TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về Lợn đen Định Hóa
1.2.1 Nguồn gốc và đặc điểm
Hình 1.1: Hình dạng đặc điểm của Lợn đen
Lợn đen Định Hóa là giống lợn bản địa quý giá, có nguồn gốc từ huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam Huyện Định Hóa nổi bật với tiềm năng chăn nuôi và bảo tồn nguồn gen vật nuôi độc đáo này.
Giống Lợn đen Định Hóa có nguồn gốc từ lợn địa phương ở vùng núi Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên Với địa hình đồi núi hiểm trở và hạn chế trong việc thông thương, người dân chỉ giao dịch mua bán lợn trong khu vực huyện Do đó, giống lợn này đã được người dân địa phương đặt tên là Lợn đen Định Hóa.
Giống Lợn đen Định Hóa vẫn giữ được độ thuần chủng cao nhờ được nuôi tại vùng núi cao, nơi có nền kinh tế kém phát triển và địa lý hiểm trở Hệ thống giao thông kém phát triển đã ngăn cản việc pha tạp với các giống lợn nhập ngoại và lợn nội khác từ vùng đồng bằng Mặc dù giống lợn này chưa bị lai tạp nhiều, nhưng lại gặp vấn đề về cận huyết.
Giống Lợn đen Định Hóa vẫn tồn tại đến nay nhờ vào khả năng dễ nuôi, phàm ăn và sức đề kháng tốt, cho phép chúng sống trong điều kiện khắc nghiệt mà không mắc bệnh Chúng có thể ăn bất kỳ loại thức ăn nào, kể cả những thực phẩm thiếu dinh dưỡng Chất lượng thịt thơm ngon của chúng đã giúp lợn đen Định Hóa trở thành đặc sản, có giá trị kinh tế cao Với những ưu điểm vượt trội này, giống lợn này vẫn là nguồn cung cấp thịt chủ yếu cho khu vực miền núi hiểm trở, đảm bảo sự duy trì và không bị tuyệt chủng.
Lợn đen Định Hóa, giống lợn bản địa của vùng núi Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, có đặc điểm nổi bật với màu lông đen tuyền, lưng hơi võng, bụng sệ và mõm dài, trong khi bốn chân có màu trắng Đặc điểm lông da của giống lợn này khá đồng nhất, với xương nhỏ và thể trạng rắn chắc, giúp chúng thích nghi tốt với điều kiện nuôi thả rông trong môi trường rừng núi.
Danh pháp ba phần : S.scrofa x S.domesticus (Linnaeus, 1758)
Ở miền núi phía Bắc Việt Nam, có nhiều giống lợn địa phương phong phú như Lợn Mẹo, Lợn Mường Khương, Lợn Tạp Ná và Lợn địa phương Pác Năm, thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của địa phương Giống lợn này rất quan trọng trong đời sống các dân tộc thiểu số, cung cấp thịt mỡ cho nhu cầu của con người Chúng có nhiều ưu điểm như phù hợp với điều kiện miền núi, khả năng chịu đựng cao và thích hợp với phương thức chăn nuôi chăn thả Thịt và mỡ lợn thơm ngon được người dân ưa chuộng Tuy nhiên, giống lợn này cũng có nhược điểm như ngoại hình không đẹp, tầm vóc nhỏ, đẻ ít con và sinh trưởng chậm Dù vậy, lợn địa phương vẫn được người dân yêu thích và nuôi dưỡng.
1.2.2 Tập tính, chế độ ăn và sinh sản của Lợn đen
Lợn đen nổi bật với sức đề kháng tốt và khả năng chịu đựng kham khổ cao, giúp chúng dễ dàng thích nghi với môi trường Chúng có khả năng chống chọi với bệnh tật tốt hơn và dễ chăm sóc hơn, đồng thời không mắc các bệnh nguy hiểm như lợn rừng.
Giống lợn đen Định Hóa là giống lợn có chất lượng tốt nhất tại Thái Nguyên, với khả năng thích nghi vượt trội với khí hậu khắc nghiệt của vùng núi cao, nơi nhiệt độ có thể xuống tới 4-5 độ C và biên độ chênh lệch ngày đêm lên tới 10-15 độ C Chúng dễ nuôi, phàm ăn và có sức đề kháng cao, chống chịu bệnh tốt So với các giống lợn khác của Việt Nam, giống lợn này có tốc độ tăng trọng khá cao và thịt thơm ngon, mang lại giá trị kinh tế cao cho người chăn nuôi.
