Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận và thử nghiệm ứng dụng gama PGA (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

Trong công nghiệp thực phẩm, γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Hiện nay, axit poly γ-glutamic được sản xuất bằng các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN VÀ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin cảm ơn sâu sắc đến cô TS NGUYỄN NHƯ NGỌC –

Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, là người đã tận tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh của Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp - Trường Đại học Lâm Nghiệp đã chỉ bảo, tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Thông qua quá trình thực hiện đề ra, tôi đã học hỏi được nhiều điều và rút

ra cho mình nhiều kinh nghiệm quý báu để giúp ích cho công việc sau này của bản thân Vì kiến thức còn hạn chế, trong quá trình thực hiện, hoàn thiện đề tài này không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ các thầy, cô

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATP Adenosine triphosphate

CFU/ml Colony forming unit

D,L-PGA Axit D,L- Poly γ- glutamic

D-PGA Axit D-Poly γ- glutamic

K – γ-PGA Kali – γ-PGA

L-PGA Axit L-Poly γ-glutamic

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ TCA Axit Tricarboxylic

γ-PGA Axit Poly γ- glutamic

g/l Gram/lít

MỞ ĐẦU

Việc nghiên cứu tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay đang là một xu hướng mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi trường sống Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có nguồn gốc hóa học đang được sử dụng bừa bãi, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp được sử dụng trong chế biến thực phẩm Do đó, việc nghiên cứu ra những loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, được các tổ chức trong nước và quốc tế công nhận đang là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học trong nước và thế giới

Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học được tạo thành từ các phân tử axit glutamic Với ưu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con người và tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong công nghệ môi trường, γ-PGA được

sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng; trong y dược, γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm Trong công nghiệp thực phẩm, γ-PGA được

sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Hiện nay, axit poly γ-glutamic được sản xuất bằng cách trùng hợp các axit glutamic, thông qua con đường tổng hợp hóa học, hoặc bằng con đường lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic

Để đáp ứng một phần nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men

thu nhận và thử nghiệm ứng dụng γ-PGA ” nhằm khai thác những những điểm

mạnh của vi khuẩn Bacillus, để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến

thực phẩm ngày nay

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về axit poly γ-glutamic

Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang điện tích

âm, có các đơn phân là axit L-glutamic hay axit D-glutamic hoặc chứa cả hai đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và nhóm α-amino [25, 38] Khả năng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể được hình thành từ hơn 10.000 phân tử axit glutamic γ-PGA có thể được hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó có D-γ-PGA, L-γ-PGA và hai dạng này sẽ đồng trùng hợp tạo ra D,L-γ-PGA gọi chung

là γ-PGA [38]

Hình 1.1: Cấu trúc γ-PGA [4]

Hiện nay, cần phải nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn hơn để sản xuất PGA có năng suất cao với các tính chất khác nhau Nhiều ứng dụng y tế (đặc biệt là phân phối thuốc) đã khai thác α-PGA Vì γ-PGA thực chất khác với α-PGA (nó không liên quan đến bước điều chỉnh hóa học và không nhạy cảm với proteases) nên nó có thể được sử dụng tốt hơn trong các ứng dụng y học Phân tích sản xuất γ-PGA và kiến thức về enzyme và gen liên quan đến sản xuất γ-PGA sẽ không chỉ giúp tăng năng suất, giảm chi phí sản xuất mà còn giúp hiểu được cơ chế hoạt động của γ-PGA để ứng dụng rộng rãi hơn

γ-1.2 Cơ chế tổng hợp γ-PGA

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ con đường trao đổi chất và các enzym có liên quan đến quá trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa của vi khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá

trình tạo γ-PGA Đã có nhiều nghiên cứu công bố cho thấy sự tham gia của

enzym transglutaminase của B subtilis NR-1 là yếu tố chính xúc tác sinh tổng

hợp γ-PGA và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang D-glutamic nhờ enzym alanine recemase Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài chuỗi γ-peptid được xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine

synthetase, pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [22] Tuy nhiên, B anthracis và B subtilis không có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA Điều

đó chứng tỏ đây không phải là cơ chế tạo ra γ-PGA mà thực tế chỉ là một bước trong cả một quy trình chuyển hóa tạo γ-PGA [12]

Các nghiên cứu đã chỉ ra chủng B licheniformis 9945A có hệ enzym tổng

hợp γ-PGA dạng tự do là glutamyl transamidase Hệ enzym này xúc tác cho việc tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% axit L-glutamic và trong quá trình tổng hợp này đòi hỏi phải có sự tham gia của Mn2+ với vai trò co-factor [28]

Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh và môi trường nuôi cấy Sơ đồ hình thành nên γ-PGA được minh họa trong hình 1.2 như sau:

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp γ-PGA [23]

Con đường sinh tổng hợp γ-PGA được nghiên cứu và đưa ra từ năm 1982 bởi Hara và các cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi mỗi chủng vi khuẩn có những cách chuyển hóa riêng [23] Tuy nhiên có một

số điểm chung trong các nghiên cứu về con đường tổng hợp γ-PGA là: từ các hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa thành các dạng đường cơ bản là glucose hoặc sacccarose được vi khuẩn chuyển hóa qua quá trình đường phân thành axit pyruvic Từ axit pyruvic nhờ sự chuyển hóa của vi khuẩn qua chu trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric Với sự tham gia xúc tác của

NH4+ , phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric và glutamine thành axit glutamic Nhờ axit α-ketoglutaric và axit pyruvic mà axit L-glutamic có thể chuyển hóa một phần thành D-glutamic Giai đoạn polymer hóa nhờ sự xúc tác của enzym PGA synthetase sản sinh bởi vi khuẩn, các phần tử L-glutamic và D-

L-glutamic liên kết với nhau thành D,L-γ-PGA

 Quá trình tổng hợp γ-PGA nhìn chung có thể tổng kết qua bốn giai đoạn là:

- Giai đoạn 1: Quá trình racemic hóa γ-PGA: Do γ-PGA là một hỗn hợp

chỉ gồm L hoặc D –glutamic hoặc cả D và L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn tham gia Tuy nhiên, để có được D-glutamic cần phải có quá trình

racemic hóa từ L-glutamic Vi khuẩn B subtilis, có đoạn mã gen liên quan đến

sự hình thành enzyme có khả năng racemic hóa là glr và yrpC Trong đó glr là

enzym cytosolic có khả năng lựa chọn glutamic cao và đặc biệt đối với glutamic Quy trình racemic hóa L-glutamic thành D-glutamic được xảy ra như sau: Lglutamic được enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành L- alanine, sau đó L-alanine được enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa thành D-alanine Cũng nhờ xúc tác của enzym pyruvic aminotransferase mà D-alanine chuyển hóa thành D-glutamic [22, 38]

L Giai đoạn 2: Quá trình polymer hóa γL PGA: cơ chế polymer hóa các

phân tử γ-PGA phụ thuộc vào các phần tử ATP được chỉ ra trong hình 1.3 Đầu tiên là nhóm carboxyl ở cuối của phân tử γ-PGA kết hợp với nhóm phosphoryl

từ gamma phosphate của ATP Tiếp theo, nhóm amino của axit glutamic tấn công thay thế vào các phần tử phosphorylated trên nhóm carboxyl, kết quả hình

thành liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA [40]

Hình 1.3: Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP [40]

- Giai đoạn 3: Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym

(endo-γ-glutamyl peptidase và exo-γ-glutamyl peptidase được chứng minh là những enzym phân cắt γ-PGA Trong thực tế đã chứng minh có sự phân cắt γ-

PGA trong canh trường do enzym ngoại bào của vi khuẩn B subtilis NX2, là

nguyên nhân giảm khối lượng phân tử γ-PGA [46] Những enzym này được thể hiện rõ ở pha cuối của quá trình sinh tổng hợp

- Giai đoạn 4: Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp γ-PGA được điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều

khiển mức độ phiên mã để thể hiện các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và

sự biến đổi pha

1.3 Tính chất của γ-PGA

Axit poly γ-glutamic có thể bị phân hủy sinh học, không độc với môi trường, sinh vật và con người γ-PGA hòa tan tốt trong nước và tạo được các liên kết bền vững với nước, do vậy khả năng giữ nước được xem là một tính chất nổi trội của γ-PGA Nó có thể được phân tách với các thành phần trung tính khác nhờ sắc kí giấy γ-PGA khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất chính bởi liên kết γ-peptid Thường thì các liên kết α-peptid bị phân cắt bởi protease nhưng liên kết γ-peptid trong γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi

enzym γ-GTP [38]

Axit poly γ-glutamic có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo nên các loại muối dạng phức với các ion: Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng

rãi trong ngành y tế, môi trường, mỹ phẩm [32]

Kích thước cũng như khối lượng của axit poly γ-glutamic rất đa dạng, phụ thuộc vào cấu trúc cũng như dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trường vi sinh vật Khối lượng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu kilo dalton Nhìn chung, các phân tử D,L-γ-PGA thường

có khối lượng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA hay L-γ-PGA và dạng neo giữ thường có kích thước nhỏ hơn dạng tự do [18]

Tùy vào điều kiện môi trường hình thành khác nhau mà γ-PGA có 5 dạng hình thể là: cấu trúc xoắn anpha, thẳng beta, xoắn cuộn liên tục ngẫu nhiên, cuộn ngẫu nhiên, bao phủ thành khối thì điều kiện môi trường hình thành khác nhau

Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong ethanol, nhưng khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol

Axit poly γ-glutamic có độ nhớt cao ngay cả khi ở nồng độ thấp chính bởi vậy người ta sử dụng phương pháp đo độ nhớt để xác định γ-PGA [28]

1.4 Phân loại γ-PGA

Có thể phân loại γ-PGA dựa vào cấu trúc và phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật

1.4.1 Theo cấu trúc

Dựa trên cấu trúc, γ-PGA được phân làm 3 loại sau:

 Loại 1: Axit poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chỉ chứa các đơn phân là

axit D-glutamic và loại polymer này hiện nay mới được chứng minh chỉ tạo ra

bởi chủng vi khuẩn B anthracis một chủng vi khuẩn được tìm thấy trên các vật

chủ bị bệnh than [9, 17]

 Loại 2: Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA): là polymer chỉ chứa các

đơn phân là axit L- glutamic loại này được sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn

Natrialba aegyptiacia một loài ưa mặn, γ-PGA được sinh ra trong vi khuẩn này

nhằm để chống lại sự mất nước của vi khuẩn trong điều kiện môi trường nước biển L-γ-PGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các động vật có xúc tu (sứa biển, san hô) và thành phần chính trong chất dính của Hydra L-γ-PGA kết hợp với các cation như Ca²+ , Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh vật khác điều hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào [10]

 Loại 3: Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA): là polymer trong

phân tử chứa cả axit L-glutamic và axit D-glutamic, DL-γ-PGA được sản xuất

chủ yếu từ Bacillus và được chia thành 2 nhóm:

 Cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp

γ- Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA

Tỷ lệ đồng phân D/L trong DL-γ-PGA thường phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+trong môi trường phát triển của vi khuẩn và tùy thuộc vào loài vi khuẩn [10] Đồng phân của axit poly γ-glutamic được hình thành bởi D và L-Glutamic tùy thuộc vào chủng giống vi sinh vật tạo ra

1.4.2 Theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật

Dựa vào phương thức trong canh trường vi sinh vật, có 2 dạng như sau:

- Dạng 1: Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có trong vi khuẩn

B anthracis đối với loài vi khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng

thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn công vào bên trong tế bào Dạng neo giữ thường được tìm thấy dưới dạng nội bào, được tiết ra ngoài dưới dạng các sợi liên kết giữa vi khuẩn và môi trường ngoài khi gặp điều kiện bất lợi Do vậy việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít được nghiên cứu [25]

- Dạng 2: Axit poly γ-glutamic dạng tự do được tiết trực tiếp vào môi

trường nuôi cấy: Dạng này chủ yếu được tìm thấy trong các loài lành tính của chi Bacillus mà điển hình là B subtilis Loài vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự do là B subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn

và có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp môi trường

thiếu dinh dưỡng, trong giai đoạn suy vong của vi khuẩn [40]

1.5 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh axit poly γ-glutamic được

sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc các loài: B subtilis, B licheniformis, B thuringensis, B cereus, B pumilus, B amyloliquefaciens, B mojavensis, B atrophaeus, B megaterium, Staphylococcus epidermidis, Natrialba aegyptiaca, Lysinibacillus sphaericus và Fusobacterium nucleatum trong đó một số chủng vi

khuẩn này đã được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp và đời sống [18, 44]

Có nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tất cả các vi khuẩn tạo ra γ-PGA đều

là vi khuẩn Gram dương và chủ yếu là các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, γ-PGA

có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo loài tổng hợp và môi trường của chúng Trong những chủng vi khuẩn sản sinh ra axit poly γ-glutamic, thuộc chi

Bacillus các nghiên cứu đi sâu hơn vào các chủng của loài B subtilis, đây là

những vi sinh vật được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp và các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chúng có lợi cho đường ruột Trong tự nhiên, chúng được

phân bố rộng rãi và phổ biến: cỏ khô, bụi, đất nước… B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, thuộc họ Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết

thành chuỗi, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc,

pH môi trường có độ biến động cao Chúng có khả năng hình thành bào tử khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi như dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, hàm lượng kháng sinh, chất ức chế cao, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp hoặc biến động mạnh… Bào tử có kích thước nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào Bào tử

có thể quan sát được dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm bào tử hoặc

nhuộm gram Nhờ tính chất đặc trưng này mà có thế phân lập được B subtilis

trong môi trường

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quả trình sinh tổng hợp γ-PGA

1.6.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật sinh trưởng và tạo thành các sản phẩm mong muốn Các chủng vi sinh vật tạo ra những sản phẩm khác nhau khi được nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thông thường mỗi sản phẩm đều có một môi trường đặc hiệu khác nhau, sau nhiều năm nghiên cứu về γ-PGA các nhà khoa học trên thế giới đã đưa ra một môi trường

đặc hiệu riêng, cơ bản cho các loại vi khuẩn sinh γ-PGA (môi trường E) Thành

phần môi trường E được trình bày trong bảng 1.2:

Bảng 1.2: Thành phần môi trường cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA

Thành phần Nồng độ (g/l)

Axit L-glutamic 20 Axit citric 12

MgSO4.7H2O 0,5 FeCl3.6H2O 0.04

CaCl2.2H2O 0,15 MnSO4.H2O 0,1

Môi trường dinh dưỡng này được gọi tắt là môi trường cơ bản E Tùy thuộc vào từng loại vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA mà sự điều chỉnh các thành phần trong môi trường dinh dưỡng bao gồm: nguồn carbon, nguồn nitơ, nguyên

tố vi lượng trong đó có Mn2+, Mg2+, [33] Những yếu tố này được thay đổi phụ thuộc vào chủng giống vi khuẩn khi tổng hợp và những tính chất đặc điểm cần đạt của γ-PGA như khối lượng phân tử, năng suất, tỷ lệ đồng phân D và L-

glutamic trong γ-PGA

Theo một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, vi khuẩn B subtilis có thể sinh tổng hợp γ-PGA từ các nguồn carbon có trong đậu tương, do

đậu tương có thành phần dinh dưỡng như: protein (35-45%), ngoài ra còn có các loại axit amin cơ bản isoleucine, leucine, lysin, methionine, phenylamin, tryptophan, valin… isoflavones Trong đậu tương axit glutamic chiếm khoảng 10g/kg là thành phần chính tham gia vào quá trình tổng hợp γ-PGA Ngoài ra đậu tương có chứa: glucose (15-25%), nước (8%), chất vô cơ, muối khoáng như

Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S (5%), vitamin: A, B1, B2, D, E, F, globulin, chất xơ Những nghiên cứu về thành phần của đậu tương đã cho thấy, đây có thể là

nguồn thức ăn cung cấp nhiều dinh dưỡng cho vi khuẩn Bacillus tạo ra sản phẩm

γ-PGA có tính ưu việt, phù hợp với mục tiêu đề ra [45]

Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA đã sử dụng hai nguồn carbon

tự nhiên là bột đậu tương và bột mỳ làm cơ chất trên môi trường rắn Những nghiên cứu khác sử dụng nguồn carbon từ phụ phẩm của quá trình sản xuất natri glutamat cho môi trường sinh tổng hợp γ-PGA, để từ đó làm phụ gia thực phẩm cho người và ứng dụng trong một số lĩnh vực có liên quan đến sức khỏe

Nguồn carbon thường được sử dụng trong các nghiên cứu về γ-PGA gồm đường glucose, galactose, lactose, sacharose, glycerol, glutamic Ngoài nguồn carbon là gluxit thì các chất hữu cơ khác như các axit béo phân tử lượng lớn glycerol, axit hữu cơ… cũng được dùng làm nguồn C Thông thường trong các môi trường sinh tổng hợp γ-PGA các thành phần carbon thường được sử dụng là glycerol, axit citric, axit L-glutamic Nghiên cứu về các đặc tính và khả năng chuyển hóa của 3 nguồn carbon là axit citric, glycerol và axit glutamic được cụ thể như sau:

- Axit citric: Theo chu trình chuyển hóa γ-PGA việc sử dụng các nguồn

carbon từ axit citric là nguồn cacbon chính, bởi nó là mắt xích trung gian quan trong trong chu trình axit tricacboxylic Vì vậy nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần như mọi sinh vật Hai phần ba nguồn năng lượng sử dụng cho các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật là lấy từ citric Chu trình chuyển hóa axit tricarboxylic cho thấy tất cả các hợp chất polysaccharide đều phải chuyển hóa

cứu đã chỉ ra có thể không sử dụng glucose làm nguồn carbon khi tổng hợp PGA, nhưng nếu không sử dụng axit citric trong thành phần của môi trường, thì việc hình thành γ-PGA là rất ít hoặc không có Tuy nhiên điều này chỉ đúng với một số loại vi khuẩn

γ-Những nghiên cứu về sự ảnh hưởng của axit citric và các hợp chất ammonium trong sinh tổng hợp γ-PGA trong một số chủng vi khuẩn như

Bacillus velezensis NRRL-23189 cho thấy có sự ảnh hưởng không nhỏ của yếu

tố NH4+ trong sự hình thành γ-PGA bởi yếu tố này là tác nhân trong chu trình tổng hợp glutamic Sự chuyển hóa của axit citric trong quá trình tổng hợp γ-

PGA được khảo sát trên đối tượng là vi khuẩn B licheniformis cho thấy với

nồng độ ban đầu là 12 g/l, sau 10 giờ lên men nồng độ citric giảm mạnh và gần như bằng không sau 21 giờ lên men Để tăng hàm lượng γ-PGA, các nghiên cứu

đã tiến hành bổ sung một lượng từ 2-5 g/l axit citric vào thời điểm sau 21 giờ lên men, kết quả cho thấy lượng γ-PGA được cải thiện khoảng 15% [49]

- Glycerol: Glycerol tham gia trong chu trình tổng hợp này như một chất

xúc tác cho quá trình polymer hóa L-glutamic Ngoài ra vi khuẩn còn sử dụng glycerol như một dạng cơ chất để phát triển Trong canh trường lên men γ-PGA

của vi khuẩn B licheniformis ATCC 18 9945A, nồng độ glycerol cao trong canh

trường đã tác động đến lớp màng phospholipids trên lớp màng tế bào Vì vậy các phần tử C18:1 và C16:1 trong phospholipids bị giảm xuống và các phân tử C12:0 và C10:0 tăng lên Nhờ sự thay đổi này mà lớp màng tế bào của vi khuẩn được giãn rộng ra, tạo điều kiện cho sự bài tiết γ-PGA qua lớp màng tế bào Vì

vậy trong nhiều nghiên cứu với vi khuẩn B subtilis NX-2, tác giả đã điều chỉnh

nồng độ glycerol nhằm thay đổi khối lượng phân tử của γ-PGA Glycerol ảnh hưởng đến hàm lượng γ-PGA ngay ở thời kỳ đầu của quá trình tổng hợp Khi hàm lượng glycerol tăng hàm lượng γ-PGA tăng, khối lượng phân tử γ-PGA giảm, đồng nghĩa với việc giảm độ nhớt trong canh trường lên men

Nghiên cứu về sự thay đổi nồng độ glycerol trong toàn bộ quá trình lên

men trên B licheniformis cho thấy nồng độ glycerol thay đổi không đáng kể

trong khoảng thời gian 36 giờ đầu quá trình lên men, giảm khoảng 10-15% từ 36 giờ đến 50 giờ Hàm lượng glycerol trong canh trường lên men còn lại 45-50% sau thời gian 96 giờ và giá trị này tùy thuộc vào giá trị pH của canh trường nuôi cấy Giá trị pH càng gần 8 thì lượng glycerol còn lại trong canh trường càng cao

Những nghiên cứu về sự biến đổi glycerol trong canh trường lên men B licheniformis NCIM 2324 cho thấy lượng glycerol bằng không sau 96 giờ lên

men trong điều kiện sục khí và khuấy trộn ở tốc độ trên 750 vòng/phút Glycerol

là nguyên nhân tạo độ nhớt trong canh trường, tác động đến sự trao đổi oxy của vi khuẩn trong canh trường Do vậy quá trình khuấy và glycerol có tương quan đến nhau trong nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA

- Axit glutamic: Các nghiên cứu đi trước đã cho ta thấy γ-PGA được tạo

thành từ các thành phần chính là L-glutamic và D-glutamic thông qua hệ enzym polymerase của vi khuẩn Tùy thuộc vào enzym được sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn mà tỷ lệ D-glutamic/L-glutamic là khác nhau và khối lượng phân tử γ-PGA khác nhau Dựa trên chu trình tổng hợp γ-PGA (hình 1.2) có thể thấy axit glutamic trong quá trình tổng hợp γ-PGA được tham gia trong chu trình bằng hai cách Cách thứ nhất glutamic được thêm vào trong canh trường từ ban đầu, cách thứ 2 glutamic được tạo ra từ các nguồn carbon khác Theo một số nghiên cứu về γ-PGA, vi sinh vật tham gia tổng hợp chia làm hai nhóm :

+ Nhóm1: Môi trường đòi hỏi sử dụng axit L-glutamic để kích thích tế

bào phát triển và tổng hợp γ-PGA

+ Nhóm 2: Môi trường không đòi hỏi axit L-glutamic để sản sinh γ-PGA Nhóm sử dụng axit L-glutamic bao gồm các chủng B subtilis ATCC9945a,

IFO3335 và F-2-01 Các nhóm vi khuẩn không phụ thuộc vào axit L-glutamic

bao 19 gồm các chủng B subtilis 5E, TAM-4 và B licheniformis A35 Vi khuẩn

không phụ thuộc axit L- glutamic thường sử dụng axit citric và glucose làm

nguồn carbon chính cho việc tạo thành PGA B subtilis A35 có thể sản sinh

γ-PGA từ glucose và NH4Cl B subtilis TAM-4 có thể tạo ra một lượng lớn

γ-PGA khi môi trường nuôi cấy chứa muối amoni và đường làm nguồn thức ăn

nitơ và carbon B subtilis 5E có thể sản sinh γ-PGA từ L proline như nguồn nitơ

và carbon trong môi trường khoáng Vi khuẩn B licheniformic ATCC9945a sử

dụng axit citric và glycerol như một nguồn carbon chính, nhưng vẫn được đưa vào nhóm phụ thuộc vào axit L-glutamic, bởi trong quá trình chuyển hóa thành γ-PGA thì glutamic được sử dụng như một dạng tiền chất, có tác dụng hoạt hóa các hệ enzym tổng hợp γ-PGA

Nghiên cứu sử dụng L-glutamic như một dạng tiền chất ở vi khuẩn B subtilis ZJU-7 cho thấy với hàm lượng glutamic ban đầu cao (trên 80 g/l) sẽ tạo

điều kiện thuận lợi cho việc tích tụ γ-PGA (54 g/l) Khi lượng glutamic ở mức

độ thấp (dưới 60 g/l) sự tích tụ γ-PGA vẫn hình thành (4-5 g/l), độ nhớt vẫn tăng, nhưng kèm theo sự hình thành đáng kể các sản phẩm phụ gây nhớt có cấu trúc fructan [21, 37]

Nguồn dinh dưỡng Nitơ sử dụng trong canh trường có thể là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ Các hợp chất hữu cơ là những hợp chất giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc, cao nấm men, cao thịt bò, pepton, tryptone, protein từ cá… Nguồn nitơ vô cơ như urê, NH4NO3, các muối amon khác Nguồn nitơ là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng của tế bào và là yếu tố xúc tác cho quá trình chuyển hóa thành axit glutamic [31]

Trong môi trường sinh tổng hợp γ-PGA ngoài các nguồn nitơ có trong các sản phẩm tự nhiên như bột đậu tương cao ngô… Nguồn nitơ trong canh trường nuôi cấy đòi hỏi phải có gốc NH4+ bởi đây là yếu tố chính trong việc chuyển hóa tạo thành L-glutamic Sự khác nhau về chủng giống vi sinh vật cũng ảnh hưởng nhiều đến việc sử dụng nguồn nitơ Nhiều nguồn nitơ có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzym, một số khác lại kìm hãm hoặc không có ảnh hưởng rõ rệt Nhiều chủng có thể sử dụng một trong hai nguồn nitơ là NH4+ hoặc cao nấm

men, hoặc có thể dùng đồng thời hai loại này như B subtilis ZJU-7

Các nguồn nitơ bổ sung vào canh trường lên men quyết định đến giá thành sản phẩm sau lên men Nếu sử dụng nguồn nitơ từ các nguồn như cao nấm men, đậu tương, nitơ vô cơ giá thành sẽ rẻ hơn rất nhiều so với các nguồn nitơ đặc

chủng như tryptone Trong sản xuất γ-PGA bởi chủng B subtilis RKY3, cao ngô

từ nguồn phế phẩm nông nghiệp, được thay thế cho pepton làm nguồn nitơ Hiệu suất sinh tổng hợp từ cách thay thế này, tạo ra lượng γ-PGA bằng 80% so với sử dụng pepton

1.6.1.3 Ảnh hưởng của muối

Nồng độ muối NaCl trong canh trường ảnh hưởng đến khối lượng phân tử γ-PGA được tạo thành Khi nồng độ muối trong canh trường tăng từ 0% đến 4%

khối lượng phân tử γ-PGA tạo thành bởi B licheniformis 9945a tăng từ 1200

kDa lên 2200 kDa Nồng độ muối cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ đồng

phân D và L-glutamic trong γ-PGA sản sinh bởi chủng B subtilis [34]

Nồng độ muối NH4Cl cũng được xem là một yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào Đặc biệt, muối (NH4)2SO4 là một muối làm giảm sự tăng trưởng của tế bào, nhưng lại làm tăng sản lượng γ-PGA và tạo ra γ-PGA khối

lượng phân tử lớn đối với canh trường có vi khuẩn B subtilis IFO3335 Trong canh trường B subtilis chungkookjang, với hàm lượng (NH4)2SO4 cao tỷ lệ đồng phân L-glutamic trong γ-PGA cao hơn D-glutamic [34]

Nghiên cứu ảnh hưởng của CaCl2 cho sinh tổng hợp γ-PGA từ B subtilis

CGMCC 2108 thấy: khi tăng hàm lượng CaCl2 độ nhớt trong canh trường giảm, tăng lượng tiêu thụ glutamat ngoài tế bào lên 11,4%, nhưng làm tăng lượng γ-PGA từ 7,88g/l lên 9,07 g/l Nguyên nhân là do CaCl2 làm tăng hoạt tính ba loại enzym có liên quan trong tổng hợp γ-PGA ở nhánh 2-oxoglutarate trong chu trình TCA (isocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase và 2 oxoglutarate dehydrogenase) Tăng lượng CaCl2 dường như lượng oxoglutarate được chuyển hóa nhiều hơn, vì vậy lượng γ-PGA tăng [28]

Các nguyên tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp enzym Các nguyên tố này bao gồm cả nguyên tố đa lượng và vi lượng Trong sinh tổng hợp γ-PGA các nguyên tố vi lượng là mangan, magie, sắt, kẽm, kali, canxi và đồng Các nguyên tố này thường có trong nước hoặc trong các thành phần hữu cơ khác của môi trường (bột, cao ngô và dịch chiết khác) do đó

không cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng rất ít Nếu nồng độ của các nguyên

tố này tăng sẽ kìm hãm mạnh sự phát triển của vi sinh vật

Sinh tổng hợp γ-PGA còn chịu ảnh hưởng bởi, Ca2+ , Mg2+ , Fe3+ , Mn2+

… là các yếu tố vi lượng được đưa vào dưới dạng muối vô cơ với hàm lượng nhỏ hơn 0,5% thành phần của môi trường Trong các nguyên tố này cần lưu ý đến các ion Mn2+ và Mg2+

Ion Mg2+ được coi là thành phần cốt yếu trong việc hình thành γ-PGA và không thể thay thế bởi một ion kim loại nào khác

Đối với ion Mn2+ được chứng minh có ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành trong cấu trúc của γ-PGA, nó quyết định đến sự hình thành của các phần

tử D-glutamic trong chuỗi polymer Trong nghiên cứu về vi khuẩn B subtilis

NX-2, sự có mặt của Mn2+ từ khoảng 0 đến 1230µM sẽ tạo ra γ-PGA có 10-90%

là D-glutamic và khối lượng phân tử từ 400-2000 kDa Khi nồng độ Mn2+ từ khoảng 0 đến 0,09 g/l thì lượng D-glutamic tăng từ 18-77% Nghiên cứu trên

chủng B licheniformic 9945a cho thấy khi không có sự tham gia của MnSO4 , tế bào vi khuẩn bị suy thoái sau 50 giờ nuôi Tuy nhiên khi thêm MnSO4 vào canh trường nuôi cấy thì lượng này hầu như còn nguyên sau 96 giờ nuôi cấy Sự có mặt của MnSO4 giúp tế bào đồng hóa glycerol, L-glutamic và axit citric tốt hơn khi không có nó Sự có mặt của MnSO4 tạo ra một lượng γ-PGA (13g/l) cao hơn

so với lượng γ-PGA (5g/l) khi không có sự tham gia của MnSO4 [54]

Ion Ca2+ tuy không ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp nhưng

nó ảnh hưởng đến tính chất của sản phẩm khi ứng dụng Sự có mặt Ca2+ trong PGA sản phẩm sẽ giúp tăng sự hấp thụ Ca2+ trong cơ thể giúp ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm chức năng [8]

γ-1.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men

Các yếu tố và điều kiện môi trường nuôi cấy có khả năng ảnh hưởng đến

vi khuẩn, cụ thể là ảnh hưởng đến thành tế bào như sự thương tổn thành tế bào, làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất, gây kìm hãm, ức chế sự hoạt động của các enzym, phá hủy các quá trình tổng hợp của tế bào Các yếu tố đó cụ thể như:

1.6.2.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sống của vi khuẩn,

do vậy nó ảnh hưởng rất lớn đến các quá trình sinh tổng hợp Trong nghiên cứu

về ảnh hưởng nhiệt của nhiệt độ đến vi khuẩn chia làm các khoảng nhiệt độ như sau:

Dải nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn thông thường chia làm 3 dải: vi khuẩn ưa lạnh nhiệt độ dưới 200C, vi khuẩn ưa ấm nhiệt độ từ 20 – 450C, vi khuẩn ưa nóng từ 450C trở lên Đây cũng là đặc tính để phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn và cũng là cơ sở cho các quá trình nuôi, sinh tổng hợp γ-PGA Đối với các chủng sinh tổng hợp γ-PGA, tùy theo đặc tính của từng loài

mà nhiệt độ tối ưu của các chủng khác nhau

Nghiên cứu trên các chủng B licheniformic ATCC 9945, B licheniformic A35, B subtilis F02-1 sinh tổng hợp γ-PGA thích hợp ở nhiệt độ 300C Trong khi

đó nhiệt độ thích hợp cho các chủng B subtilis IFO3335, B subtilis ZJU-7, B

Còn chủng B subtilis natto, nhiệt độ 400C là tối ưu nhất cho tổng hợp γ-PGA [11, 22]

Yếu tố pH quyết định đến mức độ hoạt động của ion H+ trong canh trường, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong canh trường Giá trị pH sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bởi hoạt độ ion H+ trong môi trường làm thay đổi trực tiếp đến trạng thái điện tích của thành tế bào

Trong quá trình lên men, pH canh trường luôn thay đổi, tuỳ theo chủng vi sinh vật, dạng sản phẩm lên men cần thu nhận mà các nghiên cứu sẽ hiệu chỉnh hoặc không hiệu chỉnh pH theo quá trình lên men Nếu giá trị pH không phù hợp

sẽ làm tổn thất trong quá trình lên men tăng nhanh Trong các nghiên cứu về giá trị pH đối với chủng sinh tổng hợp γ-PGA các giá trị pH thông thường được khảo sát quanh giá trị pH = 7

Nghiên cứu về chủng B licheniformis NCIM 2324 cho thấy pH = 6,5 là

giá trị tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA, và axit citric được cho là sử dụng tốt ở

giá trị pH này Trong một nghiên cứu khác về chủng vi khuẩn B subtilis

IFO3335 cho thấy, pH tối ưu là 7 và lượng γ-PGA tạo thành là 23 g/l cao gấp 1,44 lần trước khi tối ưu pH Một số trường hợp đặc biệt trong nghiên cứu ảnh

hưởng của pH đến quá trình tổng hợp γ-PGA bởi chủng B subtilis CGMCC

0833, có hai trạng thái pH tối ưu đối với chủng này, tại pH = 6,5 tối ưu cho việc

sử dụng glutamat, còn pH = 7 thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn Chính vì vậy trong quá trình sinh tổng hợp γ-PGA, trong 24 giờ đầu pH = 7, sau

24 giờ giá trị pH được điều chỉnh về 6,5 Sự điều chỉnh giá trị pH của canh trường đã giúp tăng hiệu suất tổng hợp γ-PGA lên 24,8%

Khảo sát trên một số chủng vi khuẩn B licheniformis ATCC 9945a cho

thấy chủng có khả năng sinh γ-PGA cao nhất tại pH tối ưu là 7,4 Như vậy có thể nói giá trị pH tối ưu cho mỗi canh trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào các chủng vi khuẩn tham gia tổng hợp γ-PGA [55,56]

Poly γ-glutamic là nguyên nhân chính tạo độ nhớt trong canh trường, độ nhớt là yếu tố cản trở sự trao đổi các chất dinh dưỡng và oxy của quá trình lên men Điều khiển, duy trì sục khí và khuấy trộn là yếu tố rất quan trọng đối với quá trình lên men γ-PGA Kết quả nghiên cứu của Shih và các cộng sự cho thấy khi tăng lưu lượng sục khí từ 0,5 lít/phút lên 2,0 lít/phút và tốc độ khuấy từ 250

vòng/phút lên 800 vòng/phút trong quá trình nuôi cấy B licheniformis thì lượng

γ-PGA thu được tăng từ 15 g/l lên đến 23 g/l Sục khí và khuấy trộn còn ảnh hưởng đến mức độ đồng hóa glutamat và citric trong quá trình tổng hợp Đối với

vi khuẩn B licheniformis sau 96h nếu không có sục khí và khuấy trộn thì lượng

glutamat và citric còn lại tương ứng là 8,3 g/l và 7,5 g/l, nhưng khi có khuấy trộn và sục khí, lượng glutamat và citric còn lại tương ứng là 0,2 g/l và 2,2 g/l Mức độ cung cấp oxy cho quá trình lên men γ-PGA thông qua khuấy và sục khí

là yếu tố cần thiết cho việc sinh tổng hợp của vi sinh vật, bởi như vậy các nguồn

dinh dưỡng mới được đồng hóa triệt để, tạo sản phẩm có khối lượng phân tử lớn, năng suất cao [38]

Trong nghiên cứu qui trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm, quá trình lắc (cấp khí và khuấy trộn) có thể không thể hiện chính xác, tương ứng với quy

mô khi nhân rộng Nhưng ở quy mô thực nghiệm quy mô lớn, quá trình sục khí, khuấy trộn ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất của quá trình lên men Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA khi nuôi cấy trên quy mô phòng thí nghiệm thường được nghiên cứu ở chế độ nuôi tĩnh, trong khi thực hiện ở quy mô công nghiệp thường được nghiên cứu bổ sung thêm chế độ sục khí hoặc khuấy trộn đển đảm bảo nguồn oxy cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp γ-PGA Vì vậy, trước khi lên men trên quy mô lớn cần phải nghiên cứu kỹ đặc tính chu kỳ sinh trưởng và tổng hợp của chủng vi khuẩn để đưa ra những chế độ cấp khí và khuấy trộn phù hợp [19, 49]

1.7 Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA

1.7.1 Định tính và định lượng γ-PGA

Poly γ-glutamic được nghiên cứu từ năm 1913, để xác định được γ-PGA

có thể thông qua các kĩ thuật phân tích như sau:

Đo độ nhớt: đặc tính tạo nhớt của γ-PGA tỷ lệ thuận với nồng độ γ-PGA,

do vậy đo độ nhớt được lựa chọn để đánh giá chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra nhiều γ-PGA nhất trong canh trường Sau khi thu nhận γ-PGA từ các mẫu thí nghiệm theo các mốc thời gian tiến hành ly tâm loại bỏ xác vi sinh vật, tủa bằng cồn 98% với tỷ lệ 3:1, đem kết tủa và hòa tan trong nước với cùng một tỷ lệ như nhau, đem đi đo độ nhớt bằng nhớt kế Brookfield Tuy nhiên trong nhiều trường hợp sự tạo nhớt trong canh trường là những hợp chất không phải là γ-PGA mà là hợp chất polysaccharide Để có thể kết luận chính xác cần bổ sung thêm công đoạn định tính γ-PGA bằng cách thủy phân γ-PGA thành các monomer axit glutamic và xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB), CTAB sẽ kết hợp với γ-PGA tạo phức Phức chất này sẽ được hấp thụ

ở bước sóng 400nm Khi phức chất tạo ra càng nhiều, giá trị hấp thụ màu của

phản ứng CTAB ở bước sóng 400nm càng lớn Hàm lượng γ-PGA được xác định dựa trên độ tăng khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp

Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cách đo độ hấp thụ trong vùng ánh sáng

tử ngoại: phương pháp được dựa trên đặc tính hấp thụ cực đại của dung dịch PGA tại vùng ánh sáng tử ngoại, bước sóng 216nm Nghiên cứu về cách đo này

γ-đã được Zeng và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh năm 2012 và γ-đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu gần đây Phương pháp đơn giản, được sử dụng trong việc xác định các hợp chất hữu cơ và vô cơ, có thể thực hiện dễ dàng trong các phòng thí nghiệm Phương pháp dựa trên đặc tính hấp thụ ánh sáng cực đại của γ-PGA khi hòa tan trong nước deion tại vùng ánh sáng tử ngoại, có thể xác định hàm lượng γ-PGA mà không bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử γ-PGA [52]

1.7.2 Thu nhận và tinh sạch γ-PGA

Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã được tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo phổ hấp thụ hồng ngoại Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong phần nhầy của Natto có 58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5 – 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ γ-PGA và polysaccharide khi pH môi trường thay đổi Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao

γ-PGA được sản xuất chủ yếu bởi vi khuẩn Gram dương, bao gồm chi Bacillus

Nó cũng đã được báo cáo rằng ít nhất một loại vi khuẩn Gram âm

(Fusobacterium nucleatum), một số vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn có khả

năng sản xuất γ-PGA

Thu nhận γ-PGA từ môi trường lên men lỏng thường đơn giản bởi γ-PGA

là một polymer có khả năng tan trong nước, nên có thể loại bỏ các tạp chất bằng cách lọc hoặc ly tâm Đối với γ-PGA thu được bằng phương pháp lên men trên môi trường rắn, sau khi kết thúc quá trình lên men, γ-PGA được trích ly bằng nước nhiều lần và đem đi lọc trước khi mang đi tinh sạch [25, 38]

Một số nghiên cứu về γ-PGA của các nhà khoa học đã đưa ra nhiều phương pháp tinh sạch γ-PGA, các phương pháp này chủ yếu là sử dụng cồn 98% để làm sạch γ-PGA sau khi lên 26 men Tỷ lệ cồn và dịch nổi thu hồi từ

quá trình lên men thường được sử dụng theo tỷ lệ 1:3 hoặc 1:4 Cồn sau khi sử dụng tinh sạch γ-PGA được đem thu hồi và xử lý lại Phương pháp sử dụng cồn chỉ có tác dụng khi tinh sạch với các axit D-L γ-PGA bởi chỉ các axit này mới bị kết tủa Khi sử dụng cồn, γ-PGA và protein bị kết tủa, một số khác không bị kết tủa sẽ được loại bỏ theo dịch Nhờ tính chất phân cực của mình sau khi kết tủa γ-PGA có thể hòa tan trở lại trong môi trường nước đã được deion, một đặc tính ít thấy ở protein

Trong công nghiệp sản xuất đại trà γ-PGA của các nhà máy lớn, γ-PGA được tinh sạch bằng các hệ thống lọc và các hệ thống chất hấp thụ như than hoạt tính, cation, anion, celite nhằm loại bỏ các ion kim loại, hợp chất tạo màu, tạo mùi ảnh hưởng đến sản phẩm Dựa trên tính chất tạo nhớt của γ-PGAcó thể thu hồi làm sạch bằng cách làm giảm độ nhớt của γ-PGA bằng cách giảm pH, tăng nhiệt độ dịch sau đó sử dụng các phương pháp như lọc, ly tâm, hấp thụ để loại

bỏ các tạp chất Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch γ-PGA từ một số chủng

B subtilis natto, B subtilis BS 62 và B licheniformis CCRC1286 cho thấy phần

lớn quá trình tinh sạch γ-PGA có áp dụng kết tủa bằng cồn và để giảm lượng ethanol sử dụng trong quá trình tinh sạch, có phối hợp khai thác các kỹ thuật khác như ly tâm, lọc, tẩy màu, tẩy mùi là những phương pháp tinh sạch được

sử dụng hiện nay [25, 39]

Dịch lên men

Phương pháp của Goto và Kunioka [22]

Hình 1.4 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Goto và

Hòa kết tủa trong nước deion

Thẩm tách 4oC trong 24 giờ bằng

nước Thu nhận

1.8 Ứng dụng của γ-PGA

1.8.1 Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm

Axit poly γ-glutamic được sử dụng làm chất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do chúng không gây độc cho con người Ngoài ra nó còn được sử dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm cũng như tới sức khỏe của con người

Canxi chiếm khoảng 1,5-2% trọng lượng cơ thể nhưng khả năng hấp thụ Canxi trong ruột bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như chế độ ăn uống, hàm lượng phytate và oxalate Các chất trên hình thành các muối ít tan với canxi nên không được hấp thụ qua đường ruột mà thải ra ngoài thông qua đường tiêu hóa Khi thiếu hụt canxi có thể dẫn đến chứng loãng xương, đặc biệt là ở phụ nữ lớn tuổi, lượng ion Ca2+ trong máu thấp có thể dẫn đến hiện tượng loãng xương co cứng

cơ hay chuột rút Năm 2007, nghiên cứu của Tanimoto và các cộng sự đã chỉ ra rằng γ-PGA làm tăng khả năng hấp thụ canxi đường ruột người nhờ khả năng tạo muối tan đặc biệt không bị phân hủy bởi protease và sẽ từ từ ngấm qua thành ruột và được cơ thể hấp thụ

Axit poly γ-glutamic có khả năng làm giảm sự hấp thụ và lưu giữ Na+tăng hấp thụ K+ trong máu nên nó có khả năng chống cao huyết áp [27, 40]

Phức hệ γ-PGA -Vitamin C có khả năng ức chế Collagenase giúp giảm nếp nhăn khi da lão hóa [14]

Axit poly γ-glutamic được sử dụng thay thế một phần cho CMC trong công nghệ chế biến thực phẩm để tạo trạng thái và ổn định sản phẩm [14, 24]

Trong công nghệ sản xuất bánh kem xốp, nó được bổ sung vào trong nguyên liệu làm kem cùng với chất nhũ hóa để làm tăng tính ổn định sản phẩm, tăng cường tính chất của kem giữa hai mặt bánh, giảm độ dày lớp kem mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

Trong đồ uống từ quả tươi thường xảy ra hiện tượng đắng bởi các

mono-diglyceride kết hợp với axit polycacboxylic hoặc muối của axit đó γ-PGA

ổn định hệ cấu trúc nhũ hóa trong sản phẩm giúp sản phẩm không bị phân lớp trong thời gian bảo quản [21, 49]

Ngoài ra, nó còn là thành phần có trong kẹo cao su, đồ uống có tác dụng chống hôi miệng, ngăn ngừa sâu răng mà không làm giảm hương vị của thực phẩm Tác dụng này của nó được so sánh cao hơn so với nước muối sinh lý từ 30 - 35% [24, 49]

Axit poly γ-glutamic có khả năng cải thiện sự phân hủy protein cũng như ngăn chặn sự biến tính của protein Bên cạnh đó, nó còn có khả năng ổn định, làm chậm quá trình oxy hóa các chất béo trong nước như một dạng chất nhũ hóa, khả năng tạo vị, tăng vị cho sản phẩm giống như các loại đường aspartam, saccaroza hay có vị đạm giống axit amin và có vị mặn nhẹ của muối [24]

1.8.2 Trong lĩnh vực y-dược

Tác dụng hút ẩm và giữ ẩm của γ-PGA được so sánh và thay thế cho axit hyaluronic (HA) như một loại kem dưỡng ẩm Sự liên quan giữa hàm lượng vitamin C và hàm lượng collagen có liên quan mật thiết đến nhau Vitamin C còn là một chất chống oxy hóa hiệu quả trong việc bảo vệ da khi bị tổn thương bởi tia cực tím, ngăn chặn sự hủy hoại của sắc tố da Tuy vậy vitamin C rất dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ, ánh sáng và nhiều yếu tố khác Sự kết hợp giữa γ-PGA-vitamin C bằng liên kết giữa nhóm cacboxyl trong γ-PGA và hydroxyl của vitamin C đã giúp phần cải thiện tính bền của vitamin C Nhờ sự liên kết này mà vitamin C được sử dụng hiệu quả hơn trong việc chăm sóc da, bởi hợp chất này giống như một chất ức chế collagenase khi được kích hoạt bởi tia cực tím [9, 24]

Trong các sản phẩm chăm sóc da, γ-PGA được kết hợp với tia cực tím, hồng ngoại có tác dụng làm giảm kích thước của lỗ chân lông giúp bề mặt da nhẵn mịn hơn sau khi trị liệu [7, 14]

1.8.3 Trong lĩnh vực môi trường

Do tính chất là một polymer có nguồn gốc sinh học, có khả năng phân hủy sinh học, không độc với con người và môi trường Nên γ-PGA được sử dụng

như, một chất tạo chelate trong xử lý nước thải, làm nhựa sinh học có tác dụng liên kết bùn nhằm làm đông tụ, kết lắng bùn thay thế cho muối nhôm sunfat, chitosan, axit polyacrylic Trong quá trình xử lý môi trường có nhiều loại kim loại nặng, phóng xạ tự nhiên ảnh hưởng đến sức khỏe con người, γ-PGA có tác dụng làm bao bọc và cô lập các yếu tố gây hại thành một nhóm và không cho phát tán ra môi trường, hoặc làm cho các kim loại nặng này liên kết với nhau thành các cụm, nhóm tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình xử lý môi trường Không những vậy γ-PGA còn được sử dụng như một chất xử lý cho nguồn nước sinh hoạt và nguồn nước cho quá trình lên men Axit poly γ-glutamic được ứng dụng làm vật liệu bao bì có khả năng phân hủy sinh học trong suốt, có độ đàn hồi và độ dai cao, nhằm thay thế cho các bao bì không có khả năng phân hủy sinh học [13, 14]

1.8.4 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Trong lĩnh vực nông nghiệp do γ-PGA có khả năng liên kết bền vững với nước và có khả năng trương nở (giãn cấu trúc mạch) nên được ứng dụng trong sản xuất phân bón Không chỉ được biết đến như chất giữ ẩm, giữ nước cho cây, γ-PGA còn được xem như một chất bảo vệ nguồn vi lượng cho cây, vì nó có khả năng liên kết với các nguyên tố K, Na, Mn2+, Mg2+, Fe3+, Ca2+, các khoáng chất này được cây trồng hấp thụ dần theo nước có chứa γ-PGA Do vậy đối với cây trồng γ-PGA có tác dụng kích thích phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản lượng và chất lượng cho nông sản Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi γ-PGA được sử dụng như một chất bổ sung làm tăng cường khả năng thấp thụ canxi, photpho của vật nuôi, giúp cho chúng có khung xương chắc khỏe, tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, cho hiệu quả chăn nuôi cao nhất Nhờ có sự hấp thụ khoáng chất này mà sản lượng trứng tăng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi [35]

1.9 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam

1.9.1 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới

Các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, các polymer sinh học, các vật liệu sinh học đang dần thay thế các polymer dầu mỏ, các sản phẩm có nguồn gốc dầu

mỏ và khoáng sản đang dần cạn kiệt Trong số các sản phẩm sinh học có những đặc tính nói trên phải kể đến axit poly γ-glutamic (γ-PGA), một sản phẩm được tổng hợp từ axit glutamic, được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật với các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như ngô, khoai, sắn hay từ sinh khối thực vật Hiện tại trên thế giới một số công ty đã sản xuất γ-PGA như Wako Pure Chemical Industries, Vedan Enterprise Corp (Đài Loan), Alamanda Polymers (Canada)…Mặc dù dễ sản xuất nhưng giá thành cao

Năm 1913, axit poly γ-glutamic chỉ được biết đến trong hỗn hợp với fructan,

ở lớp màng nhầy của Natto – sản phẩm đậu tương lên men của người Nhật Bản [36]

Năm 1937, axit poly γ-glutamic được tìm thấy lần đầu tiên bởi Ivanovíc

và các cộng sự khi họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một loại vi khuẩn gây nên bệnh than rất nguy hiểm cho các động vật

ăn cỏ, động vật có vú và con người [29]

Năm 1942, Bovarnick đã chứng minh rằng γ-PGA là một sản phẩm tiết trực tiếp vào canh trường nuôi cấy giống như một sản phẩm lên men ngoại bào thông thường [16]

Năm 1962, House và các cộng sự phân tách được một hệ enzym tổng hợp PGA cũng từ chủng Bacillus licheniformis 9945A Tuy nhiên, hệ enzym này xúc tác tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% là axit L-glutamic [26]

Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzym poly-glutamyl

synthetase ở màng nhầy bao quanh vi khuẩn B licheniformis 9945A xúc tác cho

hàng loạt phản ứng trên màng, trong đó axit L- glutamic được hoạt hóa, đồng phân hóa và polymer hóa thành cấu trúc rất giống PDGA như là một sản phẩm tiết vào canh trường dạng hòa tan Hệ enzym xúc tác cho các phản ứng này đòi

hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+ và không thể thay thế bằng các ion kim loại hóa trị hai khác [42]

Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập được một

số enzym ngoại bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa

amin đặc biệt là cho glutamine Các đơn phân này được chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [41]

Năm 2007, Tanimoto nghiên cứu γ-PGA làm tăng lượng canxi hòa tan trong cơ thể và các nghiên cứu có liên quan tới tình trạng thiếu canxi trong máu, mất chất khoáng trong xương, loãng xương, còi xương ở phụ nữ sau mãn kinh của Nhật Bản Nghiên cứu này được tiến hành ở một nhóm người lấy ngẫu nhiên

để thực hiện và xác định ảnh hưởng của γ-PGA với 80,6% axit L-glutamic tới sự hấp thu canxi Kết quả người sử dụng γ-PGA có khả năng hấp thụ canxi là 39,1% cao hơn so với người không sử dụng γ-PGA có khả năng hấp thụ canxi chỉ là 34,6%

Trong các nghiên cứu khoa học gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào các lĩnh vực thực phẩm, nông nghiệp và xử lý môi trường, chăm sóc sức khỏe ngày càng phổ biến và được quan tâm sâu hơn Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thức phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên được tổng hợp từ quá trình sinh học của

vi sinh vật đang là đích đến của các nhà nghiên cứu Các hợp chất có nguồn gốc

từ vi sinh vật tổng hợp được phân tách ra làm các sản phẩm với các mục đích khác nhau So với các hợp chất được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, chúng

có những ưu điểm vượt trội như an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện với môi trường [38]

1.9.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam

Ở nước ta việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao như

trong công nghệ thực phẩm đã được hình thành từ lâu trong đời sống xã hội Những sản phẩm truyền thống như nước mắm, tương Bần, tương Nam đàn, tôm chua Huế, Chao… là những nguồn tài nguyên vi sinh vật tiềm năng cho phát triển công nghệ sinh học hiện đại đặc biệt là các hợp chất polymer sinh học Nghiên cứu về axit poly γ-glutamic ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là hợp tác nghiên cứu các phần có liên quan đến γ-PGA Sản phẩm γ-PGA chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở các dạng mỹ phẩm gia dụng, màng sinh học và hầu hết các sản phẩm γ-PGA này đều có nguồn gốc nước ngoài: từ Nhật bản, Hàn Quốc, Mỹ, Đức… Các công trình nghiên cứu về γ-PGA tại Việt Nam cho đến nay mới chủ yếu đạt được ở mức tổng quan, mô tả về quy trình, mô tả về ứng dụng thực tiễn trong một số tài liệu giảng dạy Việc đi sâu nghiên cứu về cơ chế quá trình sinh tổng hợp γ-PGA và khai thác ứng dụng sản phẩm này hầu như là chưa có

Hiện tại cũng có một số nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam tại nước ngoài có liên quan đến γ-PGA như nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa

enzym γ-PGA synthetase từ B subtilis của Viện nghiên cứu thực phẩm Quốc gia

Nhật bản và Viện Công nghệ Sinh học Nhìn một cách tổng thể việc nghiên cứu

γ-PGA ở Việt Nam còn rất ít và chỉ liên quan đến vi khuẩn Bacillus và các ứng

dụng của vi khuẩn này trong công nghệ sinh học hay công nghệ thực phẩm

Hiện tại ở Việt Nam tập đoàn Vedan đã sử dụng vi khuẩn B subtilis var natto và

axit L-Glutamic qua cơ chế chuyển hóa sinh hóa Salvage Bioconversion Pathway để tạo thành sản phẩm γ-PGA Tuy nhiên công nghệ này chỉ được sử dụng trong khuôn khổ của tập đoàn Vedan nên mọi thông tin công nghệ hay chủng giống đều được bảo mật và sản phẩm tạo thành γ-PGA của Vedan là sản phẩm dạng nước sử dụng cho mục đích làm thức ăn chăn nuôi và phân bón nông nghiệp [43]

Năm 2013 đề tài nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp γ-polyglutamic acid từ đồ uống Boza” của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên được thực hiện nhằm mục đích phân lập được chủng vi khuẩn có năng

lực sinh tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp

γ-PGA có tính ứng dụng cao tuy nhiên chưa được nghiên cứu sâu ở nước

ta Chính bởi vậy cần có những nghiên cứu rộng hơn về những tính chất ưu việt của γ-PGA cũng như các chủng vi khuẩn sinh ra nó để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống một cách rộng rãi

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu chung

Thu nhận được γ-PGA từ chủng vi khuẩn Bacillus và định hướng ứng dụng

2.1.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được điều kiện lên men thu γ-PGA từ vi khuẩn Bacillus

- Thu nhận được γ-PGA từ dịch lên men vi khuẩn Bacillus

- Thử nghiệm ứng dụng được γ-PGA trong bảo quản nông sản

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp γ-PGA

- Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp γ-PGA từ vi khuẩn

Bacillus

- Thử nghiệm ứng dụng γ-PGA trong bảo quản nông sản

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Nguồn mẫu

Các chủng Bacillus subtilis được cung cấp bởi bộ môn Công nghệ Vi

sinh–Hóa sinh của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm

nghiệp Việt Nam

2.3.2 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong phân lập và tuyển chọn vi khuẩn: pepton, cao nấm men, axit L-glutamic, axit citric, glycerol, NH4Cl, K2HPO4 , CaCl2.2H2O, FeCl3.6H2O, MgSO4.7H2O, NaOH, γ-PGA, CaCO3, NaCl bộ nhuộm Gram, xanh methylene, lugol, fuchsine

2.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường phân lập Luria Broth (LB): với thành phần môi trường gồm (g/l): Peptone 10; Cao nấm men 5; NaCl 5 và Agar 20 đối với môi trường đặc

Môi trường nuôi cấy cơ bản (NA): với thành phần môi trường gồm (g/l): tinh bột 3, pepton 5, cao nấm men 5, NaCl 3, MgSO4 0,3, agar 20 đối với môi trường đặc

Môi trường đặc hiệu (E): Thành phần môi trường đặc hiệu gồm (g/l): Axit L-glutamic 40; Axit citric 12; Glycerol lỏng 80; NH4Cl 7; MgSO4.7H2O, 0,5; FeCl3 6H2O, 0,04; K2HPO4 0,5; CaCl2 2H2O 0,15; MnSO4 H2O 0,04; Agar 20 đối với môi trường đặc

Các môi trường trên, sau khi hòa tan hết các thành phần môi trường, được điều chỉnh về pH=7, phân phối vào bình chứa tương ứng và được thanh trùng ở1210C trong 20 phút

2.3.4 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ, thiết bị được sử dụng có sẵn trong phòng thí nghiệm Vi Hóa sinh của Viện Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam

sinh- Dụng cụ

- Ống nghiệm, bình tam giác, bình scot, đĩa petri

- Cốc đong, ống đong, ống fancol, ống effendof

- Pipep malt, đầu côn, pipep thủy tinh

- Que cấy ria, que cấy chấm điểm, que chang mẫu thủy tinh

- Sắc ký bản mỏng

 Thiết bị sử dụng

Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm

Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

Nồi hấp

thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Anh

Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức

Máy ly tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn quốc

Đức