Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược đối với vi khuẩn pseudomonas spp gây bệnh lở loét trên cá bông bớp (bostrichthys sinensis)

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC ĐỐI VỚI VI KHUẨN Pseudomonas sppGÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ BỐNG BỚP Bostrichthys sinensisLUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC SINH HỌCC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC ĐỐI VỚI VI KHUẨN Pseudomonas sppGÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ BỐNG BỚP (Bostrichthys sinensis)

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC SINH HỌCCHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ: 60.42.30

Người thực hiện : Đinh Thị Vân Chung Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Ngọc Hùng

Vinh - 2012

Để hoàn thành tốt khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Ngọc Hùng – giảng viên khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh, là người đã định hướng và hướng dẫn nhiệt tình, chu đáo trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trương Thị Thành Vinh, ThS Nguyễn Thị Kim Chung và các cán bộ phòng thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban chủ nhiệm khoa và thầy, cô giáo Phòng Đào tạo Sau đại học - Đại học Vinh đã trang bị nền tảng kiến thức và giúp đỡ tôi trong những năm học qua.n

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới khoa Sinh học, các phòng ban của trường Đại Học Vinh và gia đình, bạn bè đồng nghiệp, tập thể lớp CH18- SHTN đã quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và trong thời gian thực hiện đề tài.

Vinh, tháng 9 năm 2012

Tác giả Đinh Thị Vân Chung

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một vài đặc điểm sinh học của đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học cá Bống bớp (Bostrichthys sinesis Lecepede, 1801) 3

1.1.2 Chủng vi khuẩn Pseudomonas spp 6

1.1.3 Các loại thảo dược 8

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho thủy sản 14

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trên thế giới 16

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 23

2.3 Nội dung nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn 24

2.4.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 27

2.4.3 Phương pháp thu dịch ép từ thảo dược 28

2.4.4 Phương pháp thử kháng sinh đồ 28

2.4.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 34

2.4.7 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

Bống bớp 35 3.2 Khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp của dịch ép các loại thảo dược 36 3.3 Khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp của các loại thảo dược ở các nồng độ dịch ép khác nhau 38 3.3.1 Khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp của thảo dược ở các nồng độ dịch ép khác nhau 38 3.3.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch ép cây Cỏ mực đối với chủng Pseudomonas spp 40 3.3.3 Khả năng kháng khuẩn của dịch ép củ Gừng đối với chủng Pseudomonas spp 42 3.3.4 Khả năng kháng khuẩn của dịch ép củ nghệ đối với chủng Pseudomonas spp 43 3.3.5 Khả năng kháng khuẩn của dịch ép cây Cỏ lào đối với chủng Pseudomonas spp ` U 3.3.6 Khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp của các loại thảo dược ở cùng nồng độ dịch ép 45 3.4 Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp thảo dược Tỏi

và Gừng với các tỷ lệ khác nhau 50 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản đến khả năng kháng khuẩn của một số thảo dược (củ Tỏi) 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

TT Viết tắt Viết đầy đủ

6 NCNTTS Công nghệ nuôi trồng thủy sản

7 NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

Tỏi ở các điều kiện nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản khác nhau

52

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn .25

Hình 2.2 Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng 25

Hình 2.3 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn 28

Hình 3.1 Dấu hiệu cá bị bệnh 35

Hình 3.2 Khuẩn lạc mọc trên NA (cấy tăng sinh) 36

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc khi nhuộm gram 36

Hình 3.4 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại thảo dược và thuốc kháng sinh đối với chủng Pseudomonas spp 37

Hình 3.5 Vòng vô khuẩn của Tỏi và thuốc kháng sinh 37

Hình 3.6 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịp ép củ Tỏi ở các nồng độ khác nhau đối với chủng Pseudomonas spp 38

Hình 3.7 Vòng vô khuẩn của dịch ép củ Tỏi 40

Hình 3.8 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép cây Cỏ mực đối với chủng Pseudomonas spp 41

Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn của Cỏ mực 41

Hình 3.10 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép củ Gừng đối với chủng Pseudomonas spp 42

Hình 3.11 Vòng kháng khuẩn của Gừng 43

Hình 3.12 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép củ nghệ đối với chủng Pseudomonas spp 43

Hình 3.13 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép cây Cỏ lào đối với chủng Pseudomonas spp 44

Hình 3.15 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại thảo dược ở nồng độ dịch ép 100% 46 Hình 3.16 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại thảo dược ở nồng độ dịch ép 75% 48 Hình 3.17 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại thảo dược ở nồng độ dịch ép 50% 49 Hình 3.18 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại thảo dược ở nồng độ dịch ép 25% 50 Hình 3.19 Đường kính vòng vô khuẩn của hỗn hợp dịch ép từ Tỏi

và Gừng đối với Pseudomonas spp 51 Hình 3.20 Vòng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch ép từ củ Tỏi và củ Gừng 51 Hình 3.21 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch ép củ Tỏi ở các nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản khác nhau 53

MỞ ĐẦU

Cá Bống bớp (Bostrichthys sinensis) sống chủ yếu ở dải nước lợ ven bờ

biển Việt Nam, chúng thường phân bố tập trung nhiều ở các vùng cửa sông,rừng ngập mặn nơi có đáy là đất phù sa, bùn pha cát, có nhiều sinh vật đáy vàđộng vật giáp xác sinh sống Là một trong những loài cá có giá trị kinh tế cao

do thịt thơm ngon, bổ dưỡng, giá cả hấp dẫn nên được tiêu thụ rộng rãi trênthị trường trong và ngoài nước Bởi vậy mà cá Bống bớp đã và đang bị khaithác quá mức, cùng với sự tàn phá môi trường sinh thái và môi trường sống từviệc chuyển đổi rừng ngập mặn sang nuôi trồng thủy sản và các hoạt độngkinh tế khác của con người đã làm cho sản lượng cá Bống bớp ở nước ta bịgiảm sút nghiêm trọng và có nguy cơ bị tiêu diệt Chính vì thế, nuôi cá Bốngbớp hiện nay đang là một phong trào mạnh mẽ ở một số tỉnh ven biển có điềukiện phù hợp như Hải Phòng, Thanh Hóa, Nghệ An Trong đó Nghệ An đã vàđang phát triển nuôi cá Bống bớp trong ao

Tuy nhiên nuôi cá Bống bớp ở Nghệ An hiện nay đang gặp rất nhiềukhó khăn ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng của nghề nuôi như nguồncung cấp giống, thức ăn, dịch bệnh Đặc biệt cá Bống bớp ở đây đã xuất hiện

bệnh lở loét do vi khuẩn Pseudomonas spp.

