(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu khu hệ nấm rễ và đánh giá tác động của việc sử dụng chế phẩm nấm rễ lên năng suất và chất lượng của cây thuốc bạch chỉ

Không phải tất cả các loài trong khu hệ nấm trong đất đều cộng sinh với tất cả nấm trong các loại nấm của rễ cây mà có loài trong khu hệ nấm ở rễ sẽ cộng sinh được với cây này nhưng loại

S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGH Ệ VIỆT NAM

VI ỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

ĐỖ HOÀNG HẢI

NGHIÊN C ỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

C ỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT

VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ (ANGELICA

LU ẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

HÀ N ỘI – 2015

VI ỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

ĐỖ HOÀNG HẢI

NGHIÊN C ỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

C ỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT

VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ ANGELICA

S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

HÀ N ỘI – 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

L ỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình

Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

TS Trần Thị Như Hằng người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên cứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Mai Hương và tập thể cán

bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các Hợp chất

thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,

những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi dào sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2015

Tác gi ả luận văn

Đỗ Hoàng Hải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận

văn này là hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị

nào Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các

thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./

Tác giả luận văn

Đỗ Hoàng Hải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG, BIỂU ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ 3

1.2 Phân loại khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ 4

1.2.1 Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza) 4

1.2.2 N ấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza) 6

1.2.3 N ấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) 8

1.3 Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ 8

1.4 Vai trò của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ đối với cây chủ 9

1.4.1 Tăng khả năng hấp thụ P và dinh dưỡng của cây trồng 10

1.4.2 Hình thành ch ất kích thích sinh trưởng 10

1.4.3 Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trường của cây tr ồng 11

1.4.4 Cải thiện môi trường xung quanh cây 12

1.4.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng 12

1.5 Những nghiên cứu và ứng dụng của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ 13

1.5.1 Trên th ế giới 13

1.5.2 Ở Việt Nam 14

1.6 Tình hình phát triển cây dược liệu ở Việt Nam [1] 16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.7 Cây bạch chỉ (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook

f.) 18

1.7.1 Tên khoa học 18

1.7.2 Ngu ồn gốc, phân bố 18

1.7.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái 19

1.7.4 S ản lượng cây 19

1.7.5 Ho ạt tính sinh học (Tác dụng dược lý) 19

1.7.6 Thành ph ần hóa học 21

1.7.7 Ho ạt chất imperatorin 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Đất và rễ cây Bạch chỉ 24

2.1.2 Hóa ch ất và thiết bị thí nghiệm 24

2.1.2.1 Hóa chất 24

2.1.2.2 Thiết bị phòng thí nghiệm 24

2.1.3 Môi Trường 25

2.1.3.1 Môi trường phân lập nấm vùng rễ 25

2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy, lên men và giữ giống 25

2.1.3.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 26

2.1.3.4 Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát khó tan 26

2.1.3.5 Môi trường đánh giá khả năng sinh IAA 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp phân lập 26

2.2.1.1 Thu thập mẫu 26

2.2.1.2 Phân lập các chủng nấm 27

2.2.2 Tuy ển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2.1 Xác định hoạt khả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng

nấm phân lập 27 2.2.2.2 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan của các chủng

nấm lựa chọn 28 2.2.2.3 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA)

của các chủng nấm lựa chọn 28 2.2.2.4 Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng nấm lựa chọn 29

2 2.3 Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử 29 2.2.4 X ác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm đã lựa chọn

30 2.2.4.1 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp của các chủng nấm

lựa chọn 30 2.2.4.2 Xác định khoảng pH môi trường nuôi cấy thích hợp của các

chủng nấm lựa chọn 30 2.2.4.3 Xác định khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp của các chủng

nấm lựa chọn 30

2.2.5 T ạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm .31

2.2.5.1 Lên men các chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật 31 2.2.5.2 Quy trình phối trộn tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm 32

2.2.6 Th ử nghiệm chế phẩm trên cây bạch chỉ 32

2.2.6.1 Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ 32 2.2.6.2 Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến hàm lượng chất

imperatorin của rễ củ cây bạch chỉ sau khi thu hoạch 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập các chủng nấm 38 3.2 Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử

nghiệm 38

3.2.1 Kh ả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng nấm phân lập 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.2 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm

l ựa chọn 39

3.2.3 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA) của các ch ủng nấm lựa chọn 40

3.2.4 Xác định khả năng đối kháng của các chủng nấm lựa chọn 42

3.3 Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử 42

3.4 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm lựa chọn để tạo chế phẩm 44

3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường lên men 44

3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men 46

3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men 47

3.5 Tạo chế phẩm thử nghiệm 48

3.6 Thử nghiệm chế phẩm 49

3.6.1 Tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ 49

3.6.2 Tác động của chế phẩm đến hàm lượng chất imperatorin của rễ c ủ cây bạch chỉ sau khi thu hoạch 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1 KẾT LUẬN 63

4.2 KIẾN NGHỊ 64

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN VĂN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

TIẾNG VIỆT 66

TIẾNG ANH 67

TRANG WEB 71

PHỤ LỤC 72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH M ỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1: Nấm rễ ngoại cộng sinh 6

Hình 1.2: Nấm rễ nội cộng sinh 7

Hình 1.3: Cây bạch chỉ 18

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Imperatorin 22

Hình 2.1: Quy trình lên men tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm 22

Hình 2.2: Quy trình sản xuất chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm 32

Hình 2.3: Phổ UV-VIS của chất chuẩn imperatorin 37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH M ỤC BẢNG, BIỂU

Bảng 3.1: Kết quả khả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng nấm 39

Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm lựa chọn .40

Bảng 3.3: Khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng nấm lựa chọn 41

Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp IAA thô và phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm lựa chọn 41

Bảng 3.4: Kết quả đối kháng của các chủng nấm lựa chọn 42

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường lên men đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm lựa chọn 45

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường lên men 45

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm lựa chọn 46

Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của pH môi trường lên men 47

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm lựa chọn 47

Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của thời gian lên men 48

Bảng 3.8: Giai đoạn phát tiển của cây bạch chỉ 49

Biểu đồ 3.4: Động thái tăng trưởng chiều cao 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Biểu đồ 3.5: Động thái tăng trưởng số lá 50

Biểu đồ 3.6: Động thái tăng trưởng về đường kính tán 51

Biểu đồ 3.7: Động thái tăng trưởng chiều dài rễ củ 52

Biểu đồ 3.8: Động thái tăng trưởng đường kính rễ củ 52

Bảng 3.9: Đánh giá năng suất rễ củ bạch chỉ 54

Bảng 3.10: Kết quả xác đinh hàm lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu BC1 55

