TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về lan Cattleya
1.1.1 Đặc điểm chung của Lan Cattleya
Lan Cattleya, hay còn gọi là Cát lan, được đặt tên bởi John Lindley vào năm 1824, nhằm vinh danh William Cattleya, người đã thành công trong việc nhân giống và trồng loài lan Cattleya labiata Tên viết tắt của chi này trên các tạp chí thương mại là (C.) Ngoài ra, Cattleya còn liên quan đến các chi khác như Brassavola và Broughtonia.
Encyclia, Guarianthe, Laelia, Myrmecophila, Sophronitis [4]
Lan Cattleya, được mệnh danh là Hoàng hậu của các loài lan trong họ Orchidaceae, nổi bật với vẻ đẹp hoàn hảo và hương sắc quyến rũ.
Hình 1.1: Cattleya Almakee (Nguồn: hoanghoaorchid.com)
Cattleya có vẻ đẹp đài các, kiêu sa với rất nhiều màu sắc từ hồng, tím, vàng, đến trắng, đỏ …
Cattleya là một chi thực vật phong phú với khoảng 65 loài nguyên thủy và hàng vạn giống lai tạo Loài lan này nổi bật với kích thước hoa lớn, rộng từ 15-20cm, và màu sắc đa dạng, làm cho chúng trở thành một trong những giống lan có nhiều cây lai nhất trong họ lan.
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh học
Cattleya là loài lan đa thân với mỗi thân mang 1-2 lá và nhiều giả hành, giúp dự trữ dinh dưỡng và nước Giả hành của Cattleya thường mập hơn so với Dendrobium và cây phát triển theo chiều ngang Trên đỉnh giả hành, thường có 1 hoặc 2 lá lớn, cùng với một lưỡi mèo bao bọc phát hoa Trung bình, mỗi năm, một cây lan Cattleya có thể ra 3 giả hành mới.
Hoa Cattleya có rất nhiều màu sắc: hồng, tím trắng, vàng, cam… Lan
Cattleya là một trong những loài hoa to và hương thơm ngào ngạt, màu sắc lại rực rỡ
Cattleya có khoảng 60 loài, được phân ra làm hai nhóm: lá đơn (nhóm 1 lá) và lá kép (nhóm 2 lá) [4]
Nhóm lá đơn, với đặc điểm nổi bật là giả hành chỉ có một lá, bao gồm các loài hoa đơn độc, thường to và đẹp với màu sắc rực rỡ như Cattleya eldorado, gaskelliana, labiata, mendelii, mossiae, và precivaliana Cây có khả năng ra từ 1 đến 3 hoa cùng một lúc nếu được chăm sóc trong điều kiện tốt Thân cây cao từ 8-30cm, lá xanh đậm, dày, dài khoảng 20cm và rộng đến 7cm Phát hoa mang từ 1 đến 6 hoa, mỗi hoa có đường kính có thể lên đến 25cm.
Hình 1.2: Một số loài lan Cattleya thuộc nhóm lá đơn
Nhóm lá kép có đặc điểm là mỗi giả hành mang từ 2 đến 3 lá, với hoa nhỏ hơn và mọc thành từng cụm, điển hình như các loài Cattleya aclandiae, amethystoglossa, aueantiaca, intermedia, leopoldii, skinneri Thân của nhóm này thường nhỏ hơn nhưng cao, lá có màu xanh nhạt, dài khoảng 20cm Phát hoa vươn cao từ một bọc xanh trên đỉnh, mang nhiều hoa, có thể lên đến 15 bông Hoa có kích thước nhỏ hơn, với đường kính khoảng 10-15cm và cánh hoa thuôn dài hơn.
Hình 1.3: Một số loài lan Cattleya thuộc nhóm lá kép
Trong thiên nhiên, có nhiều loài Cattleya lai tạo tự nhiên, chẳng hạn như Cattleya guatemalensis, được phát hiện bởi Linden và Reichenbach tại Guatemala, là kết quả của sự thụ phấn tự nhiên giữa Cattleya skinneri và Cattleya aurantiaca Một ví dụ khác là Cattleya brasiliense, giống lai tự nhiên giữa Cattleya bicolor và Cattleya harrisoniana.
