RLPTGT Yêu cầu của mẫu nước tiểu:
Không sử dụng chất bảo quản
Thể tích cần thiết > 3mL nước tiểu
Bảo quản: mẫu nước tiểu sau khi lấy được bảo quản tạm thời ở 2 - 8 o C tối đa được 2 tuần Bảo quản ở -20 o C đến khi phân tích (tối đa được 6 tháng)
Thời gian thu thập mẫu: 10/2015-7/2018.
Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả, cắt ngang
2.3.1 Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
2.3.1.1 Quy trình định lượng steroid niệu
Quy trình chuẩn bị mẫu hoàn toàn thủ công, được cải tiến dựa trên kỹ thuật của Honour JW Thời gian chuẩn bị mẫu ước tính khoảng 28 giờ trước khi được bơm tự động vào máy GC/MS.
A Chuẩn bị hoá chất, thuốc thử:
Để pha dung dịch chuẩn steroid niệu từ dạng đông khô, bạn cần thêm 15 mL nước cất vào lọ chuẩn, sau đó để ổn định trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, trộn đều dung dịch và chia nhỏ vào các ống eppendorf, mỗi ống 2mL, và bảo quản ở nhiệt độ -20 độ C.
Chuẩn bị hỗn hợp steroid tinh khiết:
Cân 8 mg mỗi loại steroid tinh khiết và ghi lại khối lượng chính xác Hòa tan trong bình định mức với 100 mL methanol, thực hiện thao tác trong tủ hút hóa chất Đặt hỗn hợp ở bể ấm 37 oC cho đến khi tan hoàn toàn và sau đó bảo quản ở -20 oC.
Chuẩn nội Androstanol: cân khoảng 10 mg chuẩn nội, hoà tan trong 100 mL methanol, thao tác thực hiện trong tủ hút hóa chất, bảo quản ở 4 o C
Chúng tôi thực hiện kiểm tra chất lượng (QC) bằng cách sử dụng mẫu nội kiểm tự chuẩn bị, do không có mẫu nội kiểm thương mại trên thị trường Mẫu nước tiểu của người khỏe mạnh được thu thập để tạo thành mẫu trộn bình thường, trong khi mẫu nước tiểu của bệnh nhân mắc TSTTBS đã được chẩn đoán xác định được sử dụng làm mẫu trộn bệnh lý Các mẫu trộn này được chia nhỏ thành từng ống 3 mL và được bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
The External Quality Assessment (EQA) materials from SKML (Stichting Kwaliteitsbewaking Medische Laboratoriumdiagnostiek) in Nijmegen, Netherlands, are utilized in the international UCLH Urine Steroid Profile External Quality Assessment Scheme organized by University College London Hospitals in the UK This program involves participation from 28 laboratories worldwide, with each assessment cycle comprising 12 freeze-dried samples, allowing for one sample to be tested each month.
Đệm acetat 2M với pH từ 5,0 đến 5,2 được pha chế từ dung dịch acetat 2M và acid acetic 2M theo thể tích nhất định Việc đo và điều chỉnh pH là cần thiết để tối ưu hóa hoạt tính của enzym thủy phân steroid liên hợp.
Methoxyamine hydrochloride trong pyridine được chuẩn bị bằng cách cân 100 mg methoxyamine hydrochloride và hòa tan trong 3 mL pyridine để tạo thành dung dịch 3% Quá trình này cần được thực hiện trong tủ hút hóa chất để đảm bảo an toàn.
Ascorbate: pha 10 mg/1mL nước cất sử dụng ngay mỗi lần phân tích
B Các bước chuẩn bị mẫu: thuỷ phân, tách chiết steroid niệu và tạo dẫn xuất
Để chuẩn bị mẫu nội kiểm và ngoại kiểm cùng với chất chuẩn và mẫu bệnh, hãy cho vào mỗi ống thủy tinh loại 10mL đệm acetat các thành phần sau: mẫu bệnh phẩm, chuẩn nội, enzym glucuronidase/sulphatase, và ascorbate đã được pha chế.
Để thủy phân steroid liên hợp, cần trộn đều các mẫu và sử dụng enzym β-glucuronidase/arylsulfatase Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 37°C qua đêm Cuối cùng, thực hiện ly tâm mẫu ở tốc độ 4000 rpm trong 5 phút.
Bảng 2.2: Cách thức tiến hành định lượng steroid niệu Ống Loại mẫu Thể tích mẫu
Chuẩn nội Đệm acetat Enzym Ascorbate
2 Steroid tinh khiết 0,2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
3 Mẫu trộn bình thường 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
4 Mẫu trộn bệnh lý 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
Để tách chiết steroid tự do bằng cột Blond – Elut C18, đầu tiên, đánh số các cột và đặt lên manifold Tiếp theo, cho 3mL methanol vào mỗi cột để kích hoạt Sau khi methanol đã chảy hết, rửa sạch cột bằng 5mL nước cất tinh khiết Sau đó, đưa bệnh phẩm đã thủy phân steroid vào cột và chờ cho đến khi chất lỏng chảy xong Cuối cùng, rửa sạch cột bằng 3mL nước cất và tách lấy steroid tự do bằng cách cho 3mL methanol vào mỗi cột.
