Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung dịch NANO đồng bạc CHITOSAN SALICYLIC ACID và đèn LED lên sự tăng trưởng của lan giả hạc DENROBIUM ANOSMUM LINDL

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc Demrobium anosmum Lindl.. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của Nano Chitosan đến s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP, HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG DỊCH NANO ( ĐỒNG, BẠC, CHITOSAN), SALICYLIC ACID VÀ ĐÈN LED LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA

LAN GIẢ HẠC (DENROBIUM ANOSMUM LINDL.)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên

trường Đại học Công Nghệ TP.HCM Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý

thuyết, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ

TP.HCM Các số liệu, bảng, biểu đồ sử dụng phân tích trong đồ án là hoàn toàn trung thực

Đồ án không sao chép dưới bất kì hình thức nào, nếu phát hiện có bất kỳ gian

lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2020

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ MỸ HẠNH

LỜI CẢM ƠN

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp HCM đã tạo

điều kiện cho em được học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu của mình tại Viện

Khoa Học Ứng Dụng ngành Công Nghệ Sinh Học Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS Trịnh Thị Lan Anh Cô đã

trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy và đóng góp ý tưởng trong quá trình em thực hiện đồ án

này Cô không chỉ giảng dạy kiến thức, mà còn truyền cảm hứng, khích lệ, động viên em cũng như khơi dậy đam mê được làm nghiên cứu khoa học Qua đó tạo

động lực cho em theo đuổi đến cùng và không ngừng học hỏi, tìm hiểu thêm kiến

thức mới bổ ích Em thực sự biết ơn Cô đã giúp đỡ và luôn hỗ trợ em vượt qua khó

khăn trong quá trình thực hiện đề tài để có được kết quả thành công như hôm nay

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các Anh Chị nhân viên phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ TP HCM

đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

và thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2020

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ MỸ HẠNH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ x

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích đề tài 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 4

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn đề tài 4

5.1 Ý nghĩa khoa học 4

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

6 Kết cấu của đồ án 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? 6

1.1.2 Nhân giống in vitro 8

1.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên Thế giới và Việt Nam 9

1.2.1 Tình hình trên Thế giới 9

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam 10

1.3 Các thành phần nuôi cấy mô 12

1,3,1, Khoáng đa lượng 12

1.3.2 Khoáng vi lượng 13

1.3.3 Vitamin 13

1.3.4 Các hợp chất hữu cơ bổ sung 13

1.3.5 Nguồn C và nguồn năng lượng 15

1.3.6 Các chất điều hòa sinh trưởng 16

1.4 Vai trò của ánh sáng đến sự sinh trưởng và phát triển ở thực vật 18

1.5.Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong nuôi cấy in vitro 22

1.5.1 Thành phần và thể tích môi trường 22

1.6 Giới thiệu về dung dịch nano 23

1.6.1 Nano đồng 23

1.6.2 Nano bạc 24

1.6.3 Nano chitosan 26

1.7 Giới thiệu về lan Giả Hạc Dendrobium anosmum 27

1.7.1 Giới thiệu về Lan Dendrobium 27

1.7.2 Giới thiệu về lan Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl, 28

1.6.3.1 Nhiệt độ 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 31

2.1.1 Địa điểm 31

2.1.2 Thời gian tiến hành đề tài 31

2.2 Vật liệu và phương pháp 31

2.2.1 Nguồn mẫu 31

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 31

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 32

2.3.1 Thiết bị 32

2.3.2 Dụng cụ 32

2.3.3 Hóa chất 32

2.4 Điều kiện nuôi cấy 32

2.5 Bố trí thí nghiệm 33

2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của SA đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Demrobium anosmum Lindl ) 33

2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nano đồng đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc(Dendrobium anosmum Lind.,) 34

2.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng và tạo

cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc ( Demrobium anosmum Lindl ) 36

2.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của Nano Chitosan đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Demrobium anosmum Lindl.) 37

2.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc ( Demrobium anosmum Lindl.) 37

2.5.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ LED kết hợp (led xanh dương- đỏ) đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Demrobium anosmum Lindl ) 39

2.6 Chỉ tiêu theo dõi 41

2.7 Thống kê và xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của SA đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl,) 43

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của Nano đồng đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) 50

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.), 59

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Nano chitosan đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) 68

3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) 76

3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của đèn led kết hợp đến sự tăng trưởngvà tạo cây hoàn chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) 83

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91

4.1 Kết luận 91

4,2, Kiến nghị 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lan Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl, 28

Hình 2.1 Mô hình LED đơn sắc để nuôi cấy Lan Giả Hạc 38

Hình 2,2, Mô hình tỷ lệ LED kết hợp để nuôi cấy Lan Giả Hạc, 40

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ SA đến sự tăng trưởng của Lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl, sau 16 tuần nuôi cấy 44

Hình 3.2.Ảnh hưởng của nồng độ SA đến sự tăng trưởng của Lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl, sau 16 tuần nuôi cấy 45 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ SA đến sự tăng trưởng của Lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl, sau 16 tuần nuôi cấy 46

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ Nano chitosan đến sự tăng trưởng của Lan Giả

Hạc Dendrobium anosmum Lindl sau 10 tuần nuôi cấy 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của SA đến sự tăng trưởng, tạo cây hoàn chỉnh Lan GIả Hạc 34 Bảng 2,2, Khảo sát ảnh hưởng của nano đồng đến sự tăng trưởng, tạo cây hoàn chỉnh Lan Giả Hạc 35 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng, tạo cây hoàn chỉnh Lan Giả Hạc 36 Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng, tạo cây hoàn chỉnh Lan Giả Hạc 37 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn sáng LED đơn sắc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh Lan Giả Hạc 38 Bảng 2.6 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ LED kết hợp đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh Lan Giả Hạc 40 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của salicylic acid đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl, 47 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của Nano đồng đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl 51 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl 60 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của Nano chitosan đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl, 69 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Lindl, 79 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của đèn LED kết hợp đến sự tăng trưởng của lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Lindl, 87

