Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase

Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ..... Một s

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp, ngoài nỗ lực của bản thân còn có sự giúp đỡ tận tình của những người đi trước, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến những người đã giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, nhất là thời gian 3 tháng thực tập trên phòng thí nghiệm

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.Ts Ngô Đăng Nghĩa, cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã luôn bên em, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể từng bước hoàn thành tốt đề tài

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thầy cô trong trường, nhất là các thầy cô trong khoa công nghệ thực phẩm, bộ môn công nghệ chế biến đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em theo học tại nhà trường

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh thực phẩm, cùng thầy cô bộ môn quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh, các anh chị trung tâm công nghệ sinh học và Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập

Em chân thành cảm ơn chị Ngọc Hoài sinh viên cao học thạc sĩ, các bạn sinh viên lớp 50CBTS, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu, những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2012

Sinh viên

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về phế liệu tôm 3

1.1.1 Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam 3

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản 4

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm 5

1.1.3.1 Thành phần hóa học của phế liệu tôm 5

1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm 6

1.1.4.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi 7

1.1.4.2 Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin 7

1.1.4.3 Sản xuất màu Astaxanthin 8

1.1.4.4 Làm các sản phẩm định hình 8

1.1.4.5 Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị 8

1.2 Enzyme protease và quá trình thủy phân protein 8

1.2.1 Enzyme protease .8

1.2.1.1 Phân loại protease 9

1.2.1.2 Nguồn thu nhận protease 10

1.2.1.3 Cơ chế tác dụng của protease 10

1.2.1.4 Hoạt độ enzyme 11

1.2.1.5 Enzyme Alcalase 12

1.2.1.6 Hệ enzyme protease của tôm 12

1.2.2 Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease 14

1.2.2.1 Protein thủy phân 14

1.2.2.2 Phương pháp sản xuất protein thủy phân 16

1.2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein 16

1.2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein 17

1.3 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 19

1.3.1 Nguyên tắc 20

1.3.2 Công dụng của RMS 21

1.3.3 Ưu, nhược điểm của RMS 22

1.3.4 Các mô hình thí nghiệm trong RMS 22

1.3.4.1 Thiết kế Box-Behnken (BBD) 22

1.3.4.2 Thiết kế Central composit (CCD) 23

1.4 Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm 25

1.4.1 Trên thế giới 25

1.4.2 Ở Việt Nam 27

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 28

2.1.2 Enzyme Alcalase 28

2.1.3 Hóa chất 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu 28

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1.1 Phương pháp thu nhận mẫu 28

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 29

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

2.3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 31

2.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình

thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 33

2.3.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 34

2.3.5 Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 39

3.1.1 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được 39

3.1.2 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được 41

3.1.3 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã 43

3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 44

3.2.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 44

3.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 50

3.3 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng 56

3.4 Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu được 70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 73

4.1 Kết luận 73

4.2 Đề xuất ý kiến 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei 6

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên 33

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án 34

Bảng 2.4 Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm 35

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD 36

Bảng 3.1 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 44

Bảng 3.2 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 50

Bảng 3.4 Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RMS-CCD 57

Bảng 3.5 Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 58

Bảng 3.6 Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 58

Bảng 3.7 Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã 58

Bảng 3.8 Kết quả phân tích ANOVA 59

Bảng 3.9 Bảng tổng hợp các tiêu chí lựa chọn chế độ xử lý tối ưu cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm 67

Bảng 3.10 Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm 70

Bảng 3.11 Một số chỉ tiêu sinh hóa học của dịch thủy phân protein từ đầu tôm 71

Bảng 3.12 Thành phần % các axit béo 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease 11

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein 14

Hình 1.3 Sơ đồ chức năng chuyển đổi 20

Hình 1.4 Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng 21

Hình 1.5 Thiết kế Box-Behnken 23

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng 32

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein 37

Hình 3.1 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được 39

Hình 3.2 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được 41

Hình 3.3 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã 43

Hình 3.4 Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 45

Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 47

Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 48

Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 49

Hình 3.8 Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 51

Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzymem, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân 53 Hình 3.10 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử 54 Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân 55 Hình 3.16 Đồ thị của hàm lượng protein hòa tan , nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại 62 Hình 3.17 Đồ thị ei vs Run của hàm lượng protein hòa tan, nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại 63 Hình 3.18 Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 69 Hình 3.19 Biểu đồ Contour cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 69 Hình 3.20 Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã 70 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn thành phần % của các axit amin có trong dịch thủy phân tối ưu 72

Da : Dalton (Đơn vị khối lượng phân tử peptid)

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay ở nước ta ngành chế biến thủy sản đã trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Trong đó, mặt hàng tôm được coi là một trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản chủ lực có mức tăng trưởng khá cao