Trong nuôi trồng thủy sản, với nhóm bệnh do vi khuẩn, thông thườngchúng ta sử dụng kháng sinh tổng hợp và sẽ đem lại hiệu quả cao nếu dùngđúng thuốc, đúng liều, đúng thời điểm Tuy vậy, kháng sinh tổng hợp cũng làcon dao hai lưỡi, có thể ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật sử dụng nó và

có những tác động không nhỏ tới môi trường sinh thái, nếu dùng kháng sinhtổng hợp tùy tiện và thiếu hiểu biết có khả năng tạo ra các dòng vi khuẩnkháng thuốc Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm nuôi cũng ảnhhưởng tới sức khỏe người tiêu dùng và tác động xấu tới việc tiêu thụ sảnphẩm, đặc biệt là đối với những mặt hàng xuất khẩu

Trước tình hình đó việc nghiên cứu sử dụng các loại thảo dược trongphòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn cho các đối tượng ĐVTS được coi là mộthướng đi mới, vừa đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, vừa thân thiện vớimôi trường sinh thái Trên thế giới, một số nước như: Trung Quốc, Ấn Độ,Bangladesh, Thái lan, Thổ Nhĩ Kỳ cũng đã có những nghiên cứu thử nghiệmtác dụng của thảo dược đối với một số tác nhân gây bệnh trên động vật thủysản Ở nước ta, trong những năm gần đây các nhà khoa học cũng đã có cácnghiên cứu về tác dụng của thảo dược như: lá Trầu không, Hẹ, Tỏi, lá Xoan,

lá Húng… trong phòng và trị bệnh trên cá Chép, tôm Sú, cá Trắm cỏ, cá Rôphi vằn, cá Bống bớp…Trong khi đó trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa

có một công bố cụ thể nào đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ép một sốloại thảo dược đối với bệnh lở loét trên cá Bống bớp do vi khuẩnPseudomonas spp Bởi vậy người nuôi chỉ biết dựa vào kinh nghiệm để chữatrị, có lúc hiệu quả nên thiệt hại kinh tế không nhiều, nhưng cũng có lúckhông hiệu quả nên thiệt hại kinh tế rất lớn cho người nuôi

Từ những yêu cầu thực tế đặt ra, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược đối với vi

khuẩn Pseudomonas spp gây bệnh lở loét trên cá Bống bớp (Bostrichthys

sinensis) ”

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp của dịch ép cácloại thảo dược (Tỏi, Cỏ mực, Gừng, Nghệ, Cỏ lào) trong điều kiện nồng độ,nhiệt độ sử dụng và bảo quản, thời gian bảo quản và công thức kết hợpkhác nhau

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một vài đặc điểm sinh học của đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm sinh học cá Bống bớp (Bostrichthys sinesis Lecepede, 1801)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo

Cá Bống bớp có thân hình trụ tròn, hai vây lưng tách biệt nhau, hai vâybụng gần nhau và dính nhau ở gốc vây Đầu ngắn, mõm tầy và mắt nhỏ, toànthân phủ vẩy nhỏ, hàng vảy dọc giữa thân có hơn 100 cái Phần trên gốc vâyđuôi có một chấm đen to hình tròn hoặc hình trứng xung quanh viền trắng.Chiều dài thân gấp 5 lần chiều cao

Hình 1.1 : Cá Bống bớp (Bostrichthys sinesis)

1.1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh trưởng

Trong tự nhiên, cá Bống bớp thường sống ở đáy thành từng cặp tronghang với tỷ lệ đực/cái là 1/1, cũng không ít những hang có đến vài cặp cùngchung sống Cá sống chủ yếu ở các bãi triều cửa sông và đầm nước lợ, độ sâutrên dưới 1,5 m, nhiệt độ 17 – 35 0C, độ muối 0, 1 - 11% Cá trưởng thànhluôn sống trong hang lỗ ở các bãi triều, bờ đê ngập nước, chỉ ra ngoàikhi sinh sản hoặc kiếm ăn cá Bống bớp thuộc loài cá dữ, khi còn nhỏ chúng

ăn động vật phù du, ấu trùng động vật Cá trưởng thành ăn giáp xác vànhuyễn thể Chúng thường bắt mồi sống, cũng có khả năng ăn con mồi chếtnhưng thịt còn tươi [15]

1.1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh của cá Bống bớp và một số biện pháp phòng trị

- Tình hình nghiên cứu bệnh của cá Bống bớp

Hà Kí và Bùi Quang Tề (2007) phát hiện trên cá Bống bớp có rất nhiềutác nhân là kí sinh trùng thuộc nghành, lớp, khác nhau Đến năm 2004 thìTrần Văn Đan trong quá trình thực hiện đề tài sinh sản nhân tạo cá Bống bớp,ông đã thu mẫu định kỳ từ các bể ấp trứng, ươm nuôi ấu trùng và các lồngnuôi thương phẩm Các kết quả phân tích mẫu bệnh bước đầu đã xác địnhbệnh ở các giai đoạn và đã cho một số kết quả [12]

Bệnh nấm

Tác nhân gây bệnh nấm đã xác định là loài Saprolegnia parasitica Khi

kí sinh vào trứng hoặc ấu trùng, các sợi nấm phát triển nhanh và phân nhánhtạo thành đám dày Năm 1999 bể ấp bị nhiễm bệnh chỉ nở 22% trong khi bểkhông bị nhiễm tỉ lệ nở trung bình 76% [17]

Bệnh rận cá

Tác nhân là Caligus gây ra cho cá Bống bớp nuôi lồng trong ao nuôi tại

trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ Cá bị rận cá kí sinh với mức độcảm nhiễm cao có dấu hiệu bệnh lí đặc trưng Giai đoạn đầu cá có trạng tháibất an, bơi lội lung tung, khả năng bắt mồi giảm Nếu cá ở trong lồng thì cóhiện tượng cọ xát vào thành lồng, cá bị xây xát, chảy máu Toàn thân cá xuấthiện đốm xuất huyết đỏ Cá bị mất nhiều máu nên gầy yếu, cá bắt đầu chết rải

rác [6] Khi Caligus kí sinh trên cá nuôi lồng, chúng bám vào bề mặt cơ thể

ký chủ, dùng anten nhọn để làm rách màng tế bào biểu mô và lớp màng dưới

da của cá, sau đó tấn công trực tiếp vào mô dưới da của cá gây hỏng da, làmvết thương mở rộng gây mất cân bằng thẩm thấu và tạo điều kiện cho nấm, vikhuẩn gây bệnh xâm nhập [19]

Bệnh do vi khuẩn

Cá bố mẹ, ấu trùng cá con ở trạng thái không bình thường, khi nhiễmbệnh cá nổi lên bề mặt ao, bể, bơi lờ đờ, phản ứng với tiếng động kém, cá bỏ

ăn, khi bị nặng cá có thể chết

Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas spp ở cá Bống bớp, tác nhân là: P.

fluorescens, P anguilliseptica, P dermoalba, P putida Đây là những loài

phát triển trong môi trường đơn giản và hiếu khí, đa số chúng có thể oxi hóahoặc một số ít không oxy hóa và không lên men trong môi trường O/Fglucose Khi xuất hiện chúng gây bệnh xuất huyết trên da cá, vẩy bụng rõnhất hai bên thân và phía bụng, gốc vây lưng đều xuất huyết, các tia vây ráchnát cụt dần [26]

- Một số biện pháp phòng trị

Theo Trần Văn Đan và ctv (2006) đối với bệnh do vibrio spp và

Pseudomonas spp Để phòng trong trường hợp này phải tiến hành lọc nướcqua tầng Formaline với nồng độ 20 – 25 ppm trong 15 – 20 phút Thức ăntươi sống cũng phải xử lý trước khi cho ăn bằng Formalin với nồng độ 20 –