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

,

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của SA đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc Dendrobium

anosmum Lindl 48 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của Nano đồng đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl 57 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của Nano bạc đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Lindl 66 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nano chitosan đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc

Dendrobium anosmum Lindl 74 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Lindl 80 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của đèn LED kết hợp đến các chỉ tiêu của lan Giả Hạc Dendrobium anosmum Lindl 88

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong thế giới hoa, lan là một trong những loài hoa đẹp nhất Hoa lan được coi

là loài hoa tinh khiết, vương giả cao sang vua của các loài hoa Hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hình dáng, cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa tao nhã đến những hình dạng thân lá, cành duyên dáng ít có loài hoa nào sánh nổi

Ở Việt Nam có đến 100 loài thuộc chi Dendrobium xếp trong 14 tông phân biệt nhau phức tạp bằng than (củ giả), lá, hoa, Đặc điểm của loài này là hoa thường mọc dọc theo các đốt ở hai phần ba thân phía ngọn Tùy vùng miền xuất xứ mà hình dáng hoa khác nhau, độ đậm nhạt khác nhau, độ bay của cánh, hình dáng môi hoa, phân bố màu sắc khác nhau Lan Giả Hạc không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị

về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp cắt cành cũng như cây cảnh trên thế giới Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường là tạo được số lượng hoa lớn, nguồn hoa mới ổn định thì

việc nghiên cứu nhân chồi tạo ra số lượng lớn cây con hoàn chỉnh của lan Giả Hạc

trong một thời gian ngắn, làm nguồn mẫu cho nghiên cứu cũng như trong thực tiễn, góp phần nhân nhanh giống lan Giả Hạc

Ở Việt Nam, kể từ năm 2013 đến nay, lan giả hạc làm mưa làm với giá dao động khá phổ biến từ 600,000 – 1,200,000 đồng một ký Đến năm 2017, chúng ta

dễ dàng nhận thấy sự lên ngôi của lan giả hạc khi mà mức giá giữa lan Trầm tím rừng

và lan Giả Hạc khá tương đương nhau và ở vào khoảng 1,000,000 – 1,200,000 đồng một ký và liên tục tăng giá

Do sự quý hiếm, vẻ đẹp độc đáo, mùi thơm dễ chịu mà giống lan rừng như Giả Hạc luôn được ưa chuộng dù có giá đắt đỏ Do đó, nguồn lan rừng ngày càng khan hiếm, những khóm lan rừng ngoài tự nhiên còn rất ít do sự khai thác cạn kiệt của người dân Thực tế, sản xuất những loài lan trên ở Việt Nam còn gặp nhiều khó

khăn Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của loài lan này

như ánh sáng, dinh dưỡng,… Việc sản xuất chưa mang lại hiệu quả cao, số lượng và chất lượng hoa lan chưa đáp ứng được thị hiếu người tiêu dùng, trong khi nhu cầu sử dụng loài lan này là rất cao Cần có những phương pháp nhân giống phù hợp đạt hiệu quả cao để giảm thiểu việc khai thác lan rừng Một trong những biện pháp hữu

hiệu để bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này là cần phải tiến hành nhân giống

bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Ngày nay, với công nghệ nhân giống in vitro, người ta có thể tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục

lại phẩm chất vốn có của thực vật Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân

giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng và chất lượng cây giống, đáp ứng như cầu sản xuất trên quy mô rộng

Nhận thấy được giá trị mà giống lan này đem lại, cần phải nhân nhanh giống

lan trong môi trương dinh dưỡng thích hợp để thúc đẩy nhanh quá trình sinh trưởng

và phát triển của cây Do đó, phải nghiên cứu các chất cần bổ sung vào môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy in vitro mang lại hiệu quả tối ưu

Nhu cầu dinh dưỡng giúp cây phát triển tươi tốt, ra nhiều hoa, hoa to đẹp, bền trong khi thiếu dinh dưỡng lan còi cọc, kém phát triển, không hoặc ít có hoa Trong nuôi cấy in vitro, thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự phát sinh hình thái của cây Tùy thuộc vào nhu cầu sản xuất và

nghiên cứu mà lựa chọn môi trường thích hợp để cây phát triển như mong muốn

Gần đây, nano được coi là công nghệ vượt trội để tạo ra các vật liệu nano ứng dụng nhiều trong nông nghiêp, thực phẩm, y học … Điển hình như nano chitosan

đã được ghi nhận là chất kích thích sinh trưởng ở một số loài thực vật, trong đó có cây lan Hiệu quả của nano chitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của lan

Dendrobium dưới dạng phun lên cây trồng bên ngoài cũng như bổ sung vào môi

trường nuôi cấy in vitro đã được báo cáo (Chandrkrachang, 2002; Limpanavech et

al, 2003, Nge et al,, 2006) Ngoài ra, việc bổ sung các dung dịch nano khác như

bạc, đồng và Salicyllic acid vào môi trường nuôi cấy cũng góp phần giúp lan khỏe mạnh và tăng trưởng tốt hơn so với môi trường thông thường Tuy nhiên, vẫn chưa

có báo cáo nhiều về ảnh hưởng của các chất này trên cây lan Giả Hạc (Dendrobium

anosmum Lindl,) này

Hiện nay, với công nghệ nhân giống in vitro, hệ số nhân giống lan là rất lớn

nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ ánh

sáng đèn LED, salicylic acid và các dung dịch nano như: nano chitosan, nano bạc,nano đồng đến quá trình nhân giống lan Giả Hạc Do đó, nhằm tạo điều kiện cho cây hoa lan Giả Hạc phát triển có hiệu quả, đề tài được tiến hành: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung dịch nano (nano đồng, nano bạc, nano chitosan), salicylic acid và đèn LED lên sự tăng trưởng của lan Giả hạc (Denrobium anosmum Lindl.)”

2 Mục đích đề tài

Nghiên cứu này nhằm tìm ra nồng độ salicylic acid và dung dịch nano tốt

nhất sau đó thực hiện khảo sát ánh sáng đèn LED đơn sắc, LED kết hợp với các tỷ lệ khác nhau giúp tăng chất lượng cây con, giúp bộ rễ khỏe dễ thích nghi khi chuyển cây ra vườn ươm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của SA đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan

Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Khảo sát ảnh hưởng của nano đồng đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh

của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của

lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Khảo sát ảnh hưởng của nano chitosan đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh

của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Khảo sát ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn

chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ đèn LED kết hợp đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn

chỉnh của lan Giả Hạc (Dendrobium anosmum Lindl.)

4 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên, đơn yếu tố Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình Các số liệu sau khi thu thập được xử

lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.4®

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài lên sự hình thành chồi, rễ cũng như sự tăng

trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ cây con lan Giả Hạc giúp tìm ra được tỷ lệ nguồn

ánh sáng phù hợp, bổ sung dinh dưỡng thích hợp trong thời gian ngắn, đạt hiệu quả nhân giống cao Từ đó, góp phần phục vụ cho những ứng dụng thực tế quan trọng, nâng cao chất lượng cây trồng, giúp mang lại hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm chi phí đầu tư, giải quyết được tình trạng khan hiếm cây giống lan Giả Hạc

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu quá trình nhân chồi, rễ cũng như sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ cây con lan Giả Hạc sẽ góp phần rất lớn trong công tác nhân nhanh giống cây trồng, tiết kiệm chi phí trong việc đầu tư cũng như rút ngắn được thời gian nhân

giống, đồng thời mở ra triển vọng trong việc tạo được cho cây hoa lan Giả Hạc có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây giống, góp phần giải quyết vấn đề thiếu hụt trầm trọng cây giống lan Giả Hạc chất lượng cao ở Việt Nam trong giai đoạn hiện nay

6 Kết cấu của đồ án

Đồ án gồm những chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì?

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính

hay nói cách khác nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử

dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô

trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định,

(Trần Văn Minh, 1997) Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý

nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống

vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực

vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống

vô tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ

số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân

giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và

thành phần hóa học (Phí Thị Cẩm Miện, 2012) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối

với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng

các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất

Ví dụ: Đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân

ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất, Theo Nilov (1936), cây

Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến

11,3%, hàm lượng lynalylacetate từ 11 đến 78%; cây Bạc hà nhân giống hữu tính có

sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được

áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính,

Ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền

do duy trì được các tính trạng của cây mẹ nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho

sản phẩm có chất lượng ổn định, rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài,… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7, bạc hà piperita là 2

– 3,… Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền

thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như

ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu

điểm nổi trội như:

Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2 tỷ củ đồng nhất về di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100,000 lần

so với sinh sản hữu tính (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: các cây con được tạo ra giống hệt với

cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế

Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virut Limasset và Cornuet (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952) Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử

lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1957)

Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch Việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500,000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất in vitro liên

tục Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội Bảo quản và lưu giữ được tập

đoàn gen

Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số

nhược điểm như:

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực

vật

Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị

soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus)

Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng

là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất

cả các thực vật

1.1.2 Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo

giống

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại

cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép

trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch

nuôi cấy protoplast khắc phục hiện tượng lai xa, chuyển gen thực vật,…) đặc biệt ứng dụng nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn cũng như chọn dòng có năng suất về

hợp chất thứ cấp đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối thực vật

(sinh khối là dạng vật liệu sinh học từ sự sống, hay gần đây là sinh vật sống, đa số là các cây trồng hay vật liệu có nguồn gốc từ thực vật)

1.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên Thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình trên Thế giới

Hiện nay tình hình sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh

mẽ và đã trở thành một ngành thương mại có lợi cho nền kinh tế các nước trồng và

xuất khẩu hoa Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày được mở rộng và không ngừng tăng lên, nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về lan

đã được tổ chức Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng, ngày nay việc trồng lan dần theo quy mô công nghiệp, việc xuất khẩu lan đã đạt tới số lượng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường

Loddiges (1812), là người đầu tiên trên thế giới thiết lập vườn lan thương mại, trong những thập kỷ gần đây cùng với phương tiện giao thông phát triển mạnh

mẽ, các thành tựu khoa học kỹ thuật và sự phát triển về công nghệ sinh học được áp dụng rộng rãi Do đó việc xuất khẩu hoa lan ngày càng tăng với qui mô lớn, nhiều nước đã trở thành cường quốc xuất khẩu hoa lan như Thái Lan, Đài Loan,… (Lê Đặng Trung Tuyến, 2007)

Hiện nay, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan đạt 110 triệu USD trong năm 2003 Ngoài ra, chỉ tính riêng 6 tháng đầu năm 2007, Thái Lan

đã thu được hơn 30 triệu USD từ phong lan Năm 2009, trị giá lan xuất khẩu Thái Lan là 79,8 triệu USD Hoa lan Thái xuất khẩu phần lớn thuộc nhóm lan

Dendrobium, hơn 80% lượng hoa thuộc nhóm này trên thị trường thế giới có xuất xứ

từ Thái Lan, Dendrobium chiếm đến 94,73 % tổng số hoa lan cắt cành và 51,4% tổng số cây lan xuất khẩu của Thái Lan

Ở Mỹ, nhu cầu sử dụng hoa lan Cattleya và Dendrobium rất lớn Năm 2007 tổng giá trị nhập khẩu hoa lan gần 144 triệu USD, tăng gần 12% so với năm 2006 và đứng thứ hai so với những cây hoa khác

Có thể nói rằng sản xuất lan đã đem lại lợi nhuận rất cao cho các nước đang

phát triển và phát triển Bên cạnh đó, hoa lan Cattleya, Dendrobium, Oncidium chiếm phần lớn trong tổng số lượng sản xuất và tiêu thụ hoa lan trên thế giới Điều

