Luận văn thạc sĩ đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Hà Nội – 2014BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ THU PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLY

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Trang 2

Hà Nội – 2014

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THỊ THU PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC – NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành

Mã số

: Vi Sinh Vật Học :60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ THANH BÌNH

2

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trang 3

Hà Nội – 2014

3

Trang 4

MỞ ĐẦU

Những vấn đề nan giải đối với thực phẩm hiện nay không những phải đối mặtvới thực trạng mất an toàn vệ sinh nghiêm trọng mà còn phải đáp ứng các nhu cầu tiêudùng ngày càng cao về đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu Trướcthực trạng đó, nghiên cứu nhằm tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn là một

ưu tiên trong xu hướng “đóng gói tích cực, active packaging” Đóng gói tích cực làgiải pháp trong đó có sự tương tác giữa vật liệu bao gói, thực phẩm và môi trường đểgia tăng thời gian bảo quản, độ an toàn, trong khi vẫn bảo đảm chất lượng, các tínhchất cảm quan, độ tươi ngon của thực phẩm

Trong hơn thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu, tìm kiếm, cácloại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và vật liệu thay thế các polymer dầu mỏ,giảm thiểu ô nhiễm môi trường Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh họcnhư bacteriocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong bảo quản, chế biến thực phẩm đangđược quan tâm nhiều Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm visinh vật gây bệnh, gây hỏng thối hỏng thực phẩm được xem là an toàn (GRAS) Hiệnnay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia an toàn có ký hiệu quốc tế E234, đã vàđang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia Sử dụng nisin để bảo quảnthực phẩm đã khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bảo quản bằng hoáchất, chất kháng sinh, chiếu xạ Ngoài ra, nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bảnchất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịuđược nhiệt độ và chịu áp suất cao Vì vậy, nisin là ứng cử viên hàng đầu cho hướngnghiên cứu này

Trong số các polymer phân hủy sinh học, axit polylactic (PLA) được tổng hợp

từ axit L-lactic, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật Vì thế,PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polymer sinh học có khả năng thaythế các polymer từ dầu mỏ Hiện nay, một số loại sản phẩm nhựa sinh học PLA đã rađời như BiotaTM-Chai đựng nước bằng nhựa PLA, NobleTM- Bình đựng nước hoa quảbằng nhựa PLA, DannonTM-hộp đựng sữa chua bằng nhựa PLA

4

Trang 5

Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩnnguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực phẩm có khả năng kháng khuẩn vàphân hủy sinh học- rõ ràng là một giải pháp “thân thiện môi trường” và là lựa chọn căn

cơ cho sự phát triển bền vững

Xuất phát từ những thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh

giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm” với mục tiêu :

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin

- Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin

- Nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin

- Ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua)

và bánh cốm

5

Trang 6

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 HIỆN TRẠNG VÀ XU HƯỚNG NGHIÊN CỨU BAO BÌ THỰC PHẨM KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN HỦY SINH HỌC

Tình trạng thực phẩm hiện nay đang đứng trước các nguy cơ mất an toàn vệsinh cao trong khi lại phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm đảm bảochất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu Xu hướng đó đã dẫn tới những thay đổimạnh mẽ của ngành công nghiệp bao bì và đóng gói thực phẩm [18; 71] Các loại bao

bì an toàn và thân thiện môi trường được phát triển Các loại chất bảo quản có nguồngốc sinh học đang dần thay thế các chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh Hướngnghiên cứu tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn, có khả năng ức chế, tiêudiệt vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, bảo đảm chất lương, độ tươi ngon củathực phẩm, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường đang thu hút nhiều

nghiên cứu [12; 46; 47; 48; 51; 56; 58; 82] Trong thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công

trình nghiên cứu, tìm kiếm, sử dụng các vật liệu có nguồn gốc sinh học để dần thay thếcác polyme dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Hiện nay, các loại vật liệu phânhủy sinh học như axit polylactic (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB) được xem là cácứng cử viên cho hướng phát triển này Bởi vì, PLA, PHB có khả năng phân hủy trong

tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, không phụ thuộc vào tăng giá do quá trìnhkhan hiếm của dầu mỏ Trong số các polymer phân hủy sinh học, PLA là loại đượctổng hợp từ axit L-lactic, loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật từ cácnguồn nguyên liệu rẻ, có sẵn như ngô, khoai, sắn hoặc từ sinh khối thực vật Vì thế,PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polyme sinh học có khả năng thaythế các polyme từ dầu mỏ

Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacterocin, trong đó,đặc biệt là nisin trong quá trình bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâmnhiều Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gâybệnh, gây thối hỏng thực phẩm và được xem là an toàn (GRAS) Nisin là mộtbacteriocin, cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp

bởi một số chủng thuộc loài Lactococcus lactis Nisin được Tổ chức Nông Lương và Y

tế thế giới (FAO/WHO), cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép

6

Trang 7

sử dụng trong bảo quản và làm phụ gia thực phẩm Hiện nay, nisin nằm trong danhmục các chất phụ gia có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thựcphẩm ở hơn 50 quốc gia Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươisống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước Sửdụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại

dư lượng trong thực phẩm Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làmgiảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng đểbảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục đượcnhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ Nisin

có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ khángkhuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao [18]

Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polyme sinh học và chất kháng khuẩn, để tạo

ra sản phẩm bao bì bảo quản thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh họcđang là mục tiêu của nhiều nhóm nghiên cứu Trong công trình của Kritos và cộng sự[51], đã sử dụng màng natri – casein kết hợp với nisin để tạo ra màng kháng khuẩn Trongkhi đó, Xu và cộng sự [81] lại tạo màng từ glucomana – gellan - nisin, Millette và cộng sự[58] tạo ra màng kháng khuẩn sinh học bản chất alginate - nisin Gần đây, trong công bốcủa Liu và cộng sự [56], các tác giả đã sử dụng 80 % PLA, 20 % pectin và kết hợp với

200 IU nisin/g để tạo ra loại polyme sinh học có tính kháng khuẩn

An toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt nam là một vấn đề vô cùng cấp bách, đanggây nhiều bức xúc, vấn nạn cho xã hội Các loại thực phẩm được chế biến, bảo quản vàvận chuyển hầu hết trong điều kiện không an toàn Thực phẩm chủ yếu chỉ được đựng

và bao gói bằng bao giấy và các màng polyme có nguồn gốc dầu mỏ Những loại màngnày được tạo ra từ các loại polyme như polyethylene (PE), polypropylene (PP),polyvinylclorua (PVC) Nhược điểm của các loại màng này và bao giấy là, ngoài việcgây tổn thất chất dinh dưỡng trong quá trình bảo quản, lại không có tác dụng đối với visinh vật gây bệnh thực phẩm nội tại hay xâm nhập từ bên ngoài Mặt khác, các màngnày không có khả năng tự phân hủy, nên lại là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường.Ngoài ra, việc bảo quản thực phẩm thường lạm dụng quá mức các chất hóa học và đặcbiệt là việc sử dụng các chất kháng sinh trong y học vào bảo quản, chế biến thực

7

Trang 8

phẩm, đây là một nguyên nhân dẫn đến tình trạng phát tán nhanh tính kháng thuốc, lànguy cơ lớn đối với sức khỏe con người.