Bảng 3.11: Kết quả xác đinh hàm lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu BC2 56

Bảng 3.12: Kết quả định lượng imperatorin trong cao chiết MeOH của mẫu BC1 và BC2 56

hệ sợi ra vùng đất bao quanh rễ và lan dần ra xung quanh, nhờ đó làm tăng

khả năng hấp thu dinh dưỡng, nước của hệ rễ và đồng thời làm thay đổi cấu trúc đất theo chiều hướng có lợi Vì những vai trò ý nghĩa thiết thực của mình nên hình thức cộng sinh này đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông - lâm nghiệp ở nhiều nước trên toàn thế giới

Việt Nam là một nước có diện tích đất trồng trên cạn rất lớn Tuy nhiên

với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học với mục đích khai thác, chạy theo năng suất và chất lượng đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh

một số dịch hại không dự báo trước Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng phân bón hữu cơ, chế phẩm sinh học đặc biệt là chế phẩm nấm rễ trong canh tác nhằm nâng cao năng suất,

chất lượng cây trồng, duy trì và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là

vấn đề cấp bách cần được quan tâm hiện nay

Bên cạnh các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các cây nông, lâm nghiệp thì việc nghiên cứu tăng năng suất, chất lượng thảo dược cũng như

nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển những loài thảo dược quí có tiềm

năng là vấn đề cần được quan tâm đặc biệt Thảo dược thường có mặt ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các khu vực nhiệt đới Thảo dược hiện đang đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp chữa bệnh bằng y học cổ truyền tại các nước phương Đông Thảo dược không những mang đến các nguồn lợi về dược

học cho cộng đồng dân cư sinh sống tại những nơi đó mà còn đóng góp vào các liệu pháp chữa bệnh cho cộng đồng ở những khu vực khác Việt Nam nổi tiếng với nguồn thảo dược phong phú, tuy nhiên việc nghiên cứu tăng sản lượng cũng như chất lượng của thảo dược, đặc biệt là từ các chế phẩm nấm rễ chưa được quan tâm nhiều Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm rễ trên cây thảo dược là một hướng đi mới mẻ và vô cùng cấp thiết Xuất phát từ những lý do và yêu cầu thực tiễn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

c ứu khu hệ nấm rễ và đánh giá tác động của việc sử dụng chế phẩm nấm

rễ lên năng suất và chất lượng của cây thuốc bạch chỉ (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook f.).”

M ục tiêu nghiên cứu: Xác định được tác động của chế phẩm nấm rễ

lên năng suất và hàm lượng imperatorin của cây thuốc Bạch chỉ (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook f.)

N ội dung nghiên cứu:

 Khảo sát khu hệ nấm rễ của cây bạch chỉ: Phân lập và phân loại một

số chủng nấm rễ

 Tạo chế phẩm vi sinh

 Thử nghiệm chế phẩm trên cây bạch chỉ:

 Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ

 Nghiên cứu động thái hàm lượng chất imperatorin của cây bạch

chỉ sau khi thu hoạch

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ

Nấm cộng sinh là một loại nấm có ích, giữa các sinh vật trong tự nhiên đều có mối liên quan với nhau, ảnh hưởng lẫn nhau, tạo thành rất nhiều quần

xã sinh vật Trong mối quan hệ đó, thường có quan hệ cộng sinh là cả hai loài cùng sống chung và cùng tồn tại Khi mối quan hệ đó phát triển đến một mức cao thì hình thành một loại cộng sinh Đặc biệt về mặt sinh lí thì cũng có sự khác biệt với những loài không cộng sinh

Việc tìm hiểu nấm cộng sinh ngày càng rộng rãi và sâu sắc hơn đặc biệt

là vào giữa thế kỉ XX Thực chất, khu hệ nấm cộng sinh trong đất cộng sinh

với khu hệ nấm trong rễ cây Sự cộng sinh giữa khu hệ nấm và rễ cây mang

lại lợi ích cho cả hai bên, khu hệ nấm nhận được từ cơ thể thực vật các chất dinh dưỡng còn thực vật nhận được từ khu hệ nấm các chất dinh dưỡng khác

và nước Không phải tất cả các loài trong khu hệ nấm trong đất đều cộng sinh

với tất cả nấm trong các loại nấm của rễ cây mà có loài trong khu hệ nấm ở rễ

sẽ cộng sinh được với cây này nhưng loại này chưa chắc đã cộng sinh với các loài cây khác Ví dụ: Nấm vòng mật (Armillariella) và nấm sợi hạch (Rhizoctonia) cộng sinh với các cây họ Lan nhưng lại gây bệnh với cây gỗ

Cho nên các tác giả cho rằng hiện tượng cộng sinh của nấm rễ là một trạng thái cân bằng giữa một kẻ “tấn công” và một bên “phòng thủ” Người ta dự đoán trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm rễ Theo thống

kê của Trappe (1962) có 535 loài nấm thuộc 81 chi, 3 họ, 10 bộ nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau [38]

Nấm rễ - Mycorrhiza là nấm cộng sinh với rễ cây Thuật ngữ này được Frank sử dụng đầu tiên năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và

rễ cây thông cũng như đối với một số cây lá rộng khác Bắt nguồn từ chữ Hy Lạp “Mykes” có nghĩa là nấm và “Rhiza” có nghĩa là rễ, tạo thành Mycorrhiza (nấm rễ) [15] Nấm nội sinh ở rễ cây nên được gọi là nấm rễ, cây mang nấm được gọi là rễ - nấm Rễ cây có nấm cộng sinh đã được phát hiện trong các cây hóa thạch họ Quyết có độ tuổi khoảng 400 triệu năm [15,16,17]

Các loài nấm cộng sinh trong khu hệ nấm phần lớn thuộc bộ nấm Tán,

nấm tán đỏ, nấm gan bò, nấm mỡ, nấm bụng, nấm cổ ngựa

1.2 Phân loại khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ

Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại:

nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh Ngoài ra, còn có một số loại khác

1.2.1 Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza)