đó chứng tỏ các loài hoa này mang lại hiệu quả kinh tế cao và được người tiêu dùng

ưa chuộng

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm rất thuận lợi cho việc trồng hoa, cây cảnh Tuy nhiên, chưa được đầu tư thích đáng

nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát

triển, sản xuất lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh có khí hậu ấm áp quanh năm là trung tâm văn hóa kinh tế, chính trị, khoa học kỹ thuật của miền Nam

có một tiềm năng lớn về nuôi trồng và kinh doanh hoa lan

Từ năm 1980, Việt Nam đã xuất khẩu lan sang Liên Xô, Tiệp Khắc, Năm

1987 ở thành phố Hồ Chí Minh đã có các vườn lan quốc doanh và tư nhân cùng với

sự ra đời của nhiều hội lan, cây cảnh và có nhiều cơ sở nghiên cứu ra đời Theo số

liệu điều tra bước đầu tính đến năm 1986 thành phố Hồ Chí Minh có khoảng 15 gia đình có vườn lan với số lượng 1000 – 7000 chậu và đến năm 1987 ở thành phố Hồ

Chí Minh đã có vườn quốc doanh tư nhân: vườn lan T78, vườn lan Hàng Không dân dụng, từ năm 1980, năm nào thành phố cũng tổ chức Hội Hoa Xuân, Hội Hoa Xuân

là nơi hội tụ những tác phẩm đặc sắc và độc đáo nhất của các vườn lan Mới đây

thành phố Hồ Chí Minh dự kiến, giai đoạn 2005 – 2006 thực hiện đầu tư 20ha nuôi

trồng hoa lan và 20ha trồng cây kiểng (Dự án đầu tư, cây và cá kiểng tại thành phố

Hồ Chí Minh, T7/2005) Đến năm 2008, diện tích trồng lan của thành phố đã tăng lên gần 80 ha và năm 2010 là 200 ha

Ở Hà Nội, mười năm gần đây, khi đời sống người dân thủ đô nâng cao, nhu cầu thưởng thức hoa lan tăng, nhiều khi cung không đủ cầu và phong trào nuôi trồng lan tự phát lan rộng cả đến các vùng phụ cận khiến các nhà khoa học phải vào cuộc,

đi sâu nghiên cứu và sản xuất, kinh doanh hoa lan

Tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

đã cho ra đời hàng vạn cây giống hoa lan có giá trị kinh tế như: Hồ Điệp

(Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), lan Thái (Dendrobium),… Ngoài ra viện còn làm

cố vấn kỹ thuật, chuyển giao qui trình nuôi trồng một số giống lan có hiệu quả kinh

tế ở các tỉnh như Hải Phòng, Bắc Giang, Lạng Sơn,… và tại Trung tâm Kỹ thuật Rau – Hoa – Quả Hà Nội, 2 năm trở lại đây, phòng nuôi cấy mô hoạt động cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây lan Hồ Điệp giống và hàng vạn cây giống khác, đặc biệt đã thành công trong việc nhân giống lan Hài, lan Kiếm (Hoàng Vũ, Bạch Ngọc)

Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, hiện nay tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận như Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Dương, có trên 100

loài lan khác nhau Các loại hoa lan này có thể cho doanh thu từ 500 triệu – 1 tỷ

đồng/ha/năm, chủ yếu là hoa cắt cành thuộc nhóm Dendrobium và Mokara, chiếm tỷ

lệ ít hơn là lan Cattleya và Oncidium

Ngành sản xuất hoa lan ở các tỉnh, thành phố phía Nam phát triển mạnh hơn miền Bắc Nói chung vấn đề sản xuất – kinh doanh – xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam

từ trước đến nay vẫn còn ở mức tiềm tàng, trong khi đó sức cạnh tranh thị trường trên thế giới là rất lớn, những hoạt động, kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ có ý nghĩa khởi động và hứa hẹn sự phát triển trong tương lai

1.3 Các thành phần nuôi cấy mô

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một

số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn carbon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô,…

- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự

sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro Các nhà khoa học sử dụng

các môi trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về

thành phần môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô

sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân

nhau Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào

thực vật

các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần

vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vtrro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng

Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol

1.3.4 Các hợp chất hữu cơ bổ sung

Các chất thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao gồm các amino

acid, than hoạt tính, nước dừa, chuối,…

Than hoạt tính

- Than hoạt tính ban đầu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô

phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật Đó là sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (Van Winkle et al,, 1995) Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như: Phytohormone, vitamin, sắt, kẽm,… (Nissen và Sutter, 1990)

- Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy

phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính Sau khử

trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan và Staden, 1999)

- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng

khử độc, hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi

trường Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có

trong môi trường, NAA, kinetine, IAA, BAP, 2-Ip liên kết với than hoạt tính Khả

năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất

phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3% (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

- Trước đây, than hoạt tính (Activated charcoal-AC) thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏn Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế

và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật Vai trò của than hoạt tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là

tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin,

làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH

môi trường Từ khi than hoạt tính được ứng dụng trong nuôi cấy mô, các nhà khoa

học chủ yếu tập trung nghiên cứu và công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải

tiến môi trường nuôi cấy, tăng cường khả năng tái sinh cây, phát sinh phôi, tăng sinh

tế bào trần, ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và phát triển chồi, thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ Ngoài

ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật

- Như vậy, than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al,, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001),…

Nước dừa

- Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy, Tất

cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al,(1961) cho thấy trong nước dừa thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là: myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosid của cytokinin

- Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy Nước dừa thường

được sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất điều tiết sinh trưởng tổng

hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru, 1980) Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10 – 20%

- Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996)

- Nước dừa đã được sử dụng kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều

1.3.5 Nguồn C và nguồn năng lượng

Nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà

chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường

thường gặp trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose Các nguồn carbohydrate khác cũng được thử nghiệm nhưng hiệu quả kém hơn glucose và sucrose