Giống lợn đen Định Hóa có khả năng chống chịu bệnh tật tốt, sống khỏe mạnh trong điều kiện chăn nuôi kém và vệ sinh không đảm bảo Chúng có thể ăn tạp và vẫn phát triển dù thức ăn chất lượng kém Mặc dù sinh trưởng và sinh sản không cao, với khối lượng tăng trưởng thấp và số con cai sữa ít, giống lợn này vẫn cho thấy khả năng thích nghi tốt hơn so với các giống lợn nội khác tại Thái Nguyên Điều này khiến người dân vùng núi phía Bắc tiếp tục nuôi giống lợn này vì tính dễ nuôi và ít bệnh tật.
Thức ăn cho lợn chủ yếu được tận dụng từ các phế phụ phẩm nông nghiệp, phù hợp với phương thức chăn nuôi ở những vùng kinh tế khó khăn Các nguồn thức ăn dễ tìm kiếm trong tự nhiên bao gồm lục bình, mía cây, bẹ chuối, thân cây ngô non, rau muống, bèo tây, cỏ và các loại quả xanh Thức ăn được chia thành ba loại chính: thức ăn xanh tươi (bao gồm cây chuối, bẹ chuối, thân cây ngô non, rau muống, bèo tây và các loại cỏ), thức ăn tinh (như hạt ngũ cốc, củ quả, mầm cây và rễ cây) và muối khoáng (gồm tro bếp, đất sét và hỗn hợp đá liếm) Trong đó, sản phẩm nông nghiệp như chuối cây và cỏ bắp chiếm khoảng 60 - 70% thành phần thức ăn, cùng với một phần cám gạo.
Lợn đen Định Hóa có mức sinh sản trung bình, thường đẻ ít con và phát triển chậm Tình trạng giao phối cận thân do người dân địa phương gây ra đã dẫn đến nguy cơ cận huyết cao, khiến giống lợn này có nguy cơ tuyệt chủng Hơn nữa, việc không nuôi lợn đực giống và chỉ mượn lợn đực thương phẩm chưa bị thiến để phối giống đã làm trầm trọng thêm hiện tượng cận huyết, dẫn đến chất lượng lợn đen Định Hóa không ổn định và có khả năng giảm sút.
1.2.3 Giá trị sử dụng của lợn đen
Tác dụng của Lợn đen
Thịt lợn đen nuôi thả tự nhiên, hay còn gọi là lợn chạy bộ, được nuôi trong không gian rộng rãi tại các gia đình Loại lợn này thường hoạt động nhiều hơn so với lợn trắng nuôi công nghiệp, dẫn đến thịt săn chắc hơn, sức đề kháng tốt hơn và cần ít thuốc tăng trọng hơn.
Ngoài ra, cũng do cách nuôi, nên thịt lợn đen có tỉ lệ nạc và mỡ hài hòa hơn, lượng mỡ thấp hơn, chất đạm cao hơn
Thịt lợn đen chủ yếu chứa axit béo chưa no, có thể giúp giảm nguy cơ bệnh tim mạch và mạch máu não khi tiêu thụ hợp lý Tuy nhiên, do hàm lượng axit và chất béo không bão hòa cao hơn so với thịt lợn thông thường, nên chỉ nên thưởng thức thịt lợn đen một cách thỉnh thoảng, không cần thiết phải ăn thường xuyên.
Thịt lợn đen có tỷ lệ nạc cao và chứa chất béo phong phú, mang đến hương vị thơm ngon khi nấu chín Mặc dù giá trị dinh dưỡng của thịt lợn đen không khác biệt lớn so với thịt lợn trắng thông thường, nhưng sự khác biệt nằm ở hương vị và trải nghiệm ẩm thực khi thưởng thức.
Lợi ích đến sức khỏe con người
Thịt lợn, một loại thịt đỏ phổ biến toàn cầu, đặc biệt ở miền đông Châu Á, có đặc điểm là thịt mỡ màu trắng, da dày và giòn, cùng hương vị thơm ngon Là nguồn thực phẩm giàu protein và chất béo, thịt lợn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết
Gen CSN1S1 - Alpha S1 Casein
1.3.1 Nguồn gốc, cấu tạo và chức năng của đoạn gen CSN1S1
Trong những thập kỷ qua, việc phát hiện các locus đặc điểm định lượng (QTL) và các gen ảnh hưởng đến năng suất sữa đã trở thành trọng tâm của nghiên cứu di truyền phân tử Mối liên quan giữa các đặc điểm năng suất sữa và các gen đã được khám phá trong chăn nuôi, đặc biệt là các gen mã hóa protein sữa, đóng vai trò quan trọng trong phân tích di truyền Đa hình của các gen này được ứng dụng trong phân tích đa dạng di truyền, nghiên cứu phát sinh gen, và các chiến lược chọn lọc và bảo tồn Hơn nữa, các đột biến trong các gen này ảnh hưởng đến mức độ phiên mã và đặc điểm năng suất sữa.
Lợn sở hữu bộ nhiễm sắc thể với 2n = 38, trong đó các cặp nhiễm sắc thể có kích thước rõ ràng khác nhau Gen CSN1S1 nằm trên nhiễm sắc thể số 8, có kích thước 20076bp và bao gồm 19 exon, với mARN có kích thước 1130bp.
Hình 1.2: Hình ảnh bộ NST ở Lợn đen
Casein (α s1, β, α s2, và κ) ở động vật nhai lại được mã hóa bởi gen đơn bản sao chép liên kết trong một khu vực khoảng 300kb, bao gồm các gen CSN1S1 (α s1 -CN), CSN2 (β -CN), CSN1S2 (α s2 -CN) và CSN3 (κ -CN) (Ferretti và cs, 1990) Trong số các loại casein, α s1 -Cn chiếm hơn 40% trong sữa bò (Farrell và cs, 2004), trong khi ở sữa dê, tỷ lệ này dao động từ 0 đến 25% do sự đa hình trong gen mã hóa cho protein này (Boulanger và cs, 1984) Theo Neveu và cs (2002), đã phát hiện ít nhất 18 alen của gen CSN1S1 ở các giống dê, được phân loại thành bốn mức biểu hiện khác nhau.
0 g/L/alen và được đặt tên là "cao", "trung gian "," thấp" và "null"
Gen CSN1S1 mã hóa protein Alpha S1 Casein, một thành phần chính trong sữa với kích thước 185 axit amin và khối lượng phân tử 21671 Da Protein này có cấu trúc bậc bốn, bao gồm heteromultimers của alpha-s1 casein và kappa-casein, liên kết bằng các liên kết disulfide Trong sữa, alpha s1- và beta-casein kết tủa khi có sự hiện diện của canxi, được gọi là casein nhạy cảm với canxi Kappa-casein đóng vai trò ngăn chặn sự kết tủa của các casein khác bằng canxi thông qua việc hình thành các hạt keo ổn định lớn gọi là micelle Casein có mặt trong tất cả các loại sữa động vật, bao gồm cả sữa người, và gen Casein được tổ chức thành cụm với thứ tự S1-Casein (CSN1S1), casein (CSN2), S2-Casein (CSN1S2) và kappa-Casein (CSN3).
1990) Toàn bộ khu vực cụm gen Casein ở Dê kéo dài khoảng 250kb trên NST số
6 (Hayes và cs, 1993) Trong đó 2 đoạn gen CSN1S1 và CSN2 chỉ cách nhau 12 kb (Leroux và Martin, 1996)
Gen casein là mô hình quan trọng cho các quá trình ghép nối thay thế, với nhiều exon ngắn dẫn đến sự bỏ qua exon thường xuyên Nghiên cứu của Lenasi và cộng sự (2006) cho thấy sự xuất hiện của các dạng β-casein khác nhau ở ngựa (CSN2) liên quan đến đa hình nucleotide (SNP) trong intron đầu tiên của gen CSN2 Ngoài ra, các dạng ghép nối exon khác cũng được phát hiện trong casein alpha S1 (CSN1S1) (Matéos A và cộng sự, 2009), với CSN1S1 mã hóa protein αs1-casein có ít nhất 18 biến thể ảnh hưởng đến hàm lượng protein Một số biến thể di truyền khác nhau chỉ bởi sự thay thế axit amin, trong khi một số khác phát sinh từ bỏ qua exon Ở dê Caprine, mRNA của gen CSN1S1 dài 657bp và mã hóa cho 213 tiền chất axit amin, với protein CSN1S1 nhạy cảm với phosphoryl hóa và canxi, có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển canxi photphat trong sữa Sanchez và cộng sự (2005) dự đoán gen CSN1S1 có thể cải thiện các đặc điểm protein sữa.
Trong động vật nhai lại, 80% protein sữa chủ yếu là bốn loại casein: αS1, αS2, β-casein và к-casein Casein sữa đóng vai trò quan trọng là nguồn dinh dưỡng chính cho con non ở động vật có vú Các loại casein này, bao gồm alphaS1-casein (αS1-CN), beta-casein (β-CN), alphaS2-casein (αS2-CN) và kappa-casein (к-CN), được tìm thấy trong sữa dê và được mã hóa bởi các gen CSN1S1 và CSN2.
CSN1S2 và CSN3 được tổ chức thành một cụm 250 kilobase trên nhiễm sắc thể số 6 ở Dê (Martinet và cs, 2002) Trong các loại Casein, α-S1 Casein chiếm khoảng 40% trong sữa bò (Farrel và cs, 2004), trong khi ở sữa Dê, tỷ lệ này dao động từ 5-25% do sự xuất hiện của đa hình trong gen CSN1S1 (Boulanger và cs, 1984).
Năm 2007, nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng protein trong sữa dê bị ảnh hưởng bởi tính đa hình của gen CSN1S1, dẫn đến sự khác biệt đáng kể trong năng suất sản xuất phô mai Do tầm quan trọng kinh tế, tính đa hình của gen này đã được nghiên cứu kỹ lưỡng và tần số alen của nó đã được xác định ở một số loài cho sữa.
Hàm lượng casein trong sữa ngựa trưởng thành thấp hơn sữa bò, với khoảng 55% so với 80% tổng số protein sữa Các nghiên cứu về gen và protein casein của ngựa vẫn đang được tiến hành, liên quan đến các vai trò quan trọng của protein casein Các casein αs1 (CSN1S1), αs2 (CSN1S2) và β (CSN2) có chức năng hình thành các micelle, giúp chuyển canxi cho trẻ sơ sinh, trong khi casein (CSN3) được cho là yếu tố ổn định các micelle Hơn nữa, nghiên cứu về sữa mẹ cho thấy CSN3 có thể bảo vệ trẻ sơ sinh chống lại nhiễm trùng Helicobacter pylori.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng các thành phần sữa, bao gồm protein casein, trong sữa ngựa khác nhau ngay cả trong cùng một giống ngựa (Cieslak và cs, 2016) Với các giá trị di truyền ước tính cho lượng casein trong sữa bò (Bonfatti và cs, 2011), có thể giả định rằng yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự thay đổi hàm lượng casein ở sữa ngựa Tuy nhiên, phần lớn nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc phát hiện đa hình và phân tích sự phân bố của chúng trong các giống ngựa khác nhau (Brinkmann và cs, 2016; Hobor và cs, 2008; Selvaggi và cs, 2010) Mặc dù đã có mô tả rõ ràng về sự tồn tại của các dạng đa hình của gen casein, nhưng nghiên cứu về chức năng của các biến thể di truyền này vẫn còn hạn chế Các nghiên cứu gần đây trên động vật nhai lại cho thấy rằng một số biến thể quan trọng ảnh hưởng đến biểu hiện casein có thể nằm trong trình tự điều hòa của các gen mã hóa (Noce và cs, 2016; Cosenza và cs, 2016).
Nghiên cứu về gen casein đã được thực hiện trong nhiều năm, đặc biệt trên động vật nhai lại như gia súc, cừu và dê, vì đây là nguồn sữa chủ yếu cho con người Nhiều biến thể đa hình của gen casein đã được phát hiện, liên quan đến các đặc điểm thành phần sữa và tính chất hóa lý quan trọng Gần đây, nghiên cứu đã mở rộng sang các loài khác như lạc đà và ngựa, với sữa ngựa được chú trọng do thành phần tương tự sữa người Sữa ngựa không chỉ cung cấp dinh dưỡng mà còn có nhiều lợi ích sức khỏe, nhờ vào các thành phần sinh học như lysozyme và lactoferrin, và được khuyến cáo trong điều trị một số rối loạn như bệnh Crohn và viêm gan.
Một nghiên cứu cho thấy giống ngựa và thời điểm cho con bú có ảnh hưởng đáng kể đến biểu hiện gen và thành phần sữa, đặc biệt là nồng độ protein casein Tuy nhiên, sự biểu hiện gen ở mức mRNA và mức protein có sự khác biệt rõ rệt, cho thấy không có mối quan hệ tuyến tính giữa sự phong phú của mRNA và tốc độ tổng hợp protein Nguyên nhân chủ yếu là do sự đa dạng trong hiệu quả dịch mã cùng với nhiều cơ chế tác động đến quá trình biểu hiện gen.
Sữa đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển canxi và phốt phát, với casoxin D hoạt động như một chất đối kháng opioid và có khả năng vận mạch thông qua các thụ thể bradykinin B1 Trong sữa, alpha s1- và beta-casein kết tủa với canxi, được gọi là casein nhạy cảm với canxi Đồng thời, kappa-casein ngăn chặn sự kết tủa của các casein khác với canxi bằng cách hình thành các micelle, tạo ra các hạt keo ổn định lớn.
Theo nghiên cứu của Céline Carillier - Jacquin (2016), gen CSN1S1 có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng sữa, hàm lượng chất béo và protein trong sữa Ngoài ra, gen này còn đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường và điều hòa khả năng miễn dịch ở cá thể sơ sinh, vượt xa giá trị dinh dưỡng của nó trong sữa.
1.3.2 Các dạng alen của đoạn gen CSN1S1
Grosclaude và cs (1987) đã phát hiện 7 alen của gen CSN1S1 trên hai giống
Dê Alpine và Saanen là hai giống dê nổi bật Groscaude và Martun (1997) đã tiến hành nghiên cứu sâu rộng trên nhiều chủng loại dê khác nhau trên thế giới và công bố 17 alen của gen CSN1S1 có liên quan đến nồng độ khác nhau của α-S1 Casein trong sữa Các alen này bao gồm A, B1, B2, B3, B4, C, H, L, M, E, I, F, D.
G, O1, O2 và N Sau đó, Neveu và cs (2002) đã công bố rằng có sự hiện diện của
1 alen khác kí hiệu là O3 trên locus gen CSN1S1
Cơ sở khoa học của phương pháp PCR-RFLP
1.4.1 Khái niệm đa hình gen
Tính đa hình gen được quyết định bởi alen, và khi gen có nhiều alen, tính đa hình sẽ càng cao Gregor Mendel (1856) định nghĩa alen là các dạng khác nhau của một gen quy định một tính trạng Sau năm 1925, với thành công của Mogan trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, alen được định nghĩa lại là các dạng khác nhau của cùng một gen nằm trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể, quy định cùng một tính trạng ở sinh vật.
Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của cá thể, có thể ảnh hưởng hoặc không đến kiểu hình Những biến đổi này thường được phát hiện qua các phương pháp sinh học phân tử khác nhau Những biến đổi ảnh hưởng đến kiểu hình được coi là marker đặc hiệu, cho thấy nếu cá thể có cùng sự đa hình, có khả năng sẽ biểu hiện một số đặc điểm tương tự.
Kỹ thuật PCR, hay còn gọi là phản ứng chuỗi polymerase, là một phương pháp phổ biến trong xét nghiệm DNA và sinh học phân tử, giúp tạo ra nhiều bản sao của một trình tự DNA cụ thể.
Thông qua kỹ thuật PCR, chỉ với một đoạn DNA nhỏ (vài nanogram), có thể khuếch đại lên hàng triệu bản sao của đoạn trình tự DNA đó.
PCR là một kỹ thuật thiết yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y và xét nghiệm DNA, đóng vai trò quan trọng trong các phòng thí nghiệm hiện nay.
Phương pháp PCR, được phát minh bởi Kary Mullis và cộng sự vào năm 1983, cho phép khuếch đại nhanh chóng số lượng bản sao của gen Phản ứng PCR dựa trên tính chất biến tính và hồi tính của DNA, cùng với nguyên lý tổ hợp của nó Bằng cách sử dụng trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase, phương pháp này có thể tổng hợp đoạn DNA đích mong muốn.
PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi DNA mới từ chuỗi DNA ban đầu được cung cấp
DNA polymerase chỉ có khả năng thêm nucleotide vào nhóm 3′-OH đã có sẵn, do đó enzyme này cần một đoạn DNA mồi để bắt đầu quá trình thêm nucleotide đầu tiên.
Yêu cầu này cho phép xác định một khu vực cụ thể trong chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu mong muốn khuếch đại Sau khi phản ứng PCR kết thúc, trình tự cụ thể sẽ được nhân lên thành hàng tỷ bản sao của đoạn DNA ban đầu.
Thành phần của một phản ứng PCR thường bao gồm:
Dung dịch DNA mẫu (DNA template) chứa đoạn DNA cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản
Primers: là các đoạn DNA mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thúc của đoạn DNA mẫu
DNA polymerase là enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp các đoạn DNA mới, tạo bản sao của trình tự DNA ban đầu Enzyme này có khả năng chịu nhiệt tốt, thường được sử dụng trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với Taq polymerase là một ví dụ điển hình.
Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A,
T, G, C) –> là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của DNA –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự DNA bản sao
Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase
Ống PCR (ống PCR) là dụng cụ bằng nhựa chuyên biệt, được sử dụng để pha trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi đưa vào thiết bị thực hiện PCR (máy nhiệt cycler).
PCR thường bao gồm 20 - 40 chu kỳ biến đổi nhiệt độ, mỗi chu kỳ có 2 - 3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường là ba Chu kỳ bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C) và kết thúc khi sản phẩm PCR được tổng hợp hoặc lưu trữ ở nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn Nhiệt độ và thời gian của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm enzyme tổng hợp DNA, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs trong phản ứng, và nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi.
Giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp DNA yêu cầu nhiệt độ tăng lên từ 94 - 96°C, hoặc 98°C nếu sử dụng enzyme DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt Thời gian thực hiện giai đoạn này dao động từ 1 đến 9 phút.
Giai đoạn biến tính là bước đầu tiên trong chu kỳ, diễn ra khi nhiệt độ tăng lên 94 - 98°C trong khoảng 20 - 30 giây, dẫn đến việc phá vỡ các liên kết hydro giữa các bazơ, từ đó tạo ra phân tử DNA sợi đơn.
Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 - 65°C trong 20
Trong quá trình gắn mồi vào sợi DNA đơn, nhiệt độ cần được điều chỉnh để đảm bảo mồi bắt cặp chính xác với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn Nhiệt độ này thường thấp hơn 3 - 5°C so với Tm của mồi, giúp tạo điều kiện cho các liên kết hydro bền vững giữa phân tử AND - DNA Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu, còn nếu quá cao, mồi có thể không gắn Sau khi gắn, polymerase sẽ liên kết với các phân tử lai DNA mồi - khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp DNA.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu của đề tài
Phân tích được đa hình di truyền các đoạn gen CSN1S1 của Lợn đen Định Hóa
Tách chiết được DNA tổng số từ mẫu máu của Lợn đen Định Hóa
Thiết kế được cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen CSN1S1 xác định enzyme giới hạn phù hợp cho từng đoạn gen
Nhân bản được đoạn gen CSN1S1 từ các mẫu DNA nghiên cứu
Phân tích được sự đa hình di truyền của đoạn gen CSN1S1 bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn (RFLP)
Xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen CSN1S1 ở Lợn đen Định Hóa phục vụ đăng ký bản quyền trên ngân hàng gen quốc tế.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Gen và di truyền phân tử - Viện Công nghệ Sinh học - Đại học Lâm Nghiệp
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2019 - 5/2020
Thu thập mẫu máu Lợn trong quần thể nghiên cứu.
Vật liệu nghiên cứu
Phân tích đa hình chiều dài các đoạn gen bằng enzyme giới hạn tương ứng với mỗi gen
Pipette 0,5 - 10àl, 2 - 20àl, 10 - 100àl, 20 - 200àl, 100 - 1000àl Ống eppendorf 1,5ml; 2ml; 5ml Ống PCR, cỏc loại đầu tipe (10àl, 200àl, 1000àl) Ống fancol, xilanh
Bảng 2.1: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điên di Scie- plas Ltd-UK
2 Máy chụp gel Gel logic 1500- Kodak-USD
3 Máy nước cất Canada Bio Water system-Pall Co.UK
4 Cân điện tử TE214S- Startorius Germany
5 Máy ly tâm Eppendorf-CHLB Đức
6 Tủ lạnh -20oC; -80oC Super freezer Eco 130-Ficchetti-Italia
7 Máy voltex Voltex Genius3-IAK Genmany/China
8 Lò vi sóng Sharp Corp., Japan
9 Bể ủ ổn nhiệt Techne-OSI
10 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore
Bảng 2.2: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
11 Cặp mồi nhân gen CSN1S1 Công ty 1 st BASE - Malaysia
12 Taq-polymerase 5U/à l InTRON - Hàn Quốc
13 Buffer Taq-polymerase InTRON - Hàn Quốc
14 dNTP: nucleotide tự do A, T, G, C InTRON - Hàn Quốc
16 PCR master mix 2X InTRON - Hàn Quốc
17 Nhuộm axit nucleic Redsafe InTRON - Hàn Quốc
Bộ Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu G-spin™ Total DNA Extraction Mini Kit của InTRON - Hàn Quốc
Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit của InTRON - Hàn Quốc.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp lấy mẫu máu bao gồm việc sử dụng xilanh để lấy một lượng máu tĩnh mạch, sau đó chuyển vào ống eppendorf 2ml có chứa chất chống đông EDTA Mẫu máu này cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20 độ C cho đến khi sử dụng.
2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA được tách chiết từ mẫu máu bằng bộ kit G-spin™ Total DNA Extraction Mini Kit của InTRON - Hàn Quốc Quy trình tách chiết bao gồm các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cao.
Bước 1: Cho 200μl máu vào ống eppendorf 1,5ml
Bước 2: Thêm 20μl Protease K + 5μl RnaseA, đảo bằng Voltex
Bước 3: Thêm 200μl buffer BL Voltex nhẹ
Bước 5: Ủ ở 56 o C trong 10 phút, đảo ngược ống 3 - 4 lần
Bước 6: Ly tâm nhẹ (5000 v/p trong 2 phút) để kéo hết các giọt ở thành ống xuống
Bước 7: Thêm 200μl EtOH 100%, đảo bằng Voltex
Bước 8: Ly tâm nhẹ (5000 v/p trong 2 phút) để kéo hết các giọt ở thành ống xuống
Bước 9: Hút dung dịch chuyển vào cột; ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, RT; loại bỏ dịch trong ống, đặt cột trở lại
Bước 10: Thêm 700μl buffer WA Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút; bỏ dịch đặt cột trở lại
Bước 11: Thêm 700μl buffer WB Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút; chuyển cột
Bước 12: Ly tâm thêm 1 lần 13000 v/p trong 1 phút
Bước 13: Đặt cột sang ống eppendorf 1,5ml mới, bổ sung 50μ buffer CE; ủ ở RT trong 1 phút, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút
Bước 14: Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%
Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi như trong bảng 2.3 và các thành phần phản ứng ở bảng 2.4, chu trình nhiệt được thể hiện ở bảng 2.5
Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Bảng 2.4: Thành phần của một phản ứng PCR
Húa chất Thể tớch (àl)
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 5 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 Cho đến khi tắt máy
2.4.4 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn, hay còn gọi là Endonuclease giới hạn, là những enzyme có khả năng nhận diện các trình tự DNA đặc hiệu và cắt đứt liên kết phosphodiester tại vị trí đó.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme cắt giới hạn cho gen CSN1S1 là MaeI Sản phẩm PCR từ cặp mồi CSN1S1 được cắt bởi enzym MaeI
2.4.5 Phân tích đa hình các gen
Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn và phân lập độ dài các đoạn DNA thông qua điện di trên gel agarose 0,8% - 1,2% với hiệu điện thế 80V trong 40 phút trong hệ đệm TAE Sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide, các đoạn DNA được soi chụp dưới tia UV bằng máy chụp gel “Gel logic 1500 - Kodak - USD” Kết quả điện di được sử dụng để xác định kiểu gen cho từng cá thể.
2.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra
Phương pháp điện di DNA dựa trên đặc tính của nucleic acid là các đại phân tử mang điện tích âm, di chuyển về phía cực dương khi chịu tác dụng của điện trường Quá trình điện di phụ thuộc vào kích thước, cấu hình không gian của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện Các phân tử nhỏ di chuyển nhanh hơn so với các phân tử lớn, tạo điều kiện cho việc sang lọc các dòng tái tổ hợp thông qua việc so sánh kích thước.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
+ Sử dụng agarose 0,8% với 50ml
+ Cân 0,4g agarose cho vào 50ml dung dịch TAE 1X
+ Đun sôi bằng lò vi sóng để agarose hoà tan hoàn toàn (nồng độ gel 0,8%), làm nguội gel đến khoảng 60 o C
+ Thêm 3μl Redsafe đổ vào khuôn cài lược sẵn, chờ gel đông hoàn toàn
+ Sau khi gel đông lại, nhấc lược ra nhẹ nhàng tránh làm vỡ giếng, sau đó tách gel ra khỏi khuôn và đặt vào bể điện di
+ Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào bể điện di đủ để ngập hết bản gel
+ Sử dụng Loading Dye 6X => tỉ lệ mẫu được pha trộn là 5à mẫu + 1à Dye rồi mix đều tay (tránh tạo bọt khí)
+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 80V, 400mA, 30W trong 40 phút (vị trí vạch Dye màu xanh đi được 2/3 bản gel là được)
+ Kiểm tra kết quả điện di và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel
2.4.7 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi khuếch đại thành công, các sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch bằng bộ kit PCR Purification Kit của InTRON từ Hàn Quốc, sử dụng phương pháp tinh sạch từ gel agarose Các bước thực hiện sẽ được tiến hành theo quy trình cụ thể để đảm bảo hiệu quả tối ưu.
Bước 1: Chuyển tối đa 300mg gel vào ống Epp 2,0ml (nếu đã bảo quản gel trong ống rồi thì bắt đầu từ bước 2)
Bước 3: Ủ ở 55 o C trong 10 phút, mỗi 2 - 3 phút thì lấy ra voltex một lần Sau 10 phút phải đảm bảo gel được tan hết vào đệm
Bước 4: Để ống nguội ở RT Đặt cột vào ống thu
Chuyển 800μl hỗn hợp gel đã tan vào cột và ly tâm ở tốc độ 11000 v/p trong 30 giây Sau đó, loại bỏ dịch thừa dưới ống thu và lặp lại quy trình nếu lượng hỗn hợp ở bước 3 vượt quá 800μl.
Bước 6: Thêm 750μl washing buffer vào cột Ly tâm 11000 v/p trong 30s, loại bỏ dịch phía dưới cột
Bước 7: Ly tâm 14000 v/p trong 3 phút để làm khô cột
Bước 8: Đặt cột vào ống Epp 1,5ml mới
Bước 9: Thêm 40μl dung dịch H2O vào giữa cột (tránh để đầu côn chạm vào màng gây rách màng) Đặt ở RT trong 1 phút
Bước 10: Ly tâm 14000 v/p trong 1 phút Thu được AND ở ống Epp, bảo quản ở 4 o C để gửi đi giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch và kiểm tra nồng độ sẽ được chuyển đến công ty 1st BASE tại Malaysia để tiến hành giải trình tự nucleotide, sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing trên máy giải trình tự tự động.
2.4.9 Phương pháp phân tích số liệu
Các mẫu nghiên cứu đã được xử lý và phân tích trình tự nucleotide bằng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như BioEdit 7.2 và MEGA7, cùng với các công cụ hỗ trợ khác.