Nấm rễ ngoại cộng sinh thường kết hợp với cây rừng, trong khi đó nấm

rễ nội cộng sinh thường liên kết với thực vật thân cỏ Sự kết hợp này xảy ra trong đất, cát, trong các lĩnh vực trồng trọt, và được tìm thấy có liên quan với các loài cây tự nhiên và đại diện cho điều kiện sinh thái khác nhau Trong đất rhizospheric các loại nấm rễ cộng sinh (nấm AM) tồn tại dưới dạng bào tử

hậu, bào tử tiếp hợp và bào tử đơn

Nấm rễ ngoại cộng sinh là nấm có sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa hóa gỗ, không xuyên qua các tế bào mô rễ mà chỉ kéo dài giữa các tế bào Đặc trưng cơ bản của chúng là:

 Trên bề mặt rễ dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi nấm đan chéo nhau

 Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợi nấm sinh trưởng mà thành

 Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn, to, giòn và có màu sắc khác nhau, tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéo

dài ra

Nhìn chung, nấm rễ ngoại cộng sinh có hình dạng và màu sắc nhất định rất dễ nhận biết bằng mắt thường Tính đa dạng của chúng biểu hiện rất khác nhau ở mỗi cây chủ Rất khó xác định có bao nhiêu loài nấm rễ ngoại cộng sinh trong khu hệ nấm cộng sinh Guo Xiuzhen và cộng sự đã phát hiện 140 loài, danh sách các loài, chi, họ, nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể quả trên mặt đất như nấm gan bò (Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm

tán đỏ (Russula), nấm da (Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma),

nấm cổ ngựa đậu màu (Poisolithus)… [12]

Trong các loài cây có hoa gồm cả cây gỗ và cây bụi thì có tới 3% trong

số đó có khu hệ nấm vùng rễ, hầu hết là nấm ngoại cộng sinh, trong đó có các cây như họ Long não (Lauraceae)

Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh:

Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào

biểu bì rế ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển

Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành

lớp phủ dày đặc trên bề mặt rễ

Hình 1.1: N ấm rễ ngoại cộng sinh

1.2.2 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza)

Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ

Do đó, các đặc trưng của nấm nội cộng sinh là đối lập với nấm ngoại cộng sinh như:

 Không hình thành màng ở bề mặt rễ mà chỉ có các sợi nấm lưa thưa Tuy nhiên, thể sợi nấm kéo dài giữa các khoảng gian bào, nhưng không hình thành mạng lưới Hartig

 Sợi nấm xuyên qua vách tế bào vào trong tạo thành vòi hút

 Nấm rễ nội cộng sinh thường khó nhận biết bằng mắt thường Dựa vào kết cấu sợi nấm có vách ngăn và vòi hút, người ta chia nấm

nội cộng sinh thành 2 loại:

 Có vách ngăn (Septate - endotrophic mycorrhiza): Dựa vào cây chủ

và hình dạng sợi nấm trong tế bào được chia làm 2 nhóm như sau:

+ Nấm rễ loại Đỗ quyên (Ericaceous mycorrhiza) có sợi nấm dạng xoắn

vòng (Coil)

+ Nấm rễ loại Họ Lan (Orichidaceus mycorrhiza) thì có sợi nấm dạng

kết thắt nút (Knot) hoặc cục (Peloton) trong tế bào

 Không có vách ngăn (Aseptate - endotrophic mycorrhiza): Thường

có dạng túi bóng (Vesicular) và dạng chùm (Vesicular- Arbuscular

mycorrhiza) gọi tắt là VA Nấm VA thuộc ngành phụ nấm Tiếp hợp

(Zygomycotina), l ớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes)

So với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rất ít loài Năm 1989, chỉ

mới phát hiện 133 loài VA [40]

Con đường xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh:

Giai đoạn 1: Thiết lập điểm tiếp xúc và phát triển dọc theo bề

mặt của rễ

Giai đoạn 2: Một hoặc nhiều sợi nấm hình thành chỗ phồng thâm

nhập vào tế bào biểu bì hoặc tế bào vỏ để vào rễ

Hình 1.2: N ấm rễ nội cộng sinh

1.2.3 N ấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza)

Nấm rễ nội ngoại cộng sinh có đặc trưng của cả 2 loại trên Chúng

thường có ở các rễ cây thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ

quyên quả mọng (Arbutus) và các cây thuộc chi Nhất hướng khiêm (Monotropastrum)

1.3 Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ

Do sự chọn lọc và tính thích nghi, phạm vi tồn tại cây chủ khác nhau

Vì thế, một số loài nấm của khu hệ nấm trong đất chỉ cộng sinh với một số

loài trong khu hệ nấm trong rễ chứ không phải tất cả khu hệ nấm trong đất sẽ

cộng sinh với tất cả khu hệ nấm trong rễ Năm 1995, Tian Chengming chia ra

những loài sống trên 5 loại cây khác nhau gồm 10 loài thuộc họ Amanita,

Cantharenlus; những loài sống trên 2-3 loại cây như Boletus, Ramaria, chỉ

sống trên một loại cây có Suilus, Russula [37]

Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng

mọc đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần

Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hoá

khác nhau Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông,

vân sam, lãnh sam) Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng

(Hymenogaster Albellus) chỉ có ở cây bạch đàn

Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũng

chọn nấm thích hợp Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau

của khu hệ nấm vùng đất và rễ để hình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một

loài cây có rất nhiều loại nấm cộng sinh Có nhiều loài cây như Thông 5 lá,

Dương, Bạch đàn không có tính chuyên hóa cao đối với nấm rễ Bạch đàn Úc

tự nhiên đã thu thập được 400 loài nấm cộng sinh trên 81 chi Bạch đàn [5]

Ngược lại, có nhiều loài nấm rễ trong khu hệ nấm vùng rễ có tính chuyên hóa rất mạnh, như nấm ngoại cộng sinh trên họ cây Long não Nếu như nấm Cổ Ngựa hạt đậu cấy lên cây con giâm hom không hình thành rễ -

nấm [31]