1.3.6 Các chất điều hòa sinh trưởng

Nhóm auxin

Auxin (AIA-acid indol-3-acetic), các chất có cấu trúc tương tự hay dẫn xuất, tiền chất của AIA cũng đều được gọi là auxin Auxin đươc tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, Auxin vận chuyển hướng tích cực từ đỉnh chồi ngọn tới các cơ quan khác

Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung các auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA, 2,4-D, NOA

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng

để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin Sự áp dụng

loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

 Gây ra tính hướng động, ưu thế ngọn

 Thúc đẩy sự tăng trưởng và giãn nỡ của tế bào

 Tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất

 IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn

 Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ

trong nuôi cấy mô

 Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự

phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

 Tạo và nhân nhanh mô sẹo, tạo phôi soma (2,4-D)

 Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)

 Tạo phôi soma (2,4-D)

Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng

Nhóm các cytokinin

Có mặt trong tất cả các loại cây trồng hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể hướng ngọn hoặc hướng gốc Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: BAP, BA, 2-ip, kinetin, zeatin,…

Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo, Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v,v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ

mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các

hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi, để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi

và chồi nách

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

1.4 Vai trò của ánh sáng đến sự sinh trưởng và phát triển ở thực vật

Trong nhân giống in vitro, ánh sáng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây thông qua cường độ, quang kỳ và bước sóng của ánh sáng Theo Debergh và đồng tác giả (1992) cường độ chiếu sáng,

ngoài việc có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh

hình thái, còn ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và hiện tượng mọng nước (hiện tượng thủy tinh thể) của cây con in vitro Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng đến một

số đặc tính hình thái như sự kéo dài cây cúc và cây cà chua (Mortensen, Stromme, 1987), hình thái giải phẫu lá và kích thước lá ở cây phong (Soebo et al, 1995) và sự phát sinh rễ giả ở cây lê (Bertazza et al,, 1995)

Nhiều hệ thống chiếu sáng nhân tạo khác nhau đã được ứng dụng trong nghiên

cứu nông nghiệp, đèn huỳnh quang được sử dụng rộng rãi nhất làm nguồn sáng trong vi nhân giống

Để chế tạo đèn LED ( light emitting diode) cho cây trồng người ta thường sử dụng 2 chùm sáng là chùm màu đỏ (Red) và màu xanh (Blue) bởi 2 chùm sáng này

có vùng bước sóng tương ứng là 610-720nm và 400-520nm Khi đó quang phổ đèn LED sẽ gần trùng với quang phổ hấp phụ của chlorophyll a và chlorophyll b nên các

loài thực vật sẽ hấp thụ được tối đa năng lượng từ ánh sáng đèn LED, trong khi hiệu

suất sử dụng đối với năng lượng mặt trời và các nguồn sáng trắng chỉ vào khoảng

35%

Toàn bộ hệ thống phát sáng cho cây trồng đòi hỏi đèn LED phải phát ra cường

độ photon cao trong vùng ánh sáng đỏ và xanh đặc biệt Trước đây, đèn LED xanh

chỉ phát ra được cường độ photon thấp và có giá thành cao (Bula et al, 1991) Hiện tại công ty hóa chất Nichia (Nhật Bản) đã sản xuất và lần đầu tiên trên thế giới tạo ra ánh sáng xanh có cường độ chiếu sáng lớn, Sáng chế này đã mở đường cho sự phát triển cho toàn bộ hệ thống phát sáng LED

Đèn LED xanh siêu sáng mới có khả năng đánh giá hiệu quả của toàn bộ hệ thống đèn LED (bao gồm cả LED xanh và đỏ siêu sáng) lên sự tăng trưởng cây con

in vitro Hệ thống mới này khác hẳn với các hệ thống sử dụng đèn LED có bổ sung

ánh sáng xanh từ các nguồn sáng khác đã được công bố trước đây (Bula et al, 1991; Hoenecke et al,, 1992) Hahn và cộng sự (2000) đã báo cáo rằng tốc độ quang hợp của cây Rehmannia glutinose nuôi cấy in vitro là rất thấp dưới hệ thống LED xanh hoặc LED đỏ, trong khi đó, dưới hệ thống LED hỗn hợp (50% LED đỏ và 50% LED xanh) hoặc dưới đèn huỳnh quang có tốc độ quang hợp rất cao, Cường độ photon cao của LED xanh, đỏ và độ dài bước sóng đặc trưng của chúng làm cho hệ thống đèn mới này mang lại nhiều thuận lợi

LED đỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do sự phát photon

cao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn với LED có màu khác, Sự kết hợp giữa

các đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho quá trình

quang hợp,

Sử dụng hệ thống phát sáng bằng điện cực LED làm nguồn sáng cho cây là

một ý tượng đang được ứng dụng rộng rãi, Hệ thống phát sáng bằng LED có một số

ưu điểm trong nuôi cấy mô:

này cũng có nghĩa là đèn LED trồng cây không phải đi kèm với hệ thống làm

mát, thông thường được tìm thấy với đèn trồng cây truyền thống

Chi phí năng lượng thấp

Đèn LED được biết là sử dụng lượng điện ít hơn đáng kể so với các loại

đèn trồng cây khác, Đèn LED tiêu thụ năng lượng ít hơn từ 60% – 80%, làm giảm chi phí năng lượng

Tuổi thọ cao

Tuổi thọ của đèn LED có thể lên đến 5 lần so với đèn trồng cây khác, Chúng có thể vượt qua 50,000 giờ so với các sản phẩm chiếu sáng khác Chất lượng lumen của đèn LED cũng tương đối ổn định trong suốt vòng đời của nó, cung cấp chất lượng ánh sáng tương đối ổn định để sử dụng

sự hoạt hóa động lực của các phần khác nhau của LED

Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại

LED không tạo ra tia UV, tạo rất ít nhiệt, vì vậy là đối tượng phát sáng lý tưởng, Ánh sáng LED không gây chói, mỏi mắt Do tiêu hao nhiệt rất ít, LED hầu như không làm nóng môi trường xung quanh, do đó giảm nhiều nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh để tạo điều kiện cho cây sinh trưởng

Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế

Một LED đơn lẻ rất nhỏ và tạo ra ít ánh sáng toàn bộ Tuy vậy, điểm yếu này thực sự là thế mạnh của nó, Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một loạt kiện lumen mong muốn Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng, kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu trúc của hệ đèn LED Một thiết bị kiểm soát có thể được gắn

với phức hợp LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việc kiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng

Nhược điểm

Đèn LED ngoại trừ giá thành khá cao thì hầu như không có nhược điểm nào vì nó đã loại bỏ được tất cả các nhược điểm mà các loại đèn khác có chẳng

hạn như tuổi thọ cao, phát thải nhiệt thấp và chi phí năng lượng thấp

Các nghiên cứu ứng dụng của đèn LED:

Với sự phát triển công nghệ, đèn LED đã được các nhà khoa học nghiên cứu, đưa vào sử dụng trong nông nghiệp ở nhiều nước Ở Việt Nam, trong nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2012), mẫu lá cúc được nuôi cấy trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh dương, 50% LED

đỏ + 50% LED xanh dương, 70% LED đỏ + 30% LED xanh dương, 80% LED đỏ + 20% LED xanh dương, 90% LED đỏ + 10% LED xanh dương và ánh sáng đèn huỳnh quang (neon) và trong tối Kết quả sau bốn tuần nuôi cấy cho thấy, 70% ánh

sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh dương là tỉ lệ phù hợp cho sự tái

sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá

Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2014), đèn LED với

sự phối trộn giữa hai LED xanh dương và LED đỏ với các tỉ lệ lần lượt: 100% LED đỏ; 90% LED đỏ kết hợp với 10% LED xanh dương; 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh dương; 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh dương; 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh dương; 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh dương được sử dụng để chiếu sáng bổ sung vào ban đêm nhằm nghiên cứu

ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống Cúc (Đóa vàng, Sapphire và Kim cương) được trồng trong nhà kính Kết quả cho thấy, tỉ lệ 70%

LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của

cây Cúc giống Sapphire và Kim cương, trong khi đó, tỉ lệ 60% LED đỏ kết hợp với

40% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc giống Đóa

vàng

Nghiên cứu của Lê Thị Thúy và Trần Thị Anh Thoa (2017), với sự ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED (light emitting diode) trắng, đỏ và xanh dương lên quá trình sinh trưởng của hai giống lan Hoàng thảo Dendrobium lituiflorum Lindl và

Dendrobium Shavin White trong điều kiện nuôi cấy in vitro, Sau 60 ngày nuôi cấy

ở điều kiện in vitro, ánh sáng đèn LED đỏ là nguồn sáng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của hai loài lan này

Nguyễn Khắc Hưng và Chu Hoàng Hà (2016), nghiên cứu này

được thực hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến khả năng

sinh trưởng, một số đặc điểm sinh lý cũng như tỷ lệ tạo rễ ở cây sâm dây nuôi cấy

in vitro Kết quả khảo sát cho thấy, ánh sáng đỏ và xanh đơn sắc đều gây ức chế đến

quá trình tạo rễ cũng như sinh trưởng của các chồi cây sâm dây Trong khi đó, chồi

sâm dây sinh trưởng dưới điều kiện LED đỏ: xanh (80:20) cho khả năng phát sinh

rễ tốt nhất (90% số chồi ra rễ) so với ánh sáng huỳnh quang đối chứng (75% số

chồi tạo rễ), Bên cạnh đó, số rễ tạo thành trung bình (2,68 rễ/chồi), chiều dài rễ trung bình (2,21 cm) và chiều cao cây trung bình của chồi sinh trưởng dưới ánh sáng LED đỏ: xanh (80:20) là 7,42 cm đều cao hơn ở ánh sáng đối chứng

1.5.Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong nuôi cấy in vitro

dưỡng Chỉ có một vài số liệu hạn chế cho rằng thể tích môi trường ảnh hưởng lên

sự sinh trưởng của cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng và không ảnh hưởng đến

cây nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng (Ichihashi và Uehara, 1987)

1.6 Giới thiệu về dung dịch nano

1.6.1 Nano đồng

Vật liệu nano nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước do phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ nano đã mang lại thật nhiều

những ứng dụng thực tiễn trong khoa học và đời sống Nano đồng thu hút sự quan

tâm rộng rãi bởi vì đồng là một trong những kim loại quan trọng nhất trong ngành

kỹ thuật hiện đại (Masound Salavati-Niasari, Fatemeh Davar (2009)

Hiện nay, các hạt nano đồng đã có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp và công nghệ cao Trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều khảo

nghiệm đã được thực hiện trong những năm gần đây để khẳng định vai trò quan trọng của nano đồng trong nông nghiệp mà cụ thể hơn đó chính là khả năng diệt

nấm khuẩn gây bệnh hại ở cây trồng

Nano đồng được tổng hợp bằng nhiều phương pháp như: phân hủy nhiệt, khử muối kim loại, nhiệt vi sóng, phương pháp bức xạ, kỹ thuật vi nhũ, kỹ thuật siêu tới hạn, phóng điện hồ quang, phương pháp khử nhiệt và khử bằng sóng siêu âm,…

Cơ chế kháng khuẩn nano đồng

Các hạt nano đồng giải phóng liên tục các ion đồng, chính các ion đồng này tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn theo các cơ chế đặc thù Hoạt động giải phóng các

ion đồng này được tăng cường hơn khi các hạt nano Cu ở kích thước nhỏ và diện tích bề mặt lớn cho phép nó tương tác gần với các màng tế bào vi khuẩn Hoạt động kháng khuẩn của nano đồng là do xu hướng của nó thay thế giữa dạng Cu+ và dạng

hydroxyl liên kết với các phân tử DNA và tạo thành sự mất trật tự của cấu trúc xoắn