Việt Nam chưa có nghiên cứu về bao bì có tính kháng khuẩn và tự phân huỷ.Tuy đã có một số nghiên cứu về polyme sinh học như là chitosan, tinh bột biến tính vàmột số polymer được tách từ tự nhiên nhưng những nghiên cứu về chất kháng khuẩn

có nguồn gốc sinh học đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Lê Thanh Bình vàcộng sự [3; 9] Tuy nhiên, hầu hết các công trình trên chủ yếu tập trung vào vấn đề tạochủng giống, năng suất, công nghệ sản xuất, sản phẩm, hướng nghiên cứu tạo vật liệubao bì thực phẩm chưa được đề cập

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về nisin

Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn

nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có

mặt trong nước tiểu [73] Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cộng sự cũngkhám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vậtkhông gây bệnh, có tính đối kháng Năm 1925, Gratia đã phát hiện đã ra sự ảnh hưởng

lẫn nhau của hai chủng E coli Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng L lactis Năm 1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng

E coli V có khả năng ức chế E coi và gọi tên là “colicine” Vào năm 1953, Jacob và

cộng sự đã sử dụng “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn cóbản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữcolicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng

thuộc loài E coli và có quan hệ gần họ với họ Enterobacteriaceae Chính vì thế mà ý

nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: cóphổ kháng khuẩn hẹp và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [18] Sau

đó, phát hiện bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid Tạiđây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng

vi khuẩn Gram dương [18; 73] Bateriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn Gram dươngkhông có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn

8

Trang 9

colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn vàkhác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào và nó có thể có trình tự đầuđược phân chia trong giai đoạn thành thục [18; 45].

Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin – một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra

có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứurất nhiều về các đặc tính sinh hóa cũng như các đặc điểm về di truyền ở cấp độ phân tửbởi vai trò của nó trong vấn đề bảo quản Bacteriocin có đặc tính giống như một khángsinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh.Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tácdụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn công… [19] Bacteriocin có bản chấtprotein, được tổng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp, có khả năng ức chế các

vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [21; 25; 73] Theo Joger và cộng sự năm 2000,bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân hủy rất nhanh bởienzym phân hủy protein trong hệ tiêu hóa của người Vì vậy, để nghiên cứu bản chấtprotein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúngvới các enzym phân hủy protein

1.2.2 Cấu trúc của nisin

Nisin có công thức C143H230N42O37S7, là một bacteriocin thuộc nhóm I- còngọi là nhóm lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm Nisin cấu tạo gồm 34 axitamin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài

L lactis subsp lactis, thường được viết là L lactis [18; 44; 77] Nisin được phát hiện

từ năm 1928 Tuy nhiên, phải mãi tới năm 1957 mới xuất hiện nisin đầu tiên trong các

phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại, để bảo quản các sản phẩm làm ra Cũngtrong năm này, hãng Aplin và Barrett đã đưa ra chế phẩm nisin thương mại sử dụng trongthực phẩm Mặc dù vậy, giá trị của nisin trong bảo quản thực phẩm cũng chỉ được xác lậptrong khoảng ba thập kỷ lại đây Trong khi những nghiên cứu cơ bản và công nghệ ngàycàng được quan tâm nhiều hơn [18; 67; 77; 85] Dạng chế phẩm của nisin sẵn có nhấthiện nay trên thị trường là Nisaplin, với thành phần 2,5 % nisin

Cấu trúc của nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971 Nisin là mộtchuỗi polypeptide gồm 34 axit amin tạo thành 5 vòng cấu trúc A, B, C, D, E, được nối

9

Trang 10

với nhau bằng cầu nối disulfide (hình 1.1) Có ít nhất 6 dạng nisin đã được phát hiện,

ký hiệu từ A đến E và Z Đến nay, 4 loại nisin đã được nghiên cứu đặc tính là nisin A,

Z, Q và nisin U Trừ trường hợp nisin U được tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis, tất cả các nisin còn lại đều do loài L lactis sinh ra.

Phân tử nisin không chứa các axit amin thơm, nên không hấp thụ ở bước sóng

280 nm Các axit amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile),được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan Có thể vì các nhómnày rất quan trọng để đảm bảo nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích Cấutrúc gồm 5 vòng của nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề khánglại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt

Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Dal.Tuy nhiên, do các phân tử nisin có thể tương tác, liên kết với nhau thông qua các nhómaxit dehydroamin và các nhóm amin Vì vậy, nisin có thể tồn tại ở dạng dime haytetrame, với khối lượng phân tử tương ứng là 7000 Dal và 14000 Dal

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử nisin

Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây, chứng minh nisin baogồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen nhưsau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z

Trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu 2 dạng nisin là A và Z, chúng khá bền vững.Cấu tạo của nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một axit amin ở vị trí thứ 27, histidinetrong cấu trúc của nisin A, trong khi axit aspartic ở nisin Z

Do có bản chất là một protein, nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin phụthuộc nhiều vào pH của môi trường xung quanh Mức độ hoà tan của nisin phụ thuộc

10

Trang 11

rất nhiều vào pH Nisin kém bền vững và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao.

Nisin là một bacteriocin bền nhiệt Sau 60 phút xử lý ở 100 oC, nisin vẫn còn

50 % hoạt tính Ở 121 oC, sau 10 phút, hoạt tính còn 46 %, sau 60 phút còn 22 % Độbền nhiệt của nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao So vớicác bacteriocin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn

Nisin không có khả năng tác động đối với vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấmmốc Trong điều kiện thông thường, nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram

dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria, Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, Clostridium.

Nisin tác động có hiệu quả cao hơn ở trong các sản phẩm thực phẩm có độ pH thấp, cótrải qua giai đoạn gia nhiệt, như các sản phẩm rau quả, thực phẩm đóng hộp Một trongnhững cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm là do sự tạo thànhcác lỗ thủng, các kênh trên màng nguyên sinh chất, nguyên nhân gây thất thoát cácphân tử, các ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển protonPMF (Proton Motive Force), ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tếbào [43; 59; 68]

Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nghiên cứu nhiều hơn.Phần lớn các quan điểm cho rằng, để tác động đối với vi khuẩn, nisin phải trải qua haibước chính:

- Ban đầu bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua các thụ thể

- Sau đó xâm nhập qua thành tế bào và tạo các lỗ trên màng nguyên sinh chất vàthông qua các cơ chế theo mô hình “kiểu chèn”, theo kiểu nêm và cơ chế tạo mao quản

có sự tham gia của lipide II [18; 35; 43]

1.2.3 Cơ chế tác dụng của nisin

Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh,

gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl Tyrobutiricum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus [17; 26; 30; 44] Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế sự

nảy mầm của chúng Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-)nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit thì nisin

có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [15]

11

Trang 12

Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vikhuẩn Gram (+) Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơnrất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng [26] Nguyên nhân do sự phá vỡ các tổ chứccục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào

tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó [34; 73]

Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu

diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E coli bị ức chế khi có mặt của

EDTA Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-)đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinhdưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng Điều này được giải thích là do sự khác nhaucủa thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Bacteriocin chỉ tạo được lỗ thủngtrên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-)[26]

Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình Kiểu tác dụngkhông đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà không cần phải

có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bàolàm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [30] Kiểu hình thứ 2:nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bàođích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tếbào [79]

Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vàothành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn Ở vi khuẩn Gram (+),peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới

25 lớp Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổngkhối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài quan trọng (outermembrane – OM) Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương tự màng nguyênsinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc mà còn cópolysaccharide và protein Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ với nhau tạothành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào Vi

12

Trang 13

khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vàolớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả.Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phépcác hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng Lớp ngoài cùng củamàng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán kịnước.

Chính nhờ lớp màng ngoài OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của cácbacteriocin Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảmchức năng rào cản của lớp màng ngoài OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức “càng”(chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốcthẩm thấu Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp vớibacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) EDTA là hợp chất được nghiên cứunhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram (- ) Stevens và các cộng

sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt một số chủng

Salmonella Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50 mg/ml và EDTA 20 nM thì sau 1

giờ xử lý ở 37oC, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm từ 10 3,2đến 10 6,9 CFU/ml Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân EDTA hoặcnisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể

1.2.4 Khả năng diệt khuẩn của nisin

Khả năng diệt vi khuẩn Gram (+)

Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm

những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B cereus, Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L monocytogens, L innocua, L grayi, L ivanovii, L murrayi, L seeligeri, L welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium Giá trị quan trọng của nisin đối với

việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử

như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm.