25 ppm trong 10 – 20 phút, sau đó rửa sạch rồi mới cho ăn Khi cá bị nhiễmbệnh rồi thì cần phải tiến hành trị bằng thuốc kháng sinh Erythrommycin cộngvới Bactrim theo tỉ lệ 1:1 với nồng độ từ 1 – 3 ppm Đánh thuốc trực tiếp vào

bể sau 12 giờ thay nước xử lý [8]

Pseudomonas spp là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, không sinh bào

tử, kích thước tế bào khoảng 0,5-1,0 x 1,5-5,0 mm Phần lớn 2 tế bào nối liềnnhau, phía đầu có 1-2 tiêm mao, có khả năng di động, không có nha bào,không có giác mạc Khuẩn lạc hình tròn, đường kính khoảng 0,5-1mm hơi lồi,ướt, mặt nhẵn bóng, ria đều, màu trắng xám, sau 24h tạo sắc tố vàng lục

Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm, ngoài ra chúngcòn được phát hiện trong muối tươi, biển và nơi cửa sông, thậm chí cả người

và động vật Chúng phân bố khắp trên môi trường đất, nước và vi khuẩn này

có khả năng gây bệnh trên cá, người và động vật Tác nhân gây bệnh ở cá

gồm một số loài: P fluorescens, P chlororaphis P anguilliseptica, P.

dermoalba, P Putid [31].

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Pseudomonas spp gây ra trên cá

Ở động vật thủy sản vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gâythiệt hại lớn đến sản lượng nuôi thủy sản của mỗi quốc gia với các loài vikhuẩn chủ yếu như: Streptococcus spp, Aeromonas spp, Pseudomonas spp…[4]

Pseudomonas spp xuất hiện tại Malaysia đối với cá song mỡ

(E.tauvina) với các dấu hiệu bệnh lí khi cá bị bệnh là hoại tử da và vảy đuôi,

bệnh thường xảy vào mùa mưa trên tất cả các gia đình cá nuôi trong suốt năm

1982 đến năm 1986, thiệt hại gây chết Pseudomonas spp từ 20%- 60% tổng

số cá nuôi lồng [29]

Pseudomonas spp là vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá, còn có tên

gọi khác là bệnh đốm đỏ, hoặc bệnh lở loét trên cá Dịch bệnh do vi khuẩn

Pseudomonas spp đã xuất hiện rộng rãi và khá phổ biến vào thế kỷ XIX Năm

1891, Sanarelli đã có nghiên cứu đầu tiên về sự bùng nổ dịch bệnh này ở cáchình Ban đầu, nguyên nhân gây bệnh được phỏng đoán do các vi sinh vật

gây ra hoặc do vi khuẩn Vibrio anguillarum Sau đó, Schaperclaus (1930) đã

mô tả bệnh này xuất hiện ở cá chép với dấu hiệu bệnh lý là lở loét ở bụng và

ông phân lập được loài vi khuẩn gây bệnh là Bacterium punctatum Trong khi

đó, Toranzo và cộng sự (1989) đã tìm thấy Aromonas sobria khi dịch bệnh

này bùng nổ trên cá Mòi dầu hay cá Hồi nước ngọt Vào lúc đó, một hướngnghiên cứu khác đưa ra nguyên nhân chủ yếu gây bệnh phù trên cá chép được

xem là do virus và vi khuẩn Pseudomonas fluorescens là tác nhân thứ cấp gây

ra bệnh [35], [26]

Tại Việt Nam, năm 1972 - 1973, bệnh lở loét được phát hiện trên cáLóc ở An Giang và Đồng Tháp Năm 1975, bệnh lở loét đã thấy xuất hiệnđầu tiên tại Đồng Bằng sông Cửu Long với mức độ nhẹ nhưng đến năm

1983 bệnh đã bùng nổ thành dịch Bệnh lở loét trên cá đã lan rộng khắp các

vùng sông Tiền, sông Hậu, sông Đồng Nai, sông Sài Gòn với tỷ lệ cá bịnhiễm bệnh từ 60% - 70%.

Theo kết quả nghiên cứu của đề tài “chuẩn đoán và phòng trị một sốbệnh truyền nhiễm ở cá nuôi và thủy sản” năm 1996 đến năm 1998 cho biết

cá song được đưa vào nuôi lồng khoảng 1 – 2 tuần đã có biểu hiện như: cá mùmắt, mắt có mủ trắng thường một bên mắt, da đầu, thân đuôi thường bị ănmòn, viêm loét các gốc vây và trong 3 năm đó Bùi Quang Tề và ctv đã phânlập được 6 loài Vibrio spp và một loài Pseudomonas spp ở cá Song khi xuất

hiện bệnh lở loét, trong đó V.alginolyticus chiếm 44,3% [21].

1.1.3 Các loại thảo dược

Ở nước ta có rất nhiều loại thảo dược có khả năng chữa được bệnh Tuynhiên với mục tiêu của đề tài là hướng tới các loại thảo dược rẻ tiền, dễ tìm,

dễ sử dụng và có hiệu quả cao đối với việc phòng và trị bệnh trên thủy sản,nên trong đề tài này chúng tôi lựa chọn các loại thảo dược dễ tìm, quen thuộc

có mặt hàng ngày trong cuộc sống của người dân

1.1.3.1 Tỏi (Allium sativum L.)

Từ lâu đời, Tỏi được nhân dân xem là một loại dược liệu có vị cay, hôi,tính ấm, có tác dụng sát khuẩn, giải độc, tiêu đờm, trừ giun Củ Tỏi có kíchthước trung bình từ 2 ÷6 cm, có màu trắng, mỗi củ có từ 12÷20 tép

- Thành phần hóa học

Trong củ Tỏi có chứa 0,1-0,36% tinh dầu, trong đó hơn 90% chứa cáchợp chất lưu huỳnh (S) Thành phần kháng thuốc chủ yếu là chất alicin(C6H10OS2) có khả năng diệt khuẩn mạnh, ở động vật thủy sản nó có tác dụngrất tốt với các vi khuẩn gam (-) Trong Tỏi tươi không có chất alicin nó chỉđược hình thành khi Tỏi đã được phơi khô Ngoài ra củ Tỏi còn chứa nhiềuvitamin và chất khoáng [14]

- Tác dụng

Thành phần kháng khuẩn chủ yếu của Tỏi

là chất alicin (C6H10OS2), đây là một chất sulfur

có tác dụng diệt khuẩn mạnh, phổ diệt khuẩn

rộng với nhiều loài vi khuẩn như: thương hàn,

phó thương hàn, lỵ, tả, trực khuẩn, bạch hầu, vi

khuẩn gây thối rữa [14]