Với sự phát triển ngày càng cao của khoa học công nghệ, bên cạnh các sản phẩm chính, nguyên liệu còn lại bao gồm đầu và vỏ tôm cũng đã và đang được tận dụng một cách tối đa và hiệu quả như sản xuất bột đạm, thức ăn chăn nuôi, tách chiết astaxanthin, sản xuất chitin-chitosan Điều này đã góp phần to lớn trong việc

xử lý ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị cho ngành thủy sản và tạo thêm nhiều công ăn việc làm, thu nhập cho người dân

Trong phế liệu đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với đủ các thành phần axit amin không thay thế và có giá trị cao về mặt sinh học Vì thế việc nghiên cứu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm này là hết sức cần thiết

Một số nghiên cứu về quá trình thủy phân protein trên đầu tôm đã được quan tâm thực hiện ở nước ta nhưng phương pháp bố trí thí nghiệm được sử dụng chủ yếu là phương pháp cổ điển, vì thế chưa đánh giá được đầy đủ tác động của các yếu

tố ảnh hưởng Nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân protein trên đầu tôm là một quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố

như nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân… (Diniz and Martin 1997a; Deng et al 2002) Vì vậy để có thể hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng và sự tương tác

qua lại của chúng cần sử dụng các công cụ toán học hiện đại để hỗ trợ Box và Wilson đã giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), một công cụ hết sức hiệu quả cho phép nghiên cứu tối ưu các quá trình thủy phân

Trước tình hình đó, dưới sự hướng dẫn của thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và

cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase”

2 Mục đích của đề tài

 Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu trên đầu tôm thẻ chân trắng với Alcalase bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để thu hồi đồng thời protein và chitin

 Đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ là dữ liệu khoa học về sử dụng enzyme trong thu hồi sản phẩm hữu ích từ nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm, đồng thời cho phép tối ưu hoá quá trình sản xuất ở qui mô pilot

4 Nội dung đề tài

 Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thuỷ phân và việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm

 Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm

 Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase

 Đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về phế liệu tôm

1.1.1 Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam

Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km với vùng đặc quyền kinh tế 1.000.000 km2rất thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản Theo số liệu thống kê của Tổng cục Thủy sản, tổng diện tích nuôi tôm cả nước đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 đến 381.728 ha năm 2008 Năm 2011, diện tích nuôi tôm cả nước đạt 656.425 ha tôm, sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71% về diện tích và 5,48% về sản lượng so với năm 2010 Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, tôm thẻ chân trắng là 33.049 ha, sản lượng đạt 176.451 tấn [18]

Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn là vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước với diện tích 602.416 ha (bằng 91,8% diện tích cả nước), trong đó diện tích tôm sú là 588.419 ha, tôm thẻ chân trắng là 18.998 ha Sản lượng thu hoạch đạt 368.983 tấn, bằng 74,4% sản lượng của cả nước, trong đó, tôm sú là 296.958 tấn, tôm thẻ chân trắng là 71.025 tấn Cà Mau là tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn nhất với 266.600 ha [18]

Theo như báo cáo, phương pháp nuôi tôm phổ biến hiện nay là theo phương pháp thâm canh, bán thâm canh và nhiều địa phương đã tiến hành nuôi tôm theo phương pháp quảng canh cải tiến nhằm nâng cao năng suất và thân thiện hơn với môi trường [19]

Xuất khẩu tôm của Việt Nam tăng trưởng liên tục hằng năm Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), tính trung bình trong đầu những năm 2000, sản lượng tôm đông lạnh xuất khẩu hằng năm đạt khoảng 150.000 tấn, trị giá gần 1tỷ USD Trong 6 tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ

năm 2010 Trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD [15]

Tôm của Việt Nam đã có mặt trên 70 thị trường ở khắp các châu lục trên thế giới Có hơn 50 mặt hàng tôm đông lạnh xuất khẩu, được chế biến dưới nhiều dạng sản phẩm khác nhau như tươi sống, đông lạnh, các sản phẩm chế biến sẵn, chế biến

ăn liền, các sản phẩm phối chế, các sản phẩm khô, đóng hộp, làm lên mem chua [20]

Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), từ nay đến năm 2015, tiêu thụ thủy sản tính theo đầu người trên toàn cầu sẽ tăng trưởng khoảng 0,8%/năm, tổng nhu cầu thủy sản và các sản phẩm thủy sản sẽ tăng khoảng 2,1%/năm Như vậy, có thể thấy, nhu cầu thủy sản thế giới năm 2012 sẽ tiếp tục tăng so với năm nay, đó là một điều kiện thuận lợi để các doanh nghiệp thủy sản Việt Nam tiếp tục đẩy mạnh xuất khẩu trong năm tới, nhất là với các thủy sản nuôi trồng như tôm, cá tra

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản

Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến Hằng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn, khoảng 70.000 tấn, riêng ở tỉnh Khánh Hòa lượng phế liệu này vào khoảng 2.300 tấn/năm [21], trong đó chủ yếu là phế liệu tôm