Nhiều nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan đều mở rộng nghiên cứu về khu hệ nấm cộng sinh vùng nấm rễ với họ cây Long não - loài cây tượng trưng cho rừng mưa nhiệt đới Chủ yếu là nấm

mỡ sáp (Laccaria laccuta) và nấm Cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm Cổ

ngựa đậu mùa [18] Những loài cây khác nhau, các giai đoạn khác nhau phát triển khác nhau, loài nấm cộng sinh cũng không hoàn toàn như nhau, nói chung những cây rừng non lượng rễ-nấm rất ít, rừng già trưởng thành số loài chiếm nhưng rừng già lại rất ít Quần thể nấm rễ thường thay đổi: nấm Boletus

và Amanita thay thế dần nấm Cổ ngựa vỏ cứng và chiếm dần ưu thế, cuối cùng

là nấm ngoại cộng sinh thay thế [18] Không những thế chúng biểu hiện sự giao thoa nhau Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do đặc tính sinh lí

của cây ở các giai đoạn khác nhau

1.4 Vai trò của khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ đối với cây chủ

Nấm rễ có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của thực vật ở cạn, chúng có vai trò thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu trình vật

chất, năng lượng trong tự nhiên

Nấm rễ là thể sống cộng sinh bắt buộc Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau Nấm sử dụng nguồn cacbon từ

thực vật dưới dạng đường hexoses và các vitamin Sự vận chuyển cacbon từ

thực vật sang nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào

Tại các sợi nấm nội bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipit… cho hoạt động của nấm Gần 20% cacbon do

thực vật tổng hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc

từ thực vật được nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu cơ trong đất

1.4.1 Tăng khả năng hấp thụ P và dinh dưỡng của cây trồng

Cây chỉ có thể hấp thụ P ở dạng hòa tan Trong khi đó, các dạng P không tan chiếm tới 1/3-1/2 thậm chí 95-99% lượng P tổng số Trong các vấn đề sinh thái và nông nghiệp sự cộng sinh giữa khu hệ nấm trong đất và rễ rất quan

trọng, cây lấy phốt pho chủ yếu từ các loài nấm của khu hệ nấm trong đất và

rễ AM được coi là mạng lưới của trao đổi phốt pho

Nấm rễ ngoại cộng sinh có khả năng sản sinh photphotaza chuyển P không tan thành P hòa tan, cung cấp cho cây trồng Hoạt tính của enzyme này

ở cây có khu hệ nấm rễ tăng gấp mấy lần so với cây không có khu hệ nấm rễ Ngoài ra nấm rễ ngoại cộng sinh thể sản sinh muối oxalat kết hợp với Fe, Al,

muối P không tan trong đất, từ đó làm tăng khả năng hút P của rễ cây Bên

cạnh việc tăng khả năng hấp thụ phốt pho thì khu hệ nấm trong đất và rễ cũng tăng cường cải thiện hấp thụ các chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng

nhất là tăng cường hấp thụ dinh dưỡng lân P (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được cung cấp nhờ nấm) [39] Sợi nấm có thể lan rộng đến 8cm quanh rễ và hấp thụ chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần Tốc độ thâm

nhập của P qua sợi nấm cao gấp 6 lần so với qua các lông rễ

1.4.2 Hình thành chất kích thích sinh trưởng

Năm 2002, theo Smith và Read trong quá trình cộng sinh với rễ cây, khu hệ nấm vùng rễ hình thành nhiều chất kích thích sinh trưởng như chất sinh trưởng tế bào (auxin), chất phân chia tế bào (citomdimin), chất mốc đỏ (gibberellins), vitamin B1, indole-3-acctic acid (IAA) Nhiều loài nấm cộng

sinh trong khu hệ nấm trong đất và rễ điều tiết ra những chất này trước và sau khi cộng sinh với cây [32]

1.4.3 Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trường của cây trồng

Nghiên cứu khu hệ trong đất và rễ đã trở thành một trong những lĩnh

vực quan trọng trong ngành khoa học môi trường hiện đại, từ những khía cạnh

cơ bản để ứng dụng trong nông nghiệp và trong việc phục hồi các hệ sinh thái

Arbuscular mycorrhiza (AM) là phổ biến nhất dựa trên sự cộng sinh

Nhiều nghiên cứu cho biết, sau khi nhiễm khu hệ nấm trong đất cho cây, cây chủ có khả năng chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, độ ẩm và pH

cực trị, đề kháng với kim loại nặng Năm 1993, Charest và cộng sự nhận thấy

nấm rễ AM giúp cây ngô chịu được lạnh giá và tăng khả năng thích nghi với đất ở pH thấp Khi trồng trên núi đá vôi tỷ lệ sống của cây con nhiễm khu hệ

nấm cộng sinh tăng 14% Trong điều kiện khô hạn tuyệt đối, khả năng chống

chịu cũng tăng lên

Nấm và thực vật có thể sống được trong môi trường có nhiệt độ lên tới

500C, nhưng với điều kiện chúng phải sống cùng nhau Các nhà nghiên cứu

đã tìm thấy kiểu cộng sinh như vậy xung quanh các suối nước nóng ở công viên Núi Lửa Lassen và công viên Quốc gia Yellowstone (Mỹ) Loài nấm này

là một thành viên chưa được biết tới trong một họ nấm cộng sinh lớn sống dưới mặt đất, thuộc chi Curvularia Chúng quấn quanh rễ của cây chủ - loài

cỏ tắc Dichanthelium lanuginosum chuyên cư ngụ trong các suối nước nóng Khi đưa chúng vào phòng thí nghiệm, Russell Rodriguez tại cơ quan nghiên

cứu địa chất Mỹ phát hiện thấy, không loài nào chịu được môi trường đất có nhiệt độ 50oC nếu chúng đứng độc lập Tuy nhiên nếu hai loài đó cộng sinh

với nhau, thì chúng có thể chịu được nhiệt độ lên tới 65oC trong những khoảng thời gian ngắn [34] Tuy nhiên cơ chế nào giúp chúng chịu được môi trường

nóng như vậy vẫn còn chưa sáng tỏ Các tác giả này phỏng đoán, có lẽ mạng lưới tế bào chằng chịt và rộng lớn của nấm có vai trò tản nhiệt quanh rễ của

thực vật, hoặc có thể cả hai loài này đã trao đổi những chất bảo vệ đặc biệt nào đó

1.4.4 Cải thiện môi trường xung quanh cây

Nhiều nghiên cứu điện tử chứng minh rằng chung quanh rễ những cây thông có nấm rễ xuất hiện tầng kết dính rộng gấp nhiều lần so với cây thông không có nấm rễ cộng sinh, tầng đó tạo ra khu trao đổi ion, làm cho bộ rễ tăng

khả năng hấp thụ ion và vận chuyển, có lợi cho sinh trưởng của cây

1.4.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng

Các nhà nghiên cứu cho rằng phát hiện sau khi bón nấm cộng sinh cho cây bạch đàn thì bệnh héo xanh do vi khuẩn (Pseuudomonas solanacerum

E.F.Smith) ít phát sinh hơn Các nghiên cứu (1968, 1982, 1994) cho thấy chúng có thể phòng trừ bệnh, tăng cường sinh trưởng cây con và làm giảm bệnh thối cổ rễ thông xuống 25% Các bệnh: tuyến trùng, mốc sương, bướu

rễ đều giảm đi rõ rệt [32]