ốc nhờ các liên kết ngang trong và giữa các acid nucleic và làm hỏng các proteins quan trọng nhờ liên kết với các nhóm carboxyl và amino sulfhydryl của các acid

amin

Điều này làm cho protein tạo enzyme không hiệu quả Nó làm cho các proteins

bề mặt tế bào không hoạt động, các protein này cần cho việc chuyển các vật chất đi qua màng tế bào, do đó ảnh hưởng lên sự bền vững của màng tế bào và các lipids

màng tế bào Các ion đồng bên trong tế bào vi khuẩn cũng ảnh hưởng đến các quá

trình sinh học

Dựa trên tất cả những nghiên cứu này, có thể thấy ion Cu có ảnh hưởng lên protein và các enzyme trong các vi khuẩn và tạo cho Cu đặc tính kháng khuẩn

1.6.2 Nano bạc

Các hạt nano bạc có kích thước dao động từ 1 – 100 nm được xem như các hạt

nano hay là các túi nano (Rafsanjani et al, 2012) Nhờ kích thước cực kỳ nhỏ này,

các hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăng khả năng tiếp xúc với không gian bên

ngoài Do đó, sự bám dính lên bề mặt tế bào gia tăng dẫn đến hiệu quả tác động cao (Shah và Belozerov, 2008)

Nano bạc là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau ( Nguyễn Ngọc Tú, 2009):

- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi

xa, chống tĩnh

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có

phụ gia hóa chất

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các

dung môi phân cực như nước trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene)

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

Đã có một vài nghiên cứu tập trung vào tác động và cơ chế của nano bạc trên

thực vật Kết quả của những nghiên cứu này đã được báo cáo với mục đích cung cấp

cái nhìn sâu sắc hơn vào mối liên hệ giữa thực vật và các loại vật liệu nano (Mahna

et al,, 2013) Tuy nhiên, cho đến nay, có rất ít công bố về việc nano có ảnh hưởng

đến nuôi cấy mô tế bào thực vật Việc bổ sung nano bạc vào môi trường nuôi cấy đã được Nabeel (2011) thực hiện trên đối tượng cây Nhung hoa (Iresine herbstii) thuộc

họ Araceae (Nabeel, 2011) Zahra và cộng sự (2013) đã tiến hành đánh giá hiệu quả nano bạc lên các giai đoạn phát triển, năng suất và thành phần của tinh dầu cây thuộc chi cỏ Xạ hương (Thymus), một loại cây dược liệu truyền thống của Iran Kết quả cho thấy, việc sử dụng nano bạc có thể thay đổi các giai đoạn sinh trưởng của cây và số lượng các hợp chất thứ cấp; tuy nhiên, hiệu quả của nano bạc lên cây trồng cần được nghiên cứu sâu hơn

- Hạt nano bạc chủ yếu ở kích thước 1 – 10 nm tấn công vào bề mặt của màng

tế vào và làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến những chức năng màng, như là tính thấm

và sự hô hấp

- Chúng còn có khả năng thâm nhập vào vi khuẩn và gây nên những tổn hại bằng những tương tác thích hợp với các phức hợp có chứa sulfur - và phospho như DNA

- Những thành phần giải phóng ion bạc, mà có thể đóng góp thêm vào hiệu quả diệt khuẩn của hạt nano bạc

Shrivastava và cộng sự (2007) đã mô tả khả năng kháng vi khuẩn của hạt nano bạc mới với đường kính 10 – 15 nm với những dòng vi khuẩn kháng thuốc và

không kháng thuốc, Kim và cộng sự (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của

nano bạc chống lại 44 dòng thuộc 6 loài nấm từ phân lập lâm sàng và dòng ATCC từ

Trichophyton mentagrophytes và Candida albanicans Kết quả là mức độ ức chế

80% (IC80) đạt được ở nồng độ 1 – 7 μg/ml Hoạt tính kháng nấm đạt được là do việc phá hoại tính nguyên vẹn của màng

1.6.3 Nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong

những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano Chitosan là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài động vật giáp xác như tôm, cua,…Với khả năng hòa hợp sinh học và tự phân hủy cao (Richardson et al,, 1999) Nó có độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao và đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cường khả năng miễn dịch, giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển các khối u, có tác dụng nhanh trên các vết thương, vết bỏng (Jing và et al,, 1997) Trong số các đặc tính đã nêu, hoạt

tính kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đối với cả vi khuẩn Gram âm

(Helander et al,, 2001) và Gram dương (Bae et al,, 2006 ; Jeon et al,, 2001; Vishu Kumar et al, 2004; No et al,, 2002) được xem là một trong các đặc tính quan trọng

có liên quan trực tiếp tiềm năng ứng dụng sinh học của chúng trong việc tạo ra các

chế phẩm bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên (Aider, 2010) Hoạt tình kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào độ acetyl hóa (Jeon et al,, 2001) pH (Holappa et al,, 2006), nhiệt độ (Tsai và Su, 1999), nồng độ (Wang et al,, 2004) và dung dịch hòa tan (Qin et al,, 2006)

Nano chitosan là các hạt chitosan có kích thước siêu nhỏ (từ 10 – 1000 nm)

nên dễ dàng đi qua màng tế bào, diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học mang thuốc, vaccine, trong nghệ sinh học làm vector chuyển gen (Agnihotri et al,, 2004; Patel et al,, 2009; Zhang et al,, 2010; Trapani et

al,, 2009), trong việc xử lý kim loại nặng và chất ô nhiễm hữu cơ trong nước sinh

hoạt (Tamura et al,,, 2010; Ge và Huang, 2010)

Ở nước ta, các nghiên cứu về nano chitosan tương đối ít mặc dù vài công trình

nổi bật đã được công bố Việc tiến hành phun chất kích thích sinh trưởng nano chitosan (kích thước 150 nm) cho lúa đã hạn chế sâu bệnh nên không cần sử dụng

thuốc bảo vệ thực vật (Đỗ Trường Thiện et al,, 2010) Hoạt tính kháng nấm của

phức hệ nano chitosan-tinh dầu nghệ (kích thước trên 100 nm) đã được thử nghiệm

thành công trên C, albicans, T, mentagrophyte, F, oxysporum và P, italicum (Nguyễn Thị Kim Cúc et al,, 2014)

