TỔNG QUAN
Khái quát về phế liệu tôm
1.1.1 Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam
Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km và vùng đặc quyền kinh tế rộng 1.000.000 km2 tạo điều kiện thuận lợi cho ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản Theo Tổng cục Thủy sản, diện tích nuôi tôm trên toàn quốc đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 lên 381.728 ha năm 2008, và đạt 656.425 ha vào năm 2011, với sản lượng 495.657 tấn, tăng 2,71% về diện tích và 5,48% về sản lượng so với năm 2010 Đồng bằng Sông Cửu Long là vùng nuôi tôm chủ yếu, chiếm 91,8% diện tích cả nước với 602.416 ha, trong đó tôm sú chiếm 588.419 ha và tôm thẻ chân trắng 18.998 ha Sản lượng thu hoạch từ vùng này đạt 368.983 tấn, tương đương 74,4% tổng sản lượng cả nước, với tôm sú đạt 296.958 tấn và tôm thẻ chân trắng 71.025 tấn Cà Mau là tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn nhất với 266.600 ha.
Theo báo cáo, hiện nay có ba phương pháp nuôi tôm phổ biến: thâm canh, bán thâm canh và quảng canh cải tiến Nhiều địa phương đã áp dụng phương pháp quảng canh cải tiến nhằm nâng cao năng suất và bảo vệ môi trường.
Xuất khẩu tôm của Việt Nam đã liên tục tăng trưởng qua các năm, với sản lượng tôm đông lạnh xuất khẩu trung bình khoảng 150.000 tấn, trị giá gần 1 tỷ USD trong đầu những năm 2000 Trong 6 tháng đầu năm 2011, Việt Nam đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, đạt giá trị 971,109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010, trở thành nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các mặt hàng thủy sản xuất khẩu Đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm đã mang về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với năm trước, trong đó tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD.
Tôm Việt Nam đã xuất khẩu sang hơn 70 thị trường toàn cầu, với hơn 50 loại tôm đông lạnh được chế biến đa dạng Các sản phẩm tôm bao gồm tôm tươi sống, đông lạnh, chế biến sẵn, ăn liền, phối chế, khô, đóng hộp và làm lên men chua.
Theo FAO, từ nay đến năm 2015, tiêu thụ thủy sản toàn cầu sẽ tăng trưởng khoảng 0,8%/năm, với tổng nhu cầu thủy sản và sản phẩm thủy sản tăng khoảng 2,1%/năm Điều này cho thấy nhu cầu thủy sản thế giới năm 2012 sẽ tiếp tục tăng, tạo điều kiện thuận lợi cho các doanh nghiệp thủy sản Việt Nam tăng cường xuất khẩu, đặc biệt là đối với các sản phẩm nuôi trồng như tôm và cá tra.
1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản
Trong ngành chế biến thủy sản xuất khẩu, sản phẩm đông lạnh giáp xác chiếm 70-80% công suất chế biến Hằng năm, các nhà máy thải bỏ khoảng 70.000 tấn phế liệu giáp xác, riêng tỉnh Khánh Hòa khoảng 2.300 tấn/năm, chủ yếu là phế liệu từ tôm.
Phế liệu tôm bao gồm các thành phần như đầu, vỏ và đuôi tôm, cùng với tôm gãy, tôm lột vỏ sai quy cách và tôm bị biến màu, có thể chiếm hơn 60% khối lượng sản phẩm Trong quá trình chế biến, phần lớn tôm được sử dụng đã được bóc vỏ và bỏ đầu, trong đó phần đầu chiếm khoảng 34-35% và phần vỏ, đuôi, chân chiếm 10-15% trọng lượng tôm nguyên liệu Tỷ lệ phế liệu này còn phụ thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng; riêng đối với tôm thẻ, phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 28% và vỏ chiếm 9%, tổng cộng là 37% phế liệu từ tôm thẻ.
Với sự gia tăng sản lượng tôm nguyên liệu, lượng phế liệu từ các nhà máy chế biến thủy sản cũng tăng theo Điều này tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào cho các ngành công nghiệp, giúp tận dụng phế liệu thủy sản để sản xuất các sản phẩm có giá trị khác.