Khả năng diệt vi khuẩn Gram (-)

Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ

EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH

13

Trang 14

thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella, Klebsiella, E coli.

Khả năng diệt nấm mốc

Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi

sinh vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus.

Tác dụng của nisin lên nấm men

Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ50 IU/g đã kéo dài thờigian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày Các vi sinh vật chiếm ưu thế

trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể.

1.2.5 Ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm

Việc ứng dụng bacteriocin vào bảo quản thực phẩm, không chỉ do có tác dụngkháng khuẩn rõ rệt, mang tính thời sự cao mà còn do con người nhận thức rõ hơn vềhậu quả của ô nhiễm môi trường, do việc sử dụng hóa chất và chất kháng sinh trongbảo quản [18; 43; 59; 68] Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươisống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước [18;77] Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng,không để lại dư lượng trong thực phẩm Dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp,

sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng Nisin đã trở thành chất chuyên biệtdùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắcphục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu

xạ [18; 43] Sử dụng nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên menaxit lactic Bổ sung nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài quá trình cất giữbia Nisin còn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chếbiến từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói Để bảo quản thực phẩm, nisin có thể bổsung với hàm lượng 100 mg/kg- 200 mg/kg và tối đa là 500 mg/kg

Do đặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính,bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như khônglên men

Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lacticphân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [34] Các vi

14

Trang 15

khuẩn lactic này sinh trưởng tạo ra pH thấp và sinh tổng hợp bacteriocin ức chế các visinh vật gây thối cũng như các vi sinh vật gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tựnhiên Do đó, sản phẩm lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn cho người

Theo tác giả B Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic còn được sử dụngtrong các nghiên cứu phân loại

Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩmthương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạngthương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin Nisin được quan tâm nghiêncứu nhiều cả ở trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp Nisin được chứngminh là an toàn cho con người khi sử dụng từ năm 1962 bởi hai tác giả Frazer và Hara.FAO/WHO cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969 Năm

1988, tổ chức FDA của Mỹ công nhận nisin là an toàn cho sử dụng và nó được sửdụng làm chất bảo quản thực phẩm

Theo Linda J Harris và cộng sự (1992), H Chen và D.G Hoover năm 2003[18, 40], nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởienzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin và erepcin Nisin có chứa axitamin lanthionine (Ala-S-Ala) và β – methyllanthionine (Abu-S-Ala), axit aminobutyric (Abu), dehydroalanin (Dha), dehydrobutyrin (Dhb)

Nisin là một bacteriocin duy nhất được cho phép sử dụng trong bảo quản thựcphẩm Nó được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực áp dụngchính của nisin vẫn là các sản phẩm thực phẩm thông dụng hàng ngày (nhất là phomat

15

Trang 16

và các sản phẩm thực phẩm đóng hộp) Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHOExpert Committee on Food Additive) ngưỡng cho phép sử dụng nisin đầu vào (ADI –Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao

và đến năm 1988, FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính toán

đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1người/ 1 ngày Đến năm 1992, SCF (the Scientific Committee on Food) cho phép được

sử dụng 0,13 mg nisin tinh khiết/kg thể trọng (với hoạt tính là 40.000 IU/mg) Năm

2001 FDA công nhận tính an toàn của nisin trong việc sử dụng nisin để bảo quản sảnphẩm thịt lợn và thịt gia cầm đã chế biến với hàm lượng nisin có mặt tối đa là 0,0025

% ở trong sản phẩm hoàn thiện Theo FSANZ [32] thì nisin ngày nay đã được phêchuẩn cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thếgiới bao gồm: Mỹ, Anh, EU, Trung Quốc, MERCOSUR (bao gồm Argentina, Brasil,Urugoay, Paragoay, Venezuela)…

Ở Việt Nam, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu, ứng dụng trong công nghiệpthực phẩm để chế biến cũng như bảo quản thực phẩm Nhiều nông trường quốc doanh đã

sử dụng biện pháp ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhờ quá trình lên men lactic [2].Nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến thực phẩmdạng: thịt, cá hun khói, tôm chua, cá muối chua, xúc xích, sữa chua… Nhiều chế phẩm

có nguồn gốc từ các vi khuẩn lactic sống được sản xuất ứng dụng trong việc chữa cácbệnh rối loạn đường ruột cho người, các loại sữa có bổ sung khoáng và vi lượng như

Fe, Ca, Mn, Cr… để làm thức ăn bổ sung cho trẻ nhỏ và những bệnh nhân suy nhược

cơ thể Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến các sản phẩm trong nước thì nhucầu sử dụng bacteriocin mà cụ thể là nisin trong bảo quản thực phẩm là rất lớn Tuynhiên, các sản phẩm bảo quản nhập ngoại có giá thành tương đối cao Thị trường cácchất bảo quản sinh học có nguồn gốc trong nước như bacteriocin còn đang là vấn đề

mở cho các nhà sản xuất

1.2.6 Công nghệ sản xuất và các hướng nghiên cứu về nisin

Nisin là chất diệt khuẩn sinh học được thương mại hóa với mức độ lớn nhấttrong số các bacteriocin Cho đến nay, nisin đã và đang được sản xuất công nghiệp

bằng việc lên men chủng L lactis tự nhiên, thông qua việc tối ưu hoá môi trường, điều

16

Trang 17

kiện lên men, hoàn thiện công nghệ lên men, thu hồi và tinh sạch sản phẩm [18; 37; 49; 85] Nhiều công trình nghiên cứu về việc nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp nisin từ

vi khuẩn L lactis đã được công bố Jozala và đồng tác giả đã chứng minh, môi trường

MRS và M17 là môi trường gia tăng sự sinh trưởng và tổng hợp nisin từ các chủng L.lactis Một số tác giả khuyến cáo rằng, các môi trường tổng hợp thường không làm

tăng tổng hợp nisin [37] Tuy nhiên, việc phối hợp các chất bổ sung khác để giảm 50

% lượng môi trường MRS và M17 lại giúp giảm giá thành sản xuất Li và đồng tác giả(2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa, ảnh hưởng của đường saccarose, pepton đậu tương,chiết nấm men, K2HPO4 , NaCl, MgSO4 đến sự sinh tổng hợp nisin [49] Khi lên mentrong môi trường được tối ưu, năng suất tổng hợp nisin đã nâng lên từ 1074 IU/ml đến

2150 IU/ml Taniguchi Mashayuki và cộng sự đã nghiên cứu nâng cao năng suất nisin

của L lactis trong điều kiện nuôi cấy yếm khí với môi trường có thành phần gồm

đường, các muối khoáng, các nguồn nitơ và sử dụng màng siêu lọc polycrylonitride đểthu nhận nisin trên quy mô công nghiệp [74] Hiroshi Shmizu và cộng sự lại sử dụng

hệ thống nuôi cấy hỗn hợp loài L lactis với Kluyveromyces marxianus Các tác giả nhận thấy, K marxianus đã sử dụng lactat sinh ra trong quá trình nuôi cấy L lactis và

vì vậy đã có tác dụng kiểm soát được pH trong môi trường lên men Kết quả là, sảnlượng nisin trong nuôi cấy hỗn hợp đạt 9,8 mg/l, cao hơn trong môi trường nuôi cấy

đơn chủng L lactis (5,8 mg/l) [69] Tại Trung quốc, sau khoảng gần 6 † 7 năm nghiên

cứu ở Viện Hàn lâm, việc sản xuất nisin ở quy mô công nghiệp trên nồi lên men 100

m3, đã bắt đầu từ khoảng năm 1995

Ngày nay, bên cạnh những nghiên cứu lý thuyết về cơ chế phân tử sự liên quangiữa cấu trúc và chức năng, cơ chế tác dụng của nisin, cơ chế miễn dịch của chủng sảncũng như vai trò của những enzym cải biên, thì hướng áp dụng kỹ thuật di truyền, kỹthuật protein nhằm cải tiến hoạt tính, độ hoà tan, tính bền vững, tăng cường tác độngcủa nisin đối với vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm dành được sự quan tâm đặc biệt.Ngoài ra, xu hướng nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm,thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, đang hình thành bên cạnhcác nghiên cứu về năng suất và công nghệ tinh sạch cũng như công nghệ lên men