Trong nhân giống in vitro, nano chitosan đã được sử dụng và có hiệu quả cải thiện chất lượng cây con, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho sự thuần dưỡng cây con ở điều kiện ex vitro (Nge et al,, 2006) Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trưởng

và phát triển của lan Dendrobium dưới dạng phun lên cây trồng bên ngoài cũng như

bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro đã được báo cáo (Chandrkrachang, 2002; Limpanavech et al, 2003, Nge et al,, 2006)

- Nano chitosan giúp chitosan đi sâu vào tế bào cây để phát huy hiệu quả kích

thích hệ miễn dịch tốt nhất

- Nano chitosan có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp gấp từ 80 – 100 lần chitosan

dạng hòa tan nên tăng cường khả năng tiêu diệt mầm bệnh trực tiếp

- Nano chitosan giúp giữ hoạt lực chitosan lâu nhất

- Nano chitosan dạng nano tạo ra cơ chế dẫn truyền

- Nano chitosan liên kết yếu với các amino acid, ure, NPK sẽ tạo ra phân bón nano, Điều này nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón và giảm đi chi phí giá thành sản xuất

Hiện nay, những nghiên cứu về ảnh hưởng nano đối với ngành nông nghiệp nói chung còn ít.Đặc biệt là trong nuôi cấy mô in vitro đến nay vẫn có rất ít nghiên cứu

về các dung dịch nano Chính vì vậy nhiều tiềm năng của nano vẫn chưa được phát

hiện nhiều cũng như cần được quan tâm hơn

1.7 Giới thiệu về lan Giả Hạc Dendrobium anosmum

1.7.1 Giới thiệu về Lan Dendrobium

Lan là họ lớn thứ 2 trong ngành hạt kín sau họ cúc và là họ lớn nhất trong lớp

1 lá mầm, phân bố khắp nơi trên trái đất Trên thế giới, họ lan có khoảng 750 chi khác nhau với ít nhất 25,000 loài bản địa và hơn 30,000 giống lai, đây là kết quả

của việc lai tạo và danh sách các giống lai không ngừng tăng lên, Ở nước ta hiện biết trên 130 chi với 800 loài, Giống Dendrobium có khoảng 16,000 loài và đã được lai tạo thêm nhiều loài mới Ở Việt Nam, Dendrobium còn được gọi là Hoàng lan hay Đăng lan, có đến 100 loài, xếp trong 14 tông Có 2 dạng chính: dạng đứng (Dendrobium Phalaenopsis) thường mọc ở vùng nóng, chịu ẩm và siêng hoa; dạng thòng (Dendrobium Nobile) chịu khí hậu mát mẻ.

Ngành: Magnoliophyta hay Angiospermatophyta

Lớp: Liliopsida hay Monocotyledoneae

1.7.2 Giới thiệu về lan Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl,

Lưỡng điểm hạc hay phi điệp, giả hạc, giả hạc tím (danh pháp hai phần: Dendrobium anosmum) là một loài lan trong chi Lan hoàng thảo

Cây phân bố từ Nam Á đến Đông Nam Á, Tại Việt Nam, cây có mặt ở các khu vực: Bắc Giang, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Lâm Đồng

Hình 1.1 Lan Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl,

Thân chia thành nhiều đốt mỗi đốt chứa một mắt ngủ Độ dài của đốt phụ thuộc vào

giống, độ tuổi của cây, môi trường,… Màu sắc thân phi điệp rất đa dạng từ xanh, tím, chấm tím Độ mập của thân có thể có đường kính 1,5 cm khi vào mùa nghỉ (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Lá đơn mọc cách so le trên giả hành dài 10 – 15 cm rộng 3 – 4 cm, Mép lá nguyên hệ gân song song đầu lá nhọn Cây thường rụng lá vào mùa thu, đông khi cây đã thắt ngọn, bước vào mùa nghỉ và thường nở hoa vào mùa xuân Khác với

những loài đơn thân rễ mọc thẳng đứng từ thân và thường xen kẽ với lá thì rễ của

phi điệp chủ yếu mọc từ căn hành (Bùi Bảo Lộc, 2008)

Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nảy sinh

ra những cây con (keiki) Vài tháng sau, khi cây con mọc rễ dài khoảng 3 – 4 cm có thể tách ra trồng riêng, Năm đầu cây còn nhỏ và ngắn khoảng 30 – 40 cm và không

ra hoa nhưng sẽ ra hoa vào năm tới Hoa to tới 10 cm mọc từ 1 – 3 chiếc ở các đốt

đã rụng lá, hoa nở từ đầu xuân đến cuối hè có một số có thể nở vào mùa thu (Bùi Bảo Lộc, 2008) Mỗi vùng miền lại có một mặt hoa khác nhau tạo ra sự đa dạng về

mặt hoa của loài Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (2 – 3 tuần lễ) Nhiều hoa

trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa

1.6.3.1 Nhiệt độ

Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 40 – 80°F hay 8 – 25°C, Tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 100°F hay 38°C và có thể chịu lạnh tới 38°F hay 3,3°C, Ngoài ra nếu vào mùa đông không lạnh dưới 50°F hay 15,6°C trong vòng 4-6 tuần lan sẽ khó lòng

ra nụ, Lan con mới ra rất nhạy cảm với tác nhân môi trường khi thời tiết quá nóng

hoặc quá lạnh cần có biện pháp điều chỉnh nhiệt độ để giữ nhiệt độ ở khu vực nuôi

cây ổn định, nhiệt độ thích hợp từ 20 – 27°C, Đối với cây nhiệt độ ban ngày 26 – 32°C, ban đêm từ 18 –21°C (Ngô Thị Nguyệt, 2013),