Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sóc chụm (glochidion glomerulatum) và loài sóc lông (glochidion hirsutum) ở việt nam tt

Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC

TẾ BÀO CỦA LOÀI SÓC CHỤM (GLOCHIDION GLOMERULATUM) VÀ LOÀI SÓC LÔNG (GLOCHIDION HIRSUTUM) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số : 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2018

Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phan Văn Kiệm

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Vũ Kim Thư

và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có khoảng 80% dân số sử dụng y học

cổ truyền, đặc biệt là dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc, kinh nghiệm sử dụng thuốc trong dân gian là một trong những yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thành công trong tìm kiếm các hợp chất dẫn đường để tổng hợp thuốc thông qua việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí và ít độc hại với cơ thể sống Do đó, cây dược liệu vẫn là đối tượng thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới trong nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất mới

Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, chi Bọt ếch (Glochidion) ở

Việt Nam có nhiều loài được sử dụng làm thuốc và dược liệu chữa các bệnh như: Sóc Dalton chữa lỵ trực trùng; Bòn bọt chữa viêm ruột và lỵ, viêm da do tiếp xúc, ngứa, viêm da tróc vảy, mày đay, eczema; ở Viện Dược liệu, lá cây Sóc mốc dùng làm thuốc mạnh gân xương và hàn vết thương; cây Sóc lông thường dùng chữa ỉa chảy, ăn uống không tiêu, sôi bụng, lá cây dùng trị rắn cắn, Các nghiên cứu về thành phần hóa học

cho thấy chi Glochidion chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm như

terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid và một số dạng phenolic khác Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa,

Do đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học

và hoạt tính gây độc tế bào của loài Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) và loài Sóc lông (Glochidion hirsutum) ở Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài G glomerulatum và G

hirsutum ở Việt Nam

Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:

1 Phân lập các hợp chất từ cành và lá hai loài G glomerulatum và

G hirsutum ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học;

3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Phần này trình bày tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế

về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Glochidion

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cành và lá loài Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) thu tại Phúc

Yên, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng 9/2012

Cành và lá loài Sóc lông (Glochidion hirsutum) thu tại Sơn Động,

Bắc Giang, Việt Nam vào tháng 12/2012

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao

gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), độ quay

cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được xác định theo phương pháp MTT và SRB

2.3 Phân lập các hợp chất

2.3.1 Phân lập các hợp chất từ loài G glomerulatum

Phần này trình bày quá trình phân lập 10 hợp chất từ loài G

glomerulatum

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G glomerulatum

2.3.2 Phân lập các hợp chất từ loài G hirsutum

Phần này trình bày quá trình phân lập 5 hợp chất từ loài G hirsutum

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G hirsutum

2.4 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất

2.4.1 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài

G glomerulatum

Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 10 hợp chất

phân lập được từ loài G glomerulatum

2.4.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài

G hirsutum

Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 5 hợp chất

phân lập được từ loài G hirsutum

2.5 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc

2.5.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum

- 10 hợp chất (GG1-GG10) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

trên 4 dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT

2.5.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài G hirsutum

- 5 hợp chất (GH1-GH5) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

trên 4 dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626, HepG2 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào SRB

*ĐC: Ellipticine được sử dụng là chất đối chứng dương

CHƯƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ

3.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc

10 hợp chất mới được phân lập từ loài G glomerulatum: Glomeruloside

I-II (GG1-GG2), Glomeruloside A-H (GG3-GG10) Mười hợp chất mới

đều là các hợp chất saponin khung olean-12-ene

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của 10 hợp chất mới phân lập được

C55H84O20 bởi sự xuất hiện của pic ion giả phân tử [M + Cl]- tại m/z:

1099,5260 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho anion [C55H84O20Cl]- là 1099,5250 đvC)

Phổ 1

H-NMR của hợp chất GG1 cho thấy tín hiệu proton của bảy

nhóm methyl dưới dạng singlet tại H 0,89 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,10 (3H, s) và 1,30 (3H, s); một proton

olefin tại H 5,35 (1H, br s); năm proton thơm tại H 8,05 (2H, d, J = 7,6 Hz), 7,49 (2H, t, J = 7,6 Hz) và 7,60 (1H, t, J = 7,6 Hz) gợi ý sự tồn tại

của một nhóm phenyl; 3 proton anome tại H 4,46 (1H, d, 8,0 Hz), 4,62 (1H, d, 7,6 Hz), 4,86 (1H) gợi ý hợp chất này có ba đơn vị đường Các tín hiệu proton của phần đường, tín hiệu proton dạng singlet của bảy nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường cao (δH 0,81 ~ 2,46) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin khung oleane