17

Trang 18

Axit polylactic (PLA)/polylactide là một loại polyme nhiệt dẻo bán tinh thể,giòn và rắn, có nhiệt độ thủy tinh hóa tương đối thấp (~ 60 oC) và có nhiệt độ chảymềm 175 ÷ 180 oC Vì thế PLA dễ dàng được gia công trong các thiết bị gia công chấtdẻo thông thường và PLA bị phân hủy theo con đường sinh học [10] Hiện nay, trong

số các loại nhựa phân hủy sinh học, PLA là đối tượng được quan tâm nghiên cứu vàphát triển nhiều nhất trên thế giới do PLA rất thích hợp để chế tạo ra các bao bì, màngbao gói thực phẩm, các sản phẩm sử dụng một lần nhằm thay thế các sản phẩm cónguồn gốc polyme dầu mỏ gây ô nhiễm môi trường [31]

Mặc dù thời gian phát triển mới chỉ khoảng một thập kỷ, nhưng chỉ riêng tạichâu Âu tốc độ phát triển của nhựa phân hủy sinh học đã tăng gấp 10 lần Điều nàycho thấy tiềm năng chiếm lĩnh thị trường rất lớn của loại sản phẩm này Một số sảnphẩm đã được thương mại như túi sách, dụng cụ ăn uống sử dụng một lần của Công tyMater - Bỉ, các loại móc phát bóng golf, đĩa DVD, đinh tự tiêu trong phẫu thuật củaCông ty Vegemat Từ năm 2005, công ty đóng gói bao bì Coopbox của Ý đã sử dụngPLA làm khay đựng và màng film bao gói bảo quản các loại thịt tươi, rau quả chophân phối và sử dụng khắp trong các nước thành viên của liên minh châu Âu [24]

Năm 2002 tập đoàn hóa chất DowChemical và tập đoàn thực phẩm Cargill của

Mỹ đã liên kết đầu tư 300 triệu USD xây dựng nhà máy sản xuất PLA với công suất140.000 tấn/năm Cargill Dow đã sử dụng PLA như là nguyên liệu đáng tin cậy thaycho các chất dẻo truyền thống [16]

Đường, tinh bột và L-lactic L-lactide

sinh khối thực vật

Phản ứng trùng ngưng (nhiệt

độ, áp suất)

Phản ứng cộng mở vòng (nhiệt độ, chất xúc tác)

L-Polylactic Phân tử lương thấp L-Polylactic Phân tử lượng cao

Hình 1.2 Sơ đồ quy trình sản xuất PLA của hãng Cargill Dow, Mỹ

Tại Nhật Bản, PLA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Một số hãng điện tửnhư NEC, Panasonic, Fujisu sử dụng PLA làm thẻ điện thoại, bàn phím máy tính, vỏđiện thoại và một số thành phần linh kiện máy tính Ngoài ra, một số hãng ô tô như

18

Trang 19

Toyota, Honda sử dụng PLA làm một số thành phần và nội thất của xe PLA còn được

sử dụng chế tạo các dụng cụ văn phòng, đồ chơi trẻ em, giầy dép trẻ em, vỏ chai, khayđựng và màng film bao gói thực phẩm [62]

1.3.1 Sản xuất axit L-lactic

Axit lactic có lịch sử lâu đời và được áp dụng phổ biến trong lên men và bảoquản thực phẩm Axit lactic được khám phá lần đầu tiên bởi Scheele vào năm 1780,như là một thành phần của sữa Năm 1789, Lavoisier đặt tên nó là axit sữa Đến năm

1857, Pasteur là người phát hiện, axit lactic còn được tạo ra từ quá trình trao đổi chấtcủa các vi sinh vật khác [13] Hiện nay, axit lactic được sản xuất theo hai con đường:tổng hợp hóa học từ nguyên liệu dầu mỏ, khí đốt và lên men vi sinh vật từ các nguyênliệu có thể tái tạo (đường, tinh bột và sinh khối thực vật) (Hình 1.2) [78]

Tổng hợp axit lactic theo con đường hóa học đòi hỏi các thiết bị công nghiệpchịu nhiệt, chịu áp và axit, đồng thời sản phẩm tạo ra theo con đường này thường làhỗn hợp hai dạng đồng phân D và L-lactic, dẫn đến chi phí cao do việc phân tách hailoại đồng phân này [22] Theo cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (FDA),axit D(–)-lactic, không được ứng dụng trong thực phẩm, bởi vì nó không được cơ thểcon người đồng hóa dẫn đến tích lũy axit D(–)-lactic, gây rối loạn axit và làm thấtthoát canxi trong cơ thể [42] Đồng thời, tổng hợp theo con đường hóa học lại bị giớihạn bởi hai vấn đề chính đó là sự khan hiếm nguyên liệu dầu mỏ và vấn đề môi trườngtạo ra Để khắc phục các vấn đề trên, sản xuất axit lactic theo con đường lên men visinh vật được cho là một lựa chọn tối ưu [42]

Nguồn dầu mỏ

Acetaldehyde (CH3CHO)

HCN, xúc tác Lactonitrile(CH3CHOHCN)

Thủy phân bằng H2SO4 Tạo ra dạng racemic DL-lactic

axit (a) tổng hợp hóa học

Thu hồi và tinh sạch

Tạo ra L- lactic hoặc D-lactic axit

19 (b) Lên men vi sinh vật

- Các vấn đề về môi trường - Giải pháp thay thế

Trang 20

Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất axit lactic

(a): bằng con đường hóa học; (b): con đường lên men vi sinh vật

Những vi sinh vật có thể sản sinh ra axit lactic được chia thành hai nhóm: nhóm

vi khuẩn và nhóm vi nấm

Hiện nay, sản xuất axit lactic bằng lên men vi khuẩn thường sử dụng các loài

Lactobacillus rhamnosus, L helveticus, L bulgaricus, L casei, L plantarum, L pentosus, L amylophilus, L delbrueckii.

Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đường glucose và lactose thành axit lactic vớihiệu suất cao Axit lactic tạo ra theo con đường lên men vi khuẩn thường không phải chỉ

có axit L-lactic mà còn có thêm sản phẩm phụ là D - lactic Tỷ lệ giữa hai đồng phân nàyphụ thuộc vào bản chất sinh học của từng loài và từng chủng [54; 83] Hiện nay, nhiềunghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật di truyền để bất hoạt gen D-lactate dehydrogenase tổnghợp ra D-lactic, để điều khiển tổng hợp ra 100 % axit L-lactic [17; 27; 28]

Sản xuất axit L-lactic từ vi nấm khác với ở vi khuẩn lactic Một số loài vi nấm

như Rhizopus oryzae và Rhizopus arrhizus, có thể thủy phân, đồng hóa tinh bột và tạo

ra 100 % đồng phân axit L-lactic Quá trình này diễn ra trong điều kiện hiếu khínghiêm ngặt [50; 75] Nếu như quá trình lên men vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường

giàu dinh dưỡng thì quá trình lên men của Rhizopus chỉ cần môi trường muối khoáng

thông thường Vi nấm trong quá trình sinh trưởng trong môi trường dịch thể, sợi dinhdưỡng bó lại thành dạng pellet, vì thế dễ dàng loại bỏ sinh khối trong quá trình thu hồisản phẩm sau lên men [82] Mặc dù, quá trình sản xuất axit L-lactic từ vi nấm cónhược điểm là tạo ra lượng nhỏ axit fumaric và ethanol Tuy nhiên, hai dạng sản phẩmphụ này có thể bị hạn chế sinh ra bằng cách điều khiển quá trình lên men và loại bỏhoàn toàn thông qua quá trình trưng cất thu hồi axit L-lactic [61]

Như vậy, việc sử dụng lên men R oryzae và R arrhizus có thể thu nhận được

axit L-lactic có phần dễ dàng hơn so với sử dụng các vi khuẩn lactic

1.3.2 Tách và thu hồi axit L-lactic từ dịch lên men

20

Trang 21

Hiện nay, axit L-lactic sau lên men được tách và thu hồi theo những cách sau:

Sử dụng phương pháp hóa học: Trong quá trình lên men và sau lên men L-lacticđược kết tủa bằng CaCO3 hoặc Ca(OH)2 để tạo ra L-lactate-Ca Hợp chất này đượctách ra khỏi dung dịch và hoàn nguyên trở thành L-lactic bằng cách cho L-lactate-Caphản ứng với H2SO4 Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị chịu axitcao và không thu hồi L-lactic một cách triệt để [60]

Sử dụng phương pháp điện thẩm tách-electrodialysis: Hiện nay trong sản xuấtquy mô công nghiệp phương pháp này được sử dụng để tách L-lactic ra khỏi dịch lênmen Nguyên tắc của phương pháp điện thẩm tách được mô tả trong sơ đồ hình 1.3.Thiết bị gồm điện trường một chiều và hai màng cation và anion Dịch lên men đi vàođiện trường các ion dương (Ca 2+ hoặc Na +) được đi qua màng cation và về phía cực

âm Các điện tích âm L-lactic đi qua màng anion và về cực dương Dựa trên nguyên lýnày dịch L-lactic được tách và thu ở phía đầu cực dương của thiết bị Ưu điểm củaphương pháp là hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch cao và tốn ít năng lượng [38]

1.3.3 Tổng hợp polylactic

Polylactic được tổng hợp từ L-lactic theo hai con đường:

+ Con đường thứ 1 (dựa trên phản ứng trùng ngưng của axit L-lactic): từ monome banđầu là L-lactic được trùng ngưng loại nước để tạo ra PLA Quá trình này được tiến hànhđơn giản trong thiết bị gia nhiệt và bay hơi Tuy nhiên, sản phẩm PLA tạo ra

thường có phân tử lượng không cao với Mn và Mw từ 1000 ÷ 10.000 [36; 41]

+ Con đường thứ 2 (dựa trên phản ứng trùng hợp cộng mở vòng của L-lactide): từmonomer là L-lactide dưới tác động của chất xúc tác và nhiệt độ L-lactide được trùnghợp để tạo ra PLA Phương pháp cộng mở vòng thường thu được PLA có phân tửlượng cao với Mn và Mw > 100.000 Hiện nay, chủ yếu các PLA được sử dụng làmvật liệu phân hủy sinh học được tổng hợp theo con đường này [57]

Để tổng hợp PLA bằng phản ứng cộng mở vòng từ monome axit L-lactic phảitiến hành qua hai giai đoạn sau:

Giai đoạn I: Tổng hợp dime vòng (lactide) từ axit L- lactic bằng phương pháp trùngngưng chọn lọc có xúc tác:

Trang 22

Lactide

Trang 23

Chi tiết các phản ứng của giai đoạn I:

O

C H

Bước 1:Bphản-íc1:ứngPh¶nngưnggø n -tụngkhôngkh«ngxúcóctác¸t c

T, vacuum, XT

CH 3

Bước 2: phản ứng vòng hóa Unzipping

B- í c 2: Ph¶n øng vßng ho¸ Unzipping

Giai đoạn II: Trùng hợp mở vòng L-lactide thành PLA:

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về khả năng sản xuất bao bì dễ phân hủy

từ các vật liệu như tinh bột biến tính, vật liệu blend của polyetylen với các loại polyme dễ

phân hủy có nguồn gốc tự nhiên như PHB [5] Tuy nhiên, đến nay chưa có loại bao bì

nào thuộc dạng này được đưa ra thị trường Một số công ty TNHH tại Tp Hồ Chí

Trang 24

Minh, Vĩnh phúc đã nhập nguyên liệu để sản xuất bao bì dễ phân hủy, nhưng không phải là polylactic và không có các chất kháng khuẩn nên chỉ đóng vai trò làm bao gói.

1.3.4 Khả năng phân hủy sinh học của polylactic

22

Trang 25

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phân hủy sinh học của PLA DoPLA là polyeste, cho nên nó dễ dàng bị thủy phân bởi các loại enzym của vi sinh vật.Nghiên cứu của Sawada và cộng sự (2007) đã tiến hành thủy phân PLA bằng proteinase

và lipase tách từ Bacillus subtilis và Bacillus lichenformis [65] Tại Nhật Bản công ty

SAIDA đã phát triển hệ thống đánh giá khả năng phân hủy sinh học của các loại nhựa sinhhọc (Bioplastic) theo tiêu chuẩn ISO 14855-2 có tên là MODA (MODA-4, MODA-6 vàMODA-B) Trong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2009, đã sử dụng hệ thốngMODA-B để nghiên cứu khả năng phân hủy PLA ở điều kiện kỵ khí thông qua việc xácđịnh hàm lương CH4 tạo ra Kết quả là sau 60 ngày 90 % PLA đã bị phân hủy [53] Cũngtrong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2006, khi sử dụng hệ thống MODA-4 để nghiêncứu khả năng phân hủy bột PLA ở điều kiện hiếu khí và đánh giá khả năng phân hủythông qua lượng CO2 tạo ra, sau 56 ngày 80 % bột PLA bị phân hủy [52] Ở Việt Nam,trong nghiên cứu của Trần Đình Mấn và cộng sự (2008), đã sử dụng phương pháp chônlấp màng PLA để đánh giá khả năng phân hủy của PLA, kết quả thu được là sau 3 thángchôn lấp 90 % màng PLA đã bị phân hủy [76]

1.4 NGHIÊN CỨU TẠO BAO BÌ BẢO QUẢN THỰC PHẨM

1.4.1 Nghiên cứu tạo và ứng dụng khay đựng thực phẩm sử dụng một lần

Năm 2007, công ty Sealed Air lần đầu tiên giới thiệu nhãn hiệu Cryovac®NatureTRAY™- sản phẩm khay đựng thực phẩm, được sản xuất từ nhựa PL [80] Loạikhay này được sử dụng để đựng các loại thịt, cá và rau quả tươi Theo khuyến cáo nhàsản xuất loại khay từ nhựa PLA không làm mất hương vị và chất lượng của thực phẩm.Loại khay này được bổ sung chất kháng khuẩn sinh học nhằm kéo dài thêm thời gian

sử dụng an toàn của thực phẩm Tại Thái Lan Kasetsart, đã tạo thành công các khayđựng thực phẩm bằng nhựa PLA, để thay thế cho các loại khay đựng thực phẩm sảnxuất từ dầu mỏ [72] Ở Việt nam, phần lớn các hay đựng thực phẩm được sản xuấthoặc được tái chế từ các polyme dầu mỏ

1.4.2 Tạo màng, bao bì giấy PLA- Nisin và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Sự kết hợp PLA - nisin có thể tạo ra nhiều dạng sản phẩm có thể ứng dụngtrong bảo quản thực phẩm như là màng film PLA - nisin, bao bì giấy tráng phủ PLA -

23

Trang 26

nisin Các sản phẩm này có tính chất tương tự như các sản phẩm sử dụng polyme dầumỏ.

Tạo màng PLA - nisin

Màng polylactic được tạo ra theo phương pháp cán gia nhiệt hoặc tạo màng sửdụng dung môi Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự, đã đề xuất phương pháp sửdụng nisin bao lên màng film polylactic và sử dụng màng đã gắn nisin để đánh giá khảnăng kháng khuẩn của màng cũng như các tính chất cơ lý của màng [56] Jin và cộng

sự, đã tạo ra màng film cố định nisin bằng cách hòa nisin vào dung dịch PLA đã đượchòa tan trong dung môi, tạo ra màng film có độ dày 0,15 mm với lượng nisin được bổsung vào là 0,04 mg/cm2 Đánh giá khả năng kháng L monocytogenes Scott A 724, E colii 0157:H7, Salmonella của màng PLA - nisin cho thấy, sử dụng màng có khả năng

tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên có trong thực phẩm, và có thể dùng để bảo quảncác thực phẩm tươi ở 4 oC trong 21 ngày [46] Trong nghiên cứu của Tipayanate vàcộng sự, các tác giả đã sử dụng hỗn hợp 2 % PLA, 2 % axit L-lactic và nisin có nồng

độ 200 IU/ml để tạo màng bao bọc thịt bò tươi Thịt bò sau khi được bao gói bằng hỗnhợp trên có thể bảo quan ở 4 oC trong 5 ÷ 6 ngày [12]

Tại Nhật Bản, nhiều loại thực phẩm ăn nhanh được bảo quản bằng màngpolyme sinh học có chứa chất kháng khuẩn sinh học mà không làm thay đổi cảm quan,hương vị và màu sắc của thực phẩm Những loại màng bao gói dạng như vậy, đangtừng bước thay thế dần cho các phương pháp truyền thống sử dụng các loại lá bao gói

có trong tự nhiên

Các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng, các polyme sinh học có khả

năng kháng khuẩn có thể kìm hãm rất tốt vi khuẩn E coli trên bề mặt polyme Tuy

nhiên, việc sử dụng loại chất kháng khuẩn nào vẫn là bí mật của các hãng sản xuất

Ở Việt nam, hướng tạo ra màng film PLA - nisin kháng khuẩn là nghiên cứuđầu tiên, tạo sản phẩm sử dụng trong bao gói thực phẩm, nhằm khắc phục các vấn đề vềbảo quản, vệ sinh an toàn thực phẩm và về môi trường

Tạo bao bì PLA - nisin

Trên thực tế, để tăng khả năng chịu nước, các bao bì giấy được tráng phủ các loại polyme như polyethylen, polypropylene sau khi sử dụng chỉ có phần giấy bị

24

Trang 27

phân hủy còn phần polyme vẫn tồn tại trong đất Để khắc phục vấn đề này, hãng NanoFilber Tech đã đưa ra các sản phẩm như hộp đựng, cốc, bao bì giấy có tráng phủ PLA[80] Vì thế, các sản phẩm của hãng sau khi sử dụng có thể phân hủy hoàn toàn trong

tự nhiên Joerger và cộng sự đã thành công trong việc kết hợp PLA và nisin để trángphủ bề mặt giấy gói thực phẩm giúp tăng cường an toàn vệ sinh và kéo dài thời gianbảo quản thực phẩm [48]

Vì vậy, ý tưởng phát triển hệ thống đóng gói kháng khuẩn dựa trên vật liệuphân hủy sinh học PLA và nisin giải quyết hai vấn đề: an toàn thực phẩm và bảo vệmôi trường Vật liệu bao gói là rào cản đối với sự xâm nhập của vi sinh vật Chấtkháng khuẩn (CKK) có mặt trong thành phần vật liệu đóng gói sẽ không chỉ ngăn cản

sự xâm nhập từ bên ngoài mà còn kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nội tại ở thựcphẩm trong quá trình bảo quản

Tuy nhiên, do CKK nisin tráng phủ trực tiếp trên bề mặt màng film PLA có thể

bị giảm hoạt tính kháng khuẩn do bề mặt kỵ nước hoặc do bề mặt nhẵn đặc trưng củamàng PLA, sẽ ngăn cản khả năng bám kết của nisin Bởi vậy, việc nghiên cứu cácphương pháp để gắn kết, phối trộn nisin vào PLA để tăng cường khả năng bám kết củanisin vào PLA là vô cùng cần thiết và có tính quyết định [11; 20; 39; 63; 70; 84]

CKK được pha trộn vào bao bì có thể di chuyển, xâm nhập vào thực phẩm qua

cơ chế khuyến tán và phân cắt Ngoài ra, có thể thông qua cơ chế hấp phụ cân bằng[11; 63] Bao bì kháng khuẩn có thể được tạo thành bằng cách phối trộn và cố địnhCKK, hoặc bằng cách cải biến bề mặt và tráng phủ (coating) được đề cập [11; 63; 70]

Tạo màng film thực phẩm với bacteriocin (nisin, lactacin) bằng cách pha trộntrực tiếp (direct incorporation) bacteriocin vào polyme Trong khi có hai phương pháptạo màng film là ép nhiệt (heat press) và cán (casting)

Màng film sử dụng để đóng gói thực phẩm tạo ra từ các vật liệu có nguồn gốcsinh học như axit polylactic và nisin thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng phân giảisinh học, là một lựa chọn đạt hai mục tiêu và là giải pháp thân thiện môi trường.Phương pháp này không những bảo quản thực phẩm an toàn mà còn kéo dài thời gian

sử dụng, giữ được chất lượng, các đặc điểm cảm quan và tính tự nhiên của thực phẩm

Theo Sunil [70] có ba cách tạo ra bao bì đóng gói kháng khuẩn gồm:

25

Trang 28

- Phối trộn (incorporation) chất kháng khuẩn vào túi để từ đó các chất kháng khuẩn

là những chất có thể bay hơi được giải phóng ra trong quá trình bảo quản thực phẩm

- Trộn trực tiếp (direct incorporation) các chất kháng khuẩn vào màng đóng gói

- Tráng phủ (coating) trên vật liệu bao gói

Những chất kháng khuẩn không có khả năng bốc hơi phải tiếp xúc với bề mặtthực phẩm để chất kháng khuẩn có thể khuyếch tán vào bề mặt và bên trong thựcphẩm Bởi vậy, việc khuyếch tán của CKK tham gia trong thành phần của vật liệuđóng gói vào bề mặt thực phẩm là cực kỳ quan trọng, đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn[20] Tốc độ khuếch tán của CKK còn đóng một vai trò duy trì bền vững hoạt tínhkháng khuẩn đối với thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu các tác động ảnh hưởng tớiviệc giải phóng CKK rất được quan tâm

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

Chủng sử dụng để lên men sản xuất nisin là L lactis subsp lactis PD15, nisin

sử dụng để tạo màng PLA – nisin là sản phẩm dạng bột có hoạt lực 1000 IU/mg

Chủng sử dụng để sản xuất axit lactic là R oryzae VLSH01, từ axit L-lactic nhờ

phản ứng cộng mở vòng tổng hợp nên PLA, sản phẩm PLA thu được có phân tử lượngtrung bình Mn và phân tử lượng Mw đạt > 100.000

26

Trang 29

Những sản phẩm này thu được từ nghiên cứu của Phòng Công nghệ vật liệusinh học, VCNSH, VHLKH&CNVN Ngoài ra, các chủng sử dụng làm kiểm định là

Lactobacillus plantarum JCM1149 (Nhật Bản), B cereus, S aureus, L monocytogenes.Tất cả đang được lưu giữ tại bộ phận giống của Phòng.

2.1.2 Môi trường nuôi cấy, hóa chất

Sữa gầy (Skim milk) có xuất xứ Australia Môi trường nghiên cứu được sử dụng làmôi trường MRS và CM có các thành phần hóa chất như sau:

Môi trường MRS (g/l): Cao thịt (10), cao men (5), peptone (10), glucose (20),

CH3COONa (5), K2HPO4 (2), Amonicitrat (2), MgSO4.7H2O (0,2), MnSO4 (0,04),Tween 80 (1ml), agar (20) pH 6,8 Bổ sung nước cất cho đủ 1 lít

Môi trường CM (g/l): Saccarose (40), cao nấm men (10), peptone (10), KH2PO4 (0,2),NaCl (2), MgSO4.7H2O (0,2) pH 6.8 ± 0,2 Bổ sung nước cất đến 1 lít

2.1.3 Các thiết bị thông dụng dùng cho nghiên cứu

- Lò vi sóng (Sumsung, LG-Intellowave, 220V-50Hz, Max: 1150W);

- Bình phản ứng 500 ml, bình cầu nhám 500 ml, bộ chưng cất áp suất thường; thiết bị chưng cất chân không quay, máy khuấy từ, thiết bị tạo áp suất; tủ sấy chân không

- Nhớt kế Ubellohde

- Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD, Nhật Bản

- Kính hiển vi quang học Olympius CH2, Model CHS, Nhật Bản

- Máy đo pH (320 pH Metter) Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ

- Máy so màu (Spectophotometer pharmacia, Biotech, Model 80-2088 -64), Anh

- Cân điện tử AB 204, Mettler Toledo, Thuỵ Sỹ

- Máy li tâm Micro Centaur MSE, Anh

- Phân cực kế Model WXG-4, Trung Quốc

- Digital Micropipette Model 5000 DG, Nichipet, Nhật Bản

- Lên men và thu hồi nisin: Sử dụng hệ thống bình lên men 5, 10 l, 100 l và các thiết bịsấy phun, ly tâm, lọc tiếp tuyến của Viện Công nghệ sinh học, VHLKH&CNVN

27

Trang 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính nisin

Để lựa chọn chủng có hoạt tính tổng hợp nisin cao trong bộ sưu tập của Phòng,

dựa trên đánh giá tác dụng ức chế chủng kiểm định L plantarum JCM1149 [8] Hoạt

tính kháng khuẩn của nisin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trong môitrường thạch có cải tiến theo Phan K.H và cs [8], gồm một số bước:

Bước 1: Chủng kiểm định L plantarum JCM 1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ)

trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 = 1,28)

Bước 2: Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C,

15 phút Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịchhuyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm(20 ml/đĩa) Đợi thạch nguội, đục giếng Mỗi giếng có đường kính 7 mm

Bước 3: Hút 25 µl dịch nisin đã được pha loãng nhỏ vào các giếng thạch và giữ ở nhiệt

độ 4 oC trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm Quan sát và đo đường kínhvòng vô khuẩn được hình thành Trong đó, đường kính vòng vô khuẩn của mẫu nghiêncứu bằng hiệu của đường kính vòng vô khuẩn đo được và đường kính giếng thạch (D-d) Căn cứ vào việc xuất hiện vòng vô khuẩn và kích thước đường kính vòng vô khuẩn

để xác định hoạt tính nisin của chủng nghiên cứu

Hoạt tính của nisin thường được xác định bằng đơn vị quốc tế IU (International Unit).Việc xác định cơ bản dựa theo phương pháp của Fowler và cộng sự đề xuất 1975

Chủng kiểm định là L plantarum JCM1149 một chủng kháng axit và nhạy cảm với

nisin Nisin chuẩn của hãng Sigma với hoạt tính 1000000 IU/g được pha thành cácnồng độ khác nhau Xác định hoạt tính của những mẫu này bằng cách đo đường kính

vùng ức chế đối với L plantarum Từ đó lập phương trình đường chuẩn tương quan

giữa nồng độ nisin (tính bằng IU/ml hoặc IU/mg) và đường kính vòng ức chế bằngphần mềm Excel của Microsoft, phương trình có dạng hàm số mũ: Y = 102.5 x e0.281x , hệ số hồi quy R2 = 0.994 Trong công thức này: x = D-d (mm), D: là đườngkính vòng vô khuẩn (mm) , d: là đường kính lỗ khoan (mm);, Y: Hoạt tính chế phẩm(IU/ml hoặc IU/mg)

28

Trang 31

Với đường cong chuẩn đã dựng được, việc xác định hoạt tính các mẫu chứa nisin rấtthuận lợi và nhanh chóng (hình 2.1).

Hình 2.1 Đường cong chuẩn xác định nồng độ nisin (IU) 2.2.2 Phương pháp tạo màng PLA - nisin

Màng PLA - nisin được chuẩn bị theo phương pháp của T Jin và cộng sự [46].Cân 0,75 g PLA bổ sung vào bình tam giác nút nhám chứa 25ml DMCL Dung dịchđược khuấy cho đến khi tan hoàn toàn Khi dung dịch trong suốt bổ sung 0,25 g nisin

và tăng khuấy Sau đó, hỗn hợp trên được đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm Dungdịch methylene chloride được bay hơi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút

2.2.3 Xác định nồng độ nisin trên 1 cm 2 màng PLA – nisin

Đĩa petri để tạo màng có đường kính 15 cm, vậy diện tích đĩa là 176,625 cm2.Theo công thức tạo màng mục 2.2.2 nisin nồng độ 1000 IU/mg bổ sung vào là 0,25 gtương đương 250000 IU Vậy 1 cm2 màng sẽ có nồng độ nisin là 1415 IU

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

Hoạt tính kháng khuẩn của màng được xác định theo 2 cách:

 Phương pháp khuếch tán trên thạch bán lỏng: Chủng kiểm định L plantarum JCM

1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ) trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 =1,28) Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C, 15phút Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 † 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch

29

Trang 32

huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri Đợi thạch nguội, đặtcác miếng màng PLA – nisin lên bề mặt thạch, tiếp theo giữ ở nhiệt độ 4 oC trongkhoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩnđược hình thành.

 Phương pháp xác định số lượng chủng kiểm định bị tiêu diệt trong môi trường dịchthể: Cắt màng PLA - nisin ra làm các miếng khác nhau, mỗi miếng màng có diện tíchbằng 2 cm2 Các miếng màng được cho vào các ống nghiệm có chứa 2 ml môi trườngMRS dịch thể Bổ sung 0.5 % dịch huyền phù chủng vi khuẩn kiểm định vào các ống,mẫu đối chứng cũng bổ sung 0,5 % chủng kiểm định nhưng không cho màng PLA –nisin Các mẫu nuôi ở 37 oC, lấy mẫu trải đĩa kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn theo cácmốc thời gian: 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24; 36; 48 giờ

Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride lên hoạt tính nisin của màng PLA - nisin:

Tỷ lệ methylene chloride được sử dụng trong nghiên cứu này là 10, 15, 20, 25 và 30

ml Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra theo các tỉ lệ dung môi methylene chloride ởtrên, xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA: Màng PLA - nisin được tạo ra như mô tả ở mục 2.2.2.

Nhưng PLA được bổ sung với các lượng khác nhau: 0,5 g; 0,75 g; 0,9 g và 1 g Saukhi màng PLA - nisin được tạo ra với các tỉ lệ PLA ở trên, xác định hoạt tính khángkhuẩn của màng

Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng: Màng PLA - nisin được tạo ra

như mô tả ở mục 2.2.2, nhưng được đặt tại các nhiệt độ khác nhau: 37, 60, 70 và 80

°C Sau 15 phút, lấy hỗn hợp dung dịch trên đổ ra đĩa petri để tạo màng Xác định hoạttính kháng khuẩn của màng

2.2.5 Xác định khả năng phân hủy của màng PLA - nisin

Màng được chôn lấp một cách tự nhiên trong đất vườn, sau 1 tháng tiến hànhlấy mẫu cân trọng lượng và quan sát dưới hiển vi điện tử quét Thí nghiệm được tiếnhành kéo dài đến 6 tháng

2.2.6 Phương pháp thí nghiệm bảo quản thực phẩm

2.2.6.1 Phương pháp bảo quản nem chua

30

Trang 33

Mẫu nem chua thí nghiệm là nem đã chín được mua tại làng Vẽ, Đông Ngạc,

Từ Liêm, Hà Nội Các mẫu thí nghiệm được thay lớp nilon bằng màng PLA – nisinsau đó lại bọc lá như ban đầu, mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được để ở nhiệt độthường (30 oC) Đánh giá cảm quan mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng theo ngày

2.2.6.2 Phương pháp bảo quản bánh cốm

 Kiểm tra thành phần và số lượng vi sinh vật có trong bánh cốm bằng phương pháp pha loãng tới hạn [4]:

Lấy 10 gam mẫu bánh cốm cho vào 90 ml nước muối sinh lý 0,85 % nghiền mịn (thìadung để nghiền được khử vô trùng) Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10 -1 Hút 1mldịch này chuyển vào 1 ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng, được

độ pha loãng 10 -2 Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng 10 -8 hoặc cao hơn

Dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy vô trùng và trải đều trên đĩa Petri đã cósẵn môi trường phân lập thích hợp Các đĩa đã cấy được nuôi trong tủ ấm 37 oC vàtheo dõi trong khoảng 1- 2 tuần Đếm số lượng khuẩn lạc và nhận dạng các vi sinh vật

Mẫu bánh cốm thí nghiệm sử dụng màng PLA – nisin để bọc thay cho nilon,mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng (30 oC) Đánh giácảm quan mẫu theo ngày

31

Trang 34

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 LỰA CHỌN CÁC CHẤT THÀNH PHẦN TẠO MÀNG

Axit polylactic là một trong số các polymer phân hủy sinh học, một loại axitđược sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật, axit này tan trong một số dung môi nhưchloroform, methylene chloride (hay còn gọi là dichloromethane) Với mục đích tạomàng để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm thì màng tạo ra cần phải dai, mịn, cảmquan phải đẹp mắt, chính vì thế cần lựa chọn được thành phần như thế nào để tạomàng theo yêu cầu Kết quả trình bày dưới bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 So sánh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride

Hình 3.1 Ảnh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride

a/ màng tạo từ methylene chloride; b/ màng tạo từ chloroform

Kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy sử dụng dung môi methylene chloride đạtkết quả tốt hơn, màng dẻo và trong, nisin trải đều khắp bề mặt màng, hoạt tính khángkhuẩn của màng tốt, vòng ức chế đạt 9 mm Khi sử dụng chloroform thì nisin bị vóncục khó giải phóng ra thực phẩm khi bao gói bảo quản, màng đục, cứng và giòn, hoạttính kháng khuẩn thấp, vòng ức chế là 5 mm Quan trọng hơn, methylene chlorideđược cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép sử dụng làm chất

32

Trang 35

kết dính trong tạo bao bì bảo quản thực phẩm còn chloroform thì không Chính vì thếmethylene chloride được lựa chọn để làm chất kết dính tạo màng PLA – nisin.

3.2 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG PLA – NISIN VÀ HOẠT TÍNH KHÀNG KHUẨN CỦA MÀNG 3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride đến màng PLA - nisin

Tỷ lệ methylene chloride được sử dụng trong quá trình tạo màng có ảnh hưởngkhông nhỏ đến khả năng hòa tan PLA, đến độ dày, mỏng của màng cũng như hoạt tínhkháng khuẩn tính cho 1 đơn vị diện tích màng Thí nghiệm được tiến hành với lượngmethylene chloride là: 10; 15; 20; 25; 30 ml, nisin 0,25 g, PLA 1 g và được phủ lên đĩapetri cùng diện tích Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride lênhoạt tính kháng khuẩn của màng được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride đến màng PLA - nisin

Kết quả bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ methylene chloride có ảnh hưởng đến quá trìnhtạo màng Trong nghiên cứu này, methylene chloride với lượng 25 ml thích hợp nhấtcho việc tạo màng PLA – nisin, màng tạo thành dẻo, dai, mỏng đều, hoạt tính khángkhuẩn tốt, vòng ức chế là 8 mm Ở tỷ lệ thấp hơn thì lượng dung dịch tạo màng khôngphủ kín được đĩa có diện tích xác định, đồng thời màng tạo ra rất cứng, không dẻo,không dai, ở tỷ lệ 10 ml methylene chloride tuy vòng kháng khuẩn đạt 9 mm do nisinphân bố dày hơn (không phủ kín đĩa) nhưng màng lại rất cứng Còn nếu ở tỷ lệ caohơn thì lượng dung môi thừa sẽ lãng phí Do đó trong các nghiên cứu tiếp theo chọn tỷ

lệ dung môi methylene chloride là 25 ml cho quá trình tạo màng

Trang 36

nhau: 0,5 g; 0,75 g; 0,9 g và 1 g, dung dịch được phủ lên đĩa petri có cùng diện tích.Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn vàcảm quan của màng Kết quả được trình bày bảng 3.3.

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA lên hoạt tính kháng khuẩn của màng PLA - nisin

Hoạt tính kháng

mm)

dai, mủn

Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ PLA 0,75 gthích hợp nhất cho việc tạo màng PLA - nisin Ở tỷ lệ PLA này, màng tạo ra không bịdày, màng dai, không mủn, không bị cứng, hoạt tính kháng khuẩn tốt vòng ức chế là 9

mm, dễ dàng cho việc bao gói thực phẩm Ở tỷ lệ cao hơn màng bị cứng và hoạt tínhkháng khuẩn kém hơn (8 mm) Ở tỷ lệ 0,5 g tuy vòng kháng khuẩn đạt 9 mm nhưngmàng lại không dai, mủn nên cũng không đáp ứng yêu cầu

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng

Nhiệt độ trong quá trình tạo màng có thể cũng ảnh hưởng đến tính chất và hoạttính kháng khuẩn của màng Trong nghiên cứu này, quá trình tạo màng được tiến hành:Cân 0,75 g PLA và 0,25 g nisin cho vào bình tam giác có nút nhám Sau đó bổ sung 25

ml dung môi methylene chloride vào và đưa lên máy khuấy từ khuấy ở các nhiệt độkhác nhau: 37; 60 và 80 °C Sau 15 phút, lấy hỗn hợp dung dịch trên đổ ra đĩa petri đểtạo màng Màng sau khi tạo ra được xác định hoạt tính kháng khuẩn Kết quả nghiêncứu được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng đến hoạt tính kháng

Trang 37

37 60 80

pH của hỗn hợp dung

dịch tạo màng

Màng dai, dẻo, Màng dai, dẻo, Màng dai, dẻo,

Cảm quan màng không giòn Nisin không giòn Nisin không giòn Nisin

phân bố đều phân bố đều trong phân bố đều trong

Được tính thông qua đường kính vòng vô khuẩn (mm).

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy gia nhiệt trong quá trình tạo màng đã ảnh hưởngđến hoạt tính kháng khuẩn của màng nhưng không mấy ảnh hưởng đến tính chất màng.Màng có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (9 mm) khi trong quá trình tạo màng được gianhiệt ở 37 °C, màng dẻo, dai, không cứng không giòn Ở nhiệt độ cao hơn màng cũngdẻo, dai nhưng hoạt tính kháng khuẩn bị giảm (8 mm) và nhiệt độ cao làm tốn nănglượng hơn Do đó nhiệt độ 37 oC là nhiệt độ thích hợp nhất được lựa chọn để tạo màngPLA - nisin

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên hoạt tính nisin của

màng PLA - nisin

Trong nghiên cứu này, các loại màng được bảo quản ở 2 điều kiện khác nhau (ở 4

°C và ở nhiệt độ phòng) Sau đó theo thời gian các mẫu được lấy ra để xác định hoạt tính

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên hoạt tính nisin của màng

PLA - nisinThời gian bảo quản Hoạt tính của màng (đường kính vòng vô khuẩn, mm)

35

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	2,46 MB

Luận văn thạc sĩ đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm​

Luận văn thạc sĩ đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm