Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine o methyltransferase ở cây bình vôi (stephania spp )​

Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có tácdụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau dạ dày,trị ho có đờm, hen suyễn, k

Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE Ở CÂY BÌNH VÔI

(Stephania spp.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện manggen mã hóa enzyme columbamine O-methyltransferase ở cây Bình vôi

(Stephania spp.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi Mọi kết quả thu

được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác Tất cả nhữngtham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ

Thái Nguyên, tháng 11 năm

2020

Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dànhcho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứutại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn,người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trongquá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗtrợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đạihọc của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bịcho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đếnchuyên ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Tôi xin cảm ơn ThS Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Côngnghệ gen và Công nghệ tế bào của Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm –Đại học Thái Nguyên, đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thínghiệm

Tôi xin cảm ơn những ý kiến nhận xét của các thầy cô trong Hội đồngđánh giá luận văn ngày 16 tháng 11 năm 2020

Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúptôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinhsống tại Thái Nguyên, Việt Nam

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bình vôi 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi 3 1.1.2 Giá trị của cây Bình vôi ……… 7

1.1.3 Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi ………… 12

1.2 Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương……… 13

1.3 Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc ……… ……… 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 23

2.2.1 Hóa chất nghiên cứu 23

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 24

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu …… 24

2.3.1 Nhóm phương pháp tạo dòng gen 24

2.3.1.1 Thiết kế mồi colony- PCR 24

iii

2.3.1.2 Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp 25

2.3.1.3 Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp 25

2.3.1.4 Tách chiết và tinh sạch plasmid 26

2.3.2 Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích 27

2.3.2.1 Xử lý enzyme cắt giới hạn 27

2.3.2.2 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 28

2.3.2.3 Gắn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121 28

2.3.2.4 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt 29

2.3.2.5 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 29

2.3.2.6 Tách chiết plasmid từ tế bào E.coli 30

2.3.2.7 Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 31

2.3.2.8 Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện 31

2.3.2.9 Chọn dòng A tumefaciens tái tổ hợp 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT 33

3.2 Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT 35

3.3 Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Bình vôi……… 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin) 11

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine 14

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……… 16

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA… 18

Hình 1.6 Cấu trúc Ri-plasmid của A rhizogenes……… 19

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pUC19……… 22

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121……… ……… 23

Hình 3.1 So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con đường tổng hợp palmatine 34

Hình 3.2 Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT ……… 34

Hình 3.3 Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT 35

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR 36

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector PUC-1113 và vector pBI121 với enzyme XbaI và SacI 37

Hình 3.6 Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E Coli 37 Hình 3.7 Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong A.tumefaciens 38

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania……… 10

Bảng 2.1 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR 24

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng nối ghép gen 25

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng colony-PCR……… 26

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch tách plasmid ……… 27

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn 28

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối ghép gen 28

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn……… 31

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR……… 32

vii

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bình vôi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae),

là một loài cây thân thảo dạng dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vàonúi đá, có củ nặng tới hơn 40kg Vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá

Củ còn được gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”… CâyBình vôi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại tỉnh Hà Giang, TuyênQuang, Hòa Bình, Hà Tây (cũ) … Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất

alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin.

Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có tácdụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau dạ dày,trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Hiện nay, cây Bình vôi đang bị khai thácnhiều, số lượng cây Bình vôi tự nhiên ngày càng giảm mạnh Bình vôi đã đượcghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp”

(V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số

32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ

Chi Bình vôi (Stephanta) có khoảng trên 45 loài, còn ở Việt Nam có từ 14 đến 16 loài, trong đó một số loài như Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) đang được khai thác, và nhìn chung hàm lượng rotundin của các

loài Bình vôi là thấp và rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái Dovậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng rotundin

ở cây Bình vôi được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiệnenzyme chìa khóa tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp rutundin là rấtquan trọng Columbamine O-methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện làmột enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc bộMao lương, trong đó có cây Bình vôi [77] Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzymeCoOMT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng

rotundin trong cây Bình vôi được nâng cao Xuất phát từ những lí do trên

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình

vôi (stephania spp.)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme

columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT

- Tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT.

- Thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT.

2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Bình vôi

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây Bình vôi

Về nguồn gốc, phân loại: Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh

pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có

nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia Tên gọi dân dãtrong tiếng Việt là Bình vôi [91]

Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc:

Chi (genus): Stephania Lour [13].

Trên thế giới chi Bình vôi (genus: Stephania) có khoảng 50 loài, phân bố

ở vùng nhiệt đới, chủ yếu như là các nước châu Á như: Trung Quốc 43 loài, TháiLan 18 loài, Indonesia 17 loài, Việt Nam 14-16 loài, Malaysia 17 loài, Ấn

Độ 11 loài, Philippine 8 loài, Papua New Guinea 8 loài, Myanma 5 loài, NhậtBản 2 loài, Sri Lanka 2 loài, Lào 2 loài, Đông Timor 1 loài, Nepal 1 loài.Ngoài ra còn có ở châu Úc: Australia 7 loài và châu Phi 12 loài [11]

Ở Việt Nam, các loài trong chi Bình vôi phân bố rất rộng, trên nhiều địaphương từ Bắc vào Nam Song các khu vực có số loài phong phú, đa dạng vàtập trung hơn cả ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn,Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, HòaBinh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh Một số ít

loài (S venosa, S cambodica, Gagnep, S pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam

như: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yến, Ninh Thuận, Khám Hòa, BàRịa-Vũng Tàu và An Giang [8]

Đặc điểm sinh học

Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm

hoặc hằng năm Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bónghoặc xanh đậm Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sầnsùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to tạothành rễ củ Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc Củ thường códạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định Có loài rễ củthường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặngtới 50-70 kg Tuy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống

mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâusáng, nâu đậm, xám tro, đen…) Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màutrắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [16]

Lá Bình vôi mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20

cm và hai đầu phồng lên [8], có khi gấp khúc ở gốc [11] Cuống lá đính vào láthường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc là ở những khoảng cách nhấtđịnh, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá) Phiến lámỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng,hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy;gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát từ đỉnhcuống lá Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phằnghoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt,xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [24]

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá Cụm hoa có

dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [8], có cuống đơn

độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuốngcùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [13] Hoađực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánhhoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường

4

4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn Hoacái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánhhoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [24].

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Ở quảtrưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của númnhụy Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạthình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗthủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một

số loài có 5 hàng [24] Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từngtaxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giámđịnh tên khoa học đối với các loài chi Bình vôi [8] Cây mầm có lá mầm ítnhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [14]

Sinh thái, sinh trường và phát triển của các loài Bình vôi

Các loài thuộc cây Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinhhay rừng thứ sinh Chúng thường mọc trên đỉnh hay các sườn núi đá vôi, núi đấtxen lẫn đá, các dài đất ven đường, ven song, đôi khi gặp ở ven bòe biển Sốngthích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 23oC, lượng mưa 2000- 2500 mm, ưađất nhiều mùn, thoát nước, độ pH= 6,5- 7 Một số loài có thể phân bố

ở độ cao tới 2000 – 2800 m so với mực nước biển Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả

Các loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm

Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ)ngay từ tháng 11- 12 Những chồi này ở trạng thái “chồi ngủ” cho đến mùaxuân (tháng 1- 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ trong vòng 1- 2

tháng, chồi đã dài tới hơn 1 m Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất củacây Bình vôi, vì trên loài chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồixuân hè (chồi cấp II) Số lá chồi cấp II nhiều hơn cấp bội so với chồi đông xuân(tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Lá trưởng thành ngay trong mùa

hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng lá hàng năm cũng làtập tính quang trọng của cây Bình vôi Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bìnhvôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùixuống đất Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơnnhững mảnh khác Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi.Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng.

Hạt Bình vôi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1000 hạtthường chỉ khoảng 10- 29g Hạt phát tán nhờ nước Các cá thể Bình vôi trồng

từ hạt thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh Chỉ sau 5- 6 tháng tuổi, cây

đã vươn dài tới 50-100) cm, phân cành khỏe Ở một số loài, cây có thể bắt đầu

ra hoa và cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi Trong quá trìnhsinh trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ở những loài có củ) hoặcphân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những loài chỉ có rễ dạng sợi) [8]

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Bình vôi

(Nguồn:

http://www.thuocvuonnha.com/c/dung-cu-binh-voi-chua-mat-ngu/hoi-dap)

6

1.1.2 Giá trị của cây Bình vôi

Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian CủBình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữahen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng

Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, Bình vôi được dùng dưới dạngthuốc sắc, thuốc bột hoặc rượu thuốc để chữa bệnh mất ngủ, sốt nóng, nhứcđầu, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở… Liều dùng: 6 - 12 g/ngày[2], [3] Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vôi (1 phần) với rượu 40° (5 phần);mỗi ngày uống 5 - 15 ml rượu, có thể thêm đường cho dễ uống [6] Để tránh

bị ngộ độc, nên sử dụng liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 –0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [6], [21] Trong y học hiện đại, Bình vôi chủ yếuđược dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy L-tetrahydropalmatin hoặccepharanthin tuỳ theo loài L-tetrahydropalmatin (Rotundin) được dùng làthuốc trấn kinh, an thần dùng trong các trường hợp: Mất ngủ, trạng thái căngthẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần [6], [17], [94] Liềudùng là 0,05g - 0,10g dưới dạng viên L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặcsulfat [6], [94]

Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này được sử dụng

phổ biến để điều chế các loại thuốc Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloiddẫn xuất của nhân isoquinolin Trong đó quan trọng nhất là rotundin

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của alkaloid vàrotudin trong cây như sau:

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản

ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tínhmạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốcthử của alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợpchất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [55]

Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, ở thể rắn ở nhiệt

độ thường Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, cácalkaloid bay hơi thường ở thể lỏng Ở thể rắn, chúng dễ kết tinh và có độ chảyxác định Một số alkaloid không đo được độ chảy do bị phá hủy ở nhiệt độthấp hơn độ chảy Các alkaloid ở dạng lỏng thường không có oxy trong phân

tử (nicotin, spartein) Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạomuối với acid thì nó có thể chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưngspartein sulfat ở thể rắn) Tuy nhiên có một vài trường hợp ngoại lệ một sốalkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin[16], [4]

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rấtđộc Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau.Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ đượccác alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiềuthuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổnghợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây Do đó, người ta vẫn dùngphương pháp chiết xuất từ cây, ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin,eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừabán tổng hợp, ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine,vincamin [16], [4], [8]

Trước đây, người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chấtđường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh

ra Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóngxạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin Qua định tính vàđịnh lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay đổicủa chúng trong quá trình phát triển của cây, người ta thấy nơi tạo ra alkaloidkhông phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid Nhiều alkaloid được tạo

8

ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt.

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đỗ Tất Lợi và P Bonnet đã pháthiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vôi, đặt tên là rotundin - có tác dụng anthần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau

do co thắt cơ trơn [96]

Năm 1998, Nguyễn Tiến Vững và cs đã tiến hành thăm dò tác dụng củaL-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điệncực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não Kết quả là sau khi chothỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền,thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trongthể lưới thân não có những biến động rõ Sự tăng thành phần sóng chậm denta

và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin cótác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầuđại não và thể lưới thân não [14]

Năm 1996, Dương Hữu Lợi thử nghiệm tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 mldung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau 0,5%, 1%, 2% nhậnthấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trìtrong vòng 3-5 giờ [4]

Theo Zhu (1991), D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua không

chỉ có tác dụng giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ [90]

Năm 1986, Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận nghiên cứu đã cho thấygindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alkaloidchiết từ củ Bình vôi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách

rõ rệt Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năngkéo dài thời gian ngủ lên 1,5 lần Hỗn hợp alkaloid với liều 100 mg/kg thểtrọng chuột cũng có tác dụng tương đương [18]

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania

10

Nguyễn Tiến Vững đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đãkéo dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơmtrực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần [14].

L-Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang L-tetrahydropalmatin có tác dụngtrong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone [56].Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid,lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatintrong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [50]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)

Rotundin có công thức phân tử: C12H25NO4 Khối lượng phân tử làM=355,43 Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10-tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine

Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòngisoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trongcác bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật

Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú.Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L-tetrahydropalmatin rất ít độc Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm thỏ mệt 1-2 ngày,đồng tử bị liệt nhất thời rồi hết [16], [6]

11

Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiếnchống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim,mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundinnguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạpthuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và khônggây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [10].

Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tácdụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [19] Phạm Thị Kim,Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học việnQuân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng), tươngđương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dượcđiển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được

LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm Rotundin ítđộc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhấtthời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml(60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày,hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh [10],

[95]. Chu Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự nghiên cứu cơ chế giảm đaucủa L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2,ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc [35].Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như:Rotundin của công ty Dược phẩm TW3 [92], Rotundin của Công ty cổ phầnDược phẩm TW2 [93]

1.1.3 Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi

Loài Bình vôi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bịxâm hại do nạn chặt phá rừng Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đến nguy cơ tuyệtchủng cao Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh

giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguycấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [12].Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật nuôi cấy tạo nguồnnguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc ngày một tăng.

1.2 Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương

Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đốitượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng genQuốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa proteinribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S,5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit

1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADHdehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và

c, RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein,envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase,

maturase K, ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania Bên cạnh đó, hệ gen lục lạp của loài Stephania japonica cũng được xác định trình tự, kích thước của trình tự được xác định dài 157719 bp [76].

Thực vật bậc cao có rất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau, gồm hơn

25000 terpenoid, khoảng 12000 alkaloid và 8000 phenolic [36] Trong đó nhiềuchất có hoạt tính sinh học cao và được dùng làm thuốc, đặc biệt là các alkaloid.Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinhtổng hợp nhiều hợp chất quan trọng [66] Mỗi methyltransferase trong quá trìnhsinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6OMT) [68], [59], [69], [49], [57]; S-adenosyl-L-methionine:coclaurine N-methyltransferase (CNMT) [43], [83], [33], [34]; S-adenosyl-L-methionine: 3’ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase

13

(4’OMT) [57], [43]; S-adenosyl-L-methionine: scoulerine methyltransferase (SMT) [58], [78] và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơchất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc.

9-O-Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [77]

Công trình nghiên cứu của Takashi Morishige và cs (2002) là công trình

đầu tiên đã xác định được gen mã hóa columbamine O-methyltransferase tham

gia trực tiếp chuyển hóa cơ chất tetrahydrocolumbamine để sinh tổng hợprotundin Các tác giả cũng xác định được trình tự cDNA mã hóa enzyme này dài1053bp, mã hóa cho 351 amino acid (với mã số AB073908 trên Ngân hàng gen

Quốc tế) Các kết quả nghiên cứu xác định tất cả các gen O-methyltransferase có liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline trong tế bào Copapis Japonica Tác giả giải trình tự 1014 cDNA được phân lập từ tế bào nuôi cấy sản xuất alkaloid với hàm lượng cao của C Japonica Trong đó, tác giả phát hiện ra tất cả ba O-

methyltransferase và một O-methyltransferase giống như bản sao cDNA có mã

số CJEST64 cDNA này khá giống với cDNA của gen mã hóa methionine: coclaurine 6-O-methyltransferase và S-adenosyl-l-methionine:isoflavone 7-O-methyltransferase Nhờ S-adenosyl-l-methionine: columbamineO-methyl-transferase xúc tác chuyển đổi columbamine thành palmatine, là mộttrong những thành phần chưa được phân giải trong quá trình tổng hợp

S-adenosyl-l-isoquinoline alkaloid ở C japonica, tác giả đã xác định được sự khác biệt của protein trong E.coli và đánh giá sự hoạt động của columbamine O-

methyltransferase Protein tái tổ hợp biểu hiện rõ ràng hoạt tính O-methyl hóa sửdụng columbamine, cũng như (S) - tetrahydrocolumbamine, (S) -, (R, S)-scoulerine và (R, S) -2,3,9,10-tetrahydroxyprotoberine làm chất nền Kết quảnày chứng tỏ rõ ràng rằng EST rất hữu ích để phân lập gen quan tâm theo conđường sinh tổng hợp tương đối tốt Mối quan hệ giữa cấu trúc và sự nhận biếtchất nền của O-methyltransferase liên quan đến sinh tổng hợp isoquinolinealkaloid và palmatine [77]

1.3 Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc

Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là

bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bàothực vật Hai lá mầm Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector

15

liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binaryvector) là phổ biến hơn Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Tiplasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Hệ vectorđược thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang GOI

giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm

nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cảibiến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bàothực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế

bào thực vật Để tái bản trong A tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế

gồm các phần sau: (i) Vị trí ghép nối đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả

E coli và A tumefaciens; (iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv) Gen có khả năng vận chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T –

DNA ngoại biên Ngoài ra, còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kíchthích vận chuyển T – DNA [15], [60], [70]

Vector chuyển gen pBI121 có kích thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các

thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4).

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang được ứng dụng trên cây dượcliệu và ở nhiều cây trồng khác Gần đây dữ liệu hệ gen học được phát triểndựa trên những thông tin về trình tự các gen, dữ liệu EST (expressed sequencetag), thư viện cDNA, microarray Những nguồn thông tin này là cơ hội củaviệc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật chuyển gen, là cơ sở của những hiểu biết

về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phương pháp di truyền ngược.Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và cóhiệu quả ở cây dược liệu nói chung, cây Bình vôi nói riêng là điều cần thiết đitới thành công trong chiến lược cải thiện hàm lượng các dược chất quan trọng.Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thựcvật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Trong đó, phương pháp

chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens đã được ứng dụng phổ biến [37].

Agrobacterium là các vi khuẩn đất thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, yếm

khí, gây ra bệnh sần ở thân và rễ khi xâm nhiễm qua vết thương

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính, trong đó A tumefaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen A tumefaciens cũng giống như các loại vi khuẩn khác là có mang các plasmid Các thực nghiệm cho thấy, khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn A tumefaciens

không mang plasmid sẽ không gây ra khối u ở thực vật Khối u này chỉ đượchình thành khi vi khuẩn có mang plasmid Như vậy chứng tỏ rằng plasmid của

vi khuẩn đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u ởcây Do vậy người ta gọi chúng là các Ti-plasmid (tumor inducing plasmid)

Tiplasmid là một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb Trên Ti plasmid có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái(left border) T-DNA là đoạn sẽ tách khỏi plasmid, chuyển vào tế bào thực vật vàgắn vào bộ gen của cây T-DNA chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin gây nên

-sự phân chia tế bào liên tục và hình thành khối u Ngoài ra nó còn chứa các gen

17

tổng hợp nên các axit amin biến dạng gọi là các opine là nguồn cacbon và nitơ

bổ sung cho vi khuẩn (các chất này không tồn tại ở cây bình thường) NgoàiT-DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng gây độc, có chứa các gen vir chịu tráchnhiệm trong hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp T-DNA vào hệ gen tế bào thựcvật và tiêu hóa opine [9]

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình

chuyển gen: (1) Vùng T-DNA: là đoạn DN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium

vào tế bào thực vật Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen củacây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thayđổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu hiệntrong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [28]; (2) Vùng gây độc Vir

(Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gen Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp của T-ADN Trong đó vir A, B, D, G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật; vir C, E, F, H có tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gen [39]; (3) Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium:

Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T-DNA, tuy nhiên NST

của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này Chúng tác dụng lên bềmặt của tế bào vi khuẩn, giúp tạo ra exopolysaccarid, đồng thời gắn vi khuẩn

vào tế bào thực vật … Ngoài ra những gen khác như vir A đóng vai trò thứ

yếu hơn trong quá trình biến nạp [44]

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặcmất tính biệt hóa ở các mô, tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiếtsinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Đây là một trong những trở ngạilớn do tồn dư các chất điều tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấyảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên, việcnày hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ [65]

Hình 1.6 Cấu trúc Ri-plasmid của A rhizogenes [84]

Vi khuẩn đất A.rhizogenes là vi khuẩn gram âm, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm A.rhizogenes mang Ri-plasmid và đây là tác nhân gây bệnh rễ

tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Tế bào thực vật bị thương tiết racác polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây chuyển một đoạn T-DNA từ Ri-plasmit vào hệ gen của tế bào vật chủ Các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở

vi khuẩn A.rhizogenes có vai trò quan trọng quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

[26] Trong thực tế, gen tạo rễ tơ đã được các nhà nghiên cứu sử dụng để thiết kếvector biểu hiện mang gen chuyển Cấu trúc vector biểu hiện mang gen

19

chuyển và gen tạo rễ tơ được chuyển vào thực vật thông qua A tumefaciens,

giúp cho việc phân tích cây chuyển gen được thuận lợi, nhanh chóng sau 2- 4tuần chuyển gen

Đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triểnnhanh, phân nhánh cao và ổn định trên môi trường nuôi cấy mà không cần bổsung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra cáchợp chất tự nhiên của hệ thống rễ tơ cũng cao hơn rất nhiều so với thực vậtnguyên vẹn, cũng như so với hệ thống dịch treo tế bào ở nhiều loài thực vật Với

sự chuyển gen của A.rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều

loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễbất định không chuyển gen không tổng hợp lại hoặc tổng hợp với hàm lượngkhông đáng kể Rễ tơ được xem như là nguồn nguyên liệu có giá trị trong sảnxuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành

mỹ phẩm và thực phẩm Hơn nữa, kỹ thuật này có ý nghĩa lớn trong việc sảnxuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu suất cao,giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm Bên cạnh

việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào, ta còn có thể chuyển các gen

ngoại lai thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong đoạn T-DNA của

A.rhizogenes Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu hay

có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợphợp chất tự nhiên mong muốn [52], [65]

Các nghiên cứu về cải tiến việc sản xuất alkaloid C roseus đã tập trung vào

việc nuôi cấy tế bào và rễ tơ để làm sáng tỏ quy định về sự biểu hiện quá mứccủa các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp TIA ở cây chuyển gen

Magnotta và cộng sự (2007) đã phân tích sự biểu hiện protein DAT trong rễ C roseus và kết luận rằng nó thay đổi cấu trúc MIA Kết quả này cho thấy sự biểu

hiện quá mức của các gen trong con đường vindoline có thể dẫn đến những thay

đổi đáng kể hàm lượng alkaloid trong cây C Roseus [54] Dựa trên nghiên cứu

về sự biểu hiện mạnh của gen ORCA3 và G10H trong cây C Roseus Pan Q

và cộng sự (2012) kết luận rằng sự biểu hiện quá mức này làm tăng đáng kể

sự tích lũy của strictosidine, vindoline, catharanthine và ajmalicine [64]

Trong năm 2010, Wang và cộng sự đã chuyển thành công gen G10H và ORCA3 vào cây dừa cạn thông qua A rhizogens MSU440 Do đó, hàm lượng

catharanthine trong cây chuyển gen tích lũy cao gấp 6,5 lần so với cây không

chuyển gen [82] Ngoài ra, hệ thống tái sinh và chuyển gen ở C roseus sử dụng Agrobacterium tumefaciens được phát triển và hoàn thành thành công bởi Wang và cộng sự (2012) [81].

Một số nghiên cứu khác như chuyển gen gus ở cây cà chua của Đỗ

Xuân Đồng và cs (2007), ở cây dưa hấu của Nguyễn Thị Thanh Nga và cs(2012), ở cây dầu mè của Võ Thị Thúy Huệ và cs (2011), ở cây thông nhựacủa Vương Đình Tuấn và cs (2012), ở cây xoan ta của Bùi Văn Thắng và cs(2013) Ngoài ra, nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ

điệp (Phalaenopsis amabilis) của Trần Lê Lưu Li và cs (2008) với thí nghiệm lây nhiễm bởi A.tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector 35S -GUS-INT chứa gen uidA và nptII và thu được kết quả biểu hiện gus tối ưu ở nồng độ AS

50μM sau 4 ngày đồng nuôi cấy [7], [20], [23], [25], [1], [22]

21