Các nhà nghiên cứu Garsia-Garrido và Ocampo (1989), Akhtar và Siddiqui (2008) cho biết sự cộng sinh của nấm AM giúp cây trồng có khả năng

giảm được các bệnh do vi khuẩn gây ra và làm tăng khả năng kháng bệnh của cây

Năm 2000, Linder cho biết các lọa tuyến trùng gây bệnh ở rễ ít hơn khi cây cộng sinh với nấm AM nhưng có sự cạnh tranh về thức ăn và không gian

giữa AM và tuyến trùng

Năm 2004, Dalpe và Monreal nhận thấy rằng nấm AM sinh ra các kháng sinh làm chết vi sinh vật giúp cây kháng bệnh

1.5 Những nghiên cứu và ứng dụng của khu hệ nấm cộng sinh trong đất

và rễ

1.5.1 Trên thế giới

Khảo sát khu hệ nấm cộng sinh đã được thực hiện ở các nơi khác nhau trên thế giới từ rất lâu, các tiểu bào của nấm cộng sinh có khả năng ảnh hưởng

tới các quá trình của hệ sinh thái, chúng có khả năng xác định quần xã thực

vật và đem lại trạng thái phát triển khác nhau trong cùng một loài cây

Người nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh: J.M Jase (1897) tìm được

69 loài nấm nội cộng sinh, trên 75 loài cây rừng vùng rừng núi Gunnung Gedeh cao 1400-1800m so với mặt nước biển Năm 1980 và 1986, T Ingestad

và M Hahr đã nghiên cứu thành công cùng với làm tăng sinh trưởng cây gỗ,

khả năng cố định N cũng được nâng cao

Dalvis (1942) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm trong rễ thực

vật Marx (1972) và Leizengfu (1982) đã nghiên cứu tác dụng chống chịu

bệnh của nấm ngoại cộng sinh Kết quả cho thấy nấm ngoại cộng sinh chống

và trị bệnh rõ rệt [26]

Mặc dù đã được nghiên cứu từ rất lâu nhưng thuật ngữ nấm cộng sinh được Frank sử dụng đầu tiên năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm

và rễ cây thông cũng như đối với một số cây lá rộng khác [15]

Các nhà nghiên cứu như Lakshman và Raghavendra (1990), Salveraj

và Subranamian (1990) đã tiến hành khảo sát nấm AM trong cây thuốc trên các vùng địa hình của Ấn Độ [25]

Trong những năm vừa qua, nhiều nước đã nghiên cứu ứng dụng khu hệ

nấm cộng sinh trong rễ thông, bạch đàn và nhiều loài cây gỗ khác đã thu được

kết quả rõ rệt Nhiều chương trình hợp tác nghiên cứu về nấm cộng sinh trong

rễ giữa các nước Những năm thập kỉ 90, nhiều nước đã mở rộng các cuộc hội

thảo về nấm cộng sinh Tháng 11/1994, hội nghị quốc tế gồm 6 nước: Australia, Indonesia, Thái Lan, Philipin, Trung Quốc và Việt Nam đã xuất bản

36 bản báo cáo về nấm trong rễ cộng sinh cây rừng ở Châu Á (Mycorhiza for Plantation Forestry in Asia)

Theo Zao Huiun (1995) trong điều kiện khô hạn, nhiệt độ cao, độ pH

thấp đã bón nấm cộng sinh cho cây con mới trồng 10cm3/hố, tưới nước rồi thêm chất dinh dưỡng, kết quả cho thấy hiệu quả tăng gấp đôi so với đối

chứng [44]

Năm 1997, Simard và cộng sự đã nghiên cứu và thấy rằng những hệ sợi

nấm liên kết các nhóm cây khác nhau dưới một điều kiện sinh thái có lợi để trao đổi khoáng chất và các nguồn dinh dưỡng [35]

Năm 2001, Zhao và cộng sự đã phát hiện Các hệ thống rễ cây dưới hệ sinh thái rừng tự nhiên bị chi phối bởi các loài thực vật hạt kín được liên kết

bởi sự trú ngụ đa dạng của sợi nấm [44]

Guadarrama & Alvarez-Sanchez (1999), Bohrer & Amon (2004) đã quan sát thấy rằng sự xâm nhập của nấm trong đất vào trong rễ cây biến động theo mùa có liên quan chặt chẽ với cây hậu thực vật học Trong các nghiên

cứu hiện nay người ta thấy rằng số lượng bào tử lớn nhất là ở mùa mưa [13,18]

Năm 2011, Tejavathi và cs đã nghiên cứu và có những báo cáo về sự tương quan giữa phần trăm sự xâm nhập của nấm trong đất vào rễ và sự phát triển của cây trong Andrographis paniculata [36]

Gần đây, Maman Turjaman (Ấn Độ) đã nghiên cứu VA dạng viên (Mycobead) bón cho cây con thông nhựa P.merkussi ; Puspa (Indonesia)

nghiên cứu vai trò của Nấm Glomus fasciculatum cho cây họ đậu…

1.5.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ cây cũng đã được tiến hành trong các nghiên cứu Qua các nghiên cứu cũng đã

cho thấy những kết quả khả quan về vai trò của khu hệ nấm đối với cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng

Trong một số nghiên cứu của Phạm Quang Thu và Đặng Như Quỳnh (2001-2004) [6], nghiên cứu sự hình thành rễ- nấm ở cây chủ bạch đàn trong nuôi cấy in vitro Đã cho thấy: khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ của bạch đàn có khoảng hơn 400 loài Đây là lợi thế đối với loài cây này vì chúng được trồng khá phổ biến trên những lập địa hóa, nghèo dinh dưỡng Tuy nhiên, không

phải lúc nào khu hệ nấm cộng sinh cũng có sẵn trong đất thích hợp với cây bạch đàn Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm cho cây bạch đàn con ở vườn ươm nhằm mang lại hiệu quả cộng sinh cao cho bạch đàn là việc làm cần thiết Từ đó góp phần chủ động tạo ra nguồn nấm cộng sinh cho bạch đàn

Năm 2006, Nguyễn Thị Minh đã phân lập được nấm Gigaspora sp.1 và Glomus sp.2 để xử lý cho cây trồng ở phía Bắc Nấm có kích thước trong khoảng từ 100-400µm, bào tử màu trắng đến nâu Nấm là tăng sinh trưởng cây trồng và giúp cây thích nghi với môi trường

Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường (2007), nghiên cứu sự đa dạng nấm

cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì [7]

Nguyễn Minh Châu, Lê Quốc Huy [5] đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dưới dạng viên nang, đánh giá hiệu quả cộng sinh của chế phẩm dạng viên nang với cây sao đen (Hopea odorata) trong vườn ươm và ngoài đồng ruộng Kết quả cho thấy chế phẩm ECM áp dụng cho vườn ươm và trồng rừng, bước đầu cho thấy, có tác dụng làm tăng sinh trưởng của cây chủ trong vườn ươm từ 250-280% so với đối chứng là 130-170% ở rừng trồng

Trần Thị Dạ Thảo đã nghiên cứu sự cộng sinh của nấm Mycorrhiza trên

rễ có khả năng rất lớn trong việc tiết kiệm nước, tăng hấp thu dinh dưỡng và tăng năng suất cây trồng [9]

Gần đây, trường Đại học Lâm nghiệp hợp tác với việc Lâm Nghiệp nhiệt đới Trung Quốc thực hiện một loạt các vấn đề nghiên cứu về khu hệ nấm

cộng sinh phục vụ chi chương trình trồng 5 triệu ha rừng

Năm 2012, Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên trong khuôn khổ của đề tài nghị định thư với Hungary đã tạo được chế phẩm nấm rễ NR-SH Chế phẩm này bao gồm các chủng nấm rễ lựa chọn

của Việt Nam và Hungary an toàn cho người, động vật và cây trồng Chế phẩm này đã được sử dụng trên một số cây trồng nông nghiệp và cây thuốc Trên các cây nông nghiệp (lúa, cà chua, khoai tây) cho kết quả tốt làm tăng năng

suất của cây lên từ 10-30% so với đối chứng Đặc biệt khi thử nghiệm trên cây khoai tây, chế phẩm nấm rễ có xu hướng kích thích tạo củ do đó làm tằn

tỷ lệ củ to, giảm tỷ lệ củ nhỏ và củ trung bình so với đối chứng không xử lý

chế phẩm Trên cây thuốc bước đầu chế phẩm cũng có tác dụng rõ rệt, làm tăng chiều dài thân rễ và trọng lượng củ của cây thuốc bạch chỉ và địa liền so với đối chứng, làm tăng hàm lượng chất crotonkin-1 (ent-18-axetoxy-7β- hydroxykaur-16-en-15-on) của cây khổ sâm so với đối chứng

1.6 Tình hình phát t riển cây dược liệu ở Việt Nam [1]

Trong số hơn 12.000 loài thực vật ở Việt Nam, có gần 4.000 loài cho công dụng làm thuốc Trong đó, có nhiều loài dược liệu quý về công dụng

chữa bệnh lẫn giá trị về mặt kinh tế

Cả nước hiện có trên 130 loài cây thuốc đang được trồng và mỗi năm cung cấp cho thị trường khoảng 15.600 tấn Trong khi nhu cầu trong nước là 59,548 tấn/năm gồm: phục vụ công nghiệp dược 20.110 tấn, hệ thống chữa

bệnh bằng y học cổ truyền (YHCT) 18.452 tấn và xuất khẩu 20.986 tấn (đã

bao gồm cả số lượng phục vụ chưng cất tinh dầu và chiết xuất một số hợp chất tinh khiết)

Nhà nước đang nỗ lực cung cấp nguồn gen và giống cây thuốc cho công tác nghiên cứu và sản xuất như sau:

 Một số cây thuốc đã được đầu tư nghiên cứu bảo tồn và phát triển như: Bạch chỉ, Sâm ngọc linh, Thảo quả, Sa nhân, Sâm báo, Nhà nước còn

tổ chức đào tạo, tập huấn và truyền thông cho người dân để nâng cao nhận thức cũng như bảo tồn được tri thức bản địa về sử dụng các loài cây thuốc

chữa bệnh của cộng đồng dân tộc Việt Nam

 Nhà nước cũng đã đưa 120 loài cây thuốc vào bảo tồn tại các Vườn Quốc gia

Định hướng của nước ta là: Năm 2020, sẽ chủ động được 80% nguyên

liệu cho công nghiệp dược trong nước, sản xuất trên 2,500 sản phẩm đông dược Đáp ứng 90% nhu cầu dược liệu và thuốc từ dược liệu cho sử dụng ở các bệnh viện Giá trị sản xuất thuốc trong nước đến năm 2020 đạt trên 2,7 tỷ USD và đến năm 2030 đạt trên 4 tỷ USD

Thực hiện chính sách khuyến khích của Nhà nước, ở nhiều địa phương các công ty kinh doanh, các đơn vị nghiên cứu đã trực tiếp đầu tư xây dựng vùng trồng một số loài cây thuốc quý như: Sâm ngọc linh (Tỉnh Kon Tum và

Quảng Nam), Kim tiền thảo (Bắc Giang -Công ty OPC), …

Tình hình phát triển cây dược liệu nói chung và cây Bạch chỉ nói riêng

đã có những chuyển biến rõ rệt cả về số lượng và diện tích

1.7 Cây bạch chỉ (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook

Bạch chỉ được nhập nội từ Trung Quốc vào Việt Nam sau 1960, từ năm

1970 Bạch chỉ được trồng phổ biến ở Việt Nam [7]

Các vùng trồng để sản xuất dược liệu chủ yếu ở đồng bằng từ Nghệ An

trở ra các tỉnh phía Bắc và đều đảm bảo được tiêu chuẩn và chất lượng dược

liệu

1.7.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái

Bạch chỉ là cây thân thảo, sống nhiều năm, rễ thô to mọc thẳng, có lúc chia làm nhiều nhánh Thân to, tròn cao 1-2m, rỗng Cuống lá dài, bẹ to bọc

lấy thân, lá chia 2 đến 3 thùy Lá đơn hình trứng có cuống dài, mép có răng cưa Hoa hình tự tán kép, mọc ở ngọn cây hay nách lá Mỗi hoa tự hình tán có nhiều hoa nhỏ, không có tổng bao, 5 cánh hoa, 5 nhị đực mọc so le với cánh hoa Bầu hạ hai ngăn, 2 vòi hoa Quả dẹt, hình bầu dục hoặc hơi tròn có 5

cạnh, cạnh hai bên chia ra giống nhau như hai cánh bướm Mỗi hạt có 6 ống tinh dầu