Giống Cattleya lai nhân tạo đầu tiên là Cattleya hybrida được tập đoàn
Veitch đăng kí bản quyền ngày 1/1/1863 Cattleya hybrida được nhân giống giữa
Cattleya guttata và Cattleya loddigesii [16]
Giống Cattleya thường được lai với các giống Laelia, Brassavola, Sophronitis, và Broughtonia, tạo ra nhiều cây lai độc đáo như Rothara (Cattleya x Brassavola x Epidendrum x Sophronitis) và Fergusonara (Cattleya savola x Laelia x Schomburgkia x Sophronitis) Gần đây, nhiều nhà lai giống đã nỗ lực phát triển các cây có kích thước nhỏ hơn với hoa nhỏ nhưng vẫn giữ được vẻ đẹp của cây gốc Đến nay, hàng ngàn giống Cattleya đã được lai tạo với đủ hình dáng và màu sắc, trong đó nhiều giống đã được các quốc gia in lên tem.
Cattleya Francis = C bow Bells x C swan
Người ta không chỉ lai tạo các giống Cattleya mới trong cùng một chi mà còn kết hợp chúng với các chi hoa khác thuộc cùng một phả hệ như Laelia, Brassavola và Sophronitis.
Cattleya x Brassavola = Brassocattleya (thường được viết tắt là BC) Cattleya x Laelia = Laeliocattleya (LC)
Không những thế, người ta còn lai 3 chi thậm chí 4 chi trong cùng một phả hệ với nhau như:
Cattleya x Brassavola x Laelia = Brassolaeliocattleya (Blc)
Cattleya x Laelia x Sophronitis = Sophrolaeliocattleya (Slc)
Cattleya x Brassavola x Laelia x Sophronitis = Potinara (POT)
Hoa lan Cattleya mantini là một trong những loại hoa lan tuyệt đẹp, nổi bật với hương thơm quyến rũ Tuy nhiên, thời gian nở hoa của chúng rất ngắn, chỉ kéo dài trong một tuần Các loài hoa lan khác thuộc giống này cũng có những đặc điểm thú vị riêng.
Cattleya thường nở hoa trong khoảng thời gian nửa tháng và có khả năng ra hoa vào bất kỳ mùa nào trong năm, miễn là các bộ phận sinh trưởng đủ mạnh để phát triển thành một giả hành mới.
Cattleya cần ánh sáng gián tiếp với độ che sáng khoảng 50% Loài hoa này phát triển tốt trong môi trường mát mẻ và ẩm ướt, nhiệt độ lý tưởng là 21°C ban ngày và 16°C ban đêm Độ ẩm lý tưởng cho Cattleya dao động từ 40-70%, cần có thông gió tốt và tưới nước khi bề mặt đất khô, thường là một lần mỗi tuần hoặc tùy thuộc vào điều kiện thời tiết.
1.1.3 Giá trị của lan Cattleya
Lan Cattleya nổi bật với vẻ đẹp đài các và hương thơm nhẹ nhàng, dễ chịu, được ưa chuộng hơn so với những loại hoa có mùi hương nồng nặc Hương thơm này mang lại cảm giác thư thái, giúp xoa dịu căng thẳng sau những giờ làm việc mệt mỏi Đặc biệt, Cattleya có tuổi thọ dài, có thể sống từ 20 đến 30 năm nếu được chăm sóc đúng cách Hoa thường nở theo mùa, từ xuân đến đông, mang lại sự đa dạng cho không gian sống quanh năm Chính vì vậy, Cattleya được yêu thích và lưu thông rộng rãi trên thị trường, với giá trị thẩm mỹ cao hơn so với nhiều loài hoa khác.
Hiện nay, nhiều nghiên cứu về nhân giống lan bằng phương pháp in vitro đã đạt được thành công, mang lại hiệu quả cao cho quy mô công nghiệp Phương pháp này không chỉ giúp tăng cường sản xuất lan mà còn góp phần bảo tồn các loài lan và cây quý hiếm khác.