Làm khô dung dịch methanol chứa steroid bằng thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ ở 70 o C
Tạo dẫn xuất với methoxyamin: cho 100 μL methoxyamin/pyridin 3% đã pha, votex và ủ ở 80 o C trong 1,5 giờ
Tạo dẫn xuất silyl: cho 100 μL TMSI votex rồi ủ ở 110 o C trong 3,5 giờ
Tách chiết bằng iso – octan thu được mẫu để phân tích trên GC/MS: cho
400 μL HCl 1M và 600 μL iso-octan, votex 10 phút, để lắng tự nhiên rồi hút dịch nổi vào glass-insert là mẫu để phân tích trên hệ thống GC/MS
C Phân tích steroid bằng hệ thống GC/MS sau chuẩn bị mẫu
- Sử dụng hệ thống GC 7890A –MS 5975 (Agilent), cột sắc ký HP-5MS, bơm bằng bơm tự động Agilent 7693 Chương trình nhiệt độ lò cột từ 180 đến
Nhiệt độ 300 độ C được duy trì trong 30 phút, với tốc độ dòng khí heli là 1 mL/phút Các steroid được rửa giải và phát hiện thông qua phương pháp quang phổ khối SIM (giám sát ion chọn lọc), sử dụng ion đặc hiệu cho từng steroid cần xác định.
Để xây dựng đường chuẩn, cần phân tích mẫu chuẩn với nồng độ 16 sản phẩm steroid đã biết, song song với mẫu bệnh nhân và mẫu nội kiểm, ngoại kiểm Mỗi chất phân tích sẽ có đường chuẩn riêng, được thiết lập dựa trên nồng độ các steroid trong mẫu chuẩn Sau khi hoàn thành việc thiết lập đường chuẩn cho từng steroid cần đo lường, phần mềm ChemStation sẽ được sử dụng để xác định nồng độ steroid trong mẫu thử, mẫu nội kiểm và mẫu ngoại kiểm.
Mẫu steroid tinh khiết được sử dụng như một mẫu chuẩn để xác định thời gian lưu của các steroid trong các mẫu chuẩn và mẫu bệnh.
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Thực nghiệm xác định giới hạn định lượng (LoQ) được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn pha loãng 5 lần ở 5 nồng độ khác nhau Mục tiêu là xác định giới hạn nhỏ nhất mà mỗi steroid có thể phát hiện được Mỗi dung dịch chuẩn pha loãng sẽ được đo lặp lại 4 lần trong một mẻ chạy để tính toán giá trị chính xác.
SD và CV Giới hạn định lượng là nồng độ chất chuẩn ở mức thấp nhất được phát hiện mà CV ≤ 20% giữa các lần phân tích
Thực nghiệm đánh giá độ lặp (precision):
Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích hai mẫu nước tiểu, bao gồm mẫu bình thường và mẫu bệnh lý, thực hiện 20 lần trong cùng một ngày.
- Độ tái lặp được đánh giá bằng cách phân tích hai mẫu nước tiểu bình thường và bệnh lý > 20 lần trong > 20 mẻ phân tích khác nhau
Phân tích và xử lý số liệu
Mục tiêu của thẩm định phương pháp là tính toán giá trị trung bình (X), độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) nhằm đánh giá độ chụm của kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS thông qua phần mềm Excel Đồng thời, việc đánh giá sự tương quan và tương đồng giữa kết quả ngoại kiểm của phòng xét nghiệm với giá trị trung vị của các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm sẽ được thực hiện bằng phần mềm Method Validator.
Mục tiêu của nghiên cứu là thiết lập giá trị tham chiếu cho nồng độ steroid niệu ở trẻ sơ sinh bằng phương pháp GC/MS, sử dụng phần mềm IBM SPSS 22.0 để phân tích dữ liệu Kết quả cho thấy sự phân bố nồng độ steroid niệu không tuân theo quy luật Gaussian, do đó, phương pháp thống kê phi tham số được áp dụng để xác định khoảng tham chiếu cho từng chất phân tích Sau khi loại bỏ các giá trị ngoại lai, khoảng tham chiếu được thiết lập dựa trên giá trị thấp nhất và cao nhất của 95% phân bố, từ phân vị thứ 2,5 đến 97,5.
Mục tiêu chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp steroid ở trẻ em là phát hiện các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán TSTTBS và RLPTGT dựa trên khoảng tham chiếu đã được xây dựng cho nhóm chứng.
- Giá trị p