Luận văn thạc sĩ ảnh hưởng của một số chất bổ sung đến khả năng sinh trưởng của cây đảng sâm (codonopsis javanica (blume) hook f ) trong ống nghiệm​

Ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm...28 3.1.2.. Ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính đến khả năng sinh trưởn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––––

TOR SOUVANHNA

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT BỔ SUNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÂY ĐẢNG SÂM

(CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.) TRONG

ỐNG NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––––

TOR SOUVANHNA

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT BỔ SUNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÂY ĐẢNG SÂM

(CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.) TRONG

ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trongluận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả luận văn

Tor SOUVANHNA

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đã tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiêncứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viênTrần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa Sinhhọc Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn sựgiúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinhhọc - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đểtôi thực hiện quá trình nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình cùng bạn bè đã động viên, khuyếnkhích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình họctập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả luận văn

Tor SOUVANHNA

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Đảng Sâm 3

1.1.2 Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch 4

1.1.3 Một số thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm 6

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 9

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 10

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 13

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 15

1.3.1 Auxin 15

1.3.2 Cytokinin 16

1.4 Một số chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy in vitro 17

1.4.1 Đường 17

1.4.2 Than hoạt tính 18

1.4.3 Nước dừa 18

1.5 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế

bào thực vật ở trong nước và ngoài nước 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.1.1 Vật liệu thực vật 23

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 23

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24

2.2.2 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 27

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm 27

́b ̉ Chương 3: KÊT QUA VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 28

3.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 28

3.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 32

3.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 35

3.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 39

3.2 Ảnh hưởng phối hợp của các chất bổ sung đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm33Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 36Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tạo rễ của cây

Đảng Sâm 38Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 40Bảng 3.7 Ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước dừa,

than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây

Đảng Sâm trong ống nghiệm 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây và củ Đảng Sâm 3Hình 3.1 Cây Đảng Sâm sinh trưởng và phát triển trong môi trường bổ

sung sucrose30Hình 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả năng tạo rễ của

cây Đảng Sâm 32Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm34Hình 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển

của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 37Hình 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tạo rễ của cây

Đảng Sâm 38Hình 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm 41Hình 3.7 Ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước dừa,

than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây

Đảng Sâm 43Hình 3.8 Ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước

dừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng tạo ra rễ củacây Đảng Sâm 43

Mặc dù có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng và kinh nghiệm

sử dụng dược liệu làm thuốc của nhân dân ta đã có từ xa xưa, nhưng nguồn tàinguyên đó đang ngày càng suy giảm nghiêm trọng, đa số các cây thuốc quýhiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng Nguyên nhân là do sự khai thác một cách ồ

ạt, không có kế hoạch và chưa chú ý đến việc tái sinh, bảo vệ rừng làm nguồncây thuốc Việt Nam bị tàn phá nhanh và cạn kiệt

Đảng Sâm hay còn gọi là (Sâm dây) là loại dược liệu quý được đưa vàosách đỏ Việt Nam từ năm 1996 Công dụng của Đảng Sâm đã được nghiên cứu

và được y học dân tộc đưa vào các bài thuốc chữa bệnh Đảng Sâm là một vịthuốc có rất nhiều công dụng chữa bệnh và phòng ngừa bệnh, giúp cho cơ thểkhỏe mạnh và đề kháng tốt Đông y coi Đảng Sâm là nhân sâm của ngườinghèo vì có mọi công dụng của nhân sâm nhưng lại rẻ tiền hơn Vì thế việcdùng Đảng Sâm trở nên phổ biến rộng rãi, đáp ứng được nhu cầu sử dụng gầnnhư không giới hạn trong y học dân tộc Tuy nhiên, nạn tàn phá rừng làmnương rẫy quá mức trong tự nhiên làm cho vùng phân bố của cây Đảng Sâm bịthu hẹp nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt Vì vậy, việc bảo tồn cây Đảng Sâm

là cần thiết

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đa ̃lựa chọn đề tài: “Ảnh hưởng

của một số chất bổ sung đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) trong ống nghiệm”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hàm lượng phù hợp của một số chất bổ sung đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của hàm lượng đường sucrose, nướcdừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm trongống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nướcdừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm trongống nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Đảng Sâm

Cây Đảng Sâm có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,

tên thường gọi: Đảng Sâm, Vú chó, Kim tiền báo, Thổ Đảng Sâm, Đảng Sâmnam, cây Đùi gà, Mằn rầy cấy (Tày), Cang hô (Mèo)

Đảng Sâm thuộc Chi Codonopsis.

Họ Hoa chuông (Campanulaceae).

Bộ Hoa chuông (Campanulales).

Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).

Ngành Hạt kín (Magnoliophyta) Giới Thực vật (Plantae) [13], [17].

Hình 1.1 Cây và củ Đảng Sâm

(Nguồn: cơ sở tài nguyên của Viện dược liệu (http://www.vienduoclieu.org.vn ) [34].

Đảng Sâm thường mọc ở ven rừng, nương rẫy đã bỏ hoang lâu ngày, trảng

cỏ tranh ở độ cao khoảng 700m trở lên đối với các tỉnh phía bắc và độ cao1.300m đối với các tỉnh phía nam Đảng Sâm là loài cây ưa ẩm, ưa sáng, có thểchịu bóng, ưa mọc nơi đất tốt, nhiều mùn [5]

Ở Việt Nam, Đảng Sâm mọc rải rác các tỉnh miền núi phía Bắc.

Trước đây có nhiều một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, YênBái, Tuyên Quang và một số ít như: Cao Bằng, Lạng Sơn và các tỉnh phíaNam, Đảng Sâm tập trung ở cao nguyên Langbiang (Tỉnh Lâm Đồng) và xungquanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Glay - Kon Tum), Quảng Nam - Đà Nẵng [5]

Trong 44 loài thuộc chi Codonopsis Việt Nam có 2 loài được mô tả và dùng làm thuốc với tên Đảng Sâm Thứ nhất là loài Codonopsis pilosula (Đảng

Sâm leo, Phòng Đảng Sâm, Đảng Sâm bắc) còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy

Codonopsis pilosula mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi Đông

Bắc và Tây Bắc Việt Nam, ở Lạng Sơn, Cao Bằng và khu Tây Bắc Thứ hai là

loài Codonopsis javanica Blume (Đảng Sâm, Kim tiền báo, Thổ Đảng Sâm,

Đảng Sâm nam) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (mèo),

có nhiều ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Yên Bái Ở miền núi ngườidân tộc đã trồng xen Đảng Sâm với ngô mang lại hiệu quả cao [4]

Đảng Sâm là loại dây leo thảo, sống nhiều năm Toàn cây có nhựa mủtrắng, nhất là bộ phận non và lá Rễ củ hình trụ dài, phân nhánh, nạc Lá mọcđối, có cuống, phiến lá mỏng, hình tim hoặc gần hình trứng, dài 2,0cm - 5,0cm,rộng 1,5cm - 3,5cm, mép lá khía răng cưa, mặt trên lá màu xanh nhạt, mặt dướimàu trắng xanh Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hình chuông, màu trắng, hoặc hơivàng, hoặc có vân tím Lá đài 5, hình mác nhọn Tràng hoa chia thành 5 thùytam giác nhọn, Nhị 5, Bầu 5 ô Quả nang, có núm, khi chín màu tím đen Hạtnhiều, nhỏ, màu vàng nâu [17]

1.1.2 Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch

a Kỹ thuật trồng

Đảng Sâm thường gieo thẳng, cũng có thể đánh trồng, trồng bầu Gieo

Đất trồng Đảng Sâm cần làm kỹ cho tơi nhỏ Lên luống cao 20 - 25cm,rộng 70cm Rạch rãnh dọc theo luống với khoảng cách 20 - 30cm, phân lợnhoặc phân trâu bò đã hoai mục và tro thảo mộc, trộn đều phân với đất, san mặtrãnh gieo cho phẳng.