1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm
1.1.3.1 Thành phần hóa học của phế liệu tôm [1]
Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxi cacbonate, khoáng, sắc tố [3]…trong đó hàm lượng protein chiếm gần tới 50% [4]
Tỷ lệ các thành phần trong vỏ tôm không ổn định và thay đổi theo giống, loài, cũng như các đặc điểm sinh thái và sinh lý Cụ thể, thành phần chitin và protein trong vỏ tôm có sự biến đổi lớn tùy thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng và chu kỳ sinh sản của tôm.
Protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó tách ra khỏi vỏ, tồn tại dưới dạng tự do và dạng phức tạp
Protein tự do chủ yếu có mặt trong các cơ quan nội tạng và phần vỏ tôm, đặc biệt là ở phế liệu tôm, nơi chứa nhiều protein ở phần đầu tôm với thịt còn sót lại.
Protein trong vỏ tôm được liên kết phức tạp với chitin và CaCO3, tạo thành một thành phần thống nhất Đặc biệt, phức hợp protein – astaxanthin trong vỏ tôm, được gọi là cartenoprotein, không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn sở hữu những đặc tính sinh học quý giá của astaxanthin.
Đầu tôm chứa nhiều enzyme quan trọng, đặc biệt là protease, với hoạt độ khoảng 6,5 đv hoạt độ/g tươi Ngoài protease, còn có các enzyme khác như alkaline phosphatase, chitinase, N-acetyl glucosamidase, lipaza và tyrosinase, chủ yếu tập trung trong nội tạng của tôm.
Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác.
Trong đầu tôm chứa một lượng muối vô cơ, chủ yếu là canxi cacbonat
Sắc tố chủ yếu trong đầu và vỏ tôm là astaxanthin, một chất kết hợp chặt chẽ với protein Sự kiên kết này giúp bảo vệ astaxanthin trong vỏ tôm; tuy nhiên, khi liên kết bị phá vỡ, astaxanthin dễ dàng tách ra và bị oxi hóa thành Astaxin.
- Chất ngấm ra ở đầu tôm
Trymethylamin (TMA), trymethylamin N oxide (TMAO), betain, bazo purin, các axid amin tự do, urê
- Ngoài ra còn có một lượng đáng kể lipid, một lượng nhỏ photpho
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei
Chỉ tiêu phân tích Giá trị
Phế liệu tôm, đặc biệt là đầu tôm, là nguồn giàu chitin, protein và enzyme dinh dưỡng Nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein trong phế liệu tôm rất cao, và protein tôm được coi là hoàn hảo Do đó, việc tận dụng nguồn protein này là rất cần thiết.
1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm
Phế liệu tôm từ các khâu chế biến cần được thu hồi và bảo quản thích hợp
Do sự khác biệt về thành phần và tiềm năng sử dụng của các loại phế liệu như đầu, vỏ, việc thu gom riêng các thành phần này là cần thiết để thuận tiện cho việc tái chế và sản xuất các chế phẩm khác.
Một số hướng tận dụng phế liệu tôm:
1.1.4.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi
Enzyme protease và quá trình thủy phân protein
Protease là một loại enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid trong polypeptide và protein, biến chúng thành các amino acid tự do hoặc các peptid có kích thước nhỏ hơn.
Hiệu suất xúc tác của nó vượt trội, có thể gấp hàng trăm đến triệu lần so với các chất xúc tác vô cơ khác Nó đặc biệt có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong điều kiện nhẹ nhàng, với nhiệt độ và áp suất bình thường, cũng như pH gần giống với pH sinh lý Hơn nữa, chất xúc tác này cho phép thực hiện các phản ứng với độ đặc hiệu cao, tạo ra sản phẩm tinh khiết và ít tạp chất.
1.2.1.1 Phân loại protease: có thể căn cứ vào các tiêu chí sau [5]:
- Cơ chế phản ứng của enzyme tham gia
- pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease kiềm, protease trung tính
- Nguồn thu các enzyme protease
- Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme
Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:
Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ của mạch polypeptide
Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của mạch polypeptide
Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptid
Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nối mạch
Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là:
Endopeptidase là các enzyme có khả năng phân giải các liên kết trong chuỗi polypeptide, đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân protein Chúng được sử dụng phổ biến nhờ vào tính đặc hiệu rộng rãi của chúng trong việc xử lý protein.
Proteinase – serin là một loại protease có nhóm (-OH) của axit amin serin trong trung tâm hoạt động Các enzyme tiêu biểu trong phân nhóm này bao gồm Trypsin và Chymotrypsin.
- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có nhóm Thiol (-SH) của axit amin xistein Nhóm này gồm các enzyme Cathepsin
- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspartic như enzyme Pepsin
Protease kim loại là nhóm enzyme có ion kim loại trong trung tâm hoạt động, hoạt động hiệu quả trong môi trường trung tính Một ví dụ điển hình cho nhóm này là Collagenase.
Exopeptidase, hay còn gọi là peptidase, là các enzyme không thể thủy phân liên kết peptid ở đầu chuỗi polypeptide, bao gồm cả đầu amin và đầu cacboxyl, để giải phóng axit amin tự do Chúng còn được gọi là aminopeptidase và cacboxypeptidase Ngoài ra, exopeptidase có thể kết hợp với endopeptidase để thực hiện quá trình thủy phân phức tạp hơn.
1.2.1.2 Nguồn thu nhận protease: chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản sau [5]:
Enzyme từ động vật được chiết xuất từ các mô như tụy, dạ dày, ruột và nội tạng của một số loài thủy sản như mực và cá, bao gồm các loại enzyme quan trọng như trypsin, pepsin, chymotrypsin và cathepsin.
Từ thực vật: có thể thu nhận được papain từ đu đủ, bromelain từ thân, lá, vỏ dứa
Từ vi sinh vật: cũng là nguồn thu nhận enzyme rất phong phú, thường là các loài aspergillus, bacillus, clostridium, streptomyces và một số loài nấm men
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu lý tưởng cho sản xuất enzyme quy mô công nghiệp nhờ vào những ưu điểm vượt trội của chúng.
- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất
- Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn, do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 ÷ 60h
- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn
Giá thành chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thường thấp hơn so với các nguồn khác, nhờ vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật đơn giản và tiết kiệm.
Do những đặc điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.2.1.3 Cơ chế tác dụng của protease [5]
Enzyme là chất xúc tác sinh học, chủ yếu là protein, với tính đặc hiệu cao, có khả năng tương tác với các liên kết peptid trong phân tử protein và cơ chất tương tự Chúng làm suy yếu các liên kết này, giúp chúng dễ dàng bị đứt khi có nước tham gia Quá trình enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất thường trải qua ba giai đoạn.
Trong giai đoạn đầu tiên, enzyme kết hợp với cơ chất thông qua các liên kết yếu, tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền Phản ứng diễn ra nhanh chóng và yêu cầu năng lượng thấp, với các liên kết yếu trong phức hợp ES bao gồm tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và liên kết Van der Waals.
Giai đoạn 2 là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa, nơi xảy ra sự biến đổi của cơ chất dưới tác động của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme Quá trình này làm cho cơ chất từ trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động, kéo dài một số liên kết trong cơ chất và thay đổi mật độ electron.
Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do nhưu ban đầu
Hình 1.1 Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease
Trong đó: P và P + biểu thị kết quả các peptid có kích thước khác nhau được tách ra
Endoprotease hoạt động bằng cách cắt các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptide, trong khi exopeptidase thực hiện việc loại bỏ các axit amin ở đầu và cuối chuỗi polypeptide.
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/1mg protein (UI/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme
Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng nhiều phương pháp Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử
Công thức tính hoạt độ: a*b*c t
Trong đó, a: nồng độ tyrosine (àmol/ml) b: độ pha loãng của dịch enzyme c: thể tích của dịch thu được để đo (ml) t: thời gian xảy ra phản ứng (phút)
Enzyme Alcalase là một endoprotease có hoạt độ cao, được chiết xuất từ Bacillus licheniformis, với khả năng điều chỉnh độ thủy phân dễ dàng và duy trì pH ổn định trong quá trình này Lựa chọn enzyme Alcalase dựa trên đặc tính không hút nước của các axit amin trong giai đoạn cuối, giúp sản phẩm thủy phân không bị đắng và đảm bảo cân bằng tốt các axit amin thiết yếu.
Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷10 o C Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8
Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân, DH (%) nên được duy trì trong khoảng 15 ÷ 25 và dừng phản ứng enzyme gần với giá trị DH xác định Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 85 o C trong 10 phút, trong khi protease Alcalase sẽ bị bất hoạt tại pH 4 hoặc thấp hơn trong 30 phút Phản ứng có thể dừng ngay lập tức bằng cách thêm các acid như acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic, hoặc acetic Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ tức thời khó thực hiện trong điều kiện công nghiệp và kiểm soát DH % có thể gặp khó khăn do sự thủy phân vẫn tiếp tục diễn ra trong quá trình bất hoạt.
