Nghiên cứu giám định và phân tích đa dạng di truyền loài xá xị (cinnamomum parthenoxylon (jack) meisn) tại vườn quốc gia tam đảo bằng phương pháp DNA mã vạch (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

Tổng quan về DNA mã vạch DNA barcode 1.3.1 Giới thiệu về DNA mã vạch Mã vạch DNA, một phương pháp mới để xác định nhanh chóng về việc phân tích trình tự chuỗi DNA từ mẫu mô của bất kì

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO BẰNG PHƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị, máy móc trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực hiện đề tài

em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, giúp em hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp và đặc biệt cô TS Hà Bích Hồng đã hướng dẫn tận tình cho em trong thời gian thực hiện đề tài “Ngiên cứu giám định và phân tích đa dạng di truyền loài Xá xị tại vườn Quốc gia Tam Đảo bằng DNA mã vạch” Bằng sự nhiệt huyếtvà kinh nghiê ̣m của mình cô đã truyền đạt kiến thức để em nắm rõ tất cả nội dung trong quá trình nghiên cứu để có được bài báo cáo như hôm nay

Cuối cùng , em xin kính chúc các thầy , cô trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp có sức khỏe dồi dào và luôn thành công trong công việc để tiếp tục truyền đạt cho các khóa sinh viên kế tiếp

Kinh phí thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi đề tài cấp Nhà nước “Khai thác

và phát triển nguồn gen cây Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.)

ở một số tỉnh miền Bắc”

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tiến Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BANG v

DANH MỤC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Giớ i thiê ̣u chung về cây Xá xi ̣ 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Xá xi ̣ 2

1.1.2 Đă ̣c điểm sinh học và sinh thái của cây Xá xi ̣ 3

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây xá xị 5

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 6

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

1.3 Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode) 8

1.3.1 Giới thiệu về DNA mã vạch 8

1.3.2 Các đă ̣c điểm cơ bản của trình tự DNA barcode 9

1.3.3 Các DNA mã vạch thường được sử dụng 10

1.3.4 Ứng dụng của DNA barcode trên thực vâ ̣t 13

1.3.5 Một số nghiên cứu về DNA mã va ̣ch trên thực vâ ̣t 16

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.1.1.Mục tiêu chung 19

2.1.2.Mục tiêu cụ thể 19

2.2.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

2.3.Nội dung nghiên cứu 19

2.4.Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 20

2.4.1.Vật liệu nghiên cứu 20

2.4.2.Hóa chất 20

2.5.Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1.Phương pháp thu nhận mẫu 21

2.5.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21

2.5.3.Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết 22

2.5.4.Phương pháp PCR với các că ̣p mồi đặc hiệu 23

2.5.5.Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 25

2.5.6.Phương pháp phân tích số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số 26

3.2.Kết quả nhân bản trình tự DNA mã va ̣ch bằng phương pháp PCR 26

3.2.1.Kết quả nhân bản đoạn trình tự matK 27

3.2.2.Kết quả nhân bản đoạn trình tự rbcL 28

3.2.3.Kết quả bản đoạn gen trnH-psbA 29

3.3.Kết quả phân tích trình tự các đoa ̣n DNA mã va ̣ch ở loài Xá xi ̣ 30

3.3.1.Kết quả phân tích và so sánh trình tự đoa ̣n gen matK 30

3.3.2.Kết quả phân tích và so sánh trình tự gen rbcL 35

3.3.3.Kết quả phân tích và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA 39

CHƯƠNG 4 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1.Kết luận 45

4.2.Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Các

chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium

bromide

DNA

(DNA) Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid

triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic

NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

RFLP Restriction fragment length

DANH MỤC BANG

Bảng 2.1 Thành phần và nồng độ các chất sử dụng trong phản ứng PCR 23Bảng 2.2 Trình tự và thông tin về cặp mồi 24

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mồi matK RbcL, trnH - psbA

24Bảng 3.1 Một số loài có trình tự đoạn gen matK tương đồng với trình tự gen matK của mẫu VP01 trên ngân hàng gen NCBI 32 Bảng 3.2 Một số loài có trình tự gen matK tương đồng với trình tự gen rbcL của

mẫu VP01 trên ngân hàng gen NCBI 36Bảng 3.3 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL 38Bảng 3.4 Các vị trí sai khác của 07 mẫu nghiên cứu ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 41Bảng 3.5 Một số loài có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen trnH-psbA của 07 mẫu Xá xị trên ngân hàng gen NCBI 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 0.1: Cành mang hoa và quả cây Xá xị ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 2 Hình 1.2: Cây Xá Xị 3Hình 3.1: Kết quả nhân bản đoa ̣n trình tự MatK của 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo,

Vĩnh Phúc 27Hình 3.2: Kết quả nhân bản đoa ̣n trình tự rbcL của 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo,

Vĩnh Phúc 28Hình 3.3: Kết quả nhân bản đoạn gen trnH-psbA 29Hình 3.4: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen MatK đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá

xị ta ̣i Tam Đảo, Vĩnh Phúc 31Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng trên ngân hàng gen 33Hình 3.6: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu VP01 và 06 loài trên ngân hàng gen

dựa trên trình tự đoa ̣n gen MatK 34Hình 3.7: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen rbcL đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ̣

tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc 35Hình 3.8: So sánh trình tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồng trên ngân hàng gen 37Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu VP01 và 06 loài trên ngân hàng gen

dựa trên trình tự đoa ̣n gen rbcL 39Hình 3.10: So sánh trình tự nucleotide củ a đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣ 40 Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền giữa 07 mẫu nghiên cứu và 07 loài trên NCBI… 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xá xị là loài cây đa tác dụng và có phân bố ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, tỉnh Vĩnh Phúc, v.v Ngoài giá trị cho gỗ dùng trong xây dựng, làm tà vẹt và đóng đồ, các bộ phận của cây còn được chưng cất tinh dầu dùng trong công nghiệp và y dược Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khô ít bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Quả được dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà Tinh dầu Xá xị được sử dụng rộng rãi trong công nghệ hoá mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Tinh dầu còn được dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dạ dày, phong thấp, mẩn ngứa ngoài da

Tinh dầu chứa trong hầu hết các bộ phận (lá, vỏ, thân và rễ) của cây Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế Tình trạng khai thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu trong thời gian qua ở nước ta làm cho loài cây này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Hiện nay, Xá xị được xếp trong nhóm IIA thuộc Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ năm 2019, nhóm CR cực

kỳ nguy cấp trong Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 Đồng thời với việc bảo tồn, cần nghiên cứu thử nghiệm gieo trồng và đưa loài Xá xị vào đối tượng gây trồng trong các chương trình trồng rừng ở nước ta

Vớ i mu ̣c đích xác đi ̣nh chính xác loài Xá xi ̣ và nghiên cứu tính đa hình di truyền củ a loài này phu ̣c vu ̣ cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen, em thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu giám đi ̣nh và phân tích đa da ̣ng di truyền loài

Xá xi ̣ ( Cinnamomum parthenoxylon ( Jack) Meisn) ta ̣i vườn quốc gia Tam

Đảo bằng phương pháp DNA mã va ̣ch”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiê ̣u chung về cây Xá xi ̣

Xá Xị có tên khoa học: Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn

Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb 1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii Lecomte, 1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm 1952

Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương

1.1.1 Đặc điểm hình thái cu ̉ a cây Xá xi ̣

Cây gỗ, kích thước trung bình hoặc lớn; thân hình trụ thẳng, cao 20-25m, đường kính thân (40-70) cm; rụng lá nhiều hay ít; gốc cây phình to và đôi khi có bạnh gốc Vỏ ngoài màu nâu, nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc và bong ra từng mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt Cành non tròn, thô, có cạnh, màu lục xám Lá đơn nguyên, mọc cách; phiến lá hình trứng hay hình bầu dục thuôn; kích thước 5-15 x 2,5-8cm; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng; hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; cuống lá dài 1,2-3cm Cụm hoa dạng chuỳ hay tán; mọc ở đầu cành hay nách lá; mỗi cụm mang khoảng 10 hoa Hoa lưỡng tính; bao hoa 6 thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn 4 ô, chỉ nhị có lông, 3 nhị vòng trong có 2 tuyến mật; nhị lép 3 Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,6-1cm; đế hình chén, có khía răng, khi chín màu xanh vàng hoặc tím đen[1]

(Phùng Văn Phê, 2019)

Hình 1.1: Cành mang hoa và quả cây Xá xị ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

Hình 1.2: Cây Xá Xị 1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái cu ̉ a cây Xá xi ̣

Mùa hoa tháng 3-6, mùa quả tháng 6-10 Mọc trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm trên núi đất hay núi đá vôi, ở độ cao 500-1.000m thậm chí đến 3.000m Cây ưa tầng đất mặt sâu, dày, tơi xốp, nhiều mùn và thoát nước Khi còn non ưa ẩm và chịu bóng, nhưng cây trưởng thành lại ưa sáng Sinh trưởng tốt trong các loại hình rừng có mật độ cây trung bình Tái sinh chồi khỏe[1],[5]

 Giá trị nguồn gen và tình trạng bảo tồn

Nguồn gen hiếm Xá xị là loài cây đa tác dụng và có phân bố ở một số tỉnh phía Bắc và Bắc Trung bộ Việt Nam như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, tỉnh Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An,

Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận Ngoài giá trị cho gỗ dùng trong xây dựng,

làm tà vẹt và đóng đồ, các bộ phận của cây còn được chưng cất tinh dầu dùng trong công nghiệp và y dược Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khô ít bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dạ dày, phong thấp, mẩn ngứa ngoài da Quả được dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà

Tinh dầu Xá xị được sử dụng rộng rãi trong công nghệ hoá mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Tinh dầu còn được dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Tinh dầu chứa trong hầu hết các bộ phận (lá, vỏ, thân và rễ) của cây Tuy nhiên, hàm lượng tinh dầu được xác định chủ yếu là từ lá Tinh dầu Xá

xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế [5],[6]

Là loài cây quý, hiếm và có giá trị lại cộng thêm khả năng tái sinh tự nhiên kém cùng với đó là tình trạng khai thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu trong thời gian qua ở nước ta làm cho loài cây này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Loài có khu phân bố chia cắt, bị khai thác rất nghiêm trọng, hiện nay còn tìm thấy rất ít cây trưởng thành Xá xị được xếp trong nhóm IIA thuộc Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ năm 2006, nhóm cực kỳ nguy cấp CR A1a,c,d trong Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 Do vậy, bảo tồn nguồn gen Xá xị là việc làm hết sức cấp thiết Tuy nhiên, để công tác bảo tồn có hiệu quả, cần phối hợp đồng bộ cả biện pháp bảo tồn ngoại vi và bảo tồn nội vi Trong đó giải pháp tối

ưu và thiết thục nhất đó là nghiên cứu phát triển cùng với các chương trình trồng rừng [1],[6]

Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài thuộc họ Long não nói chung và chi Long não nói riêng cho tới nay đã có nhiều công trình Điển hình

như “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học loài Vù hương (Cinnamomum balansae Lecomte) làm cơ sở cho công tác bảo tồn tại rừng đặc dụng Yên Tử -

Quảng Ninh” (Phùng Văn Phê, năm 2007)

Trong đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở “Nghiên cứu kỹ thuật nhân

giống và gây trồng cây Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) ở

một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” (2009-2011), Phùng Văn Phê đã bước đầu đánh giá được đặc điểm hình thái, phân bố, sinh học và sinh thái của loài Xá xị ở

2 tỉnh Vĩnh Phúc và Cao Bằng một cách chi tiết hơn Cây trưởng thành Xá xị thường có lá đơn nguyên, mọc cách, tập trung ở đầu cành; phiến lá hình trứng

ngược hay hình trái xoan thuôn; kích thước 5-15 x 2,5-8cm Kích thước lá trung bình 6,4cm x 4,6cm Về hình thái, đầu lá có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng; hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; ở nách gân có tuyến; cuống lá nhẵn dài từ 1-3,5 cm, trung bình là 2,2 cm Đối với cây non, cây tái sinh thì lá thường

có hình trái xoan thuôn, hai đầu nhọn dần Lá thường lớn hơn lá cây trưởng thành nhiều Kích thước của lá từ 5-14 x 3,8-9 cm; trung bình là 9,3 x 5,7 cm Hai mặt lá có màu xanh lục, nhẵn Gân lá nổi rõ ở 2 mặt, thường phẳng theo mặt

lá Cụm hoa dạng chùy hay tán; mọc ở đầu cành hay nách lá; dài từ 6-12 cm, mỗi cụm mang khoảng 15 hoa Hoa lưỡng tính; bao hoa 6 thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn 4 ô, chỉ nhị có lông, 3 nhị vòng trong có 2 tuyến mật; nhị lép 3 Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,8-1,2 cm; đế hình chén, có khía răng, khi chín màu tím đen Mùa hoa tháng 3-7, mùa quả chín tháng 10-11 Xá xị là loài cây thường xanh, sinh trưởng liên tục, ra chồi quanh năm Lá non thường có màu đỏ, nhẵn cả hai mặt Chồi hoa thường mập, mang nhiều vảy chồi Chồi hoa thường nhiều, tập trung vào tháng 6 Hoa sinh trưởng chậm, kéo dài tới cả tháng Ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Xá xị phân bố rải rác chủ yếu thuộc kiểu rừng thứ sinh nhân tác Rừng thường có cấu trúc một tầng cây gỗ Số lượng cá thể Xá xị tìm thấy ở đây còn rất ít chừng 10 cây Đất nơi có Xá xị phân bố có hàm lượng mùn

ở mức trung bình đến giầu, khá giầu đạm tổng số, kali dễ tiêu và tổng số ở mức cao, thành phần cơ giới trung bình Đất chua, nghèo Canxi và Magie, ít lân

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây xá xị

1.1.3.1 Công dụng của rễ và thân cây xá xị

Trong công nghệ thực phẩm, tinh dầu xá xị được chiết, pha thành nước xá

xị giải khát để tạo mùi như xá xị mặc dù nước xá xị mà chúng ta uống hàng ngày lại có thành phần từ loại cây khác[17]

Trong y học, rễ và thân cây xá xị có vị hơi đắng, cay, tính ấm nên được dùng để điều trị cảm mạo, ăn uống khó tiêu, đau dạ dày, viêm khớp xương do phong thấp, ho gà và bệnh lỵ Ngoài ra, vỏ thân cây xá xị còn được dùng để điều trị gan sưng to Mặt khác, kết quả nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy chiết xuất vỏ cây xá xị còn có khả năng chống o xy hóa và hạ đường huyết Liều lượng: khoảng 9 – 15 g, sắc lấy nước uống

1.1.3.2 Công dụng cuả lá và quả cây xá xị

Lá xá xị dùng ngoài (giã nát lá rồi đắp lên hoặc nấu lấy nước từ lá để rửa) giúp giảm mẩn ngứa ngoài da Bên cạnh đó, nước sắc lá xá xị còn giúp cầm máu, giảm đau, điều trị ngoại thương xuất huyết, phong thấp và đau dạ dày (khoảng 9 đến 15 g) Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy chiết xuất từ lá xá xị có tiềm năng chống o xy hóa và bảo vệ gan

Quả xá xị được dùng trong điều trị cảm mạo, sốt cao, lỵ, ho gà và bệnh sởi bằng cách nghiền thành bột, mỗi lần uống từ 6 – 9 g Bên cạnh đó, có thể kết hợp nước sắc từ quả xá xị (khoảng 6 g) với lá khuynh diệp (khoảng 6 g) giúp điều trị ho gà, kiết lỵ được hiệu quả hơn [17]

1.1.3.3 Công dụng của tinh dầu xá xị

Tinh dầu xá xị là chất lỏng nặng hơn nước, được chiết xuất từ lá, thân và rễ của cây xá xị, có mùi thơm đặc biệt như nước uống xá xị và được dùng chủ trị

về đau nhức, tê thấp Bên cạnh đó, mùi thơm của tinh dầu xá xị còn giúp đua đuổi côn trùng và thoải mái tinh thần.[17]

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu phân loại các loài thực vật thuộc chi Long não (Cinnamomum)

và họ Long não (Lauraceae) cho đến nay đã có nhiều tác giả Antoine Laurent de Jussieu là nhà Thực vật học đầu tiên nghiên cứu, phát hiện và đặt tên họ Long não (Lauraceae) từ năm 1789; còn Jacob Christian Schaeffer là người đầu tiên

mô tả, đặt tên chi Long não (Cinnamomum) năm 1760 Họ Long não gồm 54

chi, khoảng 3500 loài phân bố chủ yếu ở nhiệt đới, á nhiệt đới Bắc, Nam bán cầu; tập trung ở Đông Nam á và nhiệt đới châu Mỹ[12],[13]

Long não (Cinnamomum) là một chi lớn trong họ Long não (Lauraceae),

gồm tới 250 loài phân bố từ đại lục châu Á đến khắp vùng Đông Nam Á, Australia và khu vực Tây Thái bình dương Tại miền Nam châu Mỹ chỉ có một

số ít loài, nhưng riêng khu vực Malesian đã phát hiện được khoảng 90 loài Đến nay chỉ có khoảng 150 loài đã được nghiên cứu ở những chừng mực nhất định

về từng khía cạnh khác nhau Xá xị (Cinamomum parthenoxylon (Jack) Meisn)

là một loài thuộc chi Long não (Cinnamomum), họ Long não (Lauraceae), được

xếp trong danh lục đỏ của IUCN (1994) ở phân hạng DD (Data Deficient, ver 2.3) Ở Trung Quốc, Xá Xị đã được mô tả chi tiết về đặc điểm hình thái Các nghiên cứu sâu về loài Xá xị chưa được quan tâm nhiều [12],[13]

Tác giả Rohwer J G và cộng sự (2019) đã nghiên cứu về sự không phù hợp của các quyết định hình thái và DNA trình tự mã vạch, một nghiên cứu

trường hợp ở Cinnamomum (chi Long não) Trong quá trình nghiên cứu hệ thống phân tử của Lauraceae, tác giả đã nhận được một mẫu của một cây trồng dưới cái tên Cinnamomum porrectum trong Vườn thực vật München- Nymphenburg Xác định sơ bộ, cả về hình thái dựa trên hệ thực vật Trung Quốc (Li & al 2008) và theo trình tự lục lạp ( psbA – trnH spacer, trnK intron bao gồm gen matK, trnL intro, trnL - trnF spacer và trnQ - rps16 spacer) thu được bởi Sanger giải trình tự cho rằng đó là loài C camphora, cây vẫn trông khác với các cá thể khác của C camphora được trồng trong các vườn thực vật

của Berlin, Hamburg, Mainz, Munich và Oldenburg Tác giả đã sử dụng phương pháp giải trình tự Illumina trên một tập hợp các dấu phân tử được khuếch đại

trước (ITS, trnK 3 và 5′ - intron, trnL - intron và intergenic bộ đệm psbA trnH, trnL - trnF, cũng như các bộ phận của bộ đệm trnQ - rps16 ) và

dựa trên các trình tự có sẵn của C.camphora và C parthenoxylon từ GenBank

để so sánh Sự khác biệt đáng kể đã được tìm thấy trong số những trình tự này, nhưng các nhóm haplotype không trùng với các đi ̣nh danh loài hiện tại

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nghiên cứu xác định thành phần loài và phân loại họ Long não (Lauraceae)

ở Việt Nam phải kể tới các tác giả Lecomte người Pháp (1907-1952), Phạm Hoàng Hộ (1992-2000), Nguyễn Kim Đào (2002) Phạm Hoàng Hộ năm 1991

đã mô tả tóm tắt cho 40 loài thuộc chi Long não Nguyễn Kim Đào là người có nhiều nghiên cứu về họ Long não (Lauraceae) Trong cuốn Danh lục các loài thực vật Việt Nam (tập II, năm 2003, trang 65-112), họ Long não (Lauraceae)

được công bố 257 loài thuộc 21 chi Trong đó chi Long não (Cinnamomum) có

44 loài Chi Long não (Cinnamomum) phân biệt với các chi khác trong họ Long

não (Lauraceae) ở chỗ lá thường có 3 gân chính và quả có các thùy bao hoa tồn

tại và dày lên ở phía dưới Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) là

một loài trong số đó

Nghiên cứu về giá trị tài nguyên thực vật thuộc chi Long não

(Cinnamomum) phải kể tới tập thể các tác giả thuộc Viện Sinh thái & Tài nguyên

Sinh vật Trong cuốn "Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam" (2002) đã công bố thành phần hoá học trong tinh dầu của một số loài cây thuộc chi Long não nói chung Ngoài ra, các tác giả cũng đã mô tả công dụng, đặc tính tinh dầu, tình trạng buôn bán quốc tế, khả năng nhân giống và gây trồng, đặc điểm sinh thái, sinh trưởng và phát triển của một số loài thuộc chi Long não Nghiên cứu về thành phần hoá học của tinh dầu Xá xị đã được thực hiện bởi một số nhà khoa học thuộc Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật và Trường Đại học dược Hà Nội Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế

1.3 Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode)

1.3.1 Giới thiệu về DNA mã vạch

Mã vạch DNA, một phương pháp mới để xác định nhanh chóng về việc phân tích trình tự chuỗi DNA từ mẫu mô của bất kì sinh vật sống nào, ngày nay công nghệ này đang được ứng dụng cho việc phân loại cây tiến hóa Mã vạch DNA được xem như một công cụ cho các nhà phân loại học, hỗ trợ trong việc xác định loài bằng cách mở rộng khả năng phán đoán các loài thông qua việc phát triển của vi sinh vật Như một công cụ xác định sự đa dạng sinh học, mã vạch DNA đang được sử dụng để xác định các vấn đề sinh thái cơ bản và trả lời

cho những câu hỏi liên quan đến quá trình tiến hóa

Mặc dù phương pháp mã vạch DNA đã được sử dụng trong vòng chưa đầy một thập kỷ, nhưng nó đã phát triển nhanh chóng và tạo ra lượng lớn các mã

vạch DNA cũng như các ứng dụng của nó trong phân định loài [19]

Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện các mẫu vật (Hebert, 2003) Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong geneome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau Như vậy mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào

Đến nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể Trong những trường hợp này mã vạch DNA đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô bé xíu Hơn nữa, mã vạch DNA còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên[18]

1.3.2 Các đă ̣c điểm cơ bản của trình tự DNA barcode

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR

Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn gốc các loài Thêm vào đó, DNA ty thể có số lượng bản sao lớn trong tế bào và bền vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn năm trong khi đó DNA nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng bị phân huỷ ra ngoài môi trường

Do vậy phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA Mặc dù có vài trường hợp ngoại lệ, COI được coi là một chỉ thị DNA điển hình và chung cho các loài động vật

Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên

cứu Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [7],[8],[10]

1.3.3 Các DNA mã vạch thường được sử dụng

 Trình tự gen nhân

Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [13]

 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA

được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại

hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một

trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống

đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách

phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt

giữa các loài khác nhau

Hiện tại, vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong

tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một

số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của

các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này nrDNA có thể

được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [15,13,16]

 Gen lục la ̣p

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước

120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region) Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb

Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp

có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức

độ phân loại [15],[16]

 Gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các tiểu đơn vị lớn của rubilose-1,5-bisphosphate cacboxylase/oxygenase (RUBISCO) rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật rbcL đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Tuy nhiên, do

khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng

kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK là hai locus

barcode chuẩn cho thực vật [16],[17],[18]

 Gen matK

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh

nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan

đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA Do matK

tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật

CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu

thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn

và đề nghị sử dụng

 Trình tự hai gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ

296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao

Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt

trần Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước rất

ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen

rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung trnH-psbA có thể sử

dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [13],[16]

 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA)-trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA) Taberlet và đồ ng tác giả là nhóm

nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự biến

đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với vùng biến

đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi Trong nghiên cứu để xác định

trnL(UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một barcode tiềm năng cho phân

tích, xác định các loài thực vật [11],[13],[16]

1.3.4 Ứng du ̣ng của DNA barcode trên thực vật

Mã vạch DNA thực vật được xem là một công cụ hữu hiệu trong việc nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài Đồng thời hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được thuộc loài nào.Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA mã vạch đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực liên quan đến việc thực hiện hoặc sử dụng nhận dạng thực vật như phân loại học, sinh thái học, bảo vệ môi trường, lâm nghiệp, nông nghiệp, hải quan, kiểm dịch và trong nhiều tình huống cần xác định “nhóm loài”

Sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn Theo barcode of Life Data Systems, năm 2011 đã lưu trữ được hơn 1.100.000 DNA mã va ̣ch từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau

Đã có hơn 180.000 trình tự DNA mã va ̣ch của thực vật được lưu trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế và việc sử dụng DNA mã va ̣ch, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài Có khoảng 29.000 loài cây trồng được bảo hộ trong Công ước CITES, và việc phát triển các phương pháp hiệu quả để phân biệt loài nằm trong danh sách CITES với những loài không nằm trong danh sách CITES DNA mã vạch được sử dụng để tăng cường sự hiểu biết các loài thực vật có hạt, hoặc thông qua đó đóng góp đến sự khám phá các loài ẩn danh[19].Phương pháp tiếp cận mã vạch DNA cũng đã cung cấp các thông tin hữu ích về những bí

ẩn trong đa dạng loài của các nhóm thực vật Bryothytes(Rêu) [20].Ngoài ra, DNA mã vạch còn được sử dụng để xác định các rễ cây, cây giống hoặc giai đoạn sống chưa rõ (ví dụ như cây Dương xỉ Gametophytes) Nghiên cứu DNA

mã vạch thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng DNA khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn Bằng cách so sánh mã vạch DNA ở một vài sinh vật khác với các mã vạch đã được biên soạn trong thư viện thông tin, có thể giúp nhận diện loài, xác định các loài mới hoặc các loài quý hiếm.Các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn, mở ra một triển vọng mới cho công tác đánh giá, phân loại, quản lý và bảo tồn đa dạng sinh học [2],[3],[4] Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các mẫu

mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những bí ẩn, còn mơ hồ hoặc những loài phức tạp Trong hệ sinh thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau về hình thái Phân tích sinh thái học ở thực vật đang diễn ra mạnh mẻ để hiểu được chế

độ dinh dưỡng hoặc hướng di cư của động vật

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu nhỏ, thậm chí bị vài biến biến dạng cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc Gần đây, cơ sở dữ liệu mã vạch DNA của chó

đã được các sở pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công việc của họ (Steinke et al., 2009)

 Kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng tỷ USD mỗi năm Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chống các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành mã vạch DNA

để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh Kinh doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ được đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh (CBOL ABS Brochure, 2012)[18]

 Xác định vật chủ trung gian gây bệnh

Mã vạch DNA cũng được sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh Các nhà khoa học những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa người và động vật Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng

Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và phổ biến Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ

và phương pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Bảo vệ loài nguy cấp

Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tiệt chủng Không thể kiểm soát được săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giả quý hiếm hay không Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ

ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học Một dự án chiến lược trên toàn thế giới của

mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện mã vạch của các loài đang bị đe dọa (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên

Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp Có ít nhất hai dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên (CBOL ABS Brochure, 2012)

 Kiểm tra chất lượng nước

Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nước Hiện tại nước ngọt trở thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ ở mỗi quốc gia Nguồn nước bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và biện pháp xử lý Một vài sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm (ví dụ như ấu trùng của muỗi) Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác định các chỉ số ô nhiễm Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cô gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ” Điều này giúp cho cán bộ quản

lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc đánh giá nước và thiết lập quy trình đáng giá tiêu chuẩn nước tốt hơn ở mỗi quốc gia (CBOL ABS Brochure, 2012)[18]

1.3.5 Một số nghiên cư ́ u về DNA mã vạch trên thực vật

1.3.5.1 Một số nghiên cứu về DNA mã vạch trên thế giới

Pradosh Mahadani và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định

DNA mã vạch của các loài thực vật (Rauvolfioideae: Apocynaceae) ở vùng Đông Bắc Ấn Độ” Trong nghiên cứu này, các tác giả xem xét lựa chọn sự giống nhau của điểm lựa chọn đánh dấu Để kiểm tra hiệu quả của gen lục lạp matK trong việc phân định loài bằng phương pháp DNA mã vạch Trong nghiên cứu phân tích mã vạch DNA matK và trnH-psbA trình tự được kiểm tra, chọn

lọc để phân biệt các loài thực vật của họ Apocynaceae DNA từ lá non của các loài được chọn phân lập đã cho thấy gen matK dài gần 800 bp và trnH-psbA dài

450 bp Kết quả này đóng góp vào việc cho thấy DNA lục lạp được khuếch đại

để xác định cấp độ loài Trình tự matK dài 758bp so với trnH-psbA cho thấy sự khuếch đại dễ dàng, sự liên kết và mức độ phân biệt cao ở loài Rauvolfioideae

Sự xen kẽ trnH-psbA giúp thu được các chuỗi hai chiều không đổi Rõ ràng các chuỗi matK được tạo ra một cách liên kết nhóm chặt với các nhóm trong ngân

hàng gen và có ý nghĩa lớn

Subashini Sekar và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nhận dạng

dây thìa canh bằng kỹ thuật RAPD và gen nhân lục lạp trnK” Trong nghiên cứu này họ đã sử dụng ba loài là Gymnema sylvestre, G elegan, G mountain, Sử dụng mồi RAPD để đánh dấu ba điểm cho dây thìa canh, bảy điểm cho loài G

elegan và 4 điểm cho loài G mountain Nghiên cứu đã thu được kết quả Gymnema sylvestrevà loài G mountaincó độ tương đồng cao nhất trong khi đó Gymnema sylvestre với loài G elegan có độ khác biệt lớn hơn Phân tích đa hình cho thấy gen Gymnema sylvestre dài 204 bp, loài G.elegan dài 174 bp, loài G mountain dài 168 bp Kết quả nghiên cứu này đã đóng góp thông tin vào việc sử dụng DNA barcode để xác định loài Gymnema sylvestre

1.3.5.2 Một số nghiên cứu về DNA mã vạch tại Việt Nam

Hà văn Huân và cs (2014) đã sử dụng trình tự gen matK để phân loại và giám định loài sến mật (Madhuca pasquieri) là loài cây gỗ lớn thuộc nhóm “ Tứ

thiết” của Việt Nam (Đinh, lim, sến, táu) Việc phân định và giám định loài sến mật góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài này ở Việt Nam

Phan Kế long và cs (2014) đã sử dụng hai trình tự gen matK và ITS-rDNA

để phân tích mối quan hệ di truyền của các loài sâm Lai Châu ( Panax vietnamensis var Fuscidiscus) và tam thất trắng (Panax stipuleanatus) với sâm ngọc linh (P vietnamensis var vietnamensis) Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK vad ITS-rDNA chỉ ra các loài sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai thứ sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var Fuscidiscus) và sâm ngọc linh (P vietnamensis var vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis) của loài sâm Việt ( P vietnamensis var vietnamensis Ha &

vật quý hiếm đặc hữu Việt Nam (Nguyễn Hoàng Dũng, 2014)

Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm

đại thành công hai vùng gen ITS và matK và phân tích được sự đa hình trên mỗi

vùng gen Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch DNA trong phân tích đa dạng di

truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới đã khẳng định vùng gen ITS và matK có thể giúp nhận diện

loài và dưới loài như một mã vạch phân tử, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý

Bùi Văn Thắng và cs (2017) giám định một số loài Nưa tại Thanh Hóa bằng các dẫn liệu hình thái và phân tử Trong nghiên cứu, sử dụng phương pháp hình thái để giám định 60 mẫu cây Nưa được thu tại 5 huyện của tỉnh Thanh

Hóa, kết hợp với phân tích trình tự vùng gen matK và trnL của 16 mẫu đại diện

từ 60 mẫu Nưa cho thấy các mẫu Nưa được thu từ Thanh Hóa thuộc về 2 loài là

Nưa chuông (Amorphophallus paeoniifolius) và Nưa krausei (Amorphophallus krausei) Các đặc điểm hình thái của 2 loài Nưa trên được mô tả cùng các thông

tin về đặc điểm sinh học và phân bố Kết quả cũng cho thấy việc sử dụng mã

vạch DNA của 2 đoạn gen matK và trnL trong việc giám định các mẫu Nưa ở

Thanh Hóa là hiệu quả và là cơ sở khoa học phục vụ cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Nưa có giá trị cho tỉnh

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Giám đi ̣nh loài Xá xi ̣ bằng các chỉ thi ̣ DNA mã va ̣ch

- Xác định được mối quan hệ di truyền của loài Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon) tại Tam Đảo và so sánh với các loài tương đồng trên ngân hàng gen NCBI

2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là loài Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon

(Jack) Meisn) ở Vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ta ̣i phòng thí nghiê ̣m Công nghê ̣ gen, Viện CNSH Lâm nghiê ̣p

Thờ i gian thực hiê ̣n: từ tháng 9/2019 đến tháng 5/2020

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá cây Xá xị

- Nhân bản một số đoạn DNA mã vạch (matK, rcbL, trnH-psbA) ở các mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu

- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA mã va ̣ch

(matK, rcbL, trnH-psbA) ở các mẫu Xá xi ̣

- Giám đi ̣nh loài Xá xị dựa trên các chỉ thị mã vạch DNA (matK, rcbL, trnH-psbA)

- Xác định mối quan hệ di truyền của loài Xá xị dựa trên các chỉ thị mã

vạch DNA (matK, rcbL, trnH-psbA)

2.4 Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu lá Xá xi ̣ được thu thâ ̣p từ vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

- Điều kiện mẫu: là lá non và lá bánh tẻ, lá không bị sâu bệnh, nấm mốc

2.4.2 Hóa chất

 Hóa chất tách chiết DNA tổng số

Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tách chiết DNA tổng số “ DNA minni plant Qiagen” của Đức