Giới thiệu chung về lan Cattleya Nhật Thịnh (HC2) và Cattleya
Tên gọi: Cattleya Nhật Thịnh
Là giống Cattleya giống mới được lai nhân tạo giữa 2 loài Blc Mount Hood x Blc Bryce Canyon
Hình 1.4: Lan Cattleya Nhật thịnh
Là loài Cattleya thuộc nhóm 1 lá, chỉ mang một lá trên đỉnh Cattleya này có thể ra đến 3 cùng một lúc nếu được chăm sóc trong điều kiện tốt
Hoa Cattleya Nhật có kích thước lớn, đường kính hoa lên tới 22cm, với màu hồng tím tươi sáng và hương thơm ngào ngạt lâu bền Thân cây cao từ 8-25cm, lá xanh đậm, dày và dài khoảng 20cm Ở đỉnh giả hành, một lưỡi mèo bao bọc phát hoa, giúp phát hoa vượt lên và nở rộ Rễ dài bám chặt vào giá thể từ cặn hành, với điều kiện chăm sóc bình thường, mỗi năm cây sẽ cho ra 2-3 giả hành mới.
Nhiệt độ lý tưởng cho chúng là 21 0 C vào ban ngày, ban đêm vào khoảng
16 0 C vào ban đêm, phát triển rất tốt với nhiệt độ không khí mát và ẩm Lan
Cattleya Nhật Thịnh là giống lan có khả năng sinh trưởng tốt ở cả vùng nóng và ôn đới, đặc biệt thích hợp với khí hậu Việt Nam Chính vì vậy, loại lan này được trồng và phát triển phổ biến tại nhiều tỉnh thành trên cả nước.
Cattleya Nhật thịnh chủ yếu phân bố tại Nam Mỹ và một số nước Đông Nam Á như Thái Lan, Đài Loan và Việt Nam Loài hoa này được nhập khẩu chủ yếu từ Thái Lan về Việt Nam để chăm sóc và tạo dòng thuần Hiện nay, dòng Cattleya Nhật thịnh đã có mặt tại nhiều nhà vườn ở cả miền Bắc và miền Nam, bao gồm các tỉnh như Hà Nội, Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh.
Hình 1.5: Hoa lan Cattleya bố mẹ của HC7 (Cattleya rattanakosin (A) x Cattleya almakee (B))
Cattleya rattanakosin x Cattleya almakee là một giống hoa thuộc nhóm lá đơn, với đặc điểm là chỉ có một lá trên đỉnh Hoa của giống này có kích thước lớn và tỏa hương thơm ngát Xuất xứ chủ yếu từ Thái Lan, chúng thích nghi tốt với khí hậu ôn đới, rất phù hợp để trồng tại Việt Nam.
Cattleya HC7 là một giống hoa lan mới, được lai tạo từ Cattleya rattanakosin và Cattleya almakee Giống hoa này nổi bật với màu vàng sáng chủ đạo, điểm xuyết những sọc đỏ từ trong ra ngoài Mặc dù cây không cao lớn nhưng rất khỏe mạnh và ra hoa đều đặn, với hương thơm lâu bền Hiện nay, Cattleya HC7 đã có mặt tại nhiều nhà vườn ở miền Bắc và miền Nam, đặc biệt tại các tỉnh như Hà Nội, Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh.
Tình hình nghiên cứu nhân giống các loài lan bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.1 Nhân giống lan Cattleya bằng công nghệ nuôi cấy mô
Nhân giống lan Cattleya bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro mang lại nhiều lợi ích, bao gồm việc tạo ra cây giống đồng đều, số lượng lớn và hệ số nhân cao Phương pháp này giúp giữ được đặc tính của cây ban đầu, đồng thời sản xuất cây con sạch bệnh nhờ điều kiện nuôi cấy vô trùng Ngoài ra, người trồng có thể hoàn toàn chủ động điều chỉnh các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của cây như dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và chất điều hòa sinh trưởng Việc này không chỉ tạo ra số lượng cây mới trong thời gian ngắn mà còn đáp ứng nhu cầu chơi lan của người tiêu dùng Vì những lý do này, tôi đã quyết định nhân giống hai loài lan này bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
Hiện nay, nguyên liệu chính để nhân giống cây lan bao gồm mô phân sinh ngọn, mô phân sinh bên và phôi hạt trong quả lan Trong số này, phôi hạt được sử dụng phổ biến nhất và mang lại hiệu quả cao nhất trong quá trình nhân giống.
2 loài lan Cattleya Nhật thịnh và Cattleya rattanakosin x almakee bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro này chưa được áp dụng nhiều
Nuôi cấy mô được thí nghiệm từ thế kỷ XVII, tuy nhiên chỉ được áp dụng vào nghiên cứu trên đối tượng lan vào thế kỷ XIX
Năm 1884, nhà làm vườn người Pháp Neumann đã lần đầu tiên gieo hạt lan lên các cục đất quanh gốc cây lan mới, giúp cho một số hạt lan nảy mầm.