Data (1948) đã phân lập từ Tỏi một chất gọi là allistalin, có tính chấtgiống như allicin; Machado (1948) cũng phân lập từ Tỏi chất garcin, nó làmột chất kháng khuẩn màu vàng, không có mùi lưu huỳnh, không độc, có tácdụng đến cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Garcin có thể dễ dàng hấp thuqua thành ruột và có thể đi tới dịch não tủy, đã ứng dụng có kết quả trong

nhiễm khuẩn Shigella hoặc do các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa

và giun tóc Các nhà khoa học Mỹ đã tìm thấy chất prostagladin A trong nướcTỏi, có khả năng hạn chế bệnh nhồi máu cơ tim, hạ huyết áp, phòng bệnh xơvữa động mạch Các bác sĩ Nhật Bản lại nhận xét rằng do Tỏi chứa chấtallixotine nên Tỏi có tác dụng chữa đau lưng, viêm khớp Ngoài ra các nghiêncứu lâm sàng cũng cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị được nhiều căn bệnhnhư: các bệnh về tai, mũi, họng, bỏng nhiễm khuẩn và vết thương có mủ,dùng Tỏi để trị các loại giun, dùng nước ép Tỏi để trị viêm âm đạo trùng roi,chữa các bệnh về tim mạch [14] Theo kinh nghiệm của người dân, có thểdùng Tỏi trộn vào thức ăn cho cá để trị bệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ

- Thành phần hóa học:

+ Chất màu Curcumin có 0,3% là tinh thể nâu đỏ ánh tím không tantrong nước, tan trong rượu, axit

+ Tinh dầu 1 - 5% màu vàng nhạt, thơm

+ Tinh bột, canxi oxalat, chất béo…

- Tác dụng

Tinh dầu và một số thành hóa học của nghệ có tác dụng ức chếnhiều loài vi khuẩn và nấm gây bệnh trong đó có trực khuẩn lao, các trựckhuẩn lỵ, phế cầu khuẩn, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn coli, nấm

candida albicans Cao chiết từ Nghệ có tác dụng ức chế lỵ amip Dịch

chiết từ lá nghệ diệt ấu trùng muỗi [14]

Ở nước ta có 8 loài Nghệ khác nhau, trong đó loài được sử dụng

nhiều nhất là loài Curcuma longa Theo Nguyễn Xuân Cường và Nguyễn

Văn Đàn (1977); Nguyễn Khang và nhiều tác giả (1978) thì trong Nghệ cóchất màu curcumin tinh dầu, nó là một chất lỏng màu vàng nhạt, thơm, cóchứa turmerol và ar-turmerol Từ tinh dầu Nghệ Việt Nam, NguyễnKhang và nhiều tác giả (1982) đã phân lập được một vài thành phần nhưturmerol và ar-turmerol Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu

và một số thành phần có trong tinh dầu đã thu được kết quả là tinh dầu

Nghệ, turmerol và ar-turmerol đều có tác dụng mạnh với Mycobacterium

tuberculosis H37Rv ở độ pha loãng 1 microgam/ml Tuy nhiên một số

giống vi khuẩn như Klebsiella sp, Shigella flexneri, E coli, Salmonella

typhi, Bacillus mycoides, Proteus vulgaris thì tác dụng kháng khuẩn của

tinh dầu và ar-turmerol không có, còn turmerol có tác dụng kháng khuẩntrung bình Còn theo kinh nghiệm dân gian thì Nghệ có tác dụng kíchthích lên da non và nhanh liền sẹo [14]

1.1.3.3 Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata )

Cây cỏ, sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 30 40cm Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng Lámọc đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ; hai mặt lá có lông.Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân Quả bế dài 3mm, có

-3 cạnh, hơi dẹt [1-3]

- Thành phần hóa học: Các nghiên cứu trong y học hiện đại đã phát

hiện thấy trong Cỏ mực có saponin, tanin, chất đắng

- Tác dụng: Chất tanin trong Cỏ mực có tác

dụng làm tăng tốc độ đông máu Các nhà khoa học

Trung Quốc đã làm thực nghiệm: cắt đứt động

mạch đùi chó, dùng bột Cỏ mực tán mịn đắp lên

chỗ đứt, ấn nhẹ vào thì thấy có tác dụng cầm máu

tốt Ngoài ra Cỏ mực còn có tác dụng diệt khuẩn,

tiêu viêm, có tác dụng diệt một số tụ cầu khuẩn,

trực khuẩn bạch hầu (Bacillus diphtheria), trực khuẩn viêm ruột (Bacillus

enteritidis) và có tác dụng nhất định đối với amip Ngoài ra có tác dụng tăng

cường miễn dịch, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư: kích hoạt hệ thốngmiễn dịch, đặc biệt là đối với tế bào limphô T (T-lymphocytes), có tác dụng

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt trong ung thư dạ dày [27]

1.1.3.4 Củ Gừng ( Zingiber Officinale Rosc)

Là một loại cây nhỏ 5cm – 1m, thân rễ phình

to thành củ Lá mọc so le, không cuống, có bẹ hìnhmác dài khoảng 15cm - 20cm, rộng 2cm, bẹ nhẵn,lưỡi bẹ nhỏ dạng màng Bộ phận dùng là củ Gừng

có khắp nơi ở nước ta, được trồng làm gia vị nấu

ăn, làm thuốc chữa bệnh hoặc xuất khẩu [14]

- Thành phần hóa học: Trong củ Gừng có trên 400

chất khác nhau, bao gồm 2-3% tinh dầu (Zingiberen, D-camphen), 3-5% chất

Hình 1.4 Cây cỏ mực

Hình 1.5 Củ gừng

nhựa cay như zingeron, zingerol, shogaola (trong quá trình làm khô, chấtgingerol biến thành shogaol), chất béo, các vitamin và chất khoáng nhưKali, Canci, Sắt, Mangan, Kẽm [14].

- Tác dụng:

Gừng đã được dùng làm thuốc chữa bệnh từ cách đây hơn 5000 nămtrước vì các dược tính quý giá của nó Ở Miến Điện, Gừng và nước ép cây

cọ được dùng để chống bệnh cúm Người Trung Quốc sử dụng trà Gừng

để phòng và chữa các chứng thông thường, làm kẹo Gừng để chữa ho.Người Cônggô nghiền Gừng với nhựa cây xoài thành nước uống có thểchữa bách bệnh Tại Ấn độ, Gừng được dùng để điều trị bệnh cảm cúmthông thường và dùng để chống nôn Ở Nepan, Gừng được trồng rộng rãi

và sử dùng phổ biến như một gia vị, hoặc dùng để tạo hương cho các loạitrà Theo FDA (cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ) Gừngđược dùng cho phụ nữ mang thai để điều trị chứng ốm nghén rất hiệu quả

và an toàn Trà Gừng được dùng để phòng chống tình trạng chuột rút dolạnh Ở Việt Nam, Gừng được dùng để phòng chống cảm lạnh, nôn, saytàu xe và chữa ho rất hiệu quả Gừng có tính chất chống viêm và có thểdùng để trị viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và các rối loạn khác

về cơ bắp Uống trà Gừng, đắp bã, ngâm tay, chân trong nước Gừng loãngmỗi tối 15-20 phút có thể chữa được các chứng viêm khớp Liệu pháp này

có tác dụng giảm triệu chứng đau, sưng rất rõ rệt Các thành phẩn hoá họctrong Gừng giúp ức chế sự sinh tổng hợp các chất prostaglandin gây viêm.Nhờ chứa chất Cineole nên Gừng có thể giúp giải tỏa stress, trị bệnh nhứcnửa đầu, giúp cho giấc ngủ ngon và sảng khoái Gừng còn làm dịu cơnđau răng và sự khó chịu gây ra bởi nhiễm khuẩn phần trên của đường hôhấp, nhờ vào tính chất kháng khuẩn và chống nấm của nó [37]

1.1.3.5 Cỏ lào (Chromolaena odorata)

Cây thảo mọc thành bụi, có thân cao đến

2m hay hơn Cành nằm ngang, có lông mịn Lá

mọc đối, hình trái xoan nhọn, mép có răng,

cuống dài 1-2cm, có 3 gân chính Cụm hoa xếp

thành ngù kép, mỗi cụm hoa có bao chung gồm

nhiều lá bắc xếp 3-4 hàng Hoa nhiều, có màu

hoa đào Quả bế hình thoi, 5 cạnh, có lông Cây

ra hoa vào cuối mùa đông, đầu mùa xuân

- Thành phần hóa học: Cỏ lào chứa 2,65%

mủ trên vết thương và trực trùng lỵ Shigella Thông thường ta hay dùng lá

tươi cầm máu vết thương, các vết cắn chảy máu không cầm Cũng được dùngchữa bệnh lỵ cấp tính và bệnh ỉa chảy của trẻ em; chữa viêm đại tràng đaunhức xương, viêm răng lợi, chữa ghẻ, lở, nhọt độc Ở Trung Quốc, người tadùng lá xát hoặc lấy nước bôi vào chân phòng vết cắn, bỏ lá xuống ruộngngâm nát 1-2 ngày để trừ ấu trùng ký sinh trùng (thể xoắn ốc có móc câu ởđầu) phòng khi xuống ruộng khỏi bị lây Năm 1976, Viện Nghiên cứu Y họcquân sự công bố kết quả nghiên cứu: Tác dụng chống viêm, tác dụng khángkhuẩn, liền độc của Cỏ Lào Tác dụng chống viêm: lá, thân, rễ Cỏ lào đều cótác dụng, nhưng lá mạnh hơn cả Tác dụng kháng khuẩn: nước sắc Cỏ lào cótác dụng ức chế vi khuẩn gây mủ trên vết thương và ức chế trực khuẩn lỵ

Shigella [36].

Hình 1.6 Cây Cỏ lào

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho thủy sản

Thuốc kháng sinh là tất cả những chất hóa học không kể nguồn gốc(chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) cókhả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằngcách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinhvật [31]

Dịch bệnh vẫn là một trở ngại lớn cho sự phát triển nuôi trồng thủy sảntrên phạm vi toàn cầu, hằng năm thiệt hại do dịch bệnh gây ra với nuôi trồngthủy sản trên thế giới tính khoảng 3 tỷ USD, riêng ở Việt Nam, thiệt hại dodịch bệnh gây ra hằng năm cho nuôi trồng thủy sản hàng trăm tỷ đồng [9] Đểgiải quyết tình hình này biện pháp chủ yếu thường xuyên được áp dụng hiệnnay là sử dụng thuốc kháng sinh [34] Hiện nay ở nước ta việc nuôi thuỷ hảisản đa phần là mang tính chất nhỏ lẻ, manh mún do các hộ gia đình tự nuôi.Thuốc kháng sinh và các hóa chất độc hại có thể xâm nhiễm thông qua cáccon đường như: môi trường (ao, hồ,…), con giống, thức ăn,… Ở những vùng

có các doanh nghiệp kinh doanh và chế biến được các công ty, doanh nghiệpthu mua lại, sơ chế hoặc chế biến, đóng gói và tiêu thụ Ngoài ra ở một số nơiđược các tiểu thương thu mua thì người ta có thể sử dụng các hóa chất cấm đểbảo quản sản phẩm (phân urê) Với một quy trình sản xuất và bao tiêu sảnphẩm như vậy nên việc các sản phẩm thuỷ sản có dư lượng kháng sinh và cáchoá chất độc hại là điều khó tránh khỏi [13]

Đối với vật nuôi nói chung và thủy sản nói riêng, nếu sử dụng một loạikháng sinh lặp lại trong một thời gian dài có thể gây ra những ảnh hưởng xấunhư: gây ra tác dụng phụ; giảm sức đề kháng; làm mất cân bằng hệ vi sinh vậtđường ruột, có thể tiêu diệt các vi sinh vật có ích tạo điều kiện cho vi sinh vật cóhại phát triển và gây ra những bệnh khác cho vật nuôi; làm cho vi khuẩn kháng

thuốc như: hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E ictaluri gây bệnh

gan thận mủ ở cá tra đã được cảnh báo trong nhiều năm qua [29], [25]

Việc sử dụng thủy sản có dư lượng thuốc kháng sinh và hóa chất độchại có rất nhiều nguy cơ tiềm ẩn Trong đó có việc ảnh hưởng đến sức khỏengười tiêu dùng Qua thực tế người tiêu dùng có thể bị ngộ độc cấp tính khi

sử dụng những sản phẩm này với những biểu hiện thường thấy ở người bị ngộđộc thực phẩm như: buồn nôn, chóng mặt, nhức đầu, tiêu chảy,… Ngoài rangười tiêu dùng còn có thể bị ngộ độc mãn tính, phải trải qua một thời giantích lũy lâu dài mới biểu hiện triệu chứng bệnh Cụ thể như:

- Chloramphenicol gây ra các triệu chứng rối loạn đường ruột, làm rốiloạn quá trình giảm phân của tế bào máu gây nên bệnh thiếu máu, chất nàylàm suy thoái nghiêm trọng chức năng của tủy xương, làm suy yếu hệ xương

ở trẻ sơ sinh

- Oxytetracyline là dư lượng kháng sinh được phép không quá 100ppbtrong thực phẩm Nó có thể hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc, ảnh hưởngđến hệ miễn dịch của cơ thể

- Dẫn xuất của Nitrofuran (Furaltadone, Furanzolidone, Nitrofurazone)

có thể gây ung thư

- Kháng sinh nhóm Quinolon có thể gây ung thư da khi tích lũy lâu dài[35], [42], [41]

Mặt khác dư lượng thuốc kháng sinh và các hóa chất độc hại trong sảnphẩm thủy sản còn gây nên một hậu quả nữa, đó là ảnh hưởng đến uy tín vàviệc xuất khẩu các sản phẩm này sang các nước khác Ở các nước như: Mỹ,Nhật Bản, Nga, các nước EU có những quy định rất nghiêm ngặt trong việcnhập khẩu các sản phẩm thủy sản Ngoài các quy định cụ thể về dư lượng cácchất cho phép trong sản phẩm, quy định về các chất cấm sử dụng thì quy trìnhkiểm tra các lô hàng nhập khẩu diễn ra rất chặt chẽ Ở từng thời điểm, trongcác lô hàng nhập khẩu sẽ tiến hành kiểm tra ngẫu nhiên một mẫu sản phẩm,nếu phát hiện trong mẫu sản phẩm kiểm tra có dư lượng các chất độc hại vượtmức cho phép họ sẽ cảnh báo và nâng mức kiểm soát lên cao dần Nếu trong