Mùa ra hoa tháng 5-6, quả từ tháng 7 [3,10]

Bạch chỉ là cây dễ trồng không yêu cầu khí hậu khắt khe, những nơi khí

hậu ôn hoà, đầy đủ ánh sáng đều trồng được Cây có thể sinh trưởng tốt ở các vùng sinh thái khí hậu khác nhau của miền bắc Việt Nam, từ đồng bằng đến núi cao Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển từ 18oC-22oC, dưới 14oC cây phát triển kém Lượng mưa 1.185,5mm, ẩm độ tương đối 81% [3,10]

1.7.4 Sản lượng cây

Khi khí hậu thuận lợi trung bình mỗi năm sản lượng mỗi sào khoảng 2,2 tạ khô/năm Nhưng nếu khí hậu không thuận lợi thì sản lượng mỗi sào chỉ khoảng 1,7-1,8 tạ Sản lượng của bạch chỉ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí

2-hậu, điều kiện nuôi trồng như: mật độ cây, dinh dưỡng, pH, hàm lượng nước…

1.7.5 Hoạt tính sinh học (Tác dụng dược lý)

Theo Y h ọc cổ truyền [3,10]

+ Bạch chỉ có vị cay, tính ôn, qui vào các kinh phế, vị và đại tràng Có tác dụng khử phong, chỉ thống, hoạt huyết, bài nùng, sinh cơ

+ Bạch chỉ làm thuốc giảm đau, hạ sốt, có thể dùng phối hợp hay riêng

rẽ (viên bạch đại căn, bột khung chỉ)

+ Bạch chỉ còn để dùng chữa cảm mạo, đau đầu, đau răng, đau kinh,

mụn nhọt mưng mủ, viêm tuyến vú…

Theo Y h ọc hiện đại [3,10]

+ Tác dụng kháng khuẩn: Bạch chỉ có tác dụng kháng khuẩn đối với

các loại Shigella và Salmonella (Trung Dược Học) Bằng phương

pháp khuyếch tán trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn, nước sắc và cao chiết từ

bạch chỉ có tác dụng kháng khuẩn đối với các chủng phế cầu (Diplococcus

pneumoniae), liên cầu (Streptococus hemoleticus), tụ cầu vàng (Staphylococus aureus), Bacillus subtilis, Shigella sonnei, Shigella flexneri,

Shigella shiga, Shigella dysenteriae, Enterococus, Vibrio cholerae và

Bacillus typhi (Hiện Đại Thực Dụng Trung Dược) Ngoài ra, nó còn có tác

dụng kháng Virus (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam)

+ Tác dụng giảm đau: Trên mô hình gây quặn đau bằng cách tiêm xoang

bụng dung dịch Acid Acetic 6% cho chuột nhắt trắng, bạch chỉ với liều lượng

10g/kg, có tác dụng giảm đau rõ rệt; Làm giảm đau đầu do cảm cúm, đau đầu

sau đẻ, đau lợi răng, đau thần kinh mặt (Hiện Đại Thực Dụng Trung Dược)

+ Tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh: Với liều lượng nhỏ

Angelicotoxin có tác dụng hưng phấn trung khu vận động huyết quản, vận

mạch, tủy sống, trung khu hô hấp và dây thần kinh phế vị làm tăng huyết áp,

mạch chậm, hô hấp hưng phấn, các phản xạ được tăng cường, ngoài ra việc

kích thích tiết nước bọt Tuy nhiên dung với liều lớn dẫn tới co giật, tê liệt

toàn thân (Hiện Đại Thực Dụng Trung Dược)

+ Kháng khuẩn lao: Thuốc sản xuất từ bạch chỉ có tác dụng ức chế vi

khuẩn lao ở người rõ rệt (Sổ Tay Lâm Sàng Trung Dược)

+ Dùng trong nhãn khoa: Loại Pommade từ Bạch chỉ có tác dụng tăng khả năng trị liệu và tránh được loét giác mạc do bỏng ánh sáng (Trung Dược

Học)

+ Tác dụng chống viêm: Với mô hình gây viêm thực nghiệm bằng Kaolin trên chuột cống trắng, bạch chỉ với liều lượng 10g/kg có tác dụng

chống viêm

+ Dùng trong tai mũi họng: Bột làm từ bạch chỉ và băng phiến, hít vào

lỗ mũi điều trị đau đầu, đau răng, đau thần kinh sinh ba (Trung Dược Học)

Ngoài tinh dầu, trong rễ củ Bạch chỉ có các dẫn chất coumarin: Angenomalin, Anomalin, Bergapten, Marmesin, Scopoletin, Byak-angelicin, Byak-angelicol, Oxypeucedanin, Imperatorin, Isoimperatorin, Phellopterin, Xanthotoxin, Anhydrobyakangelicin, Neobyakangelicol

Bên cạnh đó, người ta còn chiết được chất alloizoimperatorin (thăng hoa) và 5 metoxy-8-andehytpsoralen những chất này vốn không có từ bạch

chỉ nhưng có thể xuất hiện trong quá trình chiết xuất từ những chất Isoimperatorin hoặc chất Neobyakangelicol mà sinh ra

Tuy đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của cây bạch chỉ, đã có nhiều hoạt chất đã được phân lập từ loài này nhưng

hoạt chất đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm là hoạt chất imperatorin

1.7.7 Hoạt chất imperatorin

Hoạt chất imperatorin có tên gọi theo IUPAC là enyloxy)-7H-furo[3,2g] chromen-7-one

9-(3-methylbut-2-Công thức phân tử: C16H14O4

Khối lượng phân tử: 270.27996 g/mol

Hoạt chất này có mặt trong thành phần hóa học của cây bạch chỉ -

Angelica dahurica , cây xà sàng - Cnidium monnieri, cây sa sâm b ắc - Glehnia littoralis [2]

Hình 1.4: C ấu trúc hóa học của Imperatorin

Các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hoạt chất này có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào và gây giáng hóa nhiều loại tế bào Ngoài ra người ta cũng phát hiện Imperatorin có tác dụng trong quá trình hình thành xương, kháng viêm, kháng quá trình phiên mã ngược của HIV-1, tác dụng

giãn mạch máu Các nghiên cứu gần đây cho thấy imperatorin là một chất chẹn kênh calci, ngăn cản dòng Ca++ đi qua kênh, chầm vào tế bào thần kinh dãn truyền và tế bào cơ tim (tác dụng chống loạn nhịp tim) và vào tế bào cơ trơn thành mạch (tác dụng giãn mạch) Những nghiên cứu này đã sử dụng đối

chứng dương là thuốc verapamil một thuốc có tác dụng giảm tiêu thụ oxygen

của cơ tim trực tiếp bằng cách can thiệp vào quá trình chuyển hoá tiêu thụ oxygen của cơ tim, làm tăng lưu lượng máu động mạch vành và ngăn cản co

thắt động mạch vành Kết quả nghiên cứu invivo và in vitro hợp chất Imperatorin cho thấy đây là nguyên liệu tiềm năng trong phát triển thuốc hạ huyết áp.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 V ật liệu