Vào năm 1904, Noel Bernard và Hans Burgeff đã phát triển một phương pháp gieo hạt có nhiễm nấm trong chai thạch, giúp tăng đáng kể số lượng cây con từ hạt Hiện nay, nhân giống in vitro đã đạt được thành công đối với nhiều chi khác nhau trong họ lan, bao gồm Hồ Điệp, Hoàng Thảo, Kim tuyến và các giống lai của chúng.
Những thành tựu nghiên cứu về giống lan Cattleya:
Vào năm 1904, Bernard đã phát hiện ra một số loài nấm ký sinh có khả năng hỗ trợ quá trình nảy mầm hạt lan trong tự nhiên, với mỗi loài nấm có tác dụng riêng biệt trên các loại lan nhất định Cụ thể, đối với lan Cattleya, nấm Rhizoctonia repens có vai trò quan trọng trong việc giúp hạt nảy mầm ngoài môi trường tự nhiên.
Hans Burgeff năm 1909 đã làm nảy mầm của hạt Laelio, Cattleya trên môi trường dinh dưỡng gồm 0,33% đường saccarose trong điều kiện hoàn toàn bóng tối
Nghiên cứu của Jose Geraldo và Rezende năm 2009 đã chỉ ra rằng nồng độ 0 mg M-1 GA3 kết hợp với 60 mg M-1 sacarose là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của rễ và số lượng rễ non từ protorcorms của hạt nảy mầm lan Cattleya loddigesii sp.
Benner (1995), Chyi Chen (2000) và Khosravi (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình và quan hệ di truyền của các chi Cattleya, Dendrobium, Oncidium, từ đó lập bản đồ đa hình DNA, giúp xác định đặc tính của loài lan.
Nghiên cứu của Supinrach và Supinarach (2011) đã chỉ ra rằng giá thể trồng ảnh hưởng đến sinh trưởng của lan Cattleya brassolaelio Chia lin Trong giai đoạn cây con, họ đã thử nghiệm năm loại giá thể: rong biển, xơ dừa, than củi, đất sét nướng và đá núi lửa Kết quả cho thấy than củi mang lại hiệu quả tốt nhất cho sự phát triển của thân lá lan Cattleya brassolaelio Chia lin.
Nghiên cứu của Júnior và Venturieri (2011) đã chỉ ra rằng dương xỉ là giá thể tối ưu cho Cattleya forbesii, trong khi hỗn hợp sỏi và than bùn theo tỷ lệ 3:1 là lựa chọn tốt nhất cho Laelia purpurata trong giai đoạn sau nuôi cấy mô Bên cạnh đó, so sánh sự sinh trưởng giữa giá thể sỏi số 2 và hỗn hợp sỏi số 2 với than bùn đã nhấn mạnh tầm quan trọng của chất hữu cơ đối với sự phát triển của các loài lan này.
1.3.3 Các nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở nước ta có rất nhiều công trình nghiên cứu, nhân giống thành công nhiều loài hoa lan khác nhau bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Năm 2007, Nguyễn Thị Hồng Gấm và cộng sự tại Trung tâm Giống và Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Kết quả cho thấy môi trường nhân nhanh thể chồi gồm Knudson, 30g/l đường, 100g/l khoai tây, 100ml/l nước dừa, 7g/l agar, 0,3mg/l Kinetin, 0,2mg/l IAA, và 0,3mg/l NAA, đạt hệ số nhân nhanh là 4,25 Để kéo dài chồi, môi trường sử dụng tương tự nhưng thêm 0,2mg/l GA3 Môi trường ra rễ bao gồm Knudson, 30g/l đường, 100g/l khoai tây, 100ml/l nước dừa, 7g/l agar, và 0,1mg/l NAA.
Năm 2010, Nguyễn Thị Loan từ Trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) qua phôi hạt bằng phương pháp nhân giống in vitro Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi bao gồm Knudson với 20g/l sucrose, 100ml/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l nước dừa, 7g/l agar, 0,3mg/l NAA, 0,2mg/l IAA và 0,3mg/l Kinetin Để ra rễ, môi trường sử dụng Knudson với 30g/l sucrose, 100g/l dịch chiết khoai tây, 100ml/l nước dừa và 7g/l agar cùng với 0,3mg/l NAA.
Năm 2013, nghiên cứu của Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự tại Trường Đại học Lâm nghiệp đã hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Phi Điệp Tím (Dendrobium anosmum) Kết quả cho thấy, môi trường nhân nhanh thể chồi Knudson bổ sung 0,3mg/l NAA, 0,3mg/l Kinetin và 0,3mg/l BAP đạt hệ số nhân nhanh 4,56 Đối với môi trường Knudson bổ sung 30g/l đường, 0,1mg/l Kinetin và 0,5mg/l GA3, chồi có mức tăng trưởng cao nhất là 2,45cm với chất lượng tốt Đối với môi trường ra rễ, sử dụng Knudson kết hợp với 0,1mg/l NAA và 0,3mg/l IBA cho kết quả khả quan.
Năm 2017, Phan Thị Thu Hiền, và Cs (Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội
2) nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Đai châu đỏ (
Nghiên cứu về Rhynchostylis gigantea L bằng công nghệ nuôi cấy in vitro cho thấy công thức khử trùng hiệu quả nhất là Javen 10% + HgCl2 0,1% + ethanol 70%, đạt tỷ lệ mẫu sạch và sống sót cao nhất là 41,41% Để tạo phôi soma từ protocorm, môi trường MS cơ bản cần bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l IBA Môi trường thích hợp cho sự hình thành và phát triển chồi là MS + 0,5mg/l BAP + 0,5mg/l Kinetin Đối với môi trường ra rễ, sử dụng MS + 1,5mg/l NAA cho tỷ lệ ra rễ đạt 50,67%, với số rễ trung bình là 3,67 và chiều dài rễ đạt 3,3 cm Tại Việt Nam, các nghiên cứu về nhân giống in vitro lan Cattleya còn hạn chế, nhưng đã có một số công trình nghiên cứu về loài lan này và kết quả thu được.
Năm 2009, nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lý và cộng sự chỉ ra rằng trong giai đoạn sau nuôi cấy mô, cây lan Cattleya phù hợp nhất với giá thể than hoa vụn và dớn Lý do là cây chưa hoàn toàn thích ứng với điều kiện tự dưỡng, rễ còn yếu, và khả năng hút nước cũng như dinh dưỡng kém, do đó cần chọn những giá thể nhẹ và giữ ẩm tốt.
Năm 2010, Trần Mạnh đã xác định rằng Cattleya là loại lan phụ sinh, do đó việc bón phân qua phương pháp phun sương hiệu quả hơn so với tưới trực tiếp vào giá thể Phân bón lá có tỷ lệ N:P:K là 30:10:10 được khuyến cáo phun 2 lần/tuần Khi giả hành bắt đầu ra nụ, nên sử dụng phân bón 6:20:20, và để kích thích ra hoa, dùng phân 6:30:30 Bên cạnh đó, có thể kết hợp phân vô cơ với phân hữu cơ loãng hoặc các sản phẩm sinh học như rong biển và tinh cá Vitamin B1 với nồng độ 0,01% phun 1 lần/tuần cũng giúp tăng trưởng cho Cattleya Trước mùa nghỉ, cần bón phân 10:20:30 để củng cố sức sống cho cây, và khi vào mùa nghỉ, nên ngừng tưới hoàn toàn.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung: Xây dựng được kỹ thuật nhân giống cho 2 loài lan Cattleya bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Để tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt, cần xác định công thức khử trùng hiệu quả Bên cạnh đó, việc tìm ra môi trường và điều kiện ánh sáng tối ưu cho việc nhân nhanh thể chồi cũng rất quan trọng.
+ Xác định được môi trường và điều kiện ánh sáng cho nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả
+ Xác định được môi trường và điều kiện ánh sáng cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt cho 2 loài lan Cattleya HC2 và HC7
Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) và ánh sáng đèn đến khả năng nhân nhanh thể chồi in vitro của hai loài lan Cattleya HC 2 và HC 7 Kết quả cho thấy sự kết hợp tối ưu giữa các loại ĐHST và chế độ ánh sáng có thể nâng cao hiệu suất nhân giống, góp phần bảo tồn và phát triển giống lan quý hiếm này.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST và ảnh hưởng của ánh sáng đèn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cho 2 loài lan Cattleya HC 2 và HC 7
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST và ảnh hưởng của ánh sáng đèn đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của 2 loài Cattleya HC 2 và HC 7
Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng: Hai loài lan Cattleya: Cattleya Nhật Thịnh (HC2) và Cattleya rattanakosin x almakee (HC7)
Quả lan được nghiên cứu trong bài viết này là từ cây lan Cattleya Nhật Thịnh và Cattleya rattanakosin x almakee, được chọn lọc kỹ lưỡng từ những cây khỏe mạnh, mập mạp, không bị sâu bệnh Tất cả nguyên liệu được thu thập từ vườn lan Bắc Việt, tọa lạc tại Thạch Thất, Hà Nội.
Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962) được cải thiện bằng cách bổ sung đường sucrose làm nguồn cacbon, agar để làm cứng, cùng với khoai tây và các chất điều hòa sinh trưởng như Auxin và Cytokin với nồng độ khác nhau Trước khi thêm agar, pH của môi trường được điều chỉnh về mức 5,8 và sau đó tiến hành khử trùng ở nhiệt độ 118 độ C.
- Thời gian: tháng 7/2019 đến tháng 5/2020.
Phương pháp nghiên cứu
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu: Phải chia thành các công thức khác nhau, phải có công thức đối chứng
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: Phải đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức trong thí nghiệm
- Số mẫu thí nghiệm phải đủ lớn
- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3 lần
2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể
Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành
Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo với các chế độ:
+ Thời gian chiếu sáng: 10- 12 h/ngày
2.4.2.1.Thí nghiệm tạo mẫu sạch từ quả lan của 2 loài HC 2 và HC 7
Quả lan Cattleya cần được khử trùng bằng xà phòng pha loãng, sau đó lắc mẫu trong 5 phút và rửa lại dưới vòi nước sạch để loại bỏ hoàn toàn xà phòng.
Để tiến hành khử trùng mẫu quả, đầu tiên, cần rửa mẫu bằng nước cất vô trùng từ 2 đến 3 lần Sau đó, quả lan sẽ được khử trùng bằng cồn 70% trong vòng 1 phút, tiếp theo là đổ cồn ra khỏi bình và tráng lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần Tiếp theo, mẫu sẽ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian khác nhau Cuối cùng, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng từ 3 đến 4 lần để thu được mẫu đã khử trùng.
Chuẩn bị panh kéo, đĩa và dao đã được khử trùng ở 118 độ C trong 20 phút, sau đó tiến hành khử trùng thêm 2-3 lần bằng cồn 96 độ C và để nguội Tiếp theo, cắt đầu và đuôi quả, bổ quả lan theo chiều dọc, và dùng mũi dao để lấy phôi hạt gieo vào bình chứa môi trường nuôi cấy khởi đầu, bao gồm MS + 20g/l đường + 5g/l agar + 100g/l khoai tây với pH 5,8 Gieo phôi hạt vào các bình tương đương nhau, đảm bảo số lượng không quá nhiều hoặc quá ít để thuận tiện cho khả năng tái sinh.
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng
HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch của loài HC2, HC7
Tỷ lệ mẫu sạchnảy mầm (%)
- Các chỉ tiêu thu thập:
Mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 5 bình/ lần lặp Đánh giá kết quả (sau 4 - 8 tuần nuôi cấy)
2.4.2.2 Thí nghiệm nhân nhanh thể chồi a Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi của 2 loài HC 2 và HC 7
Thể chồi in vitro sẽ phát triển nhanh chóng trong môi trường tối ưu và hình thành thể chồi Những thể chồi này được sử dụng để thực hiện thí nghiệm nghiên cứu tác động của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh của hai loài lan HC2 và HC7.
Thí nghiệm được thực hiện với nhiều công thức khác nhau, mỗi công thức được lặp lại 3 lần Môi trường MS được bổ sung 100g/l khoai tây, 20g/l và 5g/l agar, cùng với các chất điều hòa sinh trưởng (NAA, BAP, Kinetin) với hàm lượng khác nhau như trình bày trong các bảng dưới đây.
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi loài HC2
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi dòng HC7
Chất điều hòa sinh trưởng(mg/l) Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi
Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp, mỗi lần lặp gồm 3 bình Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy và theo dõi, nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi.
Từ công thức nhân nhanh thể chồi lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau
(AS1) Đèn huỳnh quang: ánh sáng trắng
(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ
(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng Kết quả theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy được ghi lại ở bảng sau:
Bảng 2.4: Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi lan của 2 loài Cattleya HC2 và HC7 Ánh sáng Tỷ lệ mẫu tạo thể chồi (%)
Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi AS1
2.4.2.3 Thí nghiệm nhân nhanh chồi a Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi của
2 loài lan HC 2 và HC 7
Chồi invitro sẽ phát triển nhanh chóng trong môi trường thích hợp với điều kiện ánh sáng phù hợp, tạo ra chồi lan Những chồi này sau đó được cấy vào môi trường ra rễ, bao gồm các thành phần như MS, 20g/l sucrose, 100g/l khoai tây, 5,0g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng như đã nêu trong bảng 2.5.
Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi lan của loài HC 2
Chất ĐHST (mg/l ) Hệ số nhân nhanh chồi (lần) Đặc điểm chồi NAA BAP Kinetin
Bảng 2.6: Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi lan của loài HC 7
Chất ĐHST (mg/l ) Hệ số nhân nhanh chồi (lần) Đặc điểm chồi NAA BAP Kinetin
Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp, mỗi lần lặp gồm 3 bình Kết quả sẽ được đánh giá sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi Bài viết nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi của hai loài Cattleya.
Từ công thức nhân nhanh chồi lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau
(AS1) Đèn huỳnh quang: ánh sáng trắng
(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ
(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng Kết quả theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy được ghi lại ở bảng sau:
Bảng 2.7: Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi lan của 2 loài Cattleya HC 2 và HC 7 Ánh sáng Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
2.4.2.4 Thí nghiệm ra rễ tạo cây hoàn chỉnh a Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của 2 loài HC 2 và HC 7
Chồi lan Cattleya đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng trong thí nghiệm nhằm nghiên cứu tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Chồi lan được cấy vào môi trường MS có bổ sung 100g/l khoai tây + 20g/l đường + 5g/l agar + chất ĐHST với nồng độ khác nhau như bảng 2.8
Bảng 2.8: Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của loài HC 2
Số chồi cấy ban đầu
Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
Số rễ TB/cây Đặc điểm của rễ NAA IBA
Bảng 2.9: Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của loài HC 7
Số chồi cấy ban đầu
Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
Số rễ TB/ cây Đặc điểm của rễ NAA IBA
Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp, mỗi lần lặp có 30 chồi Kết quả được đánh giá sau 4-8 tuần nuôi cấy, nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ và hình thành cây hoàn chỉnh của hai loài HC 2 và HC 7.
Từ công thức ra rễ lan tốt nhất, tiến hành đưa mẫu vào nuôi trong môi trường gồm 3 ánh sáng đèn khác nhau
(AS1) Đèn huỳnh quang - sáng trắng
(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 3 sáng xanh: 7 sáng đỏ
(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: 1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng Kết quả theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy được ghi lại ở bảng sau:
Bảng 2.10: Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ của 2 loài
Cattleya HC 2 và HC 7 Ánh sáng Tỷ lệ chồi ra rễ
(%) Số rễ TB/cây Chất lượng cây con AS1
Sau 8 tuần nuôi cấy, các chồi đã phát triển đủ số rễ với chiều dài và kích thước đạt tiêu chuẩn Chúng sẽ được đưa vào huấn luyện và trồng trong giá thể gồm vỏ thông và rêu rừng.
Tỷ lệ Nguyên liệu (phần)
Tỷ lệ cây sống sót (%) Đặc điểm của cây
2.4.3 Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
Số liệu được thu thập sau khi mẫu tái sinh tạo thể chồi
Số liệu được thu thập bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo mẫu sạch:
Tỉ lệ mẫu sạch (%) = Tổng số 𝑏ì𝑛ℎ 𝑚ẫ𝑢 𝑠ạ𝑐ℎ
Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) = Số bình phôi tái sinh
Tổng số bình mẫu cấy 𝑥 100
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh thể chồi:
Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑡ℎể 𝑐ℎồ𝑖
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑡ℎể 𝑐ℎồ𝑖 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 Đặc điểm thể chồi: Kích thước và màu sắc thể chồi
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi:
Hệ số nhân chồi( lần) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑐ℎồ𝑖
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑏ì𝑛ℎ 𝑐ℎồ𝑖 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 Đặc điểm chồi: Khích thước và màu sắc chồi
Chỉ tiêu cho ra rễ cây:
Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑟𝑎 𝑟ễ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Sơ đồ hóa quy trình nhân giống in vitro loài lan cattleya
Trên cơ sở các kết quả thu được tôi đưa ra quy trình nhân giống in vitro loài lan Cattleya như sau:
Quả lan Công thức khử trùng: KT3
Nhân nhanh thể chồi của loài HC2 NNTC4: MS + 0,5 mg/l
BAP + 0,3 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Nhân nhanh thể chồi của loài HC7 NNTC T3 : MS + 0,5 mg/l
BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Nhân nhanh chồi của loài HC2 là NNC4: MS + 0,7 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Nhân nhanh chồi của loài HC7 là NNC T3: MS + 0,6 mg/l
BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,4 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Ra rễ của loài HC2 là R3: MS + 0,3 mg/l NAA+ 0,1mg/l IBA + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Ra rễ của loài HC7 là RT4: MS + 0,3 mg/l NAA + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Giá thể (Vỏ thông: rêu rừng = 1: 2)
Kết luận
Dựa trên kết quả từ các thí nghiệm trong khóa luận tốt nghiệp về "Nghiên cứu nhân giống 2 loài lan Cattleya bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro", tôi rút ra những kết luận quan trọng về hiệu quả của phương pháp này trong việc nhân giống loài lan.
- Công thức khử trùng mẫu đạt tỷ lệ tái sinh cao nhất củaCattleya HC2 là
KT3: cồn 70 o trong 1 phút và HgCl2 0,1% trong 7 phút đạt tỷ lệ mẫu sạch 80,00 % và tỷ lệ mẫu tái sinh là 75,3%
- Công thức khử tùng mẫu đạt tỷ lệ tái sinh cao nhất của Cattleya HC7 là
KT3: cồn 70 o trong 1 phút và HgCl2 0,1% trong 7 phút đạt tỷ lệ mẫu sạch 83,3% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 77,78%
- Công thức môi trường thích hợp để nhân nhanh thể chồi của loài HC2 là
NNTC4: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20g/l sucrose + 5g/l agar cho chồi mập mạp, xanh đậm, hệ số nhân đạt 5,8 lần
- Công thức môi trường thích hợp để nhân nhanh thể chồi của loài HC7 là
NNTC T3 : MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar cho thể chồi mập mạp, xanh đậm, hệ số nhân đạt 4,56 lần
- Công thức môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi của loài HC2là NNC4:
MS + 0,7mg/l BAP + 0,2mg/l NAA + 0,3mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20g/l sucrose + 5 g/l agar, hệ số nhân đạt 4,83 lần
- Công thức môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi của loài HC7 là NNC
T3: MS + 0,6mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,4mg/l Kinetin + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar, hệ số nhân đạt 4,6 lần
Môi trường ánh sáng đèn LED tổ hợp với 3 sáng xanh và 7 sáng đỏ giúp lan Cattleya nhân nhanh thể chồi hiệu quả, đạt tỷ lệ nhân nhanh thể chồi của HC2 là 88,33% Mặc dù tỷ lệ nhân nhanh thể chồi của HC7 ở AS2 chỉ đạt 73,33%, nhưng hệ số nhân nhanh thể chồi lại cao hơn 4,56 lần Tỷ lệ nhân nhanh chồi của hai loài Cattleya nuôi dưới AS2 lần lượt là 93,33% và 88,33%.
- Công thức môi trường thích hợp để ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của loài HC2 là R3: MS + 0,3mg/l NAA+ 0,1mg/l IBA + 100 g/l khoai tây + 20g/l sucrose
- Công thức môi trường thích hợp để ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của loài HC7 là RT4: MS + 0,3 mg/l NAA + 100 g/l khoai tây + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar
Môi trường ánh sáng tối ưu cho cây Cattleya là sự kết hợp giữa ánh sáng đèn LED với tỷ lệ 1 sáng xanh, 5 sáng đỏ và 1 sáng trắng, giúp cây ra rễ hiệu quả nhất Số lượng rễ trung bình trên cây đạt từ 8,06 đến 5,23.
- Giá thể thích hợp cho 2 loài lan Cattleya HC2 và HC7 là vỏ thông: rêu rừng ứng với tỷ lệ là 1:2.
Kiến nghị
Nghiên cứu thêm giá thể trồng cây lan Cattleya con tạo ra từ nuôi cấy in vitro
Nghiên cứu chế độ chăm sóc cây lan con ở vườn ươm để đánh giá chất lượng cây nuôi cấy in vitro.