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo GG1A

Hình 3.3 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GG1 Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của hợp chất GG1

Phổ 13

C-NMR của hợp chất GG1 xuất hiện tín hiệu của 55 carbon

và được phân loại bằng phổ DEPT thành: 1 carbon carbonyl ( 167,18),

8 carbon không liên kết với hydro (C), 27 nhóm methine (CH), 12 nhóm methylene (CH2), 7 nhóm methyl (CH3) Trong đó, có 30 carbon thuộc phần khung triterpene, 18 carbon của ba đơn vị phân tử đường hexose, 7 carbon còn lại của nhóm benzoyl Các số liệu phổ proton được gán với các số liệu carbon tương ứng thông qua phổ HSQC Phân tích số liệu phổ

1

H- , 13C-NMR và phổ HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc khung olean-12-ene với các tín hiệu đặc trưng: 7 nhóm methyl tại C 16,12 (H

0,99, 3H, s), 16,80 (H 0,89, 3H, s), 17,29 (H 1,07, 3H, s), 27,49 (H 1,30, 3H, s), 27,49 (H 1,04, 3H, s), 28,32 (H 1,10, 3H, s) và 34,32 (H 0,93, 3H, s); hai carbon olefin tại C 124,23 (H 5,35, 1H, br s) và 143,40 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton Ngoài ra, sự tồn tại của 1 nhóm benzoyl được khẳng định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại C 132,10 (C-1), 130,43 (C-2 và C-6), 129,62 (C3 và C-5), 134,09 (C-4) và 167,33 (C-7)

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất GG1 Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất GG1

Nhận thấy các số liệu phổ NMR của hợp chất GG1 tương tự với hợp chất GG1A (Glochierioside A [14]) ở phần aglycone, sự khác biệt

chỉ đến ở hợp phần các đơn vị đường (bảng 3.1) Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất GG1 được thực hiện bằng cách so sánh với số liệu phổ tương ứng của GG1A và được khẳng

định lại bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC và COSY Tương tác HMBC từ H-24 (δH 0,89) tới C-3 (δC 91,90)/ C-4 (δC

40.54)/ C-5 (δC 56,87)/ C-23 (δC 28,32) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3 Đồng thời các tương tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui

kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0,99) tới C-1 (δC 39,94)/ C-5 (56,87)/ C-9 (δC 48,10)/ C-10 (δC 37,66)

và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C-1, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10 và C-25 Tương tác HMBC từ H-26 (δH 1,07) tới C-7 (δC 33,61)/ C-8 (δC 41,18)/ C-9 (48,10)/ C-14 (δC 44,20)

và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14 và C-26

Hình 3.7 Phổ HMBC của hợp chất GG1 Hình 3.8 Phổ 1 H– 1 H COSY của hợp chất GG1

Tiếp tục, tương tác HMBC từ H-27 (δH 1,30) tới C-8/ C-13 (δC

143,40)/ C-14/ C-15 (δC 37,55) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-

13, kết hợp với tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-27/C-27,

H-15/C-15, H-12/C-12) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15 và C-27 Các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0,93) và H-30 (δH 1,04) tới C-19 (δC 47,13), C-20 (30,98), C-21 (38,33) và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H-21/C-21) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29 và C-30 Các tương tác COSY giữa H-2/H-3, H-5/H-6, H-11/H-12, H-15/H-16, H-18/H-19, H-21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C-11, C-16, C-18

khẳng định bằng các tương tác HMBC của H-16 (δH 4,32), H-18 (δH

2,46) và H-22 (δH 5,91) tới C-17

Hình 3.1 Kết quả phân tích GC các đường chuẩn và hỗn hợp đường của hợp

chất GG1 sau khi thủy phân

a) Kết quả phân tích GC của L – glucose c) Kết quả phân tích GC của D – glucose b) Kết quả phân tích GC của L – galactose d) Kết quả phân tích GC của D – galactose

e) Kết quả phân tích GC của hỗn hợp đường của hợp chất GG1 sau khi thủy phân

Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đường trong hợp chất GG1

cũng được qui kết dựa trên dữ liệu phổ 13

C-NMR, phân tích phổ hai chiều COSY, HSQC, HMBC và kết quả phân tích GC sau khi thủy phân đường

của GG1 Kết quả thủy phân đường và phân tích bằng GC cho thấy hợp chất GG1 có chứa hai loại đơn vị đường với thời gian lưu lần lượt tR1 = 14,098 phút và tR2 = 18,713 phút (hình 3.9e) So sánh với kết quả phân tích GC của các đường chuẩn, quan sát thấy thời gian lưu tR1 = 14,098 phút tương tự với thời gian lưu của đường D-glucose (tR = 14,106 phút, hình 3.9b) và thời gian lưu tR2 = 18,713 phút tương tự với thời gian lưu của đường D-galactose (tR = 18,706 phút, hình 3.9d), điều này khẳng định

phần đường của GG1 có đường D-glucose và đường D-galactose Tương

tác HMBC giữa Gal H-1 (δ 4,46, d, J = 8,0 Hz) với aglyone C-3 (δ

91,90), chuỗi tương tác quan sát được trên phổ COSY gồm Gal H-1/ Gal H-2/ Gal H-3/ Gal H-4/ Gal H-5 cùng với các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép quy kết các giá trị phổ của đơn

vị đường galactose và liên kết O-glycoside của đường này với aglycone

tại C-3 Tương tác HMBC giữa Glc I H-1 (δH 4,86) và Gal C-2 (δC

76,40), cùng với chuỗi các tương tác COSY Glc I H-1/Glc I H-2/Glc I H-3/ Glc I H-4/ Glc I H-5/ Glc I H-6 cho phép qui kết các giá trị phổ của đơn vị đường Glc I và liên kết (1→2) giữa Glc I với Gal Các số liệu phổ carbon của Glc II (δC 105,24, 75,28, 77,32, 71,17, 78,07, 62,40)

và tương tác HMBC giữa Glc II H-1 (δH 4,62) với Gal C-3 (δC 85,25) cho thấy Glc II cũng là một đơn vị đường glucose tự do gắn với Gal bởi

liên kết (1→3) O-glycoside Những phân tích trên cho phép xác nhận cấu trúc chuỗi mạch trisaccharide liên kết với C-3 là O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-[β-D-glucopyranosyl (1→2)]-β-D-galactopyranoside.

Hình 3.2 Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chính của hợp chất GG1

Hóa lập thể khung aglycone của hợp chất GG1 tiếp đó được

minh chứng dựa trên phân tích phổ tương tác không gian ROESY Các tương tác ROESY giữa H-25/H-26, H-18/H-30 cho thấy các proton này gần nhau trong không gian và cùng định hướng beta như sinh tổng hợp của các hợp chất thứ cấp khung oleane Tương tự như vậy, tương tác ROESY giữa H-5/H-9/H-27 cũng minh chứng cho sự định hướng alpha

của các proton này Trên phổ ROESY của GG1 quan sát thấy tương tác

giữa H-3 (δH 3,22) và H-5 (δH 0,81) cho phép xác định proton H-3 định hướng alpha giống H-5, hay nhóm oxygen thế ở C-3 định hướng beta Ngoài ra, quan sát thấy tương tác ROESY giữa H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH

4,32) nhưng không quan sát thấy tương tác ROESY giữa H-18 (δH 2,46) với H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH 4,32), điều đó cho phép xác định proton H-

16 và H-22 cùng định hướng alpha, hay nhóm oxygen thế ở C-22 định

hướng beta Từ các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất

GG1 được xác định là

22β-benzoyloxy-3β,16β,28-trihydroxyolean-12-ene 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-[β-D-glucopyranosyl

(1→2)]-β-D-galactopyranoside Đây là một hợp chất mới theo cơ sở dữ liệu Scifinder

2015, hợp chất GG1 được đặt tên là Glomeruloside I Số liệu phổ 1

H- và

13

C-NMR của GG1 được tổng hợp tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất GG1 và hợp chất tham khảo

C #C a,b C a,c DEPT H a,d (độ bội, J, Hz)

a CD 3 OD, b tại 200 MHz, c tại 100 MHz, d tại 400 MHz

# C của GG1A (Glochierioside A [14])

Hình 3.11 Phổ ROESY của hợp chất GG1

3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài G hirsutum

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc

5 hợp chất mới được phân lập từ loài G hirsutum: Hirsutoside A-E

(GH1-GH5) Năm hợp chất mới này đều là các hợp chất saponin khung

olean-12-ene

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của 5 hợp chất phân lập được từ loài G hirsutum

Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một

hợp chất là GH1