Phế liệu tôm là những thành phần còn lại từ quá trình sản xuất các sản phẩm tôm đông lạnh xuất khẩu bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu Tùy thuộc vào loài và các biện pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm [1] Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng đã bóc vỏ, bỏ đầu Phần đầu thường chiếm 34 ÷ 35%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10 ÷ 15% trọng lượng của tôm nguyên liệu Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng của chúng Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 28%, vỏ chiếm 9% trọng lượng tôm [6] Như vậy, tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%

Với sản lượng tôm nguyên liệu ngày một gia tăng như hiện nay, lượng phế liệu tôm do các nhà máy chế biến thủy sản thải ra là không hề nhỏ Đây sẽ là nguồn cung cấp nguyên liệu khá dồi dào cho các ngành công nghiệp tận dụng nguồn phế liệu thủy sản để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị khác

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm

1.1.3.1 Thành phần hóa học của phế liệu tôm [1]

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxi cacbonate, khoáng, sắc tố [3]…trong đó hàm lượng protein chiếm gần tới 50% [4]

Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý… Thành phần chitin và protein trong vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ

thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản…của tôm

- Protein

Protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó tách ra khỏi vỏ, tồn tại dưới dạng tự do và dạng phức tạp

+ Protein ở dạng tự do thường tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các

cơ gắn phần vỏ tôm Ở phế liệu tôm thì dạng này có nhiều ở phần đầu tôm, đó

là phần thịt đầu còn sót lại [2]

+ Protein ở dạng phức tạp liên kết với chitin, CaCO3 như một thành phần thống nhất của vỏ tôm Đặc biệt là phức hợp protein – astaxanthin trong vỏ tôm được gọi là hợp chất cartenoprotein, hợp chất này vừa có giá trị dinh dưỡng rất lớn vừa có những đặc tính sinh học quý của astaxanthin [2]

- Enzyme

Trong đầu tôm chứa một lượng không nhỏ enzyme nội tại, đó là enzyme protease Nó tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm Hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đv hoạt độ/g tươi Ngoài ra còn có enzyme alkaline phosphatease, chitinase, -N-acetyl glucosamidase, lipaza, tyrozinaza

- Chitin

Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác

bị oxi hóa thành Astaxin

- Chất ngấm ra ở đầu tôm

Trymethylamin (TMA), trymethylamin N oxide (TMAO), betain, bazo purin, các axid amin tự do, urê

- Ngoài ra còn có một lượng đáng kể lipid, một lượng nhỏ photpho

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei

1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm

Phế liệu tôm từ các khâu chế biến cần được thu hồi và bảo quản thích hợp

Do thành phần và tiềm năng sử dụng của các thành phần phế liệu như đầu, vỏ… là khác nhau nên cần phải thu gom riêng để dễ dàng cho việc tận dụng sản xuất các chế phẩm khác

Một số hướng tận dụng phế liệu tôm:

1.1.4.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Hiện nay ở nước ta đa số sử dụng phế liệu của tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy hiện nay có chứa bột tôm

và nó chiếm 30% thành phần thức ăn Bột tôm được chế biến tốt có chứa axit amin tương tự như amin trong đậu tương hay trong bột cá Phế liệu tôm có chất lượng càng cao thì bột tôm có chất lượng càng cao Do vậy việc xử lý và chế biến phế liệu

có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm có chất lượng cao Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì nó cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và axit béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng

Hiện nay có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bột tôm là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xi lô:

- Phương pháp sấy khô bằng nhiệt

Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, có thể chế biến nhanh lượng phế liệu tôm đông lạnh, tính kinh tế cao

Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

- Phương pháp ủ xi lô

Ở phương pháp này người ta sử dụng axit hữu cơ và vô cơ trong việc ủ nhằm tăng tác động của enzyme khử trùng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp

1.1.4.2 Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin

Trong thành phần của vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn chitin, vì vậy có thể sử dụng để sản xuất chitin-chitosan, sản xuất chitin-chitosan bao gồm các bước: tách khoáng, tách protein, deacetyl bằng nồng độ cao Sản phẩm chitin đem đi thủy phân bằng NaOH đậm đặc thu chitosan hoặc thủy phân bằng HCl đặc để thu glucosamine, chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, xây dựng…đặc biệt là trong y học

1.1.4.3 Sản xuất màu Astaxanthin

Trong phần vỏ của phế liệu cũng chứa sắc tố astaxanthin, tuy nó có hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại cao trên thị trường (2500 USD/kg) Astaxanthin còn

là một carotenoid có tác dụng kích thích tăng trưởng, kháng một số bệnh Nó là chất tạo màu nên được sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, thực phẩm, công nghiệp Vì hiện nay vấn đề tận dụng Astaxanthin trong công nghiệp chế biến phế liệu tôm là vấn đề đang được nhiều nước quan tâm

1.1.4.4 Làm các sản phẩm định hình

Thịt tôm vụn hoặc không đạt tiêu chuẩn có thể được chế biến thành các sản phẩm định hình như tạo thành hình con tôm hay các hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm Bằng cách tạo ra các hình dạng khác nhau, tẩm ướp tẩm gia

vị hay bao bột, người ta có thể làm ra rất nhiều sản phẩm tôm đẹp mắt Các sản phẩm này thường được làm chín trong các lò vi sóng

1.1.4.5 Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị

Ngoài ra từ phế liệu tôm có thể tận dụng để chế biến thành nhiều sản phẩm khác như đầu tôm sau khi được loại bỏ vỏ có thể chế biến thành mắm tôm và gia vị, nó cũng được tận dụng làm nguyên liệu tạo mùi cho món súp tôm đặc, tôm vụn được dùng làm món canh tôm

1.2 Enzyme protease và quá trình thủy phân protein

1.2.1 Enzyme protease [5]

Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (-CO ~ NH-) trong phân tử polypeptide, protein và các cơ chất tương tự thành các amino acid tự do

hoặc các peptid phân tử thấp [24]

Hiệu suất xúc tác của nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn hoặc hàng triệu lần

so với các chất xúc tác vô cơ khác Quan trọng hơn nữa là nó có khả năng xúc tác cho phản ứng hóa học xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, nhiệt độ và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng như cơ chất mà nó tác dụng, sản phẩm tạo ra tinh khiết, ít

tạp chất

1.2.1.1 Phân loại protease: có thể căn cứ vào các tiêu chí sau [5]:

- Cơ chế phản ứng của enzyme tham gia

- pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease kiềm, protease trung tính

- Nguồn thu các enzyme protease

- Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme

 Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:

 Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ

của mạch polypeptide

 Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon

của mạch polypeptide

 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptid

 Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nối mạch

 Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là:

 Endopeptidase: Là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch

polypeptide Chúng là những enzyme được sử dụng nhiều nhất để thủy phân protein cho tính đặc hiệu rộng hơn

- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những protease mà trong trung tâm

hoạt động của nó có nhóm (- OH) của axit amin serin Phân nhóm này gồm các enzyme như: Trypsin, Chymotrypsin

- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt

động của nó có nhóm Thiol (-SH) của axit amin xistein Nhóm này gồm các enzyme Cathepsin

- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease mà trong trung tâm

hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspartic như enzyme Pepsin

- Phân nhóm 4: Protease – kim loại Đây là những protease mà trong trung

tâm hoạt động của nó có ion kim loại Enzyme này hoạt động trong môi truờng trung tính Ví dụ như Collagenase

 Exopeptidase (peptidase): Là các enzyme không có khả năng thủy phân

liên kết peptid ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl

để lần lượt giải phóng ra các axit amin tự do ra khỏi chuỗi polypeptide Vì vậy, chúng còn được gọi là aminopeptidase hoặc cacboxypeptidase Ngoài ra, những exopeptidase còn có thể liên kết với các endopeptidase để thực hiện một sự thủy phân phức tạp hơn

1.2.1.2 Nguồn thu nhận protease: chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản sau [5]:

 Từ động vật: enzyme đuợc tách ra từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột

và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin…

 Từ thực vật: có thể thu nhận được papain từ đu đủ, bromelain từ thân, lá,

vỏ dứa

 Từ vi sinh vật: cũng là nguồn thu nhận enzyme rất phong phú, thường là

các loài aspergillus, bacillus, clostridium, streptomyces và một số loài nấm men

 Trong các nguồn nguyên liệu này thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì nó có những ưu điểm sau:

- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất

- Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn, do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 ÷ 60h

- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn

- Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các nguồn khác vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền

Do những đặc điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.2.1.3 Cơ chế tác dụng của protease [5]

Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặc hiệu cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra

khi có yếu tố nước tham gia Thông thường enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất phải trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức

hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết Hydrogen, liên kết Vandecvan

Giai đoạn 2: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ chất,

dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được

giải phóng ra dưới dạng tự do nhưu ban đầu

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease

Trong đó: P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích thước khác nhau được tách ra

Cách tác động: Endoprotease tiến hành tách các liên kết peptid ở bên trong

của nhánh polypeptide, trong khi exopeptidase tách rời các axit amin ở vị trí đầu tiên và cuối cùng của nhánh polypeptide

Trong đó,

a: nồng độ tyrosine (µmol/ml)

b: độ pha loãng của dịch enzyme

c: thể tích của dịch thu được để đo (ml)

t: thời gian xảy ra phản ứng (phút)

1.2.1.5 Enzyme Alcalase

Enzyme Alcalase là một loại enzyme endoprotease có hoạt độ cao, thu được

từ Bacillus licheniformis Đây là enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi

sinh vật Sử dụng enzyme Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượng base yêu cầu để duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các axit amin vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các axit amin thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000)

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷10oC

Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8

1.2.1.6 Hệ enzyme protease của tôm

Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein, các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều Các enzyme tiêu hóa đặc biệt là enzyme tiêu hóa protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của

cá Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, actacine Qua một số nghiên cứu của một số tác giả cho thấy enzyme từ tôm nói chung là các protein kiềm tính Các enzyme này có tính chất chung của enzyme:

- Hòa tan trong nước, dung dịch nước muối và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa, ethanol aceton để thu chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hay giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hoặc chất ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ,

pH môi trường

Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sản khác là các enzyme nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa đến nội tạng và cơ thịt Do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng của tôm nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều nhất ở phần đầu

- Trypsin: Có trong dịch vị tụy tạng, khả năng tác dụng của trypsin khá

mạnh với các loại protein có phân tử lượng thấp ở các liên kết peptid Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38oC

- Peptidase, ereptase và các loại khác: Tham gia thủy phân liên kết peptid

và các polypeptide Khả năng tác dụng cũng như tính đặc hiệu của enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm liền kề bên mối liên kết peptid

- Cacbonhydrase: Enzyme này xúc tác thủy phân các glucid và glucozit

Ngoài ra, trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin [11] được

sử dụng trong điều trị ung thư, ngoài ra trong vỏ tôm còn có một số enzyme

khác như alkaline photphatase, deacetylase, chitinase, β-N-acetylglucosamidase

[1] cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế

Đa số các enzyme nội tại trong phế liệu tôm là các enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân cắt mạch protein, cho nên khi tiến hành quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cũng cần quan tâm đến enzyme nội tại này

1.2.2 Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease

1.2.2.1 Protein thủy phân [7], [8]

Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên peptid Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein

H2N – CH – CO – NH – CH – CO – … – NH – CH – COOH + (n-1) H2O

R1 R2 Rn

enzyme

H2N – CH – COOH + H2N – CH – COOH +…+ H2N – CH - COOH

R1 R2 Rn Trong môi trường nước, sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.1

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự tấn công nuclephilic bởi phân tử nước, tạo thành axit cacboxylic và amin Nhóm cacboxyl và nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽ hình thành anion RCOOH- và cation R-NH3+

Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion RCOOH- và cation R-NH3+ Vì vậy trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Sự thủy phân protein xảy ra rất chậm ở điều kiện bình thường như pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như axit amin Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease hay proteinase Quá trình thủy phân diễn ra như sau:

Enzyme enzyme enzyme

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme Độ thủy phân tối đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng cả enzyme

1.2.2.2 Phương pháp sản xuất protein thủy phân [9]

Để sản xuất protein thủy phân người ta thường sử dụng hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu hoặc bổ sung enzyme để thủy phân protein thành các phần peptid, axit amin và thu hồi chúng Trong đó, có hai cách làm, là ủ xi lô và bổ sung enzyme protease

- Phương pháp ủ xi lô: thủy phân nguyên liệu nhờ các enzyme có sẵn trong nguyên liệu, ngoài ra còn có sự hỗ trợ của acid hữu cơ được bổ sung vào Chất lượng của protein thu được theo phương pháp này chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng các axit amin

Trong vài giờ đầu của quá trình thủy phân, lượng axit amin thiết yếu tăng lên Tuy nhiên không nên kéo dài giai đoạn thủy phân vì khi đã đạt đến hiệu suất tối đa

mà tiếp tục thủy phân trong môi trường axit sẽ làm giảm hiệu suất các axit amin thiết yếu Phương pháp này có nhược điểm là giảm hiệu suất của các axit amin thiết yếu Tuy nhiên ưu điểm của phương pháp là tận dụng được các enzyme protease có sẵn trong bản thân nguyên liệu, phương pháp đơn giản, không sử dụng máy móc, thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện

- Phương pháp bổ sung enzyme protease: cũng giống như phương pháp ủ xi

lô là lợi dụng hoạt động thủy phân protein của protese để thu hồi protein Tuy nhiên,

để giảm thời gian thủy phân người ta bổ sung enzyme protease với hàm lượng nhất định để đẩy tốc độ phản ứng thủy phân

Ngoài ra, người ta còn dùng phương pháp thủy phân bằng axit, kiềm người ta thường dùng axit HCl 6N dư ở nhiệt độ 100 – 120oC trong khoảng 24 giờ Sản phẩm thu được chủ yếu là các axit amin tự do ở dạng hydrogenclograte Và người ta cũng có thể thu được axit amin bằng cách thủy phân với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ Sản phẩm thu được hầu hết là các axit amin nhưng đều bị racemic hóa

1.2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein [9]

Thành phần của protein thủy phân gồm các peptid và các axit amin khi sự phân giải protein được gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung Nó dường

như là thành phần ứng dụng khoa học dinh dưỡng của protein thủy phân không tinh chế, nó có thể giúp ích chút ít hơn peptid tinh chế từ sự hút của oligopeptid được tăng lên sự do có mặt của nó đường và axit amin

Peptid từ thực phẩm được coi là hợp chất an toàn và có lợi cho sức khỏe, chúng có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định Chúng có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều chức năng sinh học như chống tăng huyết áp, điều hòa miễn dịch…[10] trong đó có chức năng chống oxi hóa Có sự ức chế quá trình peroxid lipid, lọc sạch các gốc tự do và kiềm hãm sự chuyển đổi ion kim loại của các peptid chống oxi hóa Khả năng chống oxi hóa của các peptid có liên quan tới kết cấu của chúng, cấu trúc và tính không ưa nước Sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các axit amin cấu thành các peptid trong chuỗi peptid giữ một vai trò quan trọng trong chức năng chống oxi hóa của peptid Liên kết peptid phản ánh cấu trúc rõ ràng, cụ thể của peptid, đồng thời cũng được khẳng định là có ảnh hưởng đến phạm vi chất chống oxi hóa của peptid Khối lượng phân tử của peptid cũng ảnh hưởng đến hoạt động chống oxi hóa của nó, peptid có khối lượng phân tử trong khoảng 500 – 1500 Da là

có hoạt động chống oxi hóa tốt nhất

1.2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein [5], [7]

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 50oC và nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị bất hoạt

Do vậy, nhiệt độ 70oC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme

Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng

10oC thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 – 2 lần Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất

b Ảnh hưởng của pH

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích pH tối thích của đa số enzyme nằm trong

vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm Phế liệu tôm có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác

c Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol…đồng thời khi kéo dài, hiệu quả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thuỷ phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn đến hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein

d Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

e Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng

độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa thì vận tốc của quá trình thủy phân cũng rất ít thay đổi

f Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là phế liệu tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme Quá trình này cứ tiếp tục xảy

ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

g Độ tươi của nguyên liệu

Độ tươi của phế liệu tôm có vai trò quan trọng quyết định đến chất lượng của sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủy phân và chitin Độ tươi của phế liệu tôm giảm thì làm giảm chất lượng của bột protein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành những sản phẩm cấp thấp như: indol, scaptol, NH3, H2S…gây ra mùi khó chịu cho sản phẩm

h Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra Do vậy, quá trình thủy phân đầu tôm nếu

ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu

bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy ta phải xác định tỷ lệ nước bổ sung thích

hợp cho quá trình thủy phân

1.3 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [13]

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng Phương pháp này đã được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951

Ý tưởng chính của RSM là sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế

để có được một phản ứng tối ưu Để làm điều này, Box và Wilson đã sử dụng một

mô hình đa thức bậc hai Mô hình này chỉ là xấp xỉ, nhưng lại tương đối dễ dàng áp dụng

1.3.1 Nguyên tắc [14]

Trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian – thời gian ngẫu nhiên cho những biến kích thích Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi) Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu Những mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biến đầu vào Xi (i = 1, …,n) cũng được gọi là những biến cơ sở Chúng được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê µj (j = 1,…,p) (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa…) Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian – thời gian

Sự chuyển đổi này của các biến kích thích có thể được thể hiện bằng sơ đồ hình1.3:

Hình 1.3 Sơ đồ chức năng chuyển đổi

Nói chung, hình thức rõ ràng của chức năng chuyển đổi này tùy thuộc vào các biến cơ sở là không được biết đến, và việc nghiên cứu về tính xấp xỉ được gọi là chức năng đáp ứng trở nên cần thiết Thông thường hơn, nó xuất hiện trong một họ chức năng thường là tuyến tính hoặc phi tuyến tính và được đặc trưng hóa bởi những thông số Xk (k=1,…,l) một cách ngẫu nhiên hay xác định Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa trên một cơ sở của những số liệu thí nghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ mét cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số Xk Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng

Chức năng đáp ứng có thể được viết dưới dạng như trong hình 1.4

Biến kích thích Xi

Hàm mục tiêu Y Chức năng

chuyển đổi

Hình 1.4 Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng

Để xây dựng một bề mặt đáp ứng, cần phải khai báo:

- |.|: hệ mét trong không gian của biến cơ sở và hàm mục tiêu Nó cho phép

đo được chất lượng điều chỉnh từ sự xấp xỉ Ψ đến mục tiêu Y

1.3.2 Công dụng của RMS [13]

- Xác định các mức yếu tố làm thỏa mãn đồng thời các thông số kỹ thuật

mong muốn

- Kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tố để cho ra kết quả mong muốn đạt được

và mô tả kết quả tối ưu đó

- Cho ra một kết quả đặc trưng khi nó bị ảnh hưởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tố vượt quá mức đang quan tâm

- Đạt được một sự hiểu biết về định lượng của hệ thống xử lý vượt quá vùng thử nghiệm

Ψ (X/µ) = Y (χ, X/µ)

Thông số Biến kích thích

sắp xếp

- Sản xuất các sản phẩm đặc trưng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố không chạy

- Tìm ra các điều kiện cho một quá trình ổn định = dấu hiệu vô tình

1.3.3 Ưu, nhược điểm của RMS [13]

Ưu điểm:

- Mang tính thực tế vì số liệu được lấy từ thực nghiệm

- Có thể áp dụng cho bất kỳ hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra

- Đánh giá được tác động của các yếu tố ảnh hưởng

- RMS thiếu việc sử dụng các nguyên tắc thống kê

1.3.4 Các mô hình thí nghiệm trong RMS

1.3.4.1 Thiết kế Box-Behnken (BBD) [23]

Thiết kế Box-Behnken làm đầy cho một khối đa diện, xấp xỉ một hình cầu

Nó được áp dụng cho 3 mức yếu tố (chạy 15 thí nghiệm), trong đó có 3 thí nghiệm

ở tâm BBD là sự kết hợp giữa thiết kế 2-level Factorial với thiết kế blokc chưa đầy đủ

Hình 1.5 Thiết kế Box-Behnken cho 3 yếu tố - (a) dưới dạng hình học và (b)

dưới dạng thiết kế

1.3.4.2 Thiết kế Central composit (CCD) [24]

Thiết kế Central composit (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các

mô hình quy hoạch thực nghiệm Nó được cấu thành từ 3 thành phần:

- Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều Nếu k>5 có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1

- 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố các tọa độ của các điểm sao là (±α, 0, 0,…0), (0,±α, 0,…0), (0, 0 ,…,0, ±α), α là khoảng cách

từ tâm phương án đến điểm sao được gọi là cánh tay đòn sao Các điểm sao là cần

thiết để mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của 1 yếu tố đơn để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bii trong phương trình hồi quy bậc 2

- Nghiệm phương trình ở tâm phương án dùng để tìm phương sai tái hiện Cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối ưu, thường là phuơng án trực giao hay phương án quay

Phương trình hồi quy (mô hình hóa) được biểu diễn bằng pt sau:

Ta có:

i N

i ij

Nếu dùng phương trình hồi quy đầy đủ hơn có kể đến các hiệu ứng tương tác hai biến:

y= bo + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b23x2x3 + b13x1x3

Thì

i N

i ij

i i

1.4 Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm

Honlada và Netto, 2006 nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pancreatin

Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein,

31,98% tro và 19,92% chitin Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60ºC, pH=8,5 Kết quả cho thấy khi tăng độ thủy phân (%DH) từ 6% tới 12% thì thu được 26% và 28% protein tương ứng Alcalase có ảnh hưởng nhiều hơn pancreatin, có thể thu hồi protein từ 4,7 đến 5,7 mg astaxanthin/100g phế liệu khô tại DH 12%

Năm 2007, bằng các test thử về khả năng chống oxi hóa, một nhóm các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra chất chống oxi hóa có trong Mungoong, một món ăn truyền thống của người Thái Lan được làm từ dịch chiết từ phế liệu của tôm Qua nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng Mungoong chứa các chất chống oxi hóa Dịch hòa tan từ sản phẩm này có hoạt tính chống oxi hóa cao bởi các test thử DPPH,

ABTS radical scavenging activities and FRAP Hoạt tính chống oxi hóa phụ thuộc vào nồng độ dịch hòa tan từ sản phẩm này

Wenhong Cao và các cộng sự, 2008 đã nghiên cứu thu hồi protein của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng cách cho đầu tôm tự thủy phân và có sự điều chỉnh nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt độ dần lên từ 40÷70ºC, cứ sau 30 phút thì tăng lên 5ºC, pH tự nhiên Kết quả cho thấy tại điều kiện nhiệt độ 40ºC, 50ºC, 60ºC thì hàm lượng protein thu hồi được tương ứng là 43,6%, 73,6%, 84,7% Và kết quả cũng chỉ

ra là khi nhiệt độ tăng từ 45ºC ÷ 60ºC là nhiêt độ mà enzyme nội tạng hoạt động mạnh nhất thì DH tăng từ 0 ÷ 48% sau 180 phút khi nâng nhiệt dần lên, lượng protein thu hồi cao nhất là 87,4% tại 60ºC

Năm 2009, nhóm các nhà khoa học người Thái Lan đã nghiên cứu sản phẩm lên men của tôm và giáp xác (Kapi, Koong-Som and Jaloo), đây là các sản phẩm truyền thống của Thái Lan Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sản phẩm lên men này có hàm lượng protein cao, và hầu hết các sản phẩm có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa tự nhiên và có lợi ích cho sức khỏe

Krushna Chandra Dora, 2011[12] đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các enzyme protease từ vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS) Ông đã nghiên cứu sử dụng các enzyme Alcalase, Neutrase và Flavourzyme cho quá trình thủy phân protein trong phế liệu tôm So sánh hoạt động thủy phân của các enzyme này, ông kết luận rằng Alcalase cho kết quả thủy phân tốt nhất Dùng phương pháp bề mặt đáp ứng, phương án central composit (CCD) để tối ưu quá trình thủy phân protein từ phế liệu tôm, ông đã đưa

ra được chế độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ thủy phân 59,37oC, ở pH 8,25, thời gian thủy phân 84,42 phút, nồng độ enzyme/cơ chất 1.84%, cho độ thủy phân 33,13% Protein thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng cao, chứa hàm lương protein cao (72,3%), axit amin (529,93 mg/g) với các axit amin thiết yếu

Hoạt tính sinh học từ protein tôm đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và qua khảo sát người ta đã thu được một số kết quả khả quan

1.4.2 Ở Việt Nam

Vũ Ngọc Bội đã sử dụng protease ở đầu tôm sú để thủy phân phế liệu tôm nhằm thu được dịch chiết và chất mùi từ phế liệu tôm

Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng

Lactobacillus plantarum lên men đầu tôm sú để thu hồi chitin Lên men đầu tôm có

tác dụng bảo quản và cho phép thu hồi một số sản phẩm có giá trị: chitin, protein, lipid, sắc tố Trong quá tình này sự khử protein là do hoạt động của hệ enzyme protease từ các vi khuẩn trong phế liệu ở giai đoạn đầu và hoạt tính protease yếu của vi khuẩn lactic Ngoài ra, axit lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hóa protein và thúc đẩy quá trình thủy phân tạo điều kiện cho một số protease hoạt động Sau 24 giờ phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa

xử lý là 12,99%

Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase để tiến hành thủy phân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong công nghệ sản xuất chitin – chitosan Tại nhiệt độ 54ºC, 8 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,22%; pH 8, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 thì thu được 52,7% protein so với ban đầu

Trang Sĩ Trung đã sử dụng enzyme Flavouzyme để tiến hành thủy phân phế liệu tôm Tại nhiệt độ 50ºC, 6 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,1%; pH 6,5 thì hiệu suất thu hồi khoảng 92 ÷ 95%

Những nghiên cứu trên đã cho biết được các thông số tối ưu cho một quá trình thủy phân protein trên đầu tôm Tuy nhiên, hầu hết phương pháp bố trí thí nghiệm vẫn là phương pháp cổ điển do đó chưa đánh giá được tác động của các yếu

tố đến quá trình thủy phân protein Chính vì thế việc nghiện cứu tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm bằng phương pháp bề mặt đáp ứng hiện đại hơn sẽ đánh giá được ảnh hưởng của từng yếu tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết Từ đó quá trình tối ưu sẽ trở nên dễ dàng và chính xác hơn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên

cứu Đầu tôm được lấy từ quy trình chế biến nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Nha Trang - Khánh Hòa

Nhiệt độ bảo quản: -20oC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang

Thời hạn sử dụng nguyên liệu: 1 tháng

2.1.2 Enzyme Alcalase

Enzyme Alcalase được mua tại công ty Novozyme, Tp Hồ Chí Minh

Hoạt tính 2,4 AU-A/g

2.1.3 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều thuộc loại phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không

bị biến đỏ, không lẫn tạp chất Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được loại bỏ sạch tạp chất, đảm bảo 100% là đầu tôm và được tiến hành làm thí nghiệm ngay Trong trường hợp chưa làm ngay thì được cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC

 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Bố trí các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme alcalase đến quá trình thủy phân protein, thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy

phân protein và thí nghiệm xác định chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân protein từ phế liệu đầu tôm bằng enzyme alcalase theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đặc trưng hóa các tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân bằng phương pháp cổ điển

2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

+ Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret theo Gornall

AG, Bardawill CT, David MM (1949)

+ Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu được bằng test kiểm tra khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH theo quy trình của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai , Toshiaki Ohshima (2010)

+ Xác định hàm lượng protein trên bã theo phương pháp của Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949)

+ Xác định hiệu suất khử protein theo công thức của Rao và cộng sự (2000):

DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O) Trong đó:

P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý

A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý

O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý

+ Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN

3700 - 1990

Độ ẩm mẫu được tính theo công thức:

Trong đó, A: Độ ẩm mẫu (%)

MT: Khối lượng mẫu trước sấy

MS: Khối lượng mẫu sau sấy + Xác định hàm lượng peptid hòa tan trong axit bằng phương pháp Lowry

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nguyên liệu đầu tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất

Trước khi thủy phân, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khả năng thủy phân protein bằng cách xử lý nhiệt ở 90oC trong 15 phút, đồng thời

Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước thủy phân và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein

Nguyên liệu (đầu tôm)

Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein

Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein

Đặc trưng hóa tính chất sinh học, dinh dưỡng của dịch thủy phân protein

kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách

bổ sung enzyme alcalase 0,1%

Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein

Sau khi xác định được giới hạn và miền nghiên cứu của các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm sao cho dịch thủy phân thu được có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học là cao nhất

Sau khi có thông số tối ưu, tiến hành đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân theo thông số tối ưu đó

2.3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4

Nguyên liệu

Không XL nhiệt

Bổ sung Alcalase 0,1%

Không khác nhau

Bất hoạt enzyme (90oC/10 phút)

Ép

Dịch thủy phân

Xác định hàm lượng protein hòa tan

Xác định khả năng chống oxi hóa

Xác định hiệu suất khử protein còn lại

So sánh đánh giá ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu

và việc bổ sung enzyme đến khả năng thủy phân protein

Bã