Khi gieo trộn hạt với cát hoặc đất bột rắc vào rãnh cho đều tay, phủ mộtlớp đất nhỏ dày 5mm Mỗi hecta cần 3 - 4 kg hạt giống Nếu đất đủ ẩm sau 15ngày cây mọc [6], [28]

Đảng Sâm ra hoa vào tháng 7 - 8, quả chín vào tháng 9 - 10 Năm thứnhất lác đác cây ra hoa, nhưng từ năm thứ 2 toàn bộ cây ra hoa, quả Năng suất

và phẩm chất giống của cây năm thứ 2 thứ 3 đều cao Khi chín quả màu vàngcần thu hoạch kịp thời nếu không quả sẽ bị tách, làm hạt rơi rụng nhiều Đemphơi cả quả, khi khô đập nhẹ lấy hạt rồi phơi trong nắng yếu độ 2-3 ngày chokhô Hạt tốt là hạt không nhăn nheo và nâu bóng Bảo quản trong lọ sành haychum vại, để nơi mát mẻ và khô ráo [17]

b Chăm sóc

Làm cỏ mỗi tháng một lần Khi cây lên cao 3 - 4cm, tỉa lần thứ nhất đểcây còn lại cách nhau 2-3cm; cây cao 10cm tỉa lần thứ 2; nếu ruộng nhân giốngthì để cách nhau 20cm một cây Bón thúc phân nên kết hợp vào lúc tỉa cây

Khi cây cao độ 20cm dùng que dài 1 - 1,5m cắm trên luống để cho câyleo Làm giàn cần chú ý tạo cho luống cây thoáng gió tránh nắng để giúp câysinh trưởng tốt và hạn chế sâu bệnh hại Khi cây mới mọc có sâu xám cắnmầm, nhưng tác hại không đáng kể, có thể dùng thuốc trừ sâu xám rắc chungquanh gốc vào chiều mát Vào tháng 6 khi mưa nhiều, độ ẩm cao thường thấyxuất hiện bệnh gỉ sắt, lây lan nhanh và kéo dài trong mùa mưa Để hạn chếbệnh hại cần chú ý luân canh cải tạo đất, làm giàn thoáng, tăng cường chămsóc, có thể dùng hỗn hợp lưu huỳnh - vôi phun phòng trước mùa mưa, lúc trời

Ngoài ra, cây Đảng Sâm còn mắc bệnh thối lá xuất hiện vào tháng 7trong mùa mưa Khi bị bệnh, thân lá héo toàn bộ Có thể dùng thuốc Boóc đo0,5 - 1% phun phòng mỗi tuần 1 - 2 lần vào lúc nắng yếu [6], [28].

c Thu hái và chế biến

Đảng Sâm trồng càng lâu năm, phẩm chất rễ củ càng tốt Ở Trung quốctrồng trên 3 năm mới thu hoạch Thu hoạch vào mùa đông sau khi cây tàn lụihoặc sau khi thu giống Chọn ngày nắng ráo để lấy rễ củ, khi đào phải cẩn thậntránh gẫy nát, rửa sạch đất cát, phân loại to nhỏ đem phơi nắng hoặc sấy nhẹ.Không nên phơi quá khô rễ củ dễ bị gẫy nát ảnh hưởng đến mẫu mã [6], [28]

d Tác dụng của cây Đảng Sâm

Đảng Sâm có tác dụng chống mệt mỏi và tăng cường sự thích nghi của

cơ thể đối với môi trường nhiệt độ cao

Đối với hệ tiêu hóa, Đảng Sâm có tác dụng tăng cường trương lực củahối tràng và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng hàm lượng thuốc

Đối với hệ tim mạch, Đảng Sâm làm tăng cường độ co bóp của tim, tănglượng máu cho não, chân và nội tạng

Đối với máu và hệ thống máu, Đảng Sâm có tác dụng làm tăng số lượnghồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đôngkhô mà không có tác dụng tán huyết [6], [28]

1.1.3 Một số thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm

1.1.3.1 Một số thành phần hóa học của cây Đảng Sâm

Nghiên cứu trên cây Đảng Sâm ở trong nước chủ yếu là về phân tíchthành phần hóa học và các tác dụng dược lý của vị thuốc quý này Năm 2002,

công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng Sâm

Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh là nghiên cứu đầu tiên

công bố các thành phần hóa học của cây Đảng Sâm Việt Nam Bằng một sốphương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm sống và cao sâm,nhóm tác giả đã mô tả đặc điểm thực vật của cây Đảng Sâm mọc ở Sa Pa và

các thành phần có trong rễ Đảng Sâm khô và tươi đó là: đường khử, axit amin,chất béo và saponin; thành phần và hàm lượng của các loại axit amin có trong

rễ Đảng Sâm [3]