các lô hàng tiếp theo vẫn tiếp tục vi phạm sẽ ngưng nhập khẩu và buộc công

ty nhập khẩu tiến hành hủy toàn bộ lô hàng Cụ thể: ngày 10/6/2011, NhậtBản đã nâng mức cảnh báo đối với mặt hàng tôm xuất khẩu của Việt Nam lên100%; tháng 7/2011, ba nhà bán lẻ của Anh là Tesco, Asda, Morrisson quyếtđịnh nGừng bán cá tra Việt Nam do phát hiện tạp chất tăng trọng [38] Điềunày không những ảnh hưởng đến uy tín các mặt hàng thủy sản xuất khẩu củanước ta mà còn gây ra nhiều thiệt hại về kinh tế cho ngành xuất khẩu thủy hảisản và nhiều hệ lụy kéo theo đó Và đây cũng là một thách thức không nhỏđối với các doanh nghiệp Việt Nam trong khi nhà nước chưa có chế tài đủmạnh cũng như các biện pháp mạnh tay để kiểm soát ngay từ đầu Bởi vì hiệnnay có một nghịch lý là trong khi các doanh nghiệp xuất khẩu Việt Nam đanglao đao vì hàng xuất đi bị trả về do không đạt chuẩn thì các hóa chất độc hạivẫn được nhập về một cách tràn lan, không hề được kiểm soát và ngăn ngừacũng như hạn chế Điều này cũng dẫn đến một hậu quả nữa đó là các doanhnghiệp xuất khẩu sau khi có hàng bị trả về do không đạt chuẩn thì thay vì phảihủy, họ lại bán các phế phẩm này cho người tiêu dùng trong nước để hạn chếthiệt hại Việc làm đó chẳng khác gì đi đầu độc ngay chính người dân củamình Do vậy để tránh những điều nghịch lý như trên trong hoàn cảnh hiệnnay, nhà nước và các nhà khoa học cần phải tìm ra các biện pháp đồng bộ đểtừng bước khắc phục Một trong những biện có tính khả thi, mang tính chấtbền vững lâu dài là nghiên cứu biện pháp phòng và trị bệnh sử dụng các loạithảo dược [43], [12]

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trên thế giới

Việc sử dụng thảo dược để phòng và trị bệnh cho con người đã đượcnghiên cứu và áp dụng từ rất lâu Trên thế giới, những nước có ngành y học

cổ truyền phát triển và có truyền thống lâu đời trải qua hàng nghìn năm như:Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,… Tại những nước này ngành yhọc cổ truyền được nghiên cứu lâu đời với nguồn kinh nghiệm được tích lũy,

chắt lọc qua nhiều thế hệ đã tạo nên một vốn kiến thức rất đồ sộ và phongphú Trong đó có rất nhiều phương thuốc trị được nhiều căn bệnh (từ nhữngbệnh đơn giản đến những bệnh nan y) ở người có sử dụng các loại thảo dược.Trong đông y, một phương thuốc có thể sử dụng kết hợp rất nhiều vị thuốckhác nhau Chính sự kết hợp tài tình đó đã tạo nên hiệu quả lớn trong việc sửdụng các bài thuốc đông y để phòng và trị bệnh cứu người Vậy thì con người

có thể xem như một loài động vật tiến hóa cao nhất Nếu thảo dược có thểchữa bệnh cứu người, vậy tại sao lại không phòng và chữa được bệnh chonhững động vật khác?

Trong khi đó vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh và các hóa chất độc hại

đã và đang làm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của con người, vật nuôi, môitrường xung quanh, mặt khác nó còn làm ảnh hưởng đến ngành xuất khẩuthủy sản của các nước Hơn thế nữa việc sử dụng kháng sinh từ thảo dược cónhững lợi ích thiết thực như: chi phí thấp, dễ kiếm, dễ sử dụng, an toàn vớivật nuôi, không gây hại cho con người và thân thiện với môi trường [20].Chính vì những lợi ích như vậy, hiện nay có rất nhiều nước trên thế giới quantâm nghiên cứu ứng dụng thảo mộc vào trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản.Trong đó phải kể đến những nước có ngành nuôi trồng thủy sản tương đốiphát triển như các nước thuộc châu Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Banglades,Thổ Nhĩ Kỳ, Malaysia,… [34]

Một số tác giả T Rahman, MMR Akanda, MM Rahman, MBRChowdhury đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của thuốc kháng sinh và cácloại thảo dược đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên cá Thínghiệm được tiến hành với 4 loại thuốc kháng sinh là: CFCIN (Ciprofloxacin), Renamycin (Oxytetracycline), Dt – 10 (Doxycycline) và Sulfatrim(Sufadiazin + Trimethoprim) với các liều lượng 100, 75, 50 và 25 ppm; 4 loại

thảo dược là: Tỏi, Nghệ, Akand (C.gigentia) và hỗn hợp Akand + Neem (A.

indica) với các nồng độ là 2, 4, 6, 8 mg/ml Thí nghiệm tiến hành lần lượt đối

với cá bị nhiễm 1 trong 3 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến là: Aeromonas

hydrophyla, Pseudomonas fluorescens và Edwardsiella tarda [5]

Ở Thổ Nhĩ Kỳ, các tác giả Hakar Turker, Arzu Birinci Yildirim vàFatma Pehlivan Karakas đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của

22 loại thảo dược có ở địa phương đối với một số chủng vi khuẩn phổ biến

gây bệnh trên cá như: Aeromonas hydrophyla, Yersinia ruckeri, Lactococcus

garvieae, Streptococcus agalactiae và Enterococcus faecalis Các loại thảo

dược được chiết xuất với 2 loại dung môi là cồn và nước Kết quả dịch chiếtcác loại thảo dược cho khả năng kháng khuẩn cao nhất bao gồm: Nupharlutea, Nymphaea alba, Stachys annua, cây kim tước chỉ Lydia, Vinca nhỏ,Fragaria Kết quả này cho thấy có thể tiếp tục nghiên cứu các loại thảo dượctrên để cho ra sản phẩm thay thế dần thuốc kháng sinh hiện nay [28], [32]

Ở Ấn Độ, một số tác giả Subramanian Velmurugan, ThavassimuthuCitarasu đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chiết xuất từ một số thảo dượcMurraya koenigii, Psoralea corylifolia và Quercus infectoria đối với một số

chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và các vi khuẩn Vibrio harveyi được phân lập từ tôm trắng Ấn Độ (Fenneropenaeus

indicus) bị bệnh [1] Biện pháp áp dụng là nghiên cứu nồng độ ức chế tối

thiểu của chiết xuất từ các thảo dược trên đĩa thạch nghiêng có cấy vi khuẩnsau 24h Sau đó thử nghiệm bằng cách trộn chiết xuất từ các thảo dược vàothức ăn và cho tôm ăn liên tục trong 30 ngày và cứ 10 ngày một lần cho tôm

tắm trong dung dịch có pha vi khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi để theo dõi tỉ lệ

mắc bệnh và tỷ lệ sống sót giữa nhóm kiểm soát và nhóm đối chứng Ngoài rathực nghiệm cũng tiến hành kiểm tra hệ vi sinh vật đường ruột của tôm saukhi cho ăn thức ăn có trộn thảo dược và so sánh với nhóm đối chứng [4] Bởi

vì vi sinh vật đường ruột cũng là những tác nhân cơ hội gây bệnh khi sức đềkháng của vật chủ bị suy giảm Kết quả cho thấy có sự thay đổi đáng kể trongcác thử nghiệm nói trên giữa các loại thảo dược và giữa nhóm kiểm soát vớinhóm đối chứng (P < 0,05) [30]

Ngoài ra một số nước khác như Trung quốc, Thái Lan, Malaysia cũng

có những nghiên cứu về các loại thảo dược trong nước trong phòng và trịbệnh trên thủy sản nhằm mục đích hướng tới một ngành thủy sản xanh, vớimục tiêu hạn chế dư lượng thuốc kháng sinh và các hóa chất độc hại trong cácsản phẩm thủy sản

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước

Nước ta là một trong những đất nước từ xa xưa đã có truyền thống sửdụng thuốc đông y để chữa bệnh cho con người Với những danh y nổi tiếngqua các triều đại như: Tuệ Tĩnh (đời nhà Trần), Hải Thượng Lãn Ông – LêHữu Trác (đời nhà Hậu Lê), GS Đặng Văn Ngữ (1956) với công trình nghiêncứu tác dụng kháng khuẩn trên 500 loài cây khác nhau,…Ngoài ra với một đấtnước có nhiều dân tộc, mỗi một dân tộc lại có kinh nghiệm sử dụng các loạithảo dược khác nhau trong việc chữa bệnh cho người Chính dựa trên một nềnvăn hóa lâu đời và đa dạng như vậy nên để khắc phục và hạn chế việc sử dụngthuốc kháng sinh trên thủy sản, các nhà khoa học trong nước đã có nhữngcông trình nghiên cứu về các loại thảo dược trong việc phòng và trị bệnh chovật nuôi nói chung và thủy sản nói riêng [22]

Trong quá trình nuôi các loại thủy sản với kinh nghiệm của mình các

hộ nuôi trồng cũng đã sử dụng một số biện pháp đơn giản và rẻ tiền nhằm hạnchế dịch bệnh như: dùng lá Xoan ngâm thả trong ao nhằm mục đích phòng vàchữa bệnh do giáp xác gây ra hoặc để hạn chế sự phát triển của trùng mặt trời

(Trichodina) kí sinh và gây bệnh trên các loài cá nước ngọt Dùng Tỏi trộn

vào thức ăn cho cá để trị bệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ Ngoài ra để diệt cá tạpkhi tẩy dọn ao ương nuôi tôm giống tôm thương phẩm người dân thườngdùng rễ dây thuốc cá đập dập cho ra chất nhựa trắng, sau đó ngâm trong ao cónước sâu 15-20 cm, sau 5-10 phút cá tạp sẽ nổi lên trên [2]

Dựa trên nguồn kinh nghiệm dân gian, các nhà khoa học trong nước đãlần lượt nghiên cứu các loại thảo dược sẵn có, dễ tìm và rẻ tiền trong việcphòng và trị bệnh cho các loài thủy sản và đã cho một số kết quả nhất định

Một số công trình nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm về cácloại thảo mộc trong phòng và trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên các loại thủysản đã được tiến hành Đoàn Chí Thanh và các tác giả đã nghiên cứu thửnghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh đốm đỏ trên cá Trắm cỏ

giống (Ctenopharyngodon idellus) Thử nghiệm được tiến hành bằng cách

chiết xuất dịch chiết từ các loại thảo dược Tỏi (nước và cồn), lá Xoan, cây Cỏmực, Cộng sản, lá Bỏng, lá Hoàn ngọc, sau đó pha loãng ở các nồng độ khácnhau và thử nghiệm trên đĩa có tráng vi khuẩn Aeromonas sp với mật độ

106CFU/ml Kết quả cho thấy dịch chiết từ Tỏi có kết quả tốt nhất, còn dịchchiết từ lá Xoan và cây Cỏ mực có kết quả thấp nhất (dựa vào đường kínhvòng vô khuẩn) [8], [20] Nguyễn Anh Tuấn đã tiến hành thử nghiệm một sốloại thảo dược trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá Trắm cỏ

(Ctenopharyngodon idellus) Thử nghiệm được tiến hành với phương pháp

như trên và sử dụng các loại thảo dược là: Tỏi, Cỏ sữa lá nhỏ, Chó đẻ răngcưa, lá Húng, hỗn hợp lá Húng và Tỏi với các tỷ lệ khác nhau, rau Sam, Nghệ,

Cỏ bạc đầu, Sài đất Kết quả cho thấy có 4 loại hợp chất là Tỏi, Cỏ sữa lá nhỏ,Chó đẻ răng cưa, Tỏi + lá Húng có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn phân lậpđược (Aeromonas sp), trong đó hợp chất được phối trộn từ Tỏi và lá Húng với

tỷ lệ 50% : 50% có khả năng kháng khuẩn cao nhất và giảm dần xuống đốivới những hợp chất còn lại [24]

Ngoài ra còn có các nghiên cứu sâu hơn của các nhà khoa học về thànhphần các chất có trong thảo mộc Điều này đã tạo điều kiện cho các cơ sở, cácnhà máy bào chế thảo dược dưới dạng chế phẩm hoặc thuốc, có sự kết hợpcủa nhiều thành phần có công dụng cao hơn và thuận tiện sử dụng hơn đối vớingười dân Một số sản phẩm do Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trường vàphòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản miền Bắc thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồngthuỷ sản I bài chế như: thuốc KN-04-12 của tác giả Hà Ký là sản phẩm thuốcthảo dược của cấp nhà nước mã số KN-04-12 gồm các thành phần Tỏi, Sàiđất, Nhọ nồi, Cỏ sữa, Chó đẻ răng cưa phối trộn với vitamin và một số

khoáng vi lượng khác Sản phẩm dùng để phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn(xuất huyết đồm đỏ, thối mang, viêm ruột) Thuốc Becanor TD1 và BecanorTD2 là 2 sản phẩm của tác giả Phan Thị Vân, gồm thành phần chính là Tỏingoài ra còn có một số thành phần khác như: vitamin và một số khoáng vilượng khác,… Sản phẩm dùng để phòng trị bệnh lở loét, đốm đỏ cho một sốloài cá nước ngọt như: cá Trắm cỏ, cá Tra, cá Ba sa, cá Chép Thuốc còn giúptăng cường sức đề kháng và phòng chống stress cho cá nuôi [7], [39] Hai sảnphẩm này đã được Nguyễn Viết Khuê và các cộng sự thử nghiệm để điều trịbệnh đốm đỏ cho cá trắm cỏ tại các ao nuôi và lồng nuôi tại 2 tỉnh Bắc Ninh

và Thái Nguyên từ tháng 3/2008-10/2009 Kết quả cho thấy sau khi sử dụng 2sản phẩm này để điều trị bệnh cho cá trắm cỏ thương phẩm thì tỷ lệ cá sốngtrong các ao/lồng nuôi cao hơn so với ao/lồng nuôi đối chứng [44]

Bùi Quang Tề (2005) đã nghiên cứu chế phẩm VTS1 – C và VTS1 – T

là 2 sản phẩm phối chế từ các hoạt chất tách chiết từ Tỏi, Sài đất sử dụngphòng bệnh cho cá Tra và tôm Sú nuôi ao hoặc nuôi lồng đạt kết quả tốt,

phòng được bệnh nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Aeromonas hydrophyla,

Edwarsiella tarda, Hafnia alvei, Vibrio harveyi, V.alginolyticus cho tôm cá

[39]

Hà Kí (1995) và cộng sự trong chương trình KN 04 – 12 đã nghiêm cứumột số loại thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá Bước đầu đã chon được

9 loài cây thuốc sau: rau Nghể (Polygonum hydropiper), rau Sam (Portulaca

cleracea), cây Cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), Cỏ sữa lá nhỏ (Portulaca thymifolis), Sài đất (Wedelia calendu lacae), Nhọ nồi (Ecliptaalba), Bồ công

anh (Lactuca indica), cây Vòi voi (Heliotropium) và cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) là những loài thảo dược có thể sử dụng trong phòng trị

bệnh trên động vật thủy sản [11]

Nguyễn Quang Linh, Trần Quang Khánh Vân và các cộng sự đã nghiêncứu chế phẩm Bokashi trầu, là chế phẩm được sản xuất dựa trên công nghệchiết xuất dịch chiết từ lá Trầu và lên men với các vi sinh vật có lợi, chế phẩm

tạo nên có thành phần chủ yếu: eugenol, chavicol, estradiol, cadinen và các hợpchất phenol khác từ dịch chiết lá Trầu và các vi sinh vật chủ yếu thuộc

nhóm Lactobacillus [10] Chế phẩm được sử dụng bằng cách trộn vào

thức ăn cho thủy sản nuôi Sản phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn, vừa

có khả năng tăng cường vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của độngvật thủy sản Chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên nên thân thiện vớimôi trường và nâng cao sức đề kháng cho động vật thủy sản Ngoài ra tômđược bổ sung chế phẩm có màu sáng hơn và vỏ kintin cứng hơn so vớitôm không được bổ sung chế phẩm [43]

Một số sản phẩm chế xuất từ thảo dược đã nghiên cứu thành công

và được thương mại hóa góp phần vào việc cùng nhà nông hướng tới quytrình sản xuất và nuôi trồng thủy sản xanh, sạch và bền vững như: SDK,TS.01, TS 999, TR 555, TS 1002,… Các sản phẩm này đã được kiểmnghiệm trong thực tế và được sự chấp nhận rộng rãi của người nuôi trồngthủy sản [40]

Như vậy, ngoài các vấn đề đã giải quyết được thì các nghiên cứuvẫn còn bộc lộ một số hạn chế như ĐVTS nuôi được thử nghiệm chưanhiều, các nghiên cứu trên thực địa rất ít, sản phẩm thuốc nguồn gốc thảodược còn rất khiêm tốn, ít có các nghiên cứu đề cập đến tác động củanồng độ, nhiệt độ sử dụng và thời gian bảo quản với các công thức kếthợp khác nhau đến tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thảo dược Mặtkhác, cũng chưa tách được kháng sinh nguyên chất để nghiên cứu ViệtNam cũng tồn tại những vấn đề cần giải quyết mà tình hình chung của thếgiới đang yêu cầu Tuy nhiên trong số các công trình đã được công bố thìcông trình nghiên cứu cề các loại thảo dược hoặc các chế phẩm từ thảodược để phòng và trị bệnh thường gặp trên cá Bống bớp vẫn chưa có Vìvậy trong đề tài này chúng tôi muốn thử nghiệm tác dụng kháng khuẩncủa dịch ép một số loại thảo dược đối với vi khuẩn Pseudomonas spp gâybệnh xuất huyết trên cá Bống bớp

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cá Bống bớp giai đoạn nuôi thương phẩm bị bệnh lở loét

- Chủng vi khuẩn Pseudomonas spp phân lập từ cá Bống bớp bị bệnh

2.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

+ Cây Cỏ lào (Chromolaena odorata)

- Hoá chất: Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm gram

- Môi trường nuôi cấy cơ bản NA bổ sung 2% muối vào nước

- Máy xay, cối, chày, chai lọ, tủ ấm, nước cất, giấy lọc

- Đĩa giấy tẩm nước ép thảo dược đường kính 6mm

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp gây bệnh lở loét trên cá Bống

bớp (Bostrichthys sinensis)

- So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch ép các loại thảo dược (củ Tỏi,

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn

Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá và động vật thuỷsản của Milla và Frerichs (1993), Buller (2004)

2.4.1.1 Phương pháp thu mẫu

Cá Bống bớp (Bostrichthys sinensis) có các dấu hiệu bên ngoài như

cá yếu, bỏ ăn, nằm ở đáy ao không hoạt động, bệnh lý điển hình là damất nhớt, có các vết loét ăn sâu vào cơ thể Trong quá trình thu mẫu, cáđược đo chiều dài, cân khối lượng trước khi lấy mẫu phân lập

2.4.1.2 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm

Dùng bông cồn 700 sát trùng cá Tiến hành giải phẫu cá để lấy mẫubệnh phẩm ở gan và thận (các cơ quan đích của vi khuẩn) Các mẫu gan vàthận được nghiền nát ra để lấy dịch, ghi chép các mẫu bệnh phẩm

2.4.1.3 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn

* Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

Sau khi thu được dịch từ mẫu gan và thận cá bệnh thì tiến hành nuôicấy vi khuẩn Dùng que cấy hơ nóng trước ngọn lửa đèn cồn để vô trùng, đểnguội Lấy dịch từ mẫu bệnh phẩm và cấy vi khuẩn vào đĩa petri với môitrường Nutrient Agar (NA) Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục đíchlàm cho khuẩn lạc đứng riêng rẽ

Hình 2.2 Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng

( 1 )

( 2 )

( 3 )

( 4 )

Thu mẫu bệnh phẩm (gan, thận)

Nuôi cấy, phân lập

Nhuộm gram

Đặc điểm, hình thái

khuẩn lạc

Thử phản ứng sinh hoá

Phân lập vi khuẩnMẫu cá bệnh

Sau khi cấy xong thì đưa môi trường đã cấy vi khuẩn và đặt vào tủ ấm

ở nhiệt độ 290C Sau thời gian 24 – 48h nuôi cấy trong tủ ấm thì vi khuẩn cóthể phát triển tốt Chọn các khuẩn lạc đặc trưng để nuôi cấy tăng sinh nhằmtăng lượng vi khuẩn lên

* Phương pháp phân lập vi khuẩn

Sau khi được giống vi khuẩn thuần, tiến hành nhuộm Gram để phân lập

vi khuẩn Phương pháp nhuộm Gram được thực hiện như sau:

- Lấy mẫu phết lên lam, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vôtrùng, dùng đầu que cấy dàn mỏng lên lam kính

- Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng

- Hơ cao lam kính có mẫu trên ngọn lửa đèn cồn, để cố định và diệt vi khuẩn

- Nhỏ tiếp dung dịch 1: thuốc tím Violet lên tiêu bản, để yên 30-60 giây

à Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút à Rửa nước nhanh,vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) để nghiêng đầu một bên lam để cồnchảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu à Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút à Rửa nước, đểkhô hoặc dùng giấy thấm khô, không được để xước mẫu

- Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000) Dướikính hiển vi ta có thể xác định được các nhóm vi khuẩn nhờ khả năng bắt màucủa chúng: vi khuẩn gram âm (bắt màu hồng) và vi khuẩn gram dương (bắtmàu xanh tím)

* Phương pháp định danh vi khuẩn

Theo Bergey 1994 và được bổ sung bởi Buller 2004 Kiểm tra đặc tínhsinh hóa của vi khuẩn để định danh: