Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược. Mời các bạn cùng tham khảo!
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
TRẦN VŨ THIÊN
PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP
HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG
TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9 44 01 14
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
TP.Hồ Chí Minh – 2021
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: TSKH Hoàng Ngọc Anh
Người hướng dẫn khoa học 2: TS Phùng Văn Trung
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Các độc tố tự nhiên từ cây cỏ, nấm, sinh vật biển, ốc sên hoặc động vật có một vai trò quan trọng trực tiếp hoặc gián tiếp trong sự phát triển thuốc
Nọc độc động vật chứa nhiều độc tố nhằm để săn mồi hoặc tự vệ Rất khó để có thể xác định chính xác loại nọc độc hoặc số lượng độc tố nó tạo ra Nọc độc động vật và độc tố của nó (từ rắn, bò cạp, rết, ốc, thằn lằn, ếch, cá và côn trùng) đã được khảo sát để tìm ra hoạt tính sinh học và khả năng trị liệu của nó Những độc tố đó đã được chỉ ra là thể hiện nhiều hoạt tính dược học như: gây độc cơ, độc thần kinh, hạ huyết áp, xuất huyết, ức chế sự kết tập tiểu cầu, chống đông máu, kháng viêm, giảm đau, kháng ung thư và
diệt khuẩn Bakhle đã cho thấy thuốc Catopril được tạo thành từ nọc loài rắn Brazil, Bothrops juraraca, nổi
lên như thuốc kiểm soát hạ huyết áp và trụy tim khi bị nhồi máu cơ tim Cobrotoxin được phân lập từ loài rắn
hổ mang Đài Loan, Naja naja atra , được cho là có ảnh hưởng làm giảm đau Hanalgesin, một độc tố thần
kinh alpha (α-neurotoxin) dây dài từ loài rắn hỗ chúa (King Cobra) thể hiện hoạt tính giảm đau trên chuột, nó tạo ra giảm đau ở nổng độ 16-32 ng/g mà không gây ra nhiều tác dụng phụ lên thần kinh hay cơ Crotamine cũng được báo cáo là có ảnh hưởng làm giảm đau ở nồng độ thấp nhưng không rõ ràng trong độc tính in vivo Ảnh hưởng gây giảm đau của Crotamine cao hơn Morphin khoảng 30 lần và được chứng minh là liên
quan đến cả cơ chế giảm đau trung ương và ngoại biên Batroxobin, một enzym từ nọc loài rắn Bothrops atrox (loài rắn lục tìm thấy ở Nam và Trung Mỹ) có đặc tính giống huyết khối có khả năng cầm máu ở nồng
độ thấp và chống đông máu ở nồng độ cao
Hoạt tính giảm đau cũng được chứng minh từ nọc bò cạp và những độc tố peptide của nó Peptide có
hoạt tính giảm đau-kháng khối u từ nọc bò cạp Bothus martense thể hiện tính ức chế mạnh trên cả đau nội tạng và ngoài da cũng như hoạt tính kháng khối u trên khối u E ascites và tế bào xơ hóa S-180 Những độc
tố beta (β-toxins) từ nọc bò cạp cũng được sử dụng như công cụ dược lý trong nghiên cứu việc kích hoạt điện
áp kênh ion Na+
Cardiotoxin 3 (CTX 3), một polypeptide chứa 60 amino axit với hoạt tính kháng ung thư được phân
lập từ rắn Naja naja atra CTX 3 ức chế sự phát triển của dòng tế bào K562 phụ thuộc vào nồng độ và thời
gian khảo sát Một độc tố protein bền nhiệt (drCT-I) có KLPT 7.2 kDa được phân lập từ loài rắn lục Ấn Độ
(Daboia russelli russelli) có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào chết theo chương trình apoptosis
Phospholipase A2 (PLA2), được phân lập từ nọc loài Bothrops newweidii có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào gây khối u ác tính B16 F10 Nọc độc từ loài bò cạp đen Heterometrus bengalensis ức chế sự phát triển của dòng tế bào U937 và K562 Chlorotoxins lần đầu tiên được phân lập từ nọc của loài bò cạp Leiurus quinquestriatus, có độc tính trên dòng tế bào khối u não, nó có thể liên kết với nhiều khối u não trước khác
nhau với tính đặc hiệu trên 90% Bengalin, một protein có KLPT cao được tách từ nọc bò cạp đen Ấn Độ
Heterometrus bengalensis cũng thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào U937 và K562
Xuất phát từ những dược tính nêu trên và nhằm tìm ra các hợp chất có khả năng trị liệu hiệu quả để phát triển việc điều chế thuốc mới trong tương lai, nên luận án này tập trung vào nghiên cứu phân lập và xác
định cấu trúc của một số chất mới từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus (phân bố ở An Giang) và từ nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus (phân bố ở Vĩnh Phúc)
2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Trang 4Nghiên cứu phân lập, khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống
đông máu từ nọc bò cạp H laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược
3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Phân lập và làm sạch một số hợp chất mới từ nọc bò cạp H laoticus và rắn cạp nong B fasciatus
Khảo sát hoạt tính chống đông máu, giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư của nọc toàn phần, và
các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp H laoticus và rắn cạp nong B fasciatus
Xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính sinh học đã được làm sạch bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ
2.2 Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
2.2.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus và rắn cạp nong B fasciatus
Hình 2.1 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus
Trang 5Hình 2.2 Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus 2.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học
Khảo sát hoạt tính của các phân đoạn và toxin, protein tách ra trên các mô hình: hoạt tính đông-chảy máu trên mô hình cắt đuôi chuột của Barker [99], Liu [100]; Tác động giảm đau ngoại biên được nghiên cứu bằng mô hình đau quặn bằng acid acetic của Koster [103]; Tác động giảm đau trung ương được nghiên cứu bằng mô hình (kích thích nhiệt) nhúng đuôi chuột của Lanhers và Williamson [103]; Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư lên tế bào ung thư vú MCF7 và ung thư phổi A549 theo phương pháp khảo nghiệm MTT của Tim Mosmann [104- 106]
2.2.3 Phân tích thống kê kết quả
Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (Standard error of mean: sai
số chuẩn của giá trị trung bình) Phần mềm sử dụng thống kê là Minitab 14.0, các biểu đồ được vẽ bằng phần mềm SigmaPlot 11.0 Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 (độ tin cậy là 95%)
2.2.4 Xác định cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học
KLPT và cấu trúc của các chất có hoạt tính chống đông máu tách ra từ nọc bò cạp H.laoticus được xác
định bằng phương pháp khối phổ (ESI-MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (1
KLPT và trình tự amino acid của các protein tách ra từ nọc rắn B.fasciatus được xác định bằng phương
pháp khối phổ MALDI-TOF/TOF-MS, HR-ESI-MS/MS, hệ RP-HPLC ghép nối hệ Q Exactive HF Benchtop Orbitrap MS/MS
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả về bò cạp H laoticus
3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus
Từ nọc bò cạp H laoticus thô, tiến hành chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu được 5 phân đoạn
(PĐ1 - PĐ5) với sắc ký đồ như Hình 3.1
Trang 6Hình 3.1 Sắc ký đồ của nọc bò cạp H.laoticus
Khối lượng chạy sắc ký lọc gel của từng phân đoạn sau khi đông khô được thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Khối lượng 5 phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sau khi chạy lọc gel
thu được (mg)
% từng phân đoạn/ tổng lượng nọc thu được
3.1.2 Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)
Quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với các thông số của quá trình chạy sắc ký:
- Tốc độ dòng : 2 mL/phút
- Thời gian rửa giải : 0 – 35% dung môi B trong 70 phút
- Mật độ quang tại bước sóng : 226 nm
- Cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm)
Với điều kiện trên, từ phân đoạn 5 đã phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp (Hình 3.2)
Các phân đoạn thứ cấp này được thu lại, đông khô và bảo quản để khảo sát tác động đông - chảy máu trên chuột
Trang 7Hình 3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) trên cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm) của
(RP-Qua kết quả khảo sát cho thấy, trong 24 phân đoạn thứ cấp tách ra từ phân đoạn 5 thì có 6 phân đoạn
thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 gây ra thời gian chảy máu và thời gian đông máu dài hơn so với chất chứng (PL5), nghĩa là 6 phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 này có hoạt tính tác động lên quá
trình đông - chảy máu Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và 3.5
Bảng 3.4 Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5
Trang 8Hình 3.3 Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu
Bảng 3.4 và hình 3.3 cho thấy: Các phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian chảy máu trên chuột
theo chiều giảm dần sau: 5.5 > 5.22 > 5.16 > 5.10 > 5.11 > 5.19, trong đó phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời
gian chảy máu nhiều nhất, gấp 3,3 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 210,00 giây, lô chứng: 64,00 giây),
kế sau phân đoạn 5.5 là phân đoạn 5.22 gây ra thời gian chảy máu gấp 2,8 lần so với lô chứng (phân đoạn
5.22: 180,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây ra thời gian chảy máu thấp nhất, gấp
1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 102,70 giây, lô chứng: 64,00 giây)
Bảng 3.5 Thời gian đông máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5
Thời gian khảo sát (phút)
Trang 9Hình 3.4 Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính của PĐ5 lên thời gian đông máu
Bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy: phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với
lô chứng (phân đoạn 5.5: 458,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn 5.22 gây ra thời gian đông máu
gấp 1,9 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 563,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19
gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 470,00 giây, lô chứng: 293,00 giây)
3.1.4 Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22
Sau khi khảo sát tác động lên quá trình đông – chảy máu của các phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn 5 thì kết quả thu được là có 6 phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian đông - chảy máu trên chuột là: 5.5; 5.10; 5.11; 5.16; 5.19 và 5.22 Do phân đoạn 5.5 và 5.22 có hoạt tính chống đông máu mạnh hơn các phân đoạn còn lại (đã khảo sát ở mục 3.1.3) nên được chọn để tiếp tục tiến hành làm sạch, xác định hoạt chất chính của hai phân đoạn này và khảo sát thêm hoạt tính chống đông máu
3.1.4.1 Làm sạch phân đoạn 5.5
Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.5 với các thông số của quá trình chạy sắc ký:
- Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm)
Hình 3.5 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5
Thời gian đông máu (giây)
Thời gian khảo sát (phút)
Trang 10Tiến hành chạy mẫu thì phân đoạn 5.5 có phân đoạn chính là 5.5.1 Tiếp tục làm sạch phân đoạn
5.5.1 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.5 thu được toxin 5.5.1 có sắc ký đồ là:
Hình 3.6 Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1
3.1.4.2 Làm sạch phân đoạn 5.22
Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.22 với các thông số của quá trình chạy sắc ký:
- Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm)
Hình 3.7 Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22
Khi chạy sắc ký làm sạch thì phân đoạn 5.22 có phân đoạn chính là 5.22.3 Tiếp tục làm sạch phân
đoạn 5.22.3 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.22 thu được toxin 5.22.3 có sắc ký đồ là:
Hình 3.8 Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3
Trang 11Hai toxin 5.5.1 và 5.22.3 thu được sau quá trình chạy sắc ký RP-HPLC sẽ tiếp tục được khảo sát thêm hoạt tính chống đông máu
3.1.5 Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và toxin 5.5.1, toxin 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)
Sau khi làm sạch được các hợp chất: 5.5.1, 5.22.3, tiến hành khảo sát hoạt tính chống đông máu của những chất này cùng với chất 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp, do tác giả Võ Đỗ Minh Hoàng phân lập được cũng
từ bò cạp H laoticus nhưng từ phân đoạn 5.21 [8]) cùng với phân đoạn 5 Kết quả cho thấy:
● Cả 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp) đều thể hiện hoạt tính chống đông máu (Bảng 3.6):
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình đông máu ở chuột
- 5.21.1 (Leu-Trp) ở liều 2,48 mg/kg có thời gian đông máu dài hơn lô chứng (nhưng ngắn hơn 5.5.1
và 5.22.3) trong suốt thời gian thử nghiệm Tuy nhiên, tại thời điểm 120 phút, 5.21.1 (Leu-Trp) có thời gian đông máu dài hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng
● Về thời gian chảy máu: cả 5.5.1, 5.21.1 (Leu-Trp) và 5.22.3 đều thể hiện khả năng kéo dài thời
gian chảy máu tốt hơn so với lô chứng tương tự như thời gian đông máu (Bảng 3.7)
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình chảy máu ở chuột
Sau quá trình khảo sát thì 5.22.3 là hợp chất có hoạt tính chống đông máu tốt trong số các hợp chất
cùng khảo sát (5.22.3 kéo dài thời gian đông máu có ý nghĩa thống kê sau 90 phút tiêm mẫu) Tiếp theo tiến
Trang 12hành khảo sát thêm hoạt tính đông - chảy máu của 5.22.3 ở thời gian ngắn hơn, đó là ngay sau khi tiêm mẫu (phút 0), kết quả được thể hiện ở bảng 3.8 và 3.9:
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu
120,7 ± 13,8**
113,8
± 15,4*
101,0 ± 13,0*
83,33 ± 7,28*
67,83 ± 5,85*
59,17
± 5,79 Chứng 84,33 ±
4,72
75,83 ± 2,88
71,00 ± 4,57
67,83
± 2,59
64,33 ± 2,75
60,50 ± 3,37
46,83 ± 2,63
428,5
± 25,0*
421,5
± 14,0**
392,8
± 23,2**
397,8
± 24,1**
367,7
± 27,9*
335,3
± 14,2**
317,2
± 22,9**
* p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng Ảnh hưởng mạnh của 5.22.3 lên thời gian chảy máu sau 10 phút đầu tiên sau khi tiêm mẫu và mạnh nhất là ngay sau khi vừa tiêm mẫu xong (phút 0) và ảnh hưởng này kéo dài mang tính thống kê đến phút 90
so với lô chứng (Bảng 3.8, hình 3.9)
Hình 3.9 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu
Sự sai khác có ý nghĩa thống kê: * p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng
Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu kéo dài suốt 120 phút khảo sát Ảnh hưởng mạnh nhất của 5.22.3 lên thời gian đông máu là ngay sau khi vừa tiêm mẫu xong (phút 0) và ảnh hưởng này kéo dài mang tính thống kê đến phút 120 so với lô chứng (Bảng 3.9, hình 3.10)
Trang 13
Hình 3.10 Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu
Sự sai khác có ý nghĩa thống kê: * p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng Như vậy, tác động của 5.22.3 lên thời gian đông – chảy máu cao nhất là ngay sau khi vừa tiêm mẫu (phút 0) Ngoài ra có sự khác biệt lớn trong suốt thời gian khảo sát, điều này có thể xảy ra do tác động của 5.22.3 bị giảm theo thời gian (Bảng 3.8 và 3.9; Hình 3.9 và 3.10)
Mặt khác, kết quả ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu lớn hơn nhiều thời gian đông máu ngay sau khi vừa tiêm mẫu (phút 0) (thời gian chảy máu tăng 4,6 lần so với chứng còn thời gian đông máu tăng 1,6 lần so với chứng) (Hình 3.9, 3.10) Tại phút 20 thì 5.22.3 tăng thời gian chảy máu 2,9 lần so với chứng còn thời gian đông máu tăng 1,8 lần so với chứng
Như vậy, sau quá trình khảo sát hoạt tính đông – chảy máu thì 5.22.3 là hợp chất có hoạt tính chống đông máu tốt nhất sau 60 phút trong số các hợp chất cùng khảo sát: 5.22.3 kéo dài thời gian có ý nghĩa
thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian chảy máu tăng 4,8 lần còn thời gian đông máu tăng 1,4 lần so với
nhóm chứng); tương tự 5.5.1 cũng kéo dài thời gian có ý nghĩa thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian chảy máu tăng 3,2 lần còn thời gian đông máu tăng 1,3 lần so với nhóm chứng) Còn 5.21.1 kéo dài thời
gian nhưng không có ý nghĩa thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian chảy máu tăng 1,8 lần còn thời gian đông máu tăng 1,1 lần so với nhóm chứng)
3.1.6 Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 và 5.22.3) bằng MS và NMR
3.1.6.1 Cấu trúc của toxin 5.5.1
Sau khi đã làm sạch được toxin 5.5.1 có hoạt tính chống đông máu, tiếp theo tiến hành xác định KLPT bằng phổ khối lượng phun sương điện (ESI-MS) trên máy LCQ DECA XP+ MS (Thermo Finnigan,
United States) Theo dữ liệu khối phổ, KLPT của 5.5.1 là 267,867 Da (Hình 3.11) gần bằng với KLPT của
Adenosine (267,2 Da), bên cạnh đó 5.5.1 được tiến hành đo thêm phổ 1H-NMR và 13C-NMR để xác định chính xác cấu trúc
Trang 14Hình 3.11 Phổ MS của 5.5.1 Phổ NMR của 5.5.1 (PL6)
Để xác định cấu trúc của toxin 5.5.1 thì 5.5.1 được đo phổ 1
đo trong DMSO-d 6, D2O, H2O; b,d,e 500 MHz, 50MHz, 400MHz
[PL7]: Tham khảo dữ liệu phổ từ ChemicalBook
[PL8]: Tham khảo dữ liệu phổ từ HMDB (Human Metabolome Database)
[PL9]: Tham khảo dữ liệu phổ từ BMRB (Biological Magnetic Resonance Data Bank)
Phổ 1H-NMR cho thấy: các proton ở δH: 3,0 – 4,5 ppm (-O-C-H) là H-C-2’, H-C-3’, H-C-4’, H-C-5’; 0,5 – 6,0 ppm (-OH- Alcol) là C-2’-OH, C-3’-OH, C-5’-OH; Ở 7,3 ppm là proton của amine gắn với vòng
Trang 15Purine (C-6-NH2); Proton (vòng Purine) ở 8 – 8,5 là H-C-2, H-C-8; Do ảnh hưởng của cả N và O nên H-C-1’
ở khoảng 5,9 ppm
Phổ 13C-NMR cho thấy: Năm nguyên tử carbon sp3 liên kết trực tiếp với nguyên tử oxi (50 – 100 ppm)
là (C-1’, C-2’, C-3’,C-4’, C-5’) cộng hưởng tại 87,8; 73,3; 70,6; 85,5 và 61,6 ppm, trong đó có bốn carbon methine C-1’, C-2’, C-3’, C-4’ và một carbon methylene C5’ Có năm carbon sp2 C=C (100 – 150 ppm): C-2, C-4, C-5, C-6, C-8 cộng hưởng tại 152,3; 149,0; 119,3; 156,1 và 139,8 ppm, do việc cho điện tử từ hai nguyên tử nitơ nên C-2, C-4, C-6, C-8 có trường thấp hơn C-5 (119,3 ppm)
Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và 13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo (ChemicalBook,
BMRB, HMDB) thì 5.5.1 chính là adenosine với cấu trúc như hình 3.12
A
8
4 5
5'
HO
N
Hình 3.12 Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine)
A: Cấu trúc phẳng của Adenosine ; B : Cấu trúc không gian của Adenosine
3.1.6.2 Cấu trúc của toxin 5.22.3
Sau khi làm sạch đươc hợp chất 5.22.3 có hoạt tính chống đông máu và cũng tiến hành xác định
KLPT bằng phổ khối lượng (ESI-MS) thì KLPT của 5.22.3 là 317,133 Da (Hình 3.13) KLPT của chất này
gần bằng với KLPT của chất 5.21.1 là 317,974 Da (chất 5.21.1 là dipeptide Leu-Trp đã được tác giả Võ Đỗ
Minh Hoàng phân lập từ phân đoạn 5.21 bò cạp H laoticus [8]) Bên cạnh đó chất 5.22.3 cũng được đo thêm
phổ 1H-NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc
Hình 3.13 Phổ MS của 5.22.3
Trang 16Phổ NMR của 5.22.3 (PL10)
Do 5.21.1 và 5.22.3 có KLPT gần giống nhau là 317 Da nhưng thu được ở hai phân đoạn thứ cấp
khác nhau của cùng loài bò cạp H laoticus (phân đoạn 5.21 và 5.22) khi làm sạch bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao pha đảo (RP-HPLC), có nghĩa là các chất 5.21.1 và 5.22.3 là 2 chất đồng phân của nhau Vì vậy, do hợp chất 5.21.1 đã được xác định là Leu-Trp nên hợp chất 5.22.3 có thể là Ile-Trp Để xác định chính xác cấu trúc thì hợp chất 5.22.3 được đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR trong dung môi DMSO-d6 với máy cộng hưởng
5.22.3 cùng với số liệu phổ tham khảo của Ile-Trp từ [107] như Bảng 3.11
Phổ 1H-NMR cho thấy: proton (δH): (Alkan) R-CH3 (0,7 – 1,3 ppm) là H-C-5’, và H-C-6’; R-CH2-R (1,2 – 1,4 ppm) là H-C-4’; R3-CH (1,4 - 1,7 ppm) là H-C-3’; Ở 7 - 8 ppm là proton của vòng thơm (H-C-8, H-C-9, H-C-10, H-C-11); N-H (Amid) ở 8 – 9 là (C-2 - NH – C-1’); N-H (Pirol) ở khoảng 11 ppm là (C-5 - NH – C-7) Proton dạng Hα ở -CH-N- (3,5 – 5,0 ppm) là H-C-2 và H-C-2’ Proton dạng Hβ ở -N-C-
CH2- (2,0 – 3,0 ppm) là H-C-3
Phổ 13C-NMR cho thấy: Hai nguyên tử carbon sp3 không kề nguyên tử có độ âm điện mạnh dạng
R-CH3 (8 – 30 ppm): C-5’, C-6’ cộng hưởng tại 11,1 và 14,6 ppm; carbon sp3 dạng R-CH2-R (15 – 55 ppm):
C-3, C-4’ cộng hưởng tại 36,4 và 2C-3,4 ppm, do ảnh hưởng của vòng Pirol nên C-3 có trường thấp hơn C-4’; carbon sp3 dạng -CH-R3 (20 – 60 ppm): C-3’cộng hưởng tại 26,9 ppm Carbon sp3 kề nhóm gây hiệu ứng rút điện tử -C-N- (30 – 65 ppm): C-2, C-2’ cộng hưởng tại 56,7; 53,0 ppm (do ảnh hưởng của vòng Pirol nên C-2 có trường thấp hơn C-2’) Hai carbon nhóm C=O dạng acid, amid (155 – 185 ppm): C-1 và C-1’ cộng hưởng tại 172,7 ppm Có tám carbon sp2
C=C (100 - 150): C-4, C-5, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11, C-12 trong
đó có ba carbon bị thế hoàn toàn (C-4, C-7, C-12) cộng hưởng tại 109,3; 136,0 và 127,0 ppm và nhờ nối trực tiếp với nitơ nên C-7 (136,0 ppm) có trường thấp hơn hai carbon C-4 và C-12; năm carbon sp2 dạng methine còn lại (C-5, C-8, C-9, C-10, C-11) cộng hưởng tại 123,7; 111,3; 120,9; 118,3 và 118,0 trong đó C-8, C-9, C-
10, C-11 là bốn carbon của nhân thơm (110 – 175 ppm)
Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và 13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo thì hợp chất
5.22.3 chính là dipeptide Isoleucine – Triptophan (Ile – Trp) với cấu trúc như hình 3.14
Trang 17Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo
C (Số)
5.22.3 Hợp chất tham khảo
(Ile -Trp) [107]
δ C a,b δ H
12 7 8
11
9
10 O
O
HO
Hình 3.14 Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp)
A: Cấu trúc phẳng của Ile – Trp ; B : Cấu trúc không gian của Ile - Trp
Như vậy, từ nọc bò cạp H laoticus đã phân lập được hai hợp chất có hoạt tính chống đông máu đó
là: 5.5.1 và 5.22.3 Hai hợp chất này được xác định cấu trúc tương ứng là adenosine và dipeptide Ile – Trp
Cho đến nay trong các tài liệu đã công bố chưa có thông tin về việc phát hiện trong nọc bò cạp H laoticus có
adenosine và các dipeptide Leu-Trp và Ile-Trp hay hoạt tính chống đông máu của các hợp chất này Vì vậy,
đây là lần đầu tiên adenosine và dipeptide Ile – Trp phân lập được từ nọc bò cạp H laoticus
3.2 Kết quả về rắn cạp nong B fasciatus
3.2.1 Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B fasciatus