Cũng chính hai tác giả Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh cũng đãcông bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong Đảng Sâm.Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm lượng saponin vào khoảng3,12% Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã công bố về hàm lượng đường khửkhoảng 14,6% đối với các mẫu cây sống, và 29,5% đối với các mẫu đã qua chếbiến [3]

1.1.3.2 Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm

Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, lang y đã biết dùng củ sâm phơi khô đểdùng trong các bài thuốc chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe Ngày nay, với sự pháttriển của khoa học, con người đã biết tách chiết riêng những thành phần có tínhchất dược trong củ sâm tạo thành thuốc Công nghệ tách chiết hoạt chất đã giúpcho việc không phải sử dụng nguyên củ sâm cùng những thành phần không cócông dụng chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khoẻ

Các loài sâm nói chung cũng như Đảng Sâm nói riêng chứa rất nhiềuhoạt chất sinh học Các hoạt chất này có nhiều tính chất dược và được sử dụngnhiều để làm thuốc Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như: terpen,axit amin, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid và hợpchất saponin là hoạt chất chính tạo nên những công dụng của nhân sâm [3]

Củ Đảng Sâm có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, làm long đờm , nhưngvới liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi Dân gian thường lấy củĐảng Sâm ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể, làm mát gan.Canh rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi, nhưng không

có nhớt Đảng Sâm có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêm khớp nó giúpgiảm viêm sưng và giảm đau Đảng Sâm còn giúp giảm táo bón Dùng ĐảngSâm giúp giảm cơn ho và suyễn; dùng cho một số trường hợp nam giới bất lực

Đảng Sâm được dùng nhiều trong những bệnh về da như ghẻ; dùng làm bàithuốc trị giun sán; dùng trong bệnh sỏi thận, viêm thận; giải độc cho gan Bộphận dùng toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ: Lá có vị hơi đắng, cay; tínhlạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao) Rễ có vị ngọt, cay, tính mát Côngdụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc Chủ trị, toàn cây chữa tiểu đườngdạng 2 Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp,tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu [5], [13].

Đối với các hệ cơ quan trong cơ thể, Đảng Sâm có tác dụng chống mệtmỏi và tăng cường sự thích nghi của cơ thể đối với môi trường nhiệt độ cao.Đối với hệ tiêu hóa, Đảng Sâm có tác dụng tăng cường trương lực của hối tràng

và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng hàm lượngthuốc Đối với hệ tim mạch:làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng.Đối với máu và hệ thống máu: tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc

tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không cótác dụng tán huyết Ngoài ra, Đảng Sâm còn có tác dụng hạ huyết áp, tăngcường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn…[13], [32]

Các bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng Đảng Sâm

(1) Trị phế hư, ích phế khí, tỳ vị hư yếu, khí huyết đều suy, không có sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang

(2) Trị trung khí suy nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh

(3) Trị thiếu máu, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng

(4) Trị hư lao, nội thương, trường vị trung lãnh, hoặc tả lỵ lâu ngày, khí suyễn, phiền khát, phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản

Một số đơn thuốc có sử dụng Đảng Sâm

(1) Chữa cơ thể suy yếu, mệt mỏi: Dùng Đảng Sâm 15 - 30g, sơn dược (củ mài), đại táo (táo tàu), mỗi thứ 9 - 15g, sắc nước uống trong ngày

(2) Chữa ho do yếu phổi: Dùng Đảng Sâm tươi 30g, bách bộ 9g, sắc nước uống trong ngày.

(3) Chữa sản phụ thiếu sữa: Dùng Đảng Sâm, đương quy, mỗi thứ 10 15g, hầm với thịt gà ăn Hoặc dùng Đảng Sâm, trái vẩy ốc (tức “quả xộp”), mỗi vị30g, sắc uống

-(4) Chữa khí hư: Dùng Đảng Sâm, rễ bùng bục, mỗi thứ 15g, hải phiêu tiêu (mai cá mực) 24g, rễ rau dền gai 30g, sắc nước uống mỗi ngày trong một tháng

(5) Chữa trẻ nhỏ đái dầm: Dùng Đảng Sâm 20 - 30g, thịt lợn nạc 50 - 100g, hầm chín ăn (uống nước canh, ăn thịt)

(6) Chữa trẻ nhỏ cam tích: Dùng Đảng Sâm 15g, thịt lợn nạc 50 - 70g, cùng hầm chín, chia ra ăn trong ngày [13], [32]

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính

của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểmsinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây Theo các công trình nghiên cứuthì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếpđến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạchbệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau:(1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công tác chọn giống

(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giốngcác loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây cảnh,cây dược liệu…

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virus

(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai

(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1], [30].

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng cây giống tăng lên nhanh chóngtrên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lươngthực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường toàn cầu

Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân

giống nào có được [11]

Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản

xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ

nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.Tốc độ này khoảng 36 - 1012/ năm như khoai tây từ 50 ống của ngân hàng giốngthế giới sau 6 tháng nhân giống được 10 vạn cây khoai tây

Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây

Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh

vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh

Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000cây dâu tây cũng chỉ nặng 15 kg ); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40Ctrong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%

Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hànhtrong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [22]

Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô

phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận kháccủa cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giốngcây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương phápthông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm

đồng nhất về mặt di truyền Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩmhoàn toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mấttrong tự nhiên [22].

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấyđược tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp củađỉnh sinh trưởng [1] Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậyrất khó thành công Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy làlàm sạch virus cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởngđược tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnhsinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm [22]

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tươngquan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi

vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồicũng giảm Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng,hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng

Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu Mộtđỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một haynhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [22]

Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinhtrưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từchồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, trong thực

tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh [1]

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là:

+ Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như khoaitây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như dứa sợi,mía…

+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)

Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa,huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm cóthể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoànchỉnh Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu đượchàng triệu cá thể Do đó đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn như ở phong lan vì cóphương thức sinh sản qua dạng dẻ hành nên nhân giống vô tính hoa lan đạt được

thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi Nhờ đó mà hoa Cymdium vốn đắt trở

nên có giá phải chăng và được nhiều người ưa chuộng [1]

Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở cáccây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, câythông, bồ đề… Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây:

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinhtrưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể thực

vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được Các bộ phận đó là:

Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh… mảnh lá ở thuốc lá, cà

chua, bắp cải cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…

và nhánh củ ở tỏi, hành…[1]

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo:

Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnhtrực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây màcây cũng khá đồng đều về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mônuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹokhi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Do đó nhất thiếtphải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được câytái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạchvirus [14], [22], [29]

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau [29]:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹthường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấymẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non… Mô chọn đểnuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạchbệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị Tùytheo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng [29]

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạnnày được tiến hành theo các bước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn

môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôitrong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thờigian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các

cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất

4 lần cấy các mảnh [29]

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quátrình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khimẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vôtính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người

ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Thành phần

và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhânnhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển.Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng Giai đoạn nhân nhanhchồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu Ví dụ, từ một đỉnhsinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đối với các câykhác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từcây mẹ ban đầu [29]

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh,nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trựctiếp ra đất Thông thường giai đoạn này cần 2 - 6 tuần [29]

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thínghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng

của quy trình nhân giống in vitro Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đất khi

cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ

và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm Quá trình thích nghivới điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây đượcchuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khókhăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon baophủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng

có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọtbiển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [29]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung mộthoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rấtcần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy,yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàmlượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinhtrưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin vànhóm cytokinin [9], [12]

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn vàchủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thựcvật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổnghợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [12]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tớihàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kíchthích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có cácảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chíncủa quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trưởng thông quamối tương quan hàm lượng giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trìnhtrên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy

thuộc vào hàm lượng tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khácnhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin

là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nởcủa vách tế bào [2], [12]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất đãđược sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAAđược tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất cógiá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bịphân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và visinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ củanhững lát cắt thân Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự nhưIAA, trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khảnăng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [12]

Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sựphân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạorễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiricaxit),IAA (3-indol axetic axit), NAA (naphthalen axetic axit), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy axetic axit) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sửdụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường rachồi Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [12]

1.3.2 Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin Loại cytokinin đầu tiên pháthiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài racòn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người tathu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN [12]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) làmột phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BAđược sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các hàmlượngkhác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [12].Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúngtương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phầncủa các glycoside [12]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokinin điềuchỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khiphân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủcủa hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gâynên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá dokích thích sự lớn lên của tế bào [29]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, tạo

và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vôtính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồiđỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là:kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [29]

1.4 Một số chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy in vitro

1.4.1 Đường

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ ánhsáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy việc đưa vào môitrường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc Hai dạng đường thường

sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụngthông dụng hơn cả hàm lượngthích hợp phổ biến từ 2% - 3%, song tùy vào

mục đích nuôi cấy có thể thay đổi xuống tới 0,2% (trong chọn dòng) và tănglên đến 12% (nhằm gây ra cảm ứng mất nước).

