Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo spirulina platensis

Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành và nâng cao chất lượng sinh kh

MỞ ĐẦU

Trong những năm cuối cùng của thế kỉ 20, các nhà sinh học đã phát hiện ra các

nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh Vi tảo (Microalgae) là những sinh

vật bậc thấp có trong sự chú ý đó vì chúng không chỉ có những cơ chế đặc thù màcòn sinh trưởng và phát triển cực kì nhanh Hàng năm có 200 tỉ tấn chất hữu cơđược tạo thành trên toàn thế giới, trong số đó 170- 180 tỉ tấn là do tảo tạo thành

Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất

Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối

vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành

và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộngtrong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn chođộng vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học,năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử lý môitrường

Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng dụngcòn chưa rộng Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh khối đểphục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành phần môitrường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do

đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưatốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa được triệt để, hiệu quả chưacao Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo quản giống tốt trong một thời giandài để chủ động được nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau

Trước những lý do như thế chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo

Spirulina platensis” Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất,

rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt và các phương pháp bảo quản giống trong mộtthòi gian dài để chủ động trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm

1.1.1 Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH)

Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học

về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệkhai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để sảnxuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao phục vụ cholợi ích, nhu cầu của con người đồng thời phát triển kinh tế- xã hội và bảo vệ môitrường [30]

Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với vaitrò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có thể

sử dụng được (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90% lượngoxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của người và động vật Chính điềunày đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời và đặc biệt xuất hiện Công nghệ sinh

học vi tảo với bộ 3 nổi tiếng là Chlorella, Scenedesmus và Spirulina, chúng có

nhiều giá trị trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Trong 3

nhóm tảo trên thì Spirulina hiện được chọn để phát triển sản xuất hơn 2 loại kia

do 5 ưu thế sau:

- Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trường: Spirulina

không những đơn giản trong nhu cầu dưỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sửdụng năng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ, nướcmặn, )…, tạo ra 16,8 tấn oxy/năm Điều này giúp bảo vệ môi trường khíquyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house)

- Giá trị sử dụng đã vượt ra khỏi ranh giới truyền thống là dùng làm thựcphẩm Theo Thạc sĩ- Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y Dược

TpHCM, Spirulina là nguồn dinh dưỡng quý của tự nhiên Nó có đủ các thành

phần thiết yếu: protein- lipid- glucid cùng khoảng 30 vi lượng và hầu hết các

dinh dưỡng- vi lượng khoáng- vitamin do FAO/WHO công bố và là sản phẩm cảithiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, các

khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) và các vitamin cần thiết, tảo Spirulina còn

có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật Có thể

dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song song đó, tảo Spirulina cũng có tác

dụng trong phòng chống một số bệnh ung thư do các hoạt chất tăng cường miễndịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen Năm 1996- 1997, mộtnhóm nhà khoa học người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất

mới trong Spirulina và đặt tên là Spirulan (Ca-Sp) Các thử nghiệm đã chứng tỏ

Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31]

- Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy,

Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân,

cadimi, nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29]

- Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất

hiện đại trong công nghệ sinh học:

+ Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người

và động vật Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh

thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá,phòng chống ung thư )v.v Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng cho sinh

khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten Sự thành công trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ phù hợp,

sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dược

+ Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân

lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận(receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó Kỹ thuật tân tiến này

đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau:

 Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi

sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus Một cách hiệu quả cắt đứt vector

truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng ) của chúng Hiện một sốnghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có thể thực hiện đượcđiều này Tuy vậy, việc phải sống trôi nổi trên mặt nước (môi trường ấu trùng cácloại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi lại là điểm không có hoặcyếu kém của các vi sinh vật này Do vậy có thể tách gen di truyền tạo phao khí

nổi trên mặt nước của Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo ra những đặc

điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh [1]

 Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: có thể ghép vào Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối nhanh,

đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp Trích ly chất P.H.B để sản xuất

nhựa thay thế nhựa dẻo (như polystyrene) và chất dẻo mới này dễ bị phân huỷ

không làm ô nhiễm môi trường v.v [22]

- Spirulina tương đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất: có thể thu hoạch từ

tự nhiên hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán tựnhiên với kỹ thuật đơn giản như nuôi trồng thuỷ sản, và nuôi ở quy mô côngnghiệp [11]

1.1.2 Phân loại học

Mang nhiều tên gọi khác nhau như Spirulina, Arthrospira và là một chủ đề

được thảo luận nhiều từ trước đến nay, nhất là khi cái tên “tảo” được nhắc đếnlần đầu tiên Năm 1852, việc phân loại học đầu tiên được viết bởi Stizenberger

Ông đưa ra tên loài mới là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào,

dạng xoắn Gomont đã khẳng định những nghiên cứu của Stizenberger vào năm

1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm loài không có vách ngăn là Spirulina và loài có vách ngăn là Arthrospira Như vậy, tên được công nhận là Arthrospira, nhưng trong những hoạt động khảo sát và nghiên cứu Arthrospira được gọi là Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến cho đến nay thay cho tên Arthrospira

1.1.3 Đặc điểm sinh học của Spirulina

Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]:

Chi : Spirulina (Arthrospira)

Spirulina có kích thước lớn hơn Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều

tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào Sợi tảo Spirulina có khả năng

chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục của sợi [13]

1.1.3.2 Đặc điểm cấu tạo

Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên

kết với màng Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi màng

polysaccharide nhầy Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa con người không phân cắt được Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng

10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành

Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit

nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất Thành tế

bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme,

pectin và các loại polysacharid khác Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế

bào và nối với màng quang hợp thylakoid tại một vài điểm Spirulina không có

lục lạp mà chỉ chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất.Màng thylakoid bao quanh các hạt polyphosphat có đường kính 0,5- 1μ thườngnằm ở trung tâm tế bào Sắc tố quang hợp chính là phycocyanin, bên cạnh đó còn

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis

có chlorophyll a Ngoài ra, tế bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có

không bào chứa khí làm chức năng điều chỉnh tỉ trọng tế bào Không bào khí có

vai trò rất quan trọng trong việc làm cho Spirulina nổi lên mặt nước [10].

Spirullina là một chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina không có ty thể

và mạng lưới nội chất, tuy nhiên tế bào vẫn có ribosome với hệ số lắng 70S vàmột số thể vùi như hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, cacboxysome vàhạt mesosome [10]

Thành tế bào dưới kính hiển vi điện tử hiện lên gồm 4 lớp: từ lớp L1 đến lớp

L4 (L1, L2, L3, L4) L1 và L3 chứa vật liệu dạng sợi L2 là một peptidoglycan giốngnhư ở tế bào vi khuẩn L4 được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục sợi

Spirulina [4].

Hình 1.2 cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm

ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3

Hình 1.2 Lát cắt tế bào Spirulina platensis

Lớp L1 và L3 có chức năng vận chuyển điện tử, do đó hai lớp L2 và L4 tậptrung các điện tử đó Độ dày của mỗi lớp từ 10-15nm, nên độ dày của toàn bộthành tế bào là khoảng 40- 60nm Các lớp L1, L3, L4 có độ dày bằng nhau, lớp L1lớn hơn [2]

1.1.3.3 Đặc điểm sinh thái

Spirulina là chi tảo lam phân bố rộng trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn

và suối nước nóng Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tựdưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đạiphân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định đạm rất cao, chúngkhông thể sống hoàn toàn trong tối…

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của các

yếu tố môi trường Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinhdưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối tế bào mà cònảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào

a) Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh

vật Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều tới quá trình phát triển Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo khác có

khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn năng lượngchính [28]

Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina đối

với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng bằngviệc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon Từ các

nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở cường độ

ánh sáng 1µmol m-2 s-1 khoảng bằng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời ở bướcsóng 400- 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và mối tươngquang giữa chlorophyll và sinh khối [28] Ngoài ra, cường độ chiếu sáng còn ảnhhưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo Một số nghiên cứu đãnhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của acid béo (PUFA)giảm [26]

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina là bởi

hai yếu tố chính đó là thời gian và cường độ chiếu sáng Quá trình nuôi cấy ngoài

trời thì cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20- 30klux Về thực hành nuôi cấy Spirulina thì cường độ ánh sáng tối ưu là 25- 30klux, ở

khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt được khoảng cường

độ chiếu sáng này trong nuôi cấy [11] Ngoài ra, cường độ ánh sáng còn phụthuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cường độ ánh sáng cao mà mật độ tảolớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận được cường độ ánh sáng nhỏ Nhiều loại vi tảo cócường độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lượng cường độ ánh sáng Vìvậy trong điều kiện ánh sáng có cường độ cao và thời gian chiếu sáng dài, người

ta thấy xuất hiện hiện tượng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảmđáng kể năng suất nuôi trồng [1]

Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất

tảo Spirulina càng cao Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục Như vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang [1]

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong khi ánh sáng được xem là nhân tố môi trường quan trọng nhất choquang hợp của vi sinh vật thì nhiệt độ là nhân tố cơ bản nhất cho sự sống củasinh vật Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất cả hoạt động sống của vi sinh vật như quátrình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng cũng như các đặc tính sinh lý khác.Nhiệt độ môi trường luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh hưởng đến bất

kỳ sinh vật nào Nhiệt độ môi trường nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ

bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếusáng Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thường xuyên được theo dõitrong công nghệ nuôi trồng vi tảo [28]

Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển mạnh ở

khoảng nhiệt độ 32- 400C Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina là 35- 380C

Ở nhiệt độ dưới 250C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên 380C tảo này

sẽ chết rất nhanh [21] Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát hiện Spirulina ở

những suối nước nóng đến 690C

Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo Theo mộtnghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 350C không ảnh hưởng xấu lên sản xuấtsinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và phenolic.Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác nhau [28].

Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo.Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò

quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina Sinh trưởng của

tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó

là một chế độ nhiệt tương đối ổn định

c) Ảnh hưởng của pH

pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina.

pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao Đây là ưu thế lớn

giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14]

Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độchiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác độngngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo Khi tảo phát triểncàng mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm cho sự sinhtrưởng và phát triển Do đó, pH môi trường quá cao hay quá thấp đều làm chậmquá trình sinh trưởng của tảo [20]

Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) thì pH môi trường từ 8,5- 9

là pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng và phát triển Ở pH này, nguồn cacbon

vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất Tuy nhiên ở pH= 10- 11 Spirulina vẫn có

khả năng phát triển nhưng rất chậm Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng mặc dù

Spirulina là loài tảo sống trong môi trường kiềm nhưng giá trị pH > 10,3 là có

hại cho môi trường nuôi cấy [6]

Vì vậy pH được coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dưỡngcung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí

CO2 hoà tan [11]

d) Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Spirulina có thể sống trong môi trường tự nhiên đến các môi trường nhân tạo

hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất khoáng cần thiết vào nguồn nước tựnhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan

Thành phần dinh dưỡng bao gồm cả nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg,

Na, Cl, Ca và Fe) và nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W) Tất cả điều ảnhhưởng đến sự sinh trưởng của tảo Trong đó, các nguyên tố vi lượng là thànhphần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme, có tácdụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyllnhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll và protein.Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid[14] Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tảo,tuy nhiên hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể khôngcung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của tảo do đó việc bổ sung vi lượng vàomôi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thườngđược bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịuđựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20]

1.1.4 Đặc điểm sinh sản

Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô

tính Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc củasợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạnNecridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản) Trong các Necridia hìnhthành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại

vị trí các đĩa này Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầuhormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi Cáchormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại mộtcách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo Kiểu sinh sản này thường gặp ở các

sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina

nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13]

Trong một số điều kiện sống không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo

bào tử giống vi khuẩn, đó là hình thức sinh sản vô tính Bào tử tảo có chứa nhiềuchất dinh dưỡng ở dạng dự trữ và được bao bọc bởi một lớp dày, khi gặp điều

kiện thuận lợi, chúng sẽ tạo thành sợi mới Chu kỳ phát triển của tảo Spirulina rất

ngắn, nuôi trong phòng thí nghiệm thì thời gian thế hệ của nó chỉ kéo dài trong

24 giờ, ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3- 5 ngày [7]

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina

- Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực

phẩm hiện nay 60- 70% trọng lượng khô, cao hơn trong thịt bò 3 lần, trong đậu

tương 2 lần Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin B1, 40mg vitamin

B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP, 190mg vitamin E,4.000mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1700mg (tăng thêm 1000% so với

cà rốt), 0,5mg acid folic, inosit khoảng 500- 1.000mg Phần lớn chất béo trong

Spirulina là acid béo không no, trong đó acid linoleic 13.784mg/kg, γ-linoleic

11.980mg/kg Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác Hàmlượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là580- 646mg/kg (tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan là 23- 25mg/kg,Magie là 2.915- 3.81mg/kg, selen là 0,4mg/kg, canxi, kali, phospho đều khoảng

là 1.000- 3.000mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%) Hàmlượng cacbonhydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucose

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Hình 1.4 Vòng đời của tảo Spirulina

chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư [34,35]

- Tảo Spirulina có chứa phong phú các acid amin cần thiết như lysin,

threonin rất quan trọng cho trẻ đặc biệt là trẻ thiếu sữa mẹ Hàm lượng khoángchất và các nguyên tố vi lượng phong phú có thể phòng tránh bệnh thiếu máu dothiếu dinh dưỡng một cách hiệu quả và cũng là nguồn bổ sung dinh dưỡng rất tốtcho trẻ lười ăn [34]

- Trong tảo Spirulina có chứa nhiều loại chất chống lão hóa như β-caroten,

vitamin E, acid γ-linoleic Những chất này có khả năng loại bỏ các gốc tự dothông qua tác dụng chống ôxi hóa, làm chậm sự lão hóa của tế bào, đồng thời sắt,canxi có nhiều trong tảo vừa dễ hấp thụ vừa có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trịcác bệnh thường gặp ở người già như thiếu máu, xốp xương [34]

- Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị bệnh viêm gan, suy gan, bệnh

nhân bị cholesterol máu cao và viêm da lan tỏa, bệnh tiểu đường, loét dạ dày tátràng và suy yếu hoặc viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị lực, bệnh

rụng tóc Với liều dùng vừa phải, Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp

các chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh lý [34]

- Tảo tiêu diệt được Candida albicans, một loại nấm thường kí sinh trong đường ruột của nạn nhân AIDS Hiện nay Spirulina còn được nghiên cứu invitro,

để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV Ngoài ra, tảo Spirulina có những tác

dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34]

1.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới

Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của người

dân Aztec (Mêhicô) và bánh Dihé của bộ tộc Kanembu (Cộng hòa Chad và

Niger) Việc phát hiện và phát triển tảo Spirulina ra khắp thế giới gắn liền với

lịch sử tìm ra châu Mỹ của Christophe Colomb năm 1492 Mãi đến năm 1960,khi Leonard và Comperé (người Bỉ) phân tích và công bố giá trị dinh dưỡng của

Tecuitlatl và Dihé chứa hàm lượng protein cao thì Spirulina được giới khoa học

quan tâm nhiều hơn Năm 1963, Giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa

Pháp là người đầu tiên nghiên cứu nuôi tảo Spirulina ở quy mô công nghiệp

thành công Năm 1967, nghiên cứu này đã được triển khai tại Công ty Sosa

Texcoco ở Mêhicô, Spirulina đã được nuôi trồng ở quy mô lớn trên suối nước khoáng giàu bicacbonat Tiếp sau đó, hàng loạt xí nghiệp sản xuất tảo Spirulina

đã xuất hiện ở Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,…[11]

Nhu cầu về các chất có giá trị cao trong tảo Spirulina dùng để làm thuốc và

thực phẩm chức năng ngày càng tăng Viện Nghiên cứu truyền nhiễm virus,trường Y khoa Harvard, Earthrise Farms (California) gần đây công bố nghiên cứucủa họ về khả năng ức chế sự nhân lên của virus HIV- 1 trong dòng tế bào T của

nước chiết từ Spirulina Nếu một người sử dụng 2- 3g tảo Spirulina sẽ giúp tăng cường sức khỏe và khả năng tự bảo vệ của cơ thể [27] Tảo lam Spirulina platensis có thể là chỉ thị tốt nhất cho một vài loại nước thải Spirulina có khả

năng loại bỏ kim loại nặng cadimi trong nước thải rất tốt, do độ hấp thụ cũng nhưhiệu suất hấp thụ kim loại của nó rất cao [29]

Ngoài các hướng nghiên cứu đã được chỉ ra ở trên, hiện nay đã có nhiều công

bố thông báo về khả năng chuyển gen ở tảo Spirulina bằng việc áp dụng công

nghệ gen, kỹ thuật DNA tái tổ hợp đang được thực hiện ở Nhật Bản và một số

nước, nhằm mục đích tạo ra những chủng giống Spirulina có những đặc tính

mong muốn cho định hướng ứng dụng như tăng cường khả năng tổng hợp acid linolenic hoặc là tạo chất dẻo sinh học dễ phân hủy…[22]

γ-Việc sử dụng tảo Spirulina platensis trong các nghiên cứu về vũ trụ là hướng

có triển vọng Ý tưởng về vi hệ sinh thái tự cung tự cấp “MELISSA” (MicroEcological Life Support System Alternative) cho các chuyến du hành vũ trụ sử

dụng tảo Spirulina platensis để chuyển nước thải, CO2, phân, nước tiểu thànhsinh khối tảo dinh dưỡng, H2O sạch và O2 cung cấp lại cho người đang đượcNASA (Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ) thử nghiệm ở dạng pilot [24]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nhập nội từ Pháp năm 1972 và trở thành đối

tượng nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, tại Viện Sinh vật học (nay là Viện Công nghệsinh học) do cố Giáo sư- TSKH Nguyễn Hữu Thước chủ trì Những thí nghiệm

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

nghiên cứu về tác động của ánh sáng, nhiệt độ, pH đã cho phép đẩy nhanh quátrình thích ứng của tảo này ở điều kiện Việt Nam Các nghiên cứu tác động của

các nguyên tố khoáng lên sinh trưởng và quang hợp của tảo Spirulina là cơ sở

cho việc thiết lập những môi trường dinh dưỡng rẻ tiền, thích hợp cho nuôi trồng

chúng Chính trên nền môi trường này, Spirulina đã được đưa vào thử nghiệm

nuôi trồng đại trà tại Hà Nội, Bình Thuận, Bến Tre, Thành phố Hồ Chí Minh [7]

Vào đầu thời điểm năm 1980, ở Thuận Hải, hai sản phẩm Spirulina đã được xí

nghiệp dược phẩm TW24 tung ra thị trường dưới tên gọi “Linavina” và

“Lactogyl” để làm thuốc bổ dưỡng Sinh khối Spirulina cũng được các đơn vị

như bệnh viện Thống Nhất, bệnh viện phụ sản Từ Dũ, bệnh viện tỉnh Thuận Hải,trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh tiến hành thử nghiệmchống suy dinh dưỡng ở trẻ em và người già [11, 18]

Trong khoảng thời gian 1981- 1985, Phòng Công nghệ Tảo- Viện Công nghệsinh học đã hợp tác chặt chẽ với Bộ môn Hóa Công nghệ trường Đại học Báchkhoa Hà Nội và Công ty Công nghiệp tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Bình Thuận)

để triển khai nuôi trồng Spirulina ở quy mô lớn tại suối nước khoáng Vĩnh Hảo

giàu bicacbonat và các chất khoáng khác, tận dụng gió, ánh sáng, nhiệt độ cao

quanh năm Ban đầu, Spirulina được nuôi trồng ở quy mô 60 bể (mỗi bể 45m3)với năng suất 8- 10g khô/m2/ngày Cũng trong thời gian này, hàng loạt nghiên

cứu ứng dụng sinh khối Spirulina cho gia cầm, cá, vịt, ong, tằm cũng đã được

thực hiện

Năm 1994, Nguyễn Thị Đệ đã tiến hành nghiên cứu vai trò và một số tính chất

của phycobiliprotein chính trong tảo Spirulina [3,17]

Năm 1996, Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền đã

khẳng định khả năng ứng dụng của phycobleu tách chiết từ Spirulina platensis

cho bệnh nhân ung thư Phycobleu có tác dụng nâng cao thể trạng cho bệnh nhânung thư vùng đầu, cổ trong thời gian chiếu xạ hoặc sau phẫu thuật và loại sảnphẩm này không gây phản ứng phụ nào [15]

Năm 1997, một nhóm nhà nghiên cứu đã thử nghiệm một số đặc điểm sinh lý,

sinh hóa của Spirulina platensis trong điều kiện chịu mặn NaCl và đã kết luận

rằng hàm lượng chlorophyll và carotenoid có khuynh hướng tăng khi tăng nồng

độ trong môi trường Như vậy muốn sản xuất nhiều chlorophyll và carotenoid thìtrong môi trường nuôi cấy có thể bổ sung thêm một ít muối NaCl [12] Năm

2008, Hoàng Sỹ Nam, Đặng Diễm Hồng đã tiến hành nuôi trồng thử nghiệm 2

chủng tảo Spirulina platensis CNT và Spirulina platensis C1 trong các loại nước

khoáng Thạch Thành- Thanh Hóa, Thanh Tân- Thừa Thiên Huế và Thanh

Liêm-Hà Nam đã cho kết quả là cả 3 loại nước khoáng điều có thể sử dụng để nuôitrồng tảo, trong đó loại nước khoáng ở Thanh Hóa thì cho chi phí nuôi tảo giảmđược một nửa mà chất lượng tảo vẫn đảm bảo để làm thực phẩm cho người vàđộng vật nuôi [9]

1.3 Các vấn đề trong nuôi tảo Spirulina platensis

Trước tình hình nhu cầu sử dụng tảo Spirulina trong các lĩnh vực khác nhau

ngày càng tăng ở Việt Nam, song lượng sinh khối tảo này sản xuất ra vẫn cònchưa đáp ứng đủ, do đó việc lựa chọn, tạo đột biến được những chủng giống tảo

Spirulina tốt là điều kiện trước tiên Ngoài ra, phải tìm được môi trường dinh

dưỡng thích hợp, rẻ tiền để nuôi trồng loài tảo này ở quy mô lớn, phù hợp vớiđiều kiện khí hậu Việt Nam nhằm không ngừng nâng cao năng suất và chất lượngsinh khối tảo là điều cần được quan tâm và có ý nghĩa thực tiễn to lớn

*Spirulina sản xuất ra đường (carbohydrate hoặc saccharide) trong suốt quá

trình chúng quang hợp Khi nồng độ các chất này trở nên dư thừa trong cơ thể,chúng sẽ tiết ra môi trường Vì những chất đường nhầy nên khi sợi tảo trườn lên

sẽ tạo ra khối nhầy và các sợi tảo sẽ không tiếp xúc được với môi trường dinhdưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói Chúng ta phải cảnh giác với 3 nguyên nhândẫn đến việc sản sinh đường quá mức, đặc biệt khi nhiệt độ cao đe dọa quangphân giải Thứ hai là thiếu nitrogen phức hợp trong môi trường vì nitrogen phứchợp trong tế bào được sử dụng để chuyển hóa polysaccharide thành protein Khichúng không được chuyển hóa thành protein thì chúng sẽ tiết ra môi trường Và

sự thừa bicarbonate hoặc thiếu sulfur trong môi trường cũng dẫn tới làm sản sinhđường dư thừa [12]

*Các vi sinh vật nhiễm tạp:

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

- Động vật chân chèo (Rotifers) kích thước từ 100- 2mm

Đôi khi một số động vật chân chèo rơi vào trong môi trường và chúng thường

sử dụng tảo làm thức ăn Vào ban đêm, tảo tiêu thụ oxygen và sản sinh ra CO2,khí này có tác dụng đầu độc động vật Vì vậy, nên dừng khuấy vào ban đêm vàtảo sẽ sử dụng oxygen hòa tan và do đó động vật thiếu oxygen chúng sẽ bị chết.Cách khác để hạn chế động vật là sử dụng chúng Dùng một lưới dài, hình túi(mắt lưới đường kính 10m) gắn bên trong bể, tại các góc bên phải theo hướng dichuyển của môi trường nuôi cấy như vậy các động vật này sẽ bị giữ lại trên lưới.Những động vật này là thức ăn rất tốt cho tôm hoặc cá con [12, 38]

- Amoeba

Những loài này khác với động vật nguyên sinh ở chỗ chúng ăn tảo R.R Kudo

đã mô tả 74 loài amoeba khác nhau Có một loài trong số chúng gây nguy hiểm

cho người đó là Entamoeba histolytica Chúng lan truyền bằng các bào tử “hình

trứng”, các bào tử này bị chết trong nước nhiệt độ 450C trong thời gian 1h và ởnhiệt độ 550C trong ít giây Nhiệt độ bên trong của thiết bị sấy sử dụng nănglượng mặt trời dao động từ 50-600C và qúa trình làm khô diễn ra trong suốt 4h, vìvậy nguy cơ tiềm ẩn từ những sinh vật loại này bị diệt trừ gần như tuyệt đối [12]

- Tảo

Môi trường nuôi cấy còn bị nhiễm các loại tảo khác Nhưng do nồng độ muối,

pH cao của môi trường, do đó thường trở nên không thuận lợi với đa số các loàitảo Ở nồng độ muối đạt 20 g/l hầu như các loài tảo bị tiêu diệt Tuy nhiên, loài

tảo silic Navicula, tảo xanh lục, và tảo lục Chlorella vẫn sống sót được trong các

bể nuôi Spirulina Chúng thường sống ở đáy bể và nếu như mật độ của Spirulina

trở nên dày đặc thì ức chế các tảo khác do ánh sáng không xuống được tới đáy.Trong trường hợp chúng phát triển mạnh thì người ta sẽ dừng khuấy, thu vớt sinhkhối tảo Spirulina trên bề mặt, chuyển chúng sang bể khác, tiếp theo rửa sạch bể

để loại bỏ tảo nhiễm tạp [12, 38]

*Môi trường nuôi cấy sau khi thu hoạch có mùi tanh nồng nếu thải ra môitrường sẽ bị ô nhiễm vì có tính kiềm mạnh vì vậy cần xử lý trước khi thải rangoài

1.4 Mật rỉ (hay rỉ đường)

Mật rỉ là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đườngkhông thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường Có hailoại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải Ở Việt Nam chỉ dùng rỉ đườngmía So với rỉ đường củ cải thì rỉ đường mía có lượng saccharose thấp hơn nhưnglượng đường khử cao hơn Rỉ đường thường chiếm khoảng 3- 5% trọng lượngcủa mía ép hay 100 tấn mía sẽ tạo ra 3- 5 tấn rỉ đường Thành phần của rỉ đườngmía phụ thuộc vào giống mía, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sảnxuất

Rỉ đường mía thu được khi chế biến đường thô là một hỗn hợp phức tạp cóchứa các đường lên men, các chất hữu cơ, chất có chứa nitơ cũng như các hợpchất vô cơ Trong rỉ đường có 15- 20% là nước, 80- 85% chất khô hoà tan Trongchất khô có từ 25- 40 % là đường, trong đó saccharose chiếm 30-35%, đườngglucose, fructose chiếm 15- 20%, còn lại những chất không phải là đường hoàtan trong nước gồm có 30- 32% là các chất hữu cơ như pectin, furfurol, acid hữu

cơ, caramen, các chất màu, acid amin, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và 20% là chất vô cơ có các ion: K+, Na+, Cl-, Ca2+, Mg2+, SO32- … [37]

18-Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá trìnhnuôi cấy Muốn sử dụng chúng cho quá trình nuôi cấy đòi hỏi phải có các quátrình xử lý thích hợp Các đặc điểm cần lưu ý mật rỉ bao gồm:

- Rỉ đường thường có màu sẫm Màu này khó bị phá huỷ trong quá trình nuôicấy Sau nuôi cấy chúng sẽ bám vào sinh khối sinh vật và bám vào sản phẩm.Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó khăn

Vì vây phải xử lý trước khi tiến hành quá trình nuôi cấy

- Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40- 50%) Lượngđường này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tớinồng độ thích hợp

- Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình nuôi cấy là hệ keo trong mật

rỉ Keo càng nhiều thì khả năng hoà tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

của oxy càng kém Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phảiphá hệ keo này.

- Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vậtxâm nhập và phát triển Như vậy chất lượng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thờigian bảo quản

Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong mật rỉ đối với quátrình lên men, người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc với lượng 3,5kgcho một tấn mật rỉ Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, ta có ba cách thực hiện quá trình

xử lý này :

+ Cách thứ nhất: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều

ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch trong

+ Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun toàn bộlên 850C và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong

+ Cách thứ ba: Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4, người tađun nóng đến 120- 1250C trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâmthu dịch trong

Thực hiện một trong ba cách trên sẽ thu được dịch mật rỉ đã loại thể keo vàmàu Từ mật rỉ đã qua xử lý này đem pha chế thành các loại môi trường có nồng

độ khác nhau Tuy nhiên giá trị của mật rỉ trong quá trình nuôi cấy thu nhận sinhkhối không chỉ do lượng đường saccharose có trong mật rỉ mà còn do các loạimuối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các thành phần khác quyết định[15]

1.5 Giới thiệu về hệ thống ánh sáng đèn Led trong nuôi cấy tảo

Vấn đề môi trường đang là thách thức lớn của nhân loại Việc thải khí CO2 củacác nhà máy điện sử dụng nhiên liệu hóa thạch được coi là một trong nhữngnguyên nhân chủ yếu gây hiệu ứng nhà kính làm cho khí hậu nóng dần lên, dẫnđến hàng loạt những biến đổi khí hậu trên thế giới trong những năm gần đây Dovậy, tiết kiệm điện năng là vấn đề của tất cả các quốc gia trên thế giới khôngphân biệt là nước giàu hay nghèo Tiết kiệm điện năng trước hết là sử dụng hợp

lý các thiết bị tiêu thụ điện trong đó có các thiết bị chiếu sáng, tạo ra môi trường

ánh sáng tiện nghi cho con người mà còn tiết kiệm chi phí cho điện năng tiêu thụ

và các chi phí khác Nhưng trong hoàn cảnh thiếu hụt điện năng như bây giờ, đènLed là lựa chọn số 1, vừa bởi hiệu quả chiếu sáng cao, vừa bởi hiệu quả tiết kiệmđiện [16]

LED là viết tắt của Light-Emitting-Diode có nghĩa là “đi-ốt phát sáng” là mộtnguồn sáng phát sáng khi có dòng điện tác động lên nó Được biết tới từ nhữngnăm đầu của thế kỷ 20, công nghệ LED ngày càng phát triển từ những diode phátsáng đầu tiên với ánh sáng yếu và đơn sắc đến những nguồn phát sáng đa sắc,công suất lớn và cho hiệu quả chiếu sáng cao

Hoạt động của LED dựa trên công nghệ bán dẫn Trong khối điốt bán dẫn,electron chuyển từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mứcnăng lượng thấp hơn và sự chênh lệch năng lượng này được phát xạ thành nhữngdạng ánh sáng khác nhau Màu sắc của LED phát ra phụ thuộc vào hợp chất bándẫn và đặc trưng bởi bước sóng của ánh sáng được phát ra

Một đặc điểm của đèn LED là ít tiêu hao năng lượng và không nóng Bóngđèn truyền thống, đèn neon, đèn halogen đều cần từ 110- 220V mới cháy được,trong khi đèn LED trắng chỉ cần từ 3- 24V để phát sáng Nhiệt độ làm việc củabóng đèn LED cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 5- 80C, thấp hơn so với đènhuỳnh quang thông thường là khoảng 13- 250C Đèn LED có hiệu suất sáng caohơn, do đó tiết kiệm khoảng 75% điện năng so với các đèn chiếu sáng thôngthường LED còn có tính chất sáng nhanh, tắt nhanh nên khi nhiệt chưa tạo ra thì

đã ngắt dòng điện, cho nên nhiệt độ tỏa ra không nhiều (nhiệt là nguyên nhân

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Hình 1.5: Đèn Led và hệ thống đèn Led xanh dùng trong nuôi tảo

chính làm giảm tuổi thọ cho các thiết bị chiếu sáng) Đèn LED có tuổi thọ rất caovượt qua 50.000 giờ (tương đương với 6 năm thắp sáng liên tục) Chất lượng ánhsáng thân thiện, không tia cực tím, không bức xạ tia hồng ngoại, phát nhiệt củaánh sáng thấp, không chứa thủy ngân và những chất có hại… không nhấp nháy,không gây nhức mỏi mắt [36].

Do ít tiêu hao năng lượng nên đèn LED có thể sử dụng ở vùng sâu vùng xa màkhông cần nhà máy phát điện công suất cao Đèn LED trắng có thể sử dụng vớipin mặt trời và gần đây nhất với pin nhiên liệu chạy bằng hỗn hợp nước và rượu.Đèn pin dùng LED trắng có thể sử dụng dễ dàng khi bị mất điện, vì chỉ cần vàicục pin vẫn có thể thắp sáng được đèn

Hiện nay đèn Led được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quangsinh học như là sự tổng hợp chlorophyll ( Tripathy và Brown, 1995), quang hợp(Tennessen và cộng sự, 1994) và phát sinh hình thái ( Hoenecke và cộng sự,1992; Robin và cộng sự, 1994) [16]

Một vài loại cây trồng được báo cáo là đã trồng thành công dưới hệ thống Lednhư: cây tiêu, dưa, lúa mỳ, bó xôi ( Bula và cộng sự, 1991; Hoenecke, 1992;Brown và Schuerger, 1994; Yanagi và Okamoto, 1994), những cây khoai tây nuôicấy trong ống nghiệm ( Miyashita và cộng sự, 1995) [16]

Từ 1996 đến 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệthống phát sáng Led trên một số loại cây trồng như dâu tây, bạch đàn, hồ điệp,lan, cúc…Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn Led không những sinhtrưởng phát triển tốt ở điều kiện invitro mà còn cả ở điều kiện exvitro Nhữngnghiên cứu về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh rằng những cây nuôicấy dưới hệ thống đèn Led thì tốt hơn khi so sánh với hệ thống chiếu sáng bằngđèn neon

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

2.1.1 Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học khu A trường

Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

2.1.2 Thời gian tiến hành đề tài: Từ 11/03/2012- 01/06/2012

2.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Giống tảo Spirulina platensis được bảo quản tại phòng thí nghiệm công nghệ

sinh học- khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng ngày 21/05/2011

- Giống tảo Spirulina platensis được mua tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo

viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào 15/03/2012 Giống ở dạng dung dịch

được đựng trong chai nhựa

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị phục vụ thí nghiệm

- Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, chai thủy tinh500ml, bình tam giác, bể nuôi, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ,micropipet, ống eppendof… tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học- KhoaHóa- Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng

- Thiết bị, máy móc thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Côngnghệ thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

2.2.3 Hóa chất

2.2.3.1 Môi trường Zarrouk [10]

Bảng 2.1 Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường Zarrouk:

2.2.3.2 Môi trường rỉ đường [1]

Rỉ đường có nhiều ưu điểm để tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì sau khi

qua xử lý màu và hệ keo, bắt đầu tiến hành pha môi trường nuôi cấy Spirulina plantensis

Bảng 2.3 Thành phần môi trường rỉ đường

STT Thành phần Đơn vị tính Lượng

2.2.3.3 Các hóa chất chuyên dùng khác: Như các hóa chất để tách chiết

chlorophyll, protein, bảo quản giống của tảo Spirulina như: cloroform, methanol,

glycerol

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp hoạt hóa giống được bảo quản trong Glycerol và đông khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học

Chuẩn bị môi trường Zarrouk theo bảng 2.1 và bảng 2.2 phân phối vào bốnống nghiệm đã thanh trùng, cấy giống tảo được bảo quản (21/05/2011) trongGlycerol và đông khô (được bảo quản trong tủ lạnh đông sâu hiệu Sanyo ở-210C) Tiến hành hoạt hóa giống ở máy nuôi cấy lắc hiệu Model Grant GLS400với điều kiện lắc 150 vòng/phút ở 350C trong 24h và 48h

2.3.2 Quan sát hình dạng giống tảo hoạt hóa và giống tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa được đem đi quan sát hình thái dưới KHVquang học hiệu Model Olympus CH2 ở các vật kính 10x và vật kính 40x Sau đóchụp ảnh lại và mô tả đặc điểm hình thái

2.3.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy

Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm bốnnghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiếnhành lặp lại 3 lần

Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự tăng

sinh tảo Spirulina Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 250ml môi trường trong

bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau bao gồm:môi trường 1: môi trường cơ bản (Zarrouk), môi trường 2: môi trường 0,75ml rỉđường + 16,8g NaHCO3, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3, môitrường 4: 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3

Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34- 370C, pH =8- 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24 Môi trườngnuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm trong 30phút Tiến hành đo OD bằng máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech Ultrospec

2000 để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường khác nhau

2.3.4 Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của tảo

Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm hainghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiếnhành lặp lại 3 lần

Khảo sát ảnh hưởng của các loại ánh sáng nuôi cấy khác nhau lên sự sinh

trưởng và phát triển của tảo Spirulina platensis Cấy 30% tảo giống vào 300 ml

môi trường trong bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện khác nhau baogồm: ánh sáng đèn huỳnh quang và ánh sáng đèn Led

Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34- 370C, pH =8- 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24 Môi trườngnuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm trong 30phút Tiến hành đo OD máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech Ultrospec 2000 đểxác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường và trong điều kiện ánhsáng khác nhau

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

2.3.5 Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis

2.3.5.1 Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công

Dựa vào lực hút của trọng lực ta tiến hành thu hoạch tảo bằng cách lọc thủcông

Cách tiến hành: Lấy dịch chứa sinh khối cho chảy qua lưới lọc, thu phần sinh

khối trên lưới lọc Dịch sau lọc có thể tái sử dụng để nuôi lại tảo Vật liệu lọc ởđây có thể dùng là vải nhiều lớp hoặc giấy lọc

2.3.5.2 Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không

Do khi lọc bằng vải nhiều lớp thì do khoảng cách của các sợi vải lớn nên tảovẫn lọt qua được nên hiệu quả thu hoạch không được cao, còn khi lọc bằng giấylọc thì hầu như tảo được giữ lại toàn bộ trên giấy lọc nhưng thời gian lọc quá lâu

Để giảm thời gian lọc ta có thể dùng lọc bằng máy lọc hút chân không

Cách tiến hành: Đặt giấy lọc phía trên phễu của bình tam giác có nối với hệ

thống bơm chân không, cho dịch sinh khối chảy qua giấy lọc Dưới tác dụng củatrọng lực và lực hút của bơm chân không nên tốc độ lọc rất nhanh

2.3.5.2 Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi

Tiến hành thử nghiệm thu hoạch với chất keo tụ Al3+ Ta bổ sung lần lượt 80g/l

Al2(SO4)3, AlCl3 vào mẫu ARK và ARH, để yên trong 24h sau đó cho sục khí vào

để tảo nổi lên thành cụm và vớt ra ngoài

2.3.5.3 Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa

Vì tảo tiêu thụ CO2 nên độ pH tăng lên dần dẫn tới việc kết tủa của hydroxytmagie (Mg(OH)2) và carbonatcanxi (CaCO3) sẽ kéo theo tảo lắng xuống Dựatrên cơ sở này ta tiến hành thu hoạch tảo bằng phương pháp tự kết tủa

2.3.5.4 Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm

Nguyên tắc: Dựa vào tác động cộng hưởng của sóng siêu âm làm vỡ các

không bào khí của tảo và kéo theo tảo lắng xuống Từ tỉ lệ tế bào lắng ta biếtđược hiệu quả của phương pháp [5]

a) Mẫu nuôi kín không sục khí

Cách tiến hành:

Lắc đều mẫu trước khi cho vào bình tam giác với các mức thể tích 50 và100ml Ứng với mỗi mức thể tích tiến hành xử lý siêu âm ở máy siêu âm hiệuElmasonic S300H lần lượt ở các khoảng thời gian từ 5- 10 phút Sau khi thínghiệm xong để lắng mẫu từ 3- 4 giờ, sau đó hút phần dịch trên và cố định bằnglugol trung tính để đếm số lượng tảo còn lại sau khi xử lý siêu âm Thao tác đượctiến hành nhanh chóng và nhẹ nhàng tránh làm động lớp tảo lắng dưới đáy bình.Lặp lại thí nghiệm 3 lần.

Tiến hành thí nghiệm tương tự nhưng để yên mẫu trong 3 ngày sau đó mới hútmẫu ra để kiểm tra xem có sự thay đổi số lượng do sự phục hồi không bào khíhay không

b) Mẫu nuôi hở có sục khí

Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên

c) Định lượng tảo trước và sau khi siêu âm

Đếm số lượng tảo trước và sau khi siêu âm, từ đó biết được tảo lắng do tácđộng của siêu âm Từ số lượng tảo lắng ta đánh giá được hiệu quả thu hoạch tảo

bằng sóng siêu âm Tiến hành định lượng theo phụ lục 1.

2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi

2.3.6.1 Định lượng chlorophyll [2]

a) Nguyên tắc:

Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng của các loại sắc tố ở những bước sóngnhất định để xác định hàm lượng của chúng có trong mẫu sau khi chiết bằngdung môi thích hợp

b) Cách tiến hành:

Lấy 10ml mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20ml có vạch chiathể tích và thêm 5- 15ml methanol Đồng hóa mẫu với tốc độ 2500 vòng/phút,trong 5-10 phút bằng máy Voltex hiệu MS1 Minishaker IKA Sau khi đồng hóa

để ở nhiệt độ phòng trong 10- 20 phút Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ8000- 10000 vòng/phút, trong 5- 7 phút bằng máy ly tâm hiệu Model Rotanta

460 hightech Thu phần dịch nổi, màu trong, đem đo OD bằng máy đo quang

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

hiệu Pharmacia Biotech Ultrospec 2000 ở bước sóng 665nm với dung dịchmethanol làm mẫu đối chứng Ghi nhận giá trị tương ứng A665

™ Tính kết quả:

Trong đó: A665 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665nm

13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665nm

a là khối lượng mẫu có trong 10 ml dịch phân tích, g

Lấy 10 ml mẫu, lọc, thu phần trên giấy lọc, cân a (g) từ sinh khối lọc được cho

vào ống ly tâm, sau đó cho 10- 15 ml dung dịch đệm phosphate (xem phụ lục 2)

vào ống ly tâm, lắc kỹ Đồng hóa mẫu trong khoảng thời gian 5-10 phút, ở tốc độ

2500 vòng/phút bằng máy Voltex hiệu MS1 Minishaker IKA Để ở 370C trong 24giờ đồng hồ Khi đủ thời gian, đem ly tâm ở tốc độ 7000 vòng/phút trong thờigian 10 phút bằng máy ly tâm Model Rotanta 460 hightech Sau khi ly tâm, thuphần dịch nổi và đo cường độ màu tại bước sóng 618nm bằng máy đo quang hiệuPharmacia Biotech Ultrospec 2000, sử dụng đệm phosphate làm mẫu đối chứng Tính kết quả:

Trong đó:

a là trọng lượng sinh khối thí nghiệm (g)

A618 là giá trị hấp thu đo được của mẫu

3,39 là hệ số hấp thu của phycocyanin tại bước sóng 618nm

2.3.6.3 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [13]

a) Nguyên tắc:

A618 x 10Phycocyanin (mg/g)=

3,39 x a

13,9 x A665 x 10

Chlorophyll tổng (mg/g) =

a

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốcnhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịchmang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấpthu cực đại 465nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ởbước sóng 595nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếptới nồng độ protein Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng mộtđường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịchprotein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịchprotein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ.Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế Phươngpháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện từ 5- 200μg protein, dễ thực hiện vàtiết kiệm thời gian.

b) Cách tiến hành:

- Pha dung dịch thuốc nhuộm Bradford 1X (phụ lục 8 )

- Pha dung dịch đệm PBS 1X (phụ lục 8)

- Các bước dựng đường chuẩn:

+ Tiến hành pha loãng từ dung dịch BSA 1mg/ml để được các dung dịch BSA

- Các bước xác định lượng protein tổng từ các mẫu thí nghiệm:

+ Dùng pipet hút dung dịch thuốc nhuộm Bradford 1X + dung dịch proteintheo tỷ lệ 4 : 1, để yên 10 phút

+ Đo độ hấp thụ của dịch bằng máy Elisa reader ở bước sóng 595nm

c) Tính kết quả

Sau khi thực hiện các bước cần thiết để xây dựng đường chuẩn chúng tôi đã

xây dựng được đồ thị đường chuẩn (hình 3.19)

Thay giá trị OD595nm vào đồ thị đường chuẩn có phương trình y= 0.0053x với y=

- Lấy 10ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc

- Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl (pha loãng 1:1 với nước cất Khi dùng, lấy0,5ml dung dịch này pha thành 100ml bằng nước cất) sử dụng để loại khoáng lẫntrong sinh khối

- Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C để qua đêm Làmnguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2

2.3.8 Phương pháp thuần chủng giống tảo Spirulina platensis

G2- G1

DW = x 1000 (g/l) 10

Sau 15 ngày nuôi, dịch nuôi cấy được đem đi chiếu tia UV trong 10, 20, 30, 60

phút, độ sâu của dịch nuôi là 1cm Sau khi chiếu UV, Spirulina được giữ 22- 24

giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm Dịch nuôi được cấy lên môi trường

thạch-cá-peptone (xem phụ lục 3) để phát hiện khuẩn lạc của vi khuẩn nhiễm tạp Tiếp theo, mẫu được nhuộm fucshine (xem phụ lục 3) và quan sát dưới kính hiển vi,

dịch nuôi được đánh giá sạch và Spirulina platensis được cho là thuần chủng khi

không có sự xuất hiện của vi khuẩn tạp sau hai ngày nuôi

2.3.8.2 Thuần chủng bằng cấy chuyền nhiều lần trên môi trường thạch vô trùng [2]

Sau 15 ngày nuôi, Spirulina được ly tâm ở máy ly tâm hiệu Model Rotanta

460 hightech ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 7-10 phút, thu phần sinh khối lắngxuống và đưa lại vào môi trường Zarrouk đã vô trùng (1210C, 15 phút) Khuấynhẹ và tiếp tục ly tâm, thu sinh khối lắng xuống, ly tâm lặp lại ba lần Ở lần saucùng, thu lấy sinh khối cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng Khi xuất hiện

những sợi Spirulina đầu tiên phát triển ra thì thu lấy phần đầu của những sợi đó

và cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường Zarrouk vô trùng, để yên ở nhiệt

độ phòng Sau khoảng 12- 14 giờ nuôi, sinh khối trong ống nghiệm được rửa qua

5- 7 ống nghiệm khác cũng chứa môi trường Zarrouk vô trùng Spirulina đã rửa được cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng, lại tiếp tục thu lấy sợi Spirulina

đầu tiên phát triển ra, đưa vào ống nghiệm chứa môi trường Zarrrouk vô trùng,

để nuôi trong 12- 14 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm, lặp lại quá trình trên cho

đến khi thu được sinh khối thuần Kiểm tra mức độ thuần khiết của Spirulina

bằng nhuộm fucshine và quan sát dưới kính hiển vi, dịch nuôi được cấy lên môi

trường thạch- cá- peptone (xem phụ lục 3) để phát hiện khuẩn lạc của vi khuẩn

nhiễm tạp Dịch nuôi được đánh giá là sạch và Spirulina được cho là thuần chủng

nếu sau hai lần kiểm tra mà không xuất hiện vi khuẩn tạp nhiễm

2.3.9 Khảo sát các phương pháp bảo quản giống

2.3.9.1 Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Giống được phân bố trong các chai nhựa và giữ ở điều kiện phòng thí nghiệm.Sau một thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả năng sống sót củatảo sau bảo quản.

2.3.9.2 Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở tủ lạnh 4 0 C

Giống được phân bố trong các chai nhựa và giữ ở tủ lạnh 40C Sau một thờigian bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả năng sống sót của tảo sau bảoquản

2.3.9.3 Bảo quản giống bằng cấy chuyền trên môi trường thạch

Chuẩn bị môi trường thạch Zarrouk đổ đĩa petri Mẫu tảo sau thời gian nuôicấy thu sinh khối ở pha log bằng ly tâm hoặc lọc thu sinh khối Cấy sinh khối tảovào đĩa petri (cấy trải) Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.Sau khi cấy xong đem đi nuôi ở điều kiện bình thường

2.3.9.4 Bảo quản giống bằng glycerol và ở điều kiện lạnh sâu

Giống tảo Spirulina platensis sau khi được thu hoạch, tiến hành phân bố vào

các ống eppendoff đã vô trùng Tiến hành bổ sung Glycerol đã được vô trùng vