Nghiên cứu xác một số trình tự AND cho xác định loài dó trầm aquilaria yunnaensis ở việt nam (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

Hiện nay, các chuyên gia đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mã vạch DNA- xác định các đoạn DNA barcode là một phương pháp tiên tiến, sử dụng trình tự các đoạn DNA ngắn đặc trưng nằm trong b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU XÁC MỘT SỐ TRÌNH TỰ AND CHO XÁC ĐỊNH LOÀI DÓ TRẦM AQUILARIA YUNNANENSIS Ở

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 9

1.1.Tổng quan về cây Dó Trầm 9

1.1.1.Phân loại học 9

1.1.2.Phân bố của chi Aquilaria 9

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây 10

1.1.4 Giá trị kinh tế và sinh thái của cây Dó Trầm 11

1.1.5 Một số nghiên cứu tạo Trầm trên cây Trầm hương 12

1.1.6 Thực trạng và thách thức đối với giá trị của Trầm Hương trên thị trường hiện nay 13

1.2 Tổng quan về DNA barcode (DNA mã vạch) 14

1.2.1 Giới thiệu về AND mã vạch (DNA barcode) 14

1.2.2 Đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch 16

1.3 Những locus được sử dụng trong phương pháp ADN mã vạch ở thực vật 17

1.3.1 Trình tự gen nhân 17

1.3.2 Trình tự gen luc lạp 17

1.3.3 Trình tự gen rbcL 19

1.3.4 Trình tự gen matK 19

1.3.5 Trình tự gen ycf5 19

1.3.6 Trình tự gen rpoB và rpoC1 19

1.3.7 Trình tự hai gen trnH-psbA 20

1.3.8 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) 20

1.3.9 Vùng gen mã hóa ribosome 20

1.4 Ứng dụng mã vạch DNA 21

1.5 Những thành tựu nghiên cứu DNA ở thực vật 22

1.5.1 Những thành tựu nghiên cứu trên thế giới 22

1.5.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN của cây Dó Trầm Aquilaria 24

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 26

2.4 Vật liệu, hóa chất và các thiết bị nghiên cứu 26

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.3.2 Hóa chất 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 28

2.4.2 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau khi tách chiết 29

2.4.3 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu 30

2.4.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 32

2.4.5 Phương pháp giải trình tự 32

2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu 32

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Tách chiết ADN tổng số 33

Giếng: 1: HBQN02; 2: TDC02; 3: TD03; TD05; TD07 33

3.2 Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 33 3.2.1 Kết quả nhân bản đoạn gen matK 33

3.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen rbcL 34

3.2.3 Kết quả nhân bản đoạn gen trnH-psbA 35

3.2.4 Kết quả nhân bản đoạn gen ITS2 36

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin của một số mồi ADN mã vạch thiết kế cho hệ gen lục lạp 17

Bảng 2.1: Mẫu và kí hiệu mẫu trong nghiên cứu 27

Bảng 2.1: Thành phần và nồng độ các chất sử dụng trong một phản ứng PCR 30 Bảng 2.2: Trình tự và thông tin về cặp mồi 31 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi ITS2 31

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Dó Trầm chụp từ dưới lên 10 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK 34 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen trnH-psbA 36 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcL 35

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại trường Đại học Lâm Nghiệp, để vượt qua những khó khăn, thử thách và đạt được những kết quả mong muốn trong học tập cũng như cuộc sống, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được những sự quan tâm, giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy

cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại trường Đại học Lâm Nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thị Thơ đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp Với những kiến thức

và kỹ năng cô truyền dạy không chỉ giúp tôi hoàn thành khóa luận mà còn là tài sản quý báu theo tôi sau này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp và trường Đại học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có một môi trường tốt để học tập, nghiên cứu và rèn luyện

Cuối c ng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy cô, gia đình, bạn bè - những người đã động viên, khích lệ tôi suốt quá trình học tập, rèn luyện và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Do trong quá trình thực hiện còn có nhiều hạn chế về mặt thời gian, kiến thức và kinh nghiệm vì vậy không tránh khỏi những thiếu sót nhất định Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để khóa luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2020

A yunnanensis Aquilaria yunnanensis

A crassna Aquilaria crassna

A baillonii Aquilaria baillonii

A rugosa Aquilaria rugosa

A malaccensis Aquilaria malaccensis

A sinensis Aquilaria sinensis

A banaensis Aquilaria banaensis

DNA (ADN) Axit deoxyribonucleic ITS v ng DNA nằm giữa các gen NCBI Trung tâm Quốc gia về Thông tin

Công nghệ sinh học PCR Phản ứng chuỗi polymerase

CBOL Consortium for the Barcode of Life

EDTA axit ethylenediamine tetraacetic

bp Cặp base PVP Polyvinyl pyrrolidone RFLP Phân tích đa hình trình tự DNA

RAPD Sự khuếch đại ngẫu nhiên của DNA

đa hình

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dó trầm (Aquilaria yunnanensis) thuộc chi Dó Trầm (Aquilaria), họ

Trầm (Thymelaeaceae), là loài được biết đến là cây đặc hữu ở Vân Nam, nhưng gần đây các nhà khoa học của Trường Đại học Lâm nghiệp đã tìm thấy chúng ở Quảng Ninh

Về mặt hình thái hoa, quả của một số mẫu được thu thập tại Quảng Ninh

cho thấy chúng rất có thể là loài Aquilaria yunnanensis Tuy nhiên để có thể

khẳng định chính xác hơn về việc các mẫu tìm thấy tại Quảng Ninh trên có đúng

là loài A yunnanensis hay không thì việc phân tích DNA barcoding có thể mang

lại những bằng chứng phân tử có giá trị phân loại cao

Mặt khác, A yunnanensis cũng như các loài Dó trầm khác thuộc chi Aquilaria có khả năng tạo trầm với giá trị kinh tế rất cao Trầm hương là một

sản phẩm rất quý hiếm và là một mặt hàng xuất khẩu đem lại lợi nhuận rất lớn Trong y học cổ truyền trầm d ng làm thuốc chữa bệnh, trong công nghiệp mỹ phẩm d ng là chất định hương, hế biến dầu thơm, nước hoa, …Gỗ trầm được

d ng làm đồ d ng gia dụng

Vì giá trị cao của Trầm hương nên trên thị trường xuất hiện trầm hương giả - sử dụng những loại gỗ không có khả năng tạo trầm rồi tẩm ướp các loại hương liệu tổng hợp thậm chí là những hóa chất có hại cho sức khỏe con người

Để phục vụ cho việc xác định nguồn gốc các loài dược liệu, các chủng loài vật liệu, kiểm nghiệm các nguồn dược liệu một các chính xác và đúng nhất Hiện nay, các chuyên gia đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mã vạch DNA- xác định các đoạn DNA barcode là một phương pháp tiên tiến, sử dụng trình tự các đoạn DNA ngắn đặc trưng nằm trong bộ gen của vi sinh vật đang nghiên cứu để nhận biết và phân biệt loài Phương pháp này mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế giới

Xuất phát từ những nguyên nhân trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề

tài “Nghiên cứu xác một số trình tự ADN cho xác định loài Dó Trầm Aquilaria yunnanensis ở Việt Nam" nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch, phục vụ

cho giám định loài và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về cây Dó Trầm

Ở Việt Nam, Cây Dó Trầm còn được gọi là còn được gọi là Dó Bầu, Trầm

Dó, Trầm hương hay Kỳ Nam

1.1.2 Phân bố của chi Aquilaria

Chi Aquilaria gồm 21 loại phân bố ở Châu Á trong các khu vực rừng mưa

của Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaysia, Bắc Ấn, Trung Quốc, Phiplipes, Borneo và New Guinea

Ở nước ta, Dó Trầm được phát hiện gồm 7 loài chi trầm phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc, Quảng Ninh:

A crassna, A baillonii, A rugosa, A malaccensis, A sinensis, A banaensis, A yunnanensis Trong đó, loài A yunnanensis S C Huang (Thymelaeacea) được biết đến là loài đặc hữu của Tỉnh Vân Nam, Trung Quốc (Aquilaria yunnanensis SC Huang, Acta Bot Vân Nam 7: 277 1985.), được ghi nhận lần

đầu tiên từ khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn Kỳ Thượng, Tỉnh Quảng Ninh,

Việt Nam (Aquilaria yunnanensis S.C Huang (Thymelaeaceae)

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây

(Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (Bộ Lâm nghiệp), Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội năm 1981, tập IV, trang 178,)

Cây Dó trầm là loài Cây gỗ lớn thường xanh, cao 15 – 25 mét, đường kính 60 cm Vỏ ngoài nhẵn, màu xám có vết nhăn dọc, thịt vỏ màu trắng, có tơ mịn, dày 2 – 4 mm Cành non phủ lông mềm màu vàng xám

Hình 1.1 Cây Dó Trầm chụp từ dưới lên

Lá đơn mọc cách, dai Phiến lá hình mũi mác thuôn, dài 6 – 11cm, rộng 3 – 4cm, đỉnh có mũi nhọn, gốc hình nêm rộng, mép nguyên mặt trên màu lục, mặt dưới màu xanh xám; gân hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, hợp lại ở mép Cuống lá dài 2 – 5 mm, có lông mềm

Cụm hoa hình tán, có nhiều hoa Hoa có cuống; đài hình chuông màu trắng có 5 th y và 10 vảy đính ở họng đài Nhị 10, đính thành 2 hàng, chỉ nhị nhẵn đính ở gốc ống đài, trung đới khá rộng, bầu hình trứng có lông dày Quả mang hình trứng ngược, dài 3 – 5cm, có lông xám dầy Hạt chín màu nâu đen

Cây mọc trong các rừng ẩm nhiệt đới Có thể gặp ở độ cao 1.000 mét, nhưng tập trung ở độ cao dưới 700m Trầm là cây chịu nóng, tái sinh tự nhiên tốt, ưa đất thịt pha cát tầng đất dầy M a hoa tháng 7 – 8 Quả chín tháng 9 – 10

1.1.4 Giá trị kinh tế và sinh thái của cây Dó Trầm

Giá trị kinh tế quan trọng nhất của cây dó bầu là để khai thác trầm hương

Từ thời xa xưa trầm hương đã được coi là sản vật hết sức quí hiếm, ngày nay trầm hương vẫn là lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tế lớn Trên thế giới trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầu trầm, một chất định hướng quan trọng trong ngành công nghiệp để sản xuất các loại mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, được d ng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giá trị Trầm hương là sản phẩm văn hóa vật chất tín ngưỡng tâm linh của dân tộc Việt Nam đã tồn tại từ xa xưa đến thời nay [9]

Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species

of Wild Fauna and Flora - Công ước về buôn bán quốc tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp) khối lượng mua bán trầm hương trên thị trường thế giới thời kỳ 1995-1997 khoảng 1.350 tấn Giá mua bán trầm hương được tính theo kg

t y thuộc vào chất lượng Giá bán trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) [18]

Theo ước tính của Liên hiệp Khoa học sản xuất tinh dầu - hương liệu mỹ phẩm Việt Nam thì trong những năm từ 1980 đến 1990, khối lượng trầm hương các loại đã bị khai thác và xuất khẩu từ nước ta khoảng 300 tấn Trong đó có 2.000 kg trầm từ loại 1 - 4 trị giá khoảng 1,5 triệu USD và 300.000 kg Trầm loại

5 - 9 trị giá khoảng 4,5 triệu USD; đặc biệt là 200 g kỳ nam loại 1 - 3 trị giá 0,5 triệu USD và tới 2.800 kg kỳ nam loại 4 - 8 trị giá 2,52 triệu USD

Với giá trị kinh tế cao, trầm hương đã đem đến những hứa hẹn triển vọng cho ngành sản xuất lâm nghiệp khi 1 ha trồng cây dó bầu, tạo trầm hương có thể làm ra giá trị 1,5 - 1,8 tỷ đồng/ 10 năm, bình quân giá trị tạo ra 150 - 180 triệu/ ha/năm, trong đó lợi nhuận từ 50 - 60 % [11]

Ngoài ra trong y học, trầm hương còn được sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo Theo Đông y, trầm hương là vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính ôn, vào 3 kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng nguyên dương, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Theo tây y, trầm

hương có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium

tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt

khuẩn, làm lành vết thương), có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện) Đặc biệt, có thể d ng trầm hương để chữa ung thư tuyến giáp [15]

Cũng giống như một số cây lâm nghiệp khác, Dó Trầm là một trong những cây lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu làm giấy có chất lượng cao Theo các kết quả nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu là loài cây thích nghi tốt với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều và cho năng suất khai thác khá cao, được ngành công nghiệp giấy xác định là là một trong những nguồn nguyên liệu chính trong các dự án đầu tư phát triển sản xuất của ngành từ nay đến năm 2010 [5]

1.1.5 Một số nghiên cứu tạo Trầm trên cây Trầm hương

Đã có thành công bước đầu về tạo trầm ở cây Trầm hương trên cả hai phương diện nghiên cứu và thực tiễn Những cây Trầm hương đủ điều kiện để tạo trầm thường có thời gian sinh trưởng 5 năm tuổi trở lên, đường kính thân 15-18cm, cây sinh trưởng bình thường Các phương pháp tạo trầm đang áp dụng hiện nay là:

 Phương pháp gây tổn thương: đục khoét hoặc đóng sắt vào thân cây Cách này dễ làm, ít tốn kém, nhưng lâu cho trầm và chất lượng thấp

 Mô phỏng tự nhiên nuôi cấy các loại côn tr ng (Xén tóc; Kiến) trên thân cây trầm hương Đây là kinh nghiệm bản địa chưa có công bố kết quả

 Phương pháp sinh học: Tạo men (vi sinh) rồi cấy vào thân cây Cách này khó làm, ít người biết, giá thành cao, nhưng an toàn về mặt sử dụng sản phẩm

 Phương pháp hoá chất: Tạo hỗn hợp hóa chất rồi cấy vào thân cây Cách này phức tạp, nhanh cho trầm, nhưng có thể lưu lại một phần hoá chất có hại

Một số cách tạo trầm khác như kết hợp một số phương pháp trên với nhau Hiện đã có sáng chế tạo trầm của các ông: Balnchette; Robert A (Shoreview, MN); Van Beek; Henry Heuveling (Amsterdam, NL) thuộc Dự án sản xuất cây giống, tạo trầm trên cây Trầm hương của Tổ chức rừng mưa nhiệt đới (TRP) ở

An Giang Tuy nhiên, việc chuyển giao công nghệ này cho người dân, còn phải chờ Mỗi phương pháp tạo trầm cho kết quả không giống nhau về số lượng, chất lượng, thời gian và phí tổn, nhưng có thể khẳng định con người đã tạo được trầm trên cây Trầm hương là rõ ràng Tuy nhiên, việc nuôi cấy vi sinh tạo trầm vẫn còn là điều bí ẩn, các loại vi nấm; vi khuẩn hoặc virus được nuôi cấy thuộc chủng nào vẫn chưa được công bố Hiện nay những tổ chức và cá nhân nắm

được kỹ thuật tạo trầm chưa nhiều, họ thường giữ bí mật, coi đó là bí quyết riêng Đã có một số doanh nghiệp, cá nhân chuyên lo dịch vụ tạo trầm trên cây Trầm hương trồng (trong đó có phương pháp tạo trầm bằng vi sinh du nhập từ Thái Lan), nhưng chưa có cơ sở chắc chắn cho sự thành công của các dịch vụ này về mặt khoa học và pháp lý

Bên cạnh các nghiên cứu về các kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo, một hướng nghiên cứu cũng rất quan trọng nhưng còn bị bỏ ngỏ đó là các nghiên cứu

ở mức độ sinh học phân tử quần thể Dó Bầu để xác định nhóm các cá thể hay giống dó bầu có khả năng tạo trầm hiệu quả, vì ngay trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm và khả năng tạo trầm, chất lượng trầm

ở các loài khác nhau cũng là rất khác nhau Hơn nữa, việc đầu tư trồng cây dó bầu đến khi thu hoạch là khá lâu, đòi hỏi thời gian khoảng 7-10 năm (sau 5-7 năm mới có thể cấy tạo trầm nhân tạo, và sau 2-3 năm mới có thể hạ cây để thu trầm) Trong hội nghị về cây trầm hương ngày 24/9/2004 tại thành phố Hồ Chí Minh, các chủ trại trầm cũng đưa ra những băn khoăn về công tác lựa chọn giống để có được trầm chất lượng cao, do chất lượng trầm tạo được thật sự chỉ tạo trầm loại 4, loại 5 ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế [7]

1.1.6 Thực trạng và thách thức đối với giá trị của Trầm Hương trên thị trường hiện nay

Với giá trị kinh tế cao và nhu cầu ngày càng tăng nên trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, trầm hương tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt Năm 1994, cây Dó Trầm được ghi trong công ước quốc tế CITES quy định về việc buôn bán các sinh vật có nguy cơ tuyệt chủng Bên cạch đó, Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây Dó Trầm là sự biến đổi của các phần tử gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…xảy ra một cách tự nhiên với thời gian rất lâu Để sản xuất trầm hương nhân tạo thách thức lớn nhất

là công nghệ tạo trầm, chất lượng cây giống, các chỉ tiêu về lâm sinh đối với cây

dó trồng, sự tương thích giữa các cây trồng xen, bệnh của cây

Do trầm hương đem lại giá trị kinh tế rất cao c ng với đó là số lượng trầm

do khai thác qua nhiều năm gần như đã kiệt quệ, nên gần đây, nhiều tiểu thương

vì lợi nhuận đã sử dụng những hóa chất, hương liệu tẩm ướp làm giả trầm hương

để đem bán với giá cao Điều đó, đã làm ảnh hưởng rất lớn đến người tiêu d ng trầm, đặc biệt là sức khỏe người bệnh khi sử dụng dược liệu làm từ trầm hương

Chính vì vậy, một thách thức lớn để các nhà nghiên cứu, nhà thẩm định chất lượng tìm ra các phương pháp phân biệt được trầm hương nói riêng, cũng như các loài cây, dược liệu nói chung một cách chính xác nhất

1.2 Tổng quan về DNA barcode (DNA mã vạch)

Đến nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật

Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài giúp giải quyết mối nghi ngờ về

vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hóa của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài

Việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiếnhoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được d ng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứyếu tố khách quan nào

1.2.1 Giới thiệu về AND mã vạch (DNA barcode)

Kỹ thuật ADN mã vạch (DNA barcode) là một tên mới cho một khái niệm cũ Thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng trong một bài báo vào năm 1993 (Arnon, 1993), tuy nhiên, bài báo lại không nhận được sự chú

ý nhiều từ cộng đồng khoa học., và gần đây thuật ngữ này được sử dụng lại trong nhiều nghiên cứu

Trên thực tế, ADN mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ nghiên cứu của Hebert và cs tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện các mẫu vật (Hebert, 2003) kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng

gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI) [21] Sau đó, nhiều nghiên

cứu về định danh loài bằng chỉ thị ADN đã thành công trên động vật như chim,

cá, ốc tiền, nhện và một số loài côn tr ng thuộc bộ Cánh cứng Gần đây, hệ thống chỉ thị ADN đang được thiết lập cho các nhóm sinh vật khác như thực vật, tảo, nấm, sinh vật nguyên sinh và vi khuẩn đã thu được hiệu quả đáng kể

Để thúc đẩy việc sử dụng ADN barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã được

thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu ADN nào Với sự hỗ trợ của CBOL, ADN barcode ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới

Tháng 2/2005, tại hội nghị về xây dựng mã vạch sự sống ở Bảo tàng Lịch sử tự nhiên London, Anh, các nhà khoa học đã thống nhất thực hiện dự án

“Sáng kiến xây dựng mã vạch sự sống” với tham vọng nhanh chóng lưu trữ thông tin của khoảng 10 triệu loài sinh vật trên Trái đất bằng mã vạch ADN Trong giai đoạn 2003-2010, có tới 411 bài báo khoa học chứa “mã vạch ADN” trong tiêu đề và công cụ này được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực, từ xác định các giai đoạn trong vòng đời côn tr ng cho đến kiểm tra giám sát cá bán trong chợ

Cơ bản, mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong geneome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau

Như vậy, DNA barcode là một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn của một gen đã biết, trong đó có v ng ít bị thay đổi và v ng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật

DNA barcode là một công cụ mới, rất có hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, vi sinh vật và virus Việc xác định loài bằng DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ

sở để định danh hoặc phân biệt loài

Một DNA barcode điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

 Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật

 Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao

 Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

1.2.2 Đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch

Đặc điểm cơ bản và quan trọng nhất của ADN mã vạch là phải phổ biến

và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại,

có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do đó, ADN mã vạch lý tưởng là một đoạn ADN có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR

Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị

ADN và hệ gen nhân, v ng ADN nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm ADN chỉ thị trong một số nghiên

cứu Trong vòng 5 năm qua, nhiều v ng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị ADN cho thực vật [11], [22], [23] Tuy nhiên chưa có chỉ thị ADN nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận Mặc d vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều v ng ADN chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [11], [22], [23]

Theo một số nghiên cứu, hệ thống ADN mã vạch phải đáp ứng các yêu cầu sau:

 Đầu tiên, đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong c ng loài

 Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải được chuẩn hóa, với

c ng một v ng ADN có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

 Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để

có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ, …)

 Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại

1.3 Những locus được sử dụng trong phương pháp ADN mã vạch ở thực vật

1.3.1 Trình tự gen nhân

Các trình tự barcode được nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến

sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng ADN genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp ADN mã vạch [21], [24]

1.3.2 Trình tự gen luc lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vòng có kích thước

120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region) Hai bản sao được phân

cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb

Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp

(khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng

Bảng 1.1 Thông tin của một số mồi ADN mã vạch thiết kế cho hệ gen lục lạp

rbcL

a-f a-r

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

→

←

matK

matK 1F matK 1R matK 2F matK 2R

GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA

AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC

GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC

→

←

→

rpoC1 4 CCATAAGCATATCTTGAGTTGG ←

ycf5

(ccsA)

ycf5 1 ycf5 2 ycf5 3 ycf5 4

GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG

CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→

←

→

trnL-f trnL-g trnL-h

ATTTGAACTGGTGACACGAG3’

GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc th của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp

có độ dài ph hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy ph hợp cho nhiều mức

độ phân loại [21], [24]

1.3.3 Trình tự gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các

tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase

(RUBISCO) rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật rbcL đã được sử

dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn

10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong

những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng

nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK

là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [21], [24]

1.3.4 Trình tự gen matK

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh

nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan

đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA Do matK

tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật

CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu

thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn

và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật

[21]

1.3.5 Trình tự gen ycf5

ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này được

bảo tồn trên tất cả các v ng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho ph hợp với ADN mã vạch của một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và

sử dụng nhiều trong vai trò của một ADN mã vạch [21]

1.3.6 Trình tự gen rpoB và rpoC1

Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA

polymerase lục lạp Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi C ng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài

vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp

nhất (43%) Mặc d vậy, trong nghiên cứu Liu và đtg (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự ph hợp khi sử dụng

rpoB và rpoC1 làm chỉ thị mã vạch trong các nghiên cứu giám định loài [21]

1.3.7 Trình tự hai gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi

từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài

cao Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín

và hạt trần Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước

rất ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa c ng gen của hai gen trnH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị

barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy rằng khả năng

phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [21],

1.3.8 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), v ng intron và

v ng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA) Taberlet và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật

V ng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là v ng có sự biến

đổi lớn nhất của ADN lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với v ng biến đổi và v ng bảo thủ xen kẽ nhau Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các v ng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở v ng biến đổi Trong nghiên cứu để xác định

trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm v ng ADN mã vạch, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một barcode tiềm năng cho phân

tích, xác định các loài thực vật [21], [23]

1.3.9 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rADN là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen ADN ribosome (rADN) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rADN được sắp xếp như

các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN mã hóa ribosome 18S, 5,8S,

28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của v ng 5,8S V ng mã hóa của ba gen rADN được bảo tồn cao hơn hai v ng ITS Nhìn chung các đơn vị rADN được lặp lại

hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại v ng lớn trên nhiễm sắc thể Một

trong những tính năng đáng chú ý nhất của rADN là từng đơn vị trong hệ thống

đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách

phối hợp nhờ vậy mà rADN đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt

giữa các loài khác nhau

Hiện tại, nrITS v ng ITS của gen nhân được xem là một trong những

công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó

phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính

cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do

nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này

nrADN có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong

c ng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [21], [24]

1.4 Ứng dụng mã vạch DNA

Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các mẫu

mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những bí ẩn, còn mơ hồ hoặc những loài phức tạp Trong hệ sinh thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc d chúng hầu như không giống nhau về hình thái Phân tích sinh thái học ở thực vật đang diễn ra mạnh mẻ để hiểu được chế

độ dinh dưỡng hoặc hướng di cư của động vật

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu nhỏ, thậm chí bị vài biến biến dạng cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc Gần đây, cơ sở dữ liệu mã vạch DNA của chó

đã được các sở pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công việc của họ (Steinke et al., 2009)

 Kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng tỷ USD mỗi năm Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chống các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu tr ng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành mã vạch DNA

để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh Kinh doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ được đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Xác định vật chủ trung gian gây bệnh

Mã vạch DNA cũng được sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh Các nhà khoa học những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh tr ng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa người và động vật Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng

Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và phổ biến Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ

và phương pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn tr ng (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Bảo vệ loài nguy cấp

Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tiệt chủng Không thể kiểm soát được săn bắn ở một số v ng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giả quý hiếm hay không Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ

ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học Một dự án chiến lược trên toàn thế giới của

mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện mã vạch của các loài đang bị đe dọa (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên

Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông

nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chítuyệt chủng của nhiều loài Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp Có ít nhất hai dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Kiểm tra chất lượng nước

Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nước Hiện tại nước ngọt trở thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ ở mỗi quốc gia Nguồn nước bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và biện pháp xử lý Một vài sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm (ví dụ như ấu tr ng của muỗi) Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác định các chỉ số ô nhiễm Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cô gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ” Điều này giúp cho cán bộ quản

lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc đánh giá nước và thiết lập quy trình đáng giá tiêu chuẩn nước tốt hơn ở mỗi quốc gia (CBOL ABS

Brochure, 2012)

1.5 Những thành tựu nghiên cứu DNA ở thực vật

1.5.1 Những thành tựu nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay hệ thống ADN barcode cho thực vật chưa hoàn chỉnh Tuy nhiên với các trình tự ADN barcode này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học

Năm 2011, Xiaohui Pang và cộng sự đã nghiên cứu đề tài: “Áp dụng mã vạch ADN thực vật để nhận dạng loài Hoa hồng” Ở nghiên cứu này đã thử

nghiệm khả năng ứng dụng của bốn v ng ADN (rbcL, matK, rpoC1 và ITS2)

làm mã vạch để xác định các loài trong Hoa hồng Dựa trên đánh giá tỷ lệ thành công của khuếch đại PCR, chất lượng trình tự, mức độ phân biệt di truyền cụ

thể, khoảng cách mã vạch ADN kết quả cho thấy ITS2 là tốt nhất trong số 4

locus được thử nghiệm mã vạch loài hoa hồng Tiếp tục đánh giá hiệu quả của

ITS2 để xác định một loạt các loài hoa hồng Trong số 1410 mẫu thực vật được thu thập từ 893 loài thuộc 96 chi khác nhau, ITS2 đã xác định thành công 78 loài

và 100% trong số chúng ở cấp độ loài và giống, tương ứng Do đó, nghiên cứu

chỉ ra rằng v ng ITS2 là một mã vạch mạnh mẽ, mặc d không hoàn hảo để xác

định thực vật nhưng góp phần cung cấp thông tin có giá trị để xác định các loài

có liên quan chặt chẽ trong các nhóm phân loại thực vật khác (Xiaohui Pang và

cs, 2011)

Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp đầy đủ các thông tin về loài cụ thể Gen lạp thể không cho thấy đầy đủ

sự khác biệt, trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt trong loài cao Những khó khăn đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae, họ Magnoliaceae

và trong họ Lauraceae khi giải thích những mối quan hệ trong loài Từ những

nghiên cứu cụ thể trên ba nhóm thực vật khác nhau, thực vật hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận rằng việc kết hợp các locus hệ gen lạp thể

như rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA mang lại hiệu quả cao như một hệ

thống barcode duy nhất cho xác định các nhóm loài rộng Vì vậy, trong các dự

án như giám định loài sử dụng các chỉ thị barcode, việc đề xuất barcode hai locus tiêu chuẩn là không đủ do sự phân ly trong loài và quần thể ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn Đặc biệt trong c ng khu vực phân bố trải qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai trình tự gen lạp thể không đủ

để đánh dấu ranh giới loài Các vấn đề sinh học như đa bôi thể, dị bội, sinh sản

vô tính, chuyển gen, chọn dòng, phân ly và tiến hóa nhanh hình thái học dẫn đến

sự khó khăn trong xác định loài Do vậy không thể sử dụng c ng một v ng ADN

để xác định cho các loài khác nhau mà cần lựa chọn các v ng ADN khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau

Nhóm tác giả Lichao Jiao và cộng sự (2017) nghiên cứu ứng dụng ADN

mã vạch trong xác định 6 loài Pterocarpus cho thấy: 31 mẫu gỗ xylarium và 8 mẫu lá của 6 loài Pterocarpus quan trọng đã được chọn để nghiên cứu độ tin cậy

của mã vạch ADN để xác thực ở cấp loài và xác định tính khả thi của việc xây

dựng các thư viện tham chiếu mã vạch ADN từ mẫu xylarium Bốn mã vạch ADN (ITS2, matK, ndhF-rpl32 và rbcL) và sự kết hợp của chúng đã được thử nghiệm để đánh giá khả năng phân biệt của chúng đối với các loài Pterocarpus

với cả hai phương pháp phân tích dựa trên phân loại học và ADN Kết quả chỉ ra

rằng mã vạch kết hợp của matK + ndhF-rpl32 + ITS2 mang lại sự khác biệt tốt nhất cho các loài Pterocarpus được nghiên cứu Kết quả từ nghiên cứu này đã

xác minh không chỉ tính khả thi của việc xây dựng các thư viện mã vạch ADN

sử dụng mẫu gỗ xylarium, mà khi định danh các loài Pterocarpus thì mẫu gỗ

cho kết quả tốt hơn (Lichao Jiao và cs, 2017)

Năm 2002, Kong HZ 1 và cộng sự đã xây dựng cây phát sinh của chi

Chloranthus (Chloranthaceae) dựa trên đoạn gen ITS ribosome và dữ liệu trình

tự gen TRNL-F plastid Các bộ đệm được phiên mã nội bộ (ITS) của ADN ribosome và v ng trnL-F của ADN lục lạp đã được giải trình tự cho tất cả 10 loài thuộc chi Chloranthus và chi Sarcandra Các phân tích Parsimony của các

bộ dữ liệu riêng biệt và kết hợp cho thấy chi Chloranthus là đơn vị và có thể

được chia thành hai nhánh chính: một nhánh có chứa các loài C erectus, C spicatus, C serratus, C henryi, C sessilifolius và C oldhamii (Clade A) và nhánh còn lại chứa các loại bao gồm C angustifolius, C fortunei, C erveosus và

C japonicus (Clade B) Về mặt phân loại, hai nhánh này tương ứng với các phần mà Bentham và Hooker đã nghiên cứu là Euchloranthus và Tricercandra

Trong Clade A, hai phân nhóm tương ứng với các phần của Solms-Laubach là

Triandri và Brachyuri, có thể được nhận ra Tuy nhiên, subgenera Frnomosi và Herbacei của Solms-Laubach đã được giải quyết Do đó, sự phân chia truyền thống của chi Chloranthus trên cơ sở tăng trưởng không được hỗ trợ Bằng chứng từ các trình tự ITS và trnL-F, ph hợp với hình thái, giải phẫu và tế bào học, cho thấy chi Chloranthus bao gồm hai nhóm có thể phân biệt về hình thái bởi các đặc tính androecial của chúng Nghiên cứu hiện tại cũng ủng hộ cho giả thuyết rằng bộ ba androecium của chi Chloranthus có thể đã phát sinh bằng cách

tách một nhị hoa với hai thể cận biên

1.5.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN của cây Dó Trầm Aquilaria

Xuất phát từ những giá trị mà cây Dó Trầm mang lại đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới trong đó có Việt Nam đã tiến hành những thí nghiệm để nghiên cứu về loài cây này Một trong những nghiên cứu có đóng góp lớn nhất cho tới nay là TS Lê Công Kiệt và TS Paul Kessler người Hà Lan đã phát hiện

loài Aquilaria rugosa năm 2005 đồng thời phân biệt được Aquilaria rugosa với

A sinnesiss, A crassna, A yunasensis [30]

Bằng chỉ thị AFLP nhóm nghiên cứu của Nurita và đống tác giả (2009) đã

phát hiện được sự tương đồng di truyền giữa các Aquilaria sp là A malaccensis,

A beccatiana và A crassna khoảng 63,9 đến 72% so với các loài Aquilaria khác

[24] Các nhà khoa học người Malaysia cũng đã tiến hình phân tích trên 5 quần thể cây dó bầu ở Malaysia bằng chỉ thị RAPD với 23 cặp mồi RADP từ đó đã

tìm ra 5 chỉ thị SCAR để phân biệt A hita với các Aquilaria khác [31]

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có những công trình công

bố kết quả nghiên cứu chỉ thị phân tử nói chung và mã vạch ADN nói riêng của

các loài thuộc chi Aquilaria Việc sử dụng mã vạch ADN có thể giúp chúng ta

tìm ra những loài, xuất xứ Trầm hương cho chất lượng trầm tốt một cách nhanh nhất Điều này có ý nghĩa rất lớn trong công tác tuyển chọn, gây trồng các giống Trầm hương chất lượng cao, cũng như sử dụng đúng nguồn giống trầm tốt làm nguyên liệu nuôi cấy in vitro phục vụ tạo tinh dầu trầm

Hoàng Đăng Hiếu (2012), sử dụng 4 trình tự gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS để phân loại 18 mẫu Dó bầu thu thập từ tập đoàn Dó bầu tại Hà Tĩnh trnH-psbA và rpoB có ít sai khác và khó d ng để định danh các mẫu Dó bầu

(Aquilaria sp) Ngược lại, rbcL và ITS là hai chỉ thị có giá trị trong việc phân loại các loài thuộc chi Aquilaria

Dựa về mặt hình thái hai chi Aquilaria và Gyrinops của họ

(Thymelaeaceae) có sự khác biệt nhỏ về số nhị và kích thước của chỉ nhị [25] Một câu hỏi đặt ra chúng có thật sự thuộc hai chi khác nhau không? Để giải quyết vấn đề này chỉ có thể sử dụng mã vạch ADN Với dữ liệu về trình tự của

v ng trnL-trnF được nghiên cứu trên 9 loài thuộc Aquilaria và 5 loài thuộc Gyrinops, Eurlings và cs (2005) đã đi đến khuyến cáo: về mặt phát sinh chủng

loại Aquilaria và Gyrinops nên được nhập làm một và Aquilaria chỉ là cái tên cũ hơn so với Gyrinops [26]

Năm 2013, Lichao Jiao và cs khẳng định gỗ của Aquilaria sinensis là khó phân biệt với các loài c ng chi Aquilaria hoặc các loài thuộc chi gần gũi Gyrinops Vì vậy, nhóm tác giả đã sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 4

trình tự đặc trưng rbcL, matK, trnL-trnF và ITS và so sánh với các trình tự gen tương ứng trên GenBank Kết quả là tất cả các mô gỗ khô, tươi hay mô lá của

Aquilariasinensis có thể được xác định so với những loài gần gũi khi sử dụng cả

4 chuỗi ADN trên Cụ thể: khi so sánh trình tự của 4 chuỗi ADN được nhân bản với trình tự đã biết trên Genbank, kết quả thu được với matK và rbcL có sự ph hợp 100% trong khi trnL-trnF và ITS có chút ít sự khác biệt Đối với v ng trnL- trnF (415 bp), 8- 14 bp (1,9 - 3,37%) là những sai khác đột biến nucleotit được tìm thấy Ở v ng ITS1 (266 bp), đã có 8 - 20 bp (chiếm tỷ lệ 3,01 - 7,52%) được

tìm thấy là khác biệt Gỗ của A sinensis có thể được xác định nhờ công nghệ mã

vạch ADN [27]