NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Cây Ngải đen giống được trồng tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng,tầng 6, số 70 Trần Hưng Đạo, Hoàn Kiếm, Hà Nội.
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng
- Khoa Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng mẫu và kích thước mẫu nuôi cấy invitro của cây Ngải đen
Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của vật liệu vào mẫu đến khả năng tái sinh chồi mầm của Ngải đen
Trong nghiên cứu nhân in vitro cây Ngải đen, các cơ quan được sử dụng làm vật liệu khởi đầu bao gồm mầm củ già, mầm củ bánh tẻ và đoạn thân có chồi mới hình thành Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo cách cụ thể để đạt được kết quả tối ưu.
CT1: Mầm củ bánh tẻ
CT3: Đoạn thân chứa chồi mới hình thành
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu PSHT; Tỷ lệ tạo chồi; Tỷ lệ mẫu Protocorm; Chất lượng chồi
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng
Chồi cây Ngải đen sau 10 ngày nuôi cấy được sử dụng để làm vật liệu nghiên cứu Bố trí thí nghiệm:
CT1 : Nước cất khử trùng (Đối chứng)
Mỗi công thức được bố trí bởi 45 mẫu Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu chết (%); Tỷ lệ mẫu sạch (%); Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%
Với nguồn mẫu và các chỉ tiêu theo dõi tương tự thí nghiệm 2, thí nghiệm
3 được bố trí như sau:
3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (tạo chồi) đến khả năng nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 4 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Ngải đen.
Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với ba công thức khác nhau, mỗi công thức được lặp lại ba lần Mỗi lần lặp lại, 10 bình được cấy, trong đó mỗi bình chứa một chồi Các công thức thí nghiệm bao gồm bổ sung Inositol 100mg/l, đường 30g/l và agar 6g/l, với pH điều chỉnh từ 5,6 đến 5,8.
Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Ngải đen.
Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từ đoạn thân.
Để đảm bảo sự phát triển của chồi, cần sử dụng những chồi sạch bệnh, có chiều dài từ 0,5-1cm Trước khi đưa chồi vào môi trường đã chuẩn bị, hãy khử trùng pank bằng lửa đèn cồn và để nguội.
Cấy chồi lên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều và sau khi hoàn tất quá trình cấy, chuyển vào phòng nuôi Tiếp theo, tiến hành theo dõi số lượng và chất lượng chồi thông qua quan sát bằng mắt thường.
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, mỗi công thức được thực hiện 3 lần Mỗi lần thí nghiệm sử dụng 10 bình, và mỗi bình cấy 1 chồi.
Công thức Nồng độ BA (mg/l)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
Nồng độ BA thích hợp cho nhân nhanh chồi Ngải đen xác định ở thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 6 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Ngải đen
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần, trong đó mỗi lần cấy 10 bình và mỗi bình chứa 1 chồi Kinetin được bổ sung vào môi trường nền, cùng với nồng độ BA thích hợp cho việc nhân nhanh chồi Ngải đen, được xác định trong thí nghiệm 5 với các nồng độ cụ thể.
Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.3 Nghiên cứu xác định môi trường ra rễ tối ưu cho chồi Ngải đen invitro
Chọn chồi Ngải đen với 2-3 lá để chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường này được xây dựng dựa trên môi trường MS, kết hợp với các nồng độ NAA và IAA khác nhau nhằm kích thích sự hình thành rễ bất định và phát triển cây con hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 7 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi của Ngải đen (sau 30 ngày nuôi cấy)
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, mỗi công thức được lặp lại 3 lần Mỗi lần lặp lại sẽ cấy 10 bình, và mỗi bình sẽ chứa 1 chồi.
Công thức Nồng độ NAA (mg/l)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Số rễ/cây, chất lượng rễ.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitam1in) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
Nồng độ NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi của Ngải đen xác định ở thí nghiệm 7 (ký hiệu B) được sử dụng cho thí nghiệm sau.
3.4 Phương pháp theo dõi, các chỉ tiêu đánh giá và xử lý số liệu
- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):
(%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống):
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100%
Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi)
Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật:
+ Chồi tốt: Chồi khoẻ, xanh.
+ Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt
+ Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt.
- Số rễ trung bình/cây:
Số rễ trung bình/cây (rễ) Tổng số rễ ra (rễ)
Tổng số mẫu cấy (mẫu) Chất lượng rễ:
+ Rễ tốt : Rễ khoẻ, dài.
+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn
+ Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn.
Tỷ lệ cây sống (%) Tổng số cây sống (cây)
Tổng số cây ban đầu (cây)
Tỷ lệ cây chết (%) Tổng số cây chết (cây)
Tổng số cây ban đầu (cây)
- Chất lượng cây con : tình trạng, màu sắc.
- Xử lý số liệu: Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel 2003 và phần mềm IRRISTAT 5.0.