+ Nồi khử trùng Lequenx (Pháp) + Kính hiển vi điện tử Olympus (Nhật Bản) + Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)

+ Rây ướt các kích thước khác nhau 120µm, 60µm, 45µm, 32µm

+ Các dụng cụ cấy VSV (Việt Nam, Thụy Sỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ…)

2.1.3 Môi Trường

2.1.3.1 Môi trường phân lập nấm vùng rễ

Môi trường MMN (g/L): Glucose 10g; (NH4)2PO4 0,25g; MgSO4.7H2O 0,0732g; KH2PO4 0,5g; CaCl2 0,0662g; NaCl 0,025g; FeCl3.6H2O 0,02g; Thiamine HCl 1x10-4g Bổ sung kháng sinh sau khi khử trùng: 10ml chloramphenicol 0,5% và 10ml chlotetracycline 0,5%

2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy, lên men và giữ giống

+ Môi trường thạch - khoai tây (g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy dịch); Đường 20g; Thạch 15g Khử trùng ở 121oC trong 30 phút

+ Môi trường khoai tây dịch thể (g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy dịch); Đường 20g; Pepton 5g Khử trùng ở 121oC trong 30 phút

+ Môi trường Czapek-Dox (g/L): Saccharose 30g; NaNO3 2g; KH2PO41g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g ; FeSO4.7H2O 0,01g; pH = 6 (chỉnh bằng HCl) Khử trùng ở 121 oC trong 30 phút

+ Môi trường Sabouraud (g/L): Pepton 10g; Glucose 20g Khử trùng ở

110 oC trong 30 phút

+ Môi trường nước chiết cám (g/L): Cám gạo 100 (đun sôi trong 20 phút, lọc lấy dịch); Saccharose 30g; NaNO3 2g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g Khử trùng ở 121 oC trong 30 phút

+ Môi trường bột đậu tương (g/L): Bột đậu tương 20g; NaNO3 3g;

K2HPO4 1g; MgSO4 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4 0,1g; Glucose 20g; (pH= 5,5- 6)

Khử trùng ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút

2.1.3.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme

Môi trường thử hoạt tính enzyme phosphataza: 200ml dung dịch khoáng; Glucose 2g; Cao nấm men 0,1g; Thạch 4g Khử trùng ở 110oC trong

30 phút

(Thành phần dung dịch khoáng bao gồm (g/L): Ca3(PO4)2 5g; (NH4)2SO4 0,5g; KCl 0,2g; MgSO4.7H2O 0,1g; MnSO4.4H2O 0,001g; FeSO4.7H2O 0.001g.)

2.1.3.4 Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát khó tan

Môi trường Pikovskaya (g/L): Glucose 10g; Ca3(PO4)2 5g; (NH4)2SO40,5g; NaCl 0,2g; MgSO4.7H20 0,1g; KCl 0,2g; Cao nấm men 0,5g; MnSO4

vết; FeSO4.7H20 vết; Thạch 12g Khử trùng ở 110oC trong 30 phút

2.1.3.5 Môi trường đánh giá khả năng sinh IAA

Các chủng được lựa chọn sẽ được đánh giá khả năng sinh chất kính

thích sinh trưởng theo phương pháp Salkowsky cải tiến của Misra và Kaushik

B.D 1989 Môi trường dùng nuôi cấy vi sinh vật có công thức (g/L): Difco peptone 20g; K2HPO4 1,15g; MgSO4 1,5g; Glycerol 1,5% (v/v), tryptophan 0,1% Thuốc thử cải tiển có thành phần FeCl3 0,5M 15ml; H2SO4 98% 300ml; nước cất 500ml

2.2 P hương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập

2.2.1.1 Thu th ập mẫu

Gạt bỏ 3cm đất bề mặt để loại trừ thảm mục thực vật Dùng xẻng đã được vô trùng bằng cồn đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 0-20cm) Đào lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non Mẫu đất sau khi được thu

thập về để khô tự nhiên tránh môi trường ô nhiễm và riêng biệt, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-5oC) trước khi sử dụng cho phân lập hoặc đồng nuôi cấy

2.2.1.2 Phân l ập các chủng nấm

Phân l ập rễ: Theo phương pháp của Harvey, Linda M 1991 [19].Rửa

mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút Khi bề mặt mẫu đã ráo nước, ngâm mẫu trong cồn 70otrong 1 phút Để mẫu khô trong tủ cấy vô trùng Dùng dụng cụ

vô trùng cắt mẫu rễ thành những đoạn nhỏ dài từ 5-10mm, đặt các đoạn đó trên đĩa Petri có môi trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào

tủ ấm 30oC trong thời gian 48-72 giờ

Phân lập mẫu đất: Lấy 1g đất đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất

đã vô trùng, lắc đều, dùng pipet hút 100l dịch nhỏ vào đĩa petri có môi trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm 30°C

Lựa chọn và lưu giữ giống từ các sợi nấm mọc ra từ các mô rễ cây và đất ở các đĩa phân lập, ria cấy trên môi trường MMN để tinh sạch chủng Lựa

chọn các chủng sạch để cấy trên môi trường thạch nghiêng MMN hoặc khoai tây cho việc lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tính để dùng cho các nghiên cứu

tiếp theo Chủng nấm được bảo quản, trước khi mang ra sử dụng cần được cấy truyền sang ống thạch nghiêng để được hoạt hóa

2.2.2 Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm

2.2.2.1 X ác định hoạt khả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng nấm phân l ập

Khả năng hoà tan phosphat canxi được xác định theo nguyên lý khuếch tán trên thạch, bằng phương pháp khoan lỗ thạch; dịch nuôi nấm đã loại bỏ tế bào được đưa vào các lỗ đục trên đĩa thạch đã chứa các cơ chất tương ứng Các đĩa có lỗ thạch được để trong tủ lạnh 1-2h, rồi để trong tủ ấm 18-24h, để