1.2.1.6 Hệ enzyme protease của tôm
Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một kỹ thuật thống kê quan trọng, sử dụng dữ liệu định lượng từ thí nghiệm để phân tích mối quan hệ giữa các biến giải thích và biến phản ứng Được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951, RSM tập trung vào việc thiết kế chuỗi thí nghiệm nhằm tối ưu hóa phản ứng Mô hình đa thức bậc hai được sử dụng trong RSM, mặc dù chỉ là xấp xỉ, nhưng lại dễ dàng áp dụng trong thực tiễn.
Bề mặt đáp ứng là đại diện hình học của hàm mục tiêu trong một quá trình vật lý ngẫu nhiên theo không gian - thời gian, với hàm mục tiêu Y là kết quả của chức năng đáp ứng Sự thay đổi của các biến đầu vào Xi (i = 1,…,n), hay còn gọi là biến cơ sở, sẽ dẫn đến sự thay đổi trong hàm mục tiêu Mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng chú trọng đến việc lựa chọn biến kích thích, xác định giai đoạn quan sát và tính toán sai số Các biến đầu vào này được đặc trưng bởi thông tin thống kê (j = 1,…,p), bao gồm chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan và cơ hội chuẩn hóa Thông thường, các biến Xi thay đổi theo không gian - thời gian.
Sự chuyển đổi này của các biến kích thích có thể được thể hiện bằng sơ đồ hình1.3:
Hình 1.3 Sơ đồ chức năng chuyển đổi
Chức năng chuyển đổi phụ thuộc vào các biến cơ sở chưa được biết đến, vì vậy nghiên cứu về tính xấp xỉ và chức năng đáp ứng là cần thiết Thông thường, chức năng này thuộc một họ tuyến tính hoặc phi tuyến tính, được đặc trưng bởi các thông số X k (k=1,…,l) có thể là ngẫu nhiên hoặc xác định Việc điều chỉnh mục tiêu cần dựa trên số liệu thí nghiệm (vật lý hoặc số học) và một hệ mét để tính toán sai số, từ đó suy ra các thông số X k Hình ảnh hóa chức năng đáp ứng dưới dạng đường cong, mặt phẳng hoặc mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng.
Chức năng đáp ứng có thể được viết dưới dạng như trong hình 1.4
Hàm mục tiêu Y Chức năng chuyển đổi
Hình 1.4 Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng Để xây dựng một bề mặt đáp ứng, cần phải khai báo:
- à = {à1,…,à p } : thụng tin thống kờ về vectơ X (chức năng phõn phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa…)
Ψ(X/à) là giá trị xấp xỉ của hàm mục tiêu Y, được biểu diễn qua công thức chức năng của X Nó cung cấp thông tin về các thống kê liên quan, có thể được điều chỉnh thông qua các thông số χ (mặt đáp ứng phân tích) hoặc từ mô hình vật lý liên tiếp (mặt đáp ứng vật lý).
- |.|: hệ mét trong không gian của biến cơ sở và hàm mục tiêu Nó cho phép đo được chất lượng điều chỉnh từ sự xấp xỉ Ψ đến mục tiêu Y
- Xác định các mức yếu tố làm thỏa mãn đồng thời các thông số kỹ thuật mong muốn
- Kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tố để cho ra kết quả mong muốn đạt được và mô tả kết quả tối ưu đó
- Cho ra một kết quả đặc trưng khi nó bị ảnh hưởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tố vượt quá mức đang quan tâm
- Đạt được một sự hiểu biết về định lượng của hệ thống xử lý vượt quá vùng thử nghiệm Ψ (X/à) = Y (χ, X/à)
Thông số Biến kích thích
Sửa chữa Chọn và sắp xếp
- Sản xuất các sản phẩm đặc trưng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố không chạy
- Tìm ra các điều kiện cho một quá trình ổn định = dấu hiệu vô tình
1.3.3 Ưu, nhược điểm của RMS [13] Ưu điểm:
- Mang tính thực tế vì số liệu được lấy từ thực nghiệm
- Có thể áp dụng cho bất kỳ hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra
- Đánh giá được tác động của các yếu tố ảnh hưởng
- Thực hiện dễ dàng và nhanh chóng
- Chỉ mang tính gần đúng
- Phạm vi tác dụng bị giới hạn, mặt đáp ứng sẽ không có giá trị đối với những vùng khác ngoài dải yếu tố đang nghiên cứu
- RMS thiếu việc sử dụng các nguyên tắc thống kê
1.3.4 Các mô hình thí nghiệm trong RMS
1.3.4.1 Thiết kế Box-Behnken (BBD) [23]
Thiết kế Box-Behnken làm đầy cho một khối đa diện, xấp xỉ một hình cầu
BBD là phương pháp thiết kế thí nghiệm kết hợp giữa thiết kế 2-level Factorial và thiết kế block chưa đầy đủ, được áp dụng cho 3 mức yếu tố thông qua 15 thí nghiệm, bao gồm 3 thí nghiệm ở tâm.
Hình 1.5 Thiết kế Box-Behnken cho 3 yếu tố - (a) dưới dạng hình học và (b) dưới dạng thiết kế
1.3.4.2 Thiết kế Central composit (CCD) [24]
Thiết kế Central composit (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các mô hình quy hoạch thực nghiệm Nó được cấu thành từ 3 thành phần:
Nhân là một phương án tuyến tính với 2^k đỉnh của hình khối đều trong không gian k chiều Đối với k > 5, có thể giảm số thí nghiệm bằng cách áp dụng phương án yếu tố từng phần 2^(k-1).
Trong nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn, có 2k điểm sao (*) được phân bố trên các trục tọa độ của không gian yếu tố, với tọa độ của chúng là (±α, 0, 0,…0), (0,±α, 0,…0), (0, 0,…,0, ±α), trong đó α là khoảng cách từ tâm phương án đến điểm sao, được gọi là cánh tay đòn sao Các điểm sao này đóng vai trò quan trọng trong việc mở rộng không gian nghiên cứu, giúp tìm ra các ước lượng của hệ số bii trong phương trình hồi quy bậc 2.
Nghiệm phương trình ở tâm phương án là cách để xác định phương sai tái hiện, trong đó cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm ở tâm được lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn tối ưu, thường là phương án trực giao hoặc phương án quay.
Phương trình hồi quy (mô hình hóa) được biểu diễn bằng pt sau: y= b o + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 + b 12 x 1 x 2 + b 23 x 2 x 3 + b 13 x 1 x 3 + b 11 x 1 2 + b 22 x 2 2 + b 33 x 3 2
Trong đó, bo: hệ số tự do b1, b2, b3: hệ số bậc 1 b 11 , b 22 , b 33 : hệ số bậc 2 b 12 , b 13 , b 23 : hế số của từng cặp yếu tố x1, x2, x3: các biến y: chỉ tiêu theo dõi
Nếu dùng phương trình hồi quy đầy đủ hơn có kể đến các hiệu ứng tương tác hai biến: y= b o + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 + b 12 x 1 x 2 + b 23 x 2 x 3 + b 13 x 1 x 3
Phương sai của các hệ số được tính như sau:
Thiết kế thí nghiệm trung tâm tổng hợp (Central Composite) là phương pháp trong đó mỗi yếu tố có hơn 5 cấp độ, bao gồm cộng alpha (+α), trừ alpha (-α), cộng một (+1), trừ một (-1) và điểm trung tâm (0) Khi có yếu tố phân loại, thiết kế này sẽ nhân đôi cho mỗi sự kết hợp của các cấp độ yếu tố phân loại.
Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm
Jozef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alkalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi Chitin và protein
Gildberg và Stenberg, 2001 thu được 68,5% protein từ phế liệu tôm Pandalus borealis sau 2 giờ thủy phân với enzyme Alcalase
Nghiên cứu về việc chiết xuất astaxanthin từ phế liệu tôm đã được thực hiện rộng rãi trên toàn cầu Tại Iran, một nhóm nghiên cứu đã áp dụng cả phương pháp hóa học và sinh học để chiết xuất astaxanthin từ đầu tôm Sau khi chiết xuất, bã carotenoid thu được có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất chitin và chitosan.
Nghiên cứu của Honlada và Netto (2006) cho thấy việc thu hồi ba thành phần chính từ phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri, bao gồm protein, chitin và astaxanthin, có thể thực hiện bằng enzyme Alcalase và pancreatin Phế liệu tôm chứa 39,42% protein, 31,98% tro và 19,92% chitin Thí nghiệm thủy phân protein bằng Alcalase được thực hiện ở tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 60ºC và pH 8,5 Kết quả cho thấy, khi tăng độ thủy phân từ 6% lên 12%, lượng protein thu hồi đạt 26% và 28% Alcalase cho thấy hiệu quả cao hơn pancreatin, với khả năng thu hồi từ 4,7 đến 5,7 mg astaxanthin/100g phế liệu khô tại độ thủy phân 12%.
Năm 2007, một nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa trong Mungoong, món ăn truyền thống của người Thái Lan được chế biến từ dịch chiết phế liệu tôm Nghiên cứu cho thấy Mungoong chứa các chất chống oxi hóa với hoạt tính cao, được xác nhận qua các thử nghiệm DPPH.
ABTS radical scavenging activities and FRAP Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này
Nghiên cứu của Wenhong Cao và các cộng sự (2008) về thu hồi protein từ phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng cho thấy rằng việc thủy phân tự nhiên ở nhiệt độ từ 40 đến 70ºC, với sự tăng nhiệt 5ºC sau mỗi 30 phút và pH tự nhiên, mang lại hiệu quả cao Cụ thể, hàm lượng protein thu hồi đạt 43,6% ở 40ºC, 73,6% ở 50ºC và 84,7% ở 60ºC Đặc biệt, khi nhiệt độ tăng từ 45ºC đến 60ºC, hoạt động của enzyme nội tạng đạt tối ưu, với độ thủy phân (DH) tăng từ 0 đến 48% sau 180 phút, và lượng protein thu hồi cao nhất đạt 87,4% tại 60ºC.
Năm 2009, các nhà khoa học Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men từ tôm và giáp xác truyền thống như Kapi, Koong-Som và Jaloo Kết quả cho thấy những sản phẩm này có hàm lượng protein cao và chứa nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa tự nhiên, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Krushna Chandra Dora (2011) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng enzyme protease từ vi sinh vật thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS) Ông đã sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Flavourzyme và kết luận rằng Alcalase mang lại hiệu quả thủy phân tốt nhất Qua phương pháp central composite design (CCD), ông xác định chế độ thủy phân tối ưu với nhiệt độ 59,37°C, pH 8,25, thời gian 84,42 phút và nồng độ enzyme/cơ chất 1,84%, đạt độ thủy phân 33,13% Protein thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng cao, chứa 72,3% protein và 529,93 mg/g axit amin, bao gồm các axit amin thiết yếu.
Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đã chú ý đến hoạt tính sinh học của protein tôm, và qua các khảo sát, họ đã đạt được một số kết quả khả quan.
Vũ Ngọc Bội đã sử dụng protease ở đầu tôm sú để thủy phân phế liệu tôm nhằm thu được dịch chiết và chất mùi từ phế liệu tôm
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng
Lactobacillus plantarum được sử dụng để lên men đầu tôm sú nhằm thu hồi chitin, bảo quản và thu hồi các sản phẩm giá trị như protein, lipid và sắc tố Quá trình này diễn ra nhờ hoạt động của enzyme protease từ vi khuẩn trong phế liệu, cùng với hoạt tính protease yếu của vi khuẩn lactic Axit lactic sinh ra giúp làm mềm và hoạt hóa protein, thúc đẩy quá trình thủy phân Sau 24 giờ, phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm chỉ còn 12,99% so với mẫu chưa xử lý Đặng Thị Hiền (2008) đã áp dụng enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tôm, thu hồi protein và astaxanthin trong sản xuất chitin – chitosan Tại nhiệt độ 54ºC trong 8 giờ, với tỷ lệ enzyme 0,22%, pH 8 và tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1, đã thu được 52,7% protein so với ban đầu.
Trang Sĩ Trung đã áp dụng enzyme Flavouzyme để thủy phân phế liệu tôm, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 92 ÷ 95% khi thực hiện ở nhiệt độ 50ºC trong 6 giờ với tỷ lệ enzyme bổ sung 0,1% và pH 6,5.
Các nghiên cứu đã xác định các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm, nhưng phương pháp thí nghiệm truyền thống chưa đánh giá đầy đủ tác động của các yếu tố Do đó, việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng hiện đại sẽ giúp phân tích ảnh hưởng của từng yếu tố và mối quan hệ giữa chúng, từ đó tối ưu hóa quá trình thủy phân Phương pháp này không chỉ cung cấp giá trị thực nghiệm mà còn cho phép dự đoán chính xác hơn, làm cho quá trình tối ưu trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu Đầu tôm được lấy từ quy trình chế biến nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Nha Trang - Khánh Hòa
Nhiệt độ bảo quản: -20 o C tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang
Thời hạn sử dụng nguyên liệu: 1 tháng
Enzyme Alcalase được mua tại công ty Novozyme, Tp Hồ Chí Minh
Tất cả các hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều thuộc loại phân tích.
Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu
2.2.1.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu hoạch tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) phải đảm bảo tươi ngon, không có mùi lạ, không bị biến đỏ và không lẫn tạp chất Ngay sau khi thu hoạch, nguyên liệu được cho vào thùng xốp cách nhiệt chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Tại đây, tạp chất được loại bỏ hoàn toàn, đảm bảo 100% là đầu tôm và tiến hành thí nghiệm ngay Nếu không thể thực hiện ngay, nguyên liệu sẽ được đóng gói trong túi polyme 1 kg và bảo quản đông ở nhiệt độ -20°C.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Bài viết tập trung vào việc bố trí các thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt đối với nguyên liệu trước khi thủy phân, cũng như việc bổ sung enzyme alcalase trong quá trình thủy phân protein Thí nghiệm sẽ được thực hiện để xác định các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình này và tìm ra chế độ tối ưu cho việc thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme alcalase, theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đặc trưng hóa các tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân bằng phương pháp cổ điển
2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
+ Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret theo Gornall
AG, Bardawill CT, David MM (1949)
Khả năng chống oxi hóa của dịch thu được được xác định thông qua bài kiểm tra kiểm soát gốc tự do DPPH, theo quy trình nghiên cứu của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai và Toshiaki Ohshima (2010).
+ Xác định hàm lượng protein trên bã theo phương pháp của Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949)
+ Xác định hiệu suất khử protein theo công thức của Rao và cộng sự (2000):
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
A 0, A R : Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105 o C theo TCVN
3700 - 1990 Độ ẩm mẫu được tính theo công thức:
Trong đó, A: Độ ẩm mẫu (%)
MT: Khối lượng mẫu trước sấy
MS: Khối lượng mẫu sau sấy + Xác định hàm lượng peptid hòa tan trong axit bằng phương pháp Lowry
Phương pháp xử lí số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Excel 2007 và Design Expert 8.0.1 phiên bản dùng thử Tất cả số liệu được tổng hợp từ kết quả trung bình cộng của ba lần thí nghiệm với độ tin cậy 95%.
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu đầu tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất
Trước khi tiến hành thủy phân, nguyên liệu được đánh giá tác động của nhiệt độ lên khả năng thủy phân protein bằng cách xử lý ở 90 °C trong 15 phút Đồng thời, nghiên cứu cũng xem xét ảnh hưởng của quy trình xử lý nhiệt trước thủy phân và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein.
Nguyên liệu (đầu tôm) Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein
Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein là cần thiết để đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân protein Việc đánh giá ảnh hưởng của enzyme alcalase 0,1% đến khả năng thủy phân protein sẽ giúp nâng cao hiệu quả của quá trình này.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein
Sau khi xác định giới hạn và miền nghiên cứu của các yếu tố ảnh hưởng, việc tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm được thực hiện nhằm thu được dịch thủy phân có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học cao nhất.
Sau khi có thông số tối ưu, tiến hành đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân theo thông số tối ưu đó
2.3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho thấy cách đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và enzyme đối với quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng Nghiên cứu này nhằm xác định hiệu quả của các phương pháp xử lý khác nhau trong việc cải thiện chất lượng protein.
Thủy phân (60 o C, 6h) Đo pH Khác nhau
Bất hoạt enzyme (90 o C/10 phút) Ép
Xác định hàm lượng protein hòa tan
Xác định khả năng chống oxi hóa
Xác định hiệu suất khử protein còn lại
So sánh đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein
Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt và enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm, theo sơ đồ hình 2.3 Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
2.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình Factorial 2^k với 3 yếu tố, do đó tổng số thí nghiệm cần thực hiện là N = 2^3 = 8, kèm theo 3 thí nghiệm bổ sung ở điểm trung tâm.
Như vậy có tất cả là 8+3 thí nghiệm
Các thông số cho thí nghiệm:
- Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu (%): X1 [0,1; 0,5]
- Thời gian thủy phân (giờ): X 3 [2; 8]
- Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân (mg/100g nguyên liệu)
- Nồng độ DPPH bị khử (àM/100g NL dịch thủy phõn)
- Hiệu suất khử protein còn lại trên bã (%)
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên
Số TN Yếu tố TN
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án
2.3.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm tối ưu được thực hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS) với mô hình Central composite, bao gồm 11 thí nghiệm từ thiết kế Factorial và 9 thí nghiệm bổ sung.
Dựa trên kết quả nghiên cứu từ một số đề tài khoa học, các thông số và giá trị tương ứng đã được lựa chọn, trong đó có yếu tố cố định.
- pH tự nhiên (Kết quả so sánh pH là không khác nhau nên để pH tự nhiên) b Các yếu tố cần tối ưu:
- Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu (%) : X1 [0,1; 0,5]
- Thời gian thủy phân (giờ) : X 3 [2; 8] c Hàm mục tiêu (Y i )
Hàm mục tiêu bao gồm hàm lượng protein hòa tan, khả năng kiểm soát gốc tự do của dịch thủy phân (được thể hiện qua nồng độ DPPH bị khử) và hiệu suất khử protein còn lại trên bã.
+ Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân (mg/100g nguyên liệu) phải đạt tối đa: Y1 max
+ Nồng độ gốc tự do DPPH bị khử (àM/100g nguyờn liệu) phải đạt tối đa:
+ Hiệu suất khử protein còn lại trên bã (%): Y3 max
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thưc nghiệm được xác lập ở bảng 2.4
Bảng 2.3 Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm
Tỷ lệ enzyme so với cơ chất (%)
Ma trận thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.5 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình
Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD
Số TN Yếu tố TN
2.3.5 Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein
Mục tiêu của thí nghiệm là định tính và định lượng các thành phần dinh dưỡng cũng như hoạt tính sinh học có trong dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng Việc thu thập dữ liệu này sẽ tạo cơ sở cho những ứng dụng mới trong việc bổ sung protein thủy phân vào thực phẩm cho con người, đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.
Xđ khả năng chống oxi hóa
Xđ hàm lượng peptid tan trong axit
Xđ hàm lượng protein hòa tan
-Enzyme Alcalase: [0,1-0,5%] -Tỷ lệ nước/NL: 1/1 Ép Dịch thủy phân
Xđ hàm lượng thành phần các axit béo
Xđ hàm lượng thành phần các axit amin
Ly tâm Tách dịch thủy phân
Dịch thủy phân protein thu hồi theo chế độ thủy phân tối ưu đã xác lập sẽ được đặc trưng tính chất
Phế liệu đầu tôm được cân 100g và cho vào bình tam giác 250ml, sau đó bổ sung 100ml nước cất Bình được đậy kín bằng giấy bạc và xử lý nhiệt ở 90°C trong 15 phút bằng phương pháp đun cách thủy trong nồi điện Nhiệt độ được theo dõi thường xuyên trong suốt quá trình xử lý bằng nhiệt kế.
Sau khi xử lý nhiệt, hạ nhiệt độ của bình xuống dưới 40°C, bổ sung enzyme Alcalase với tỷ lệ từ 0,1% đến 0,3% so với khối lượng nguyên liệu Sử dụng đũa thủy tinh để khuấy đều, đảm bảo enzyme tiếp xúc đồng đều với nguyên liệu trước khi tiến hành thủy phân, sau đó đậy kín bình bằng giấy bạc.
Quá trình thủy phân diễn ra trong điều kiện tối ưu với nhiệt độ từ 50 đến 70 độ C và thời gian từ 2 đến 8 giờ Để đảm bảo nhiệt độ hỗn hợp luôn ổn định, bể ổn nhiệt được sử dụng trong suốt quá trình này.
Sau khi hoàn tất quá trình thủy phân, cần lấy bình tam giác ra khỏi bể ổn nhiệt và tiến hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở nhiệt độ 100 độ C trong 10 phút để chấm dứt ngay lập tức quá trình thủy phân.