Các loại đường khác nhau như fructose, lactose, galactose… cũng đượcthử nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được sử dụng trong trường hợpđặc biệt [19]

1.4.2 Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chấtphenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫunghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trườngtrở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của

rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung

nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường [24]

1.4.3 Nước dừa

Trong nuôi cấy mô và tế bào người ta có thể bổ sung một số hỗn hợp tựnhiên như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mỳ, dịch chiết nấm men, dịch thủyphân casein… làm nguồn bổ sung amino axit hoặc vitamin, đường, khoáng…

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng

và kích thích sinh trưởng Các chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã đượcchứng minh là myo-insitol và một số amino axit khác Nước dừa được sử dụng

để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây [19]

1.4.4 Khoai tây

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đềugồm 1 số thành phần như muối khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamim, cácamino axit, nguồn cacbon, các chất điều hòa sinh trưởng và các chất hữu cơ bổsung: nước dừa, dịch chiết nấm mem, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô….Tất

cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoạc nhiều chức năng trong sự sinh

trưởng và phân hóa của thực vật nuôi cấy in vitro Như vậy việc bổ sung hàm

lượng khoai tây vào môi trường nuôi cấy mô tế bào cho thấy có sự khác biệtgiữa các MS cơ bản không bổ sung hàm lượng khoai tây [37]

1.5 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước

Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống câytrồng đã được triển khai trên 20 năm nay Nhân giống thương mại quy mô lớn

đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệucây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống míamới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và keo laiđạt 3 triệu cây/năm Công nghệ nhân giống cũng được áp dụng trên nhiều câytrồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan

và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả…Việc thương mại hóa các quy trình côngnghệ trên đây là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng côngnghiệp vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [14]

Đối với tài nguyên cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng.Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quámức Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng vàobảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được nhiều tác giả quan tâm như:

Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phú Lịch và cs đã tiến hành

nhân giống Thanh hao hoa vàng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro Nghiên cứu

cho thấy có thể sử dụng môi trường MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sungBAP 1,5 mg/l hay kinetin 1,5 mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môitrường bổ sung NAA 0,3 mg/l là môi trường ra rễ thích hợp nhất [11] Trongmột nghiên cứu khác về cây Thanh hao hoa vàng của tác giả Nguyễn Thị KimUyên và cs (2007) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự nhân chồi là LV có

bổ sung BAP 0,3 mg/l, môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bàosoma là LV + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l [27].

Nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh của tác giả NguyễnTrung Thành và cs (2007) đã cho thấy môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-

D 1 mg/l là tối ưu cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh;

số rễ bất định hình thành cao nhất và tăng trưởng tốt ở hàm lượng IBA 2 mg/l;hàm lượng đường 50 g/l là tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ bất định [24]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành nhân

giống vô tính in vitro cây Lô hội và thu được kết quả: Môi trường MS bổ sung

BAP 2,5 mg/l cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt Bổ sung than hoạt tính

1,5 - 2 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt [21].

Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã đưa ra môi trường

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi

trường nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trường tạo

rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [25]

Vũ Thị Lan và CS (2011) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự sinhtrưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là SB1 (MS + NAA2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP); SK6(MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l +kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nước dừa) và SN10 (MS +NAA 2,0 mg/l + 20% nước dừa) [10] Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo để

nhân nhanh in vitro cây Hoắc hương, tác giả Vũ Thanh Sắc và cs (2012) đã đi

đến kết luận, môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá và thân cây Hoắchương là môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l; hàm lượngthan hoạt tính

thích hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá hoắc hương in vitro là 0,5 g/l; môi trường

tái sinh chồi từ mô sẹo cây hoắc hương tốt nhất là MS bổ sung than hoạt tính0,5 mg/l, kinetin 1,0 mg/l [16]

Nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) đã cho thấy: môi

trường thích hợp nhất để thực hiện nhân nhanh in vitro Lan Kim Tuyến là

Knud* + BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + sucrose 20 g/l +nước dừa 100 ml/l + dịch chiết khoai tây 100 ml/l + agar 7g/l Môi trường thíchhợp nhất cho sự hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh là: Knud* + IBA 0,5 - 1 mg/lhoặc NAA 1 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 5% +agar 7g/l [20]

Kỹ thuật nhân giống cây Sa nhân tím của Nguyễn Văn Hồng và cs(2013) đã cho thấy, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ

lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi làmôi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổsung BAP ở hàm lượng 4 mg/l kết hợp với IAA ở hàm lượng 0,1 mg/l; môitrường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l +Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung IBA 0,1 mg/l [8]

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên

sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của

Nguyễn Việt Cường và cs (2013), cho thấy dịch chiết chuối ở hàm lượng 10g/l, tảo spirulina ở hàm lượng 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinhtrưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng

sinh trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở hàm lượng 2 mg/l [4].

Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy

in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác

định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời xác định

được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [15]

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài và cs (2013) đã tiến hành nghiêncứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình

thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹotăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng; ánh sángđèn LED đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho

sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [18].

Đối với cây Đảng Sâm hiện nay các tài liệu nghiên cứu rất hạn chế Việcnghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu, nhất là dược liệu hoang dại

là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của côngnghệ sinh học thực vật Do đó việc nghiên cứu nhân giống cây Đảng Sâm bằng

kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn

Hi vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn để có thể xácđịnh được loại, hàm lượng của các hợp chất hóa học trong cây và tác dụng chữabệnh của nó Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn và ứng dụng nhiềuhơn của cây Đảng Sâm trong y học

Các nghiên cứu ngoài nước chủ yếu được thực hiện trên các loài họ hàng

với cây Đảng Sâm Việt Nam Codonopsis sp Do điều kiện khoa học tiến bộ nên

các khía cạnh nghiên cứu cũng rất đa dạng Slupki và đồng tác giả (2011) đã

công bố về quá trình vi nhân giống cây Codonopsis pilosula (Đảng Sâm bắc).

Nhóm nghiên cứu đã tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi từ chồinách là BAP 0,1 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l số lượng chồi có thể thu được

lên tới 69 chồi/ nách Tỉ lệ cây tạo rễ in vitro là 98% trong môi trường MS bổ

sung IAA 0,5 mg/l [32] Qui trình tạo mô sẹo từ lá là tốt nhất trong các nguồn

nguyên liệu đoạn thân, hạt ở Codonopsis lanceolata (một loài trong họ hoa

chuông) [31] Bên cạnh đó còn rất nhiều nghiên cứu về xác định thành phầnhóa học và công dụng của chúng, các phương pháp chiết xuất hợp chất trong

các loài Codonopsis sp ứng dụng trong lĩnh vực y dược.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Sử dụng cây Đảng Sâm được nuôi cấy trong ống nghiệm của phòng thínghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạmThái Nguyên - Đại học Thái Nguyên cung cấp

2.1.2 Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Sử dụng các loại hóa chất có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như cácchất kích thích sinh trưởng BAP, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch agar,than hoạt tính, khoai tây…

Thiết bị

Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốcthủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy:dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) củahãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy(Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào

thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyêncung cấp

Thời gian nghiên cứu : Thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 04

năm 2017 tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học

- Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS

Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm

để khi cấy mẫu được dễ dàng Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp

24

suất 0,7at - 1,2at Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồngcấy vô trùng.

Các bước cụ thể trong pha môi trường nuôi cấy:

(1) Xác định công thức cần pha

(2) Đong khoảng 0,6 lít nước cất, đun trên bếp điêṇ

(3) Dùng ống đong hoặc pipet để lấy dung dịch MS cơ bản và các chất kích thích sinh trưởng

(4) Cân đường sucrose, agar, than hoạt tính để riêng từng loại

(5) Khi nước cất gần sôi thì đổ đường vào, khuấy tan, sau đó cho thạch

và than vào khuấy tan hết

(6) Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở trên

(7) Bổ sung nước cất vào hỗn hợp trên cho đủ 1 lít

(8) Chuẩn đô ̣pH của hỗn hơp ̣ trong khoảng từ 5,6 - 5,8

(9) Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình 50 ml môi trường) Làm nút bông, nút giấy cho các bình tam giác

(10) Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 0,7at - 1,2at Sau khi khử trùng

để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.

Để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân giống cây Đảng Sâm trong ốngnghiệm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.Mẫu làđoạn thân cây Đẳng Sâm được cây trong môi trường MS cơ bản có bổ sungBAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l +chất phụ gia ( đường, dịch triết khoai tây, thanhoạt tính) với nồng độ thay đổi Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản +BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l không có các chất bổ sung [7]

(1) Các đoạn thân mang nách chồi được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung đường sucrose với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l

(2) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản +agar 9,0g/l + bổ sung than hoạt tính với hàm lượng từ 0,5g/l; 1g/l; 1,5g/l; 2g/l.

(3) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung nước dừa với hàm lượng từ 50ml/l; 100ml/l; 150ml/l; 200ml/l.

(4) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản +agar 9,0g/l + bổ sung khoai tây với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l

Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân) Thí nghiệm được lặplại 3 lần

Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm sau các thời gian: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau:

+ Chiều cao chồi (cm)

+ Chất lượng chồi

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh đậm

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh nhạt

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá vàng nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng

Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng hoặc màu trắng sữa

Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng nâu

Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu nâu đen

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước dừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.

Sử dụng MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l và các chất bổ sung

có hàm lượng tốt nhất ở nội dung 1 Đối chứng là môi trường MS cơ bản +BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l không có các chất bổ sung

Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân) Thí nghiệm được lặplại 3 lần Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau các thời giantheo dõi: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy bằng các chỉ tiêu theo dõi như nộidung 1

2.2.2 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu

Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bìnhmẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05.Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [26] Cácphương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theotiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, phương pháp phân tích phươngsai một nhân tố

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu

tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định

+ Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độchiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 - 12 giờ/ngày

+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì trong khoảng 25 ± 20C.+ Độ ẩm: Phòng nuôi cấy có độ ẩm khoảng 70%

Chương 3

KÊT QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm

3.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm

Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quanghợp rất thấp do thiếu clorophin, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác Vì vậy phảiđưa thêm hợp chất carbonhydrate vào thành phần môi trường nuôi cấy và hợp chấtcarbonhydrate được sử dụng phổ biến là đường sucrose Lý do nó được sử dụngphổ biến là nó ổn định trong hấp khử trùng và được cây sử dụng

Đường sucrose vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu cấy, đồng thờicòn tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường Hàm lượngđường cao mô nuôi cấy khó hút được nước Hàm lượng đường quá thấp là mộttrong những nguyên nhân gây hiện tượng mọng nước ở mẫu cấy Đường còn cóvai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định [24]

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các hàm lượng đường sucrose đến sư ̣sinhtrưởng của cây Đảng Sâm, cấy đoạn thân mang nách chồi có kích thước tươngđối bằng nhau (1cm) vào môi trường đối chứng (MS cơ bản + BAP 0,6mg/l +IBA 0,6mg/l + agar 9,0g/l) vàmôi trường thăm dò hàm lượng đường sucrose10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l Kết quảthu đươc ̣ ởbảng 3.1 vàhình 3.1

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, các công thức có thăm dò hàm lượng đườngcho khả năng nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1)không có đường sucrose Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,24 (sau 2 tuần),1,38 (sau 4 tuần) và 1,60 (sau 6 tuần) Các công thức thí nghiệm còn lại cho sốchồi/mẫu đạt từ 1,86 đến 2,55 (sau 2 tuần), 2,20 đến 3,34 (sau 4 tuần) và 2,33đến 3,82 (sau 6 tuần) Trong đó, công thức 4 bổ sung đường với hàm lượng

30g/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 2,55 (sau 2 tuần), 3,34 (sau 4 tuần) và 3,82 (sau

6 tuần) Các công thức thí nghiệm 2; 3; 5 cho số chồi/mẫu lần lượt là 1,86; 2,08;1,51 (sau 2 tuần ), 2,20; 2,47; 1,80 (sau 4 tuần) và 2,33; 2,64; 1,90 (sau 6 tuần)

Bảng 3.1 Ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả năng nhân chồi

và sự sinh trưởng của cây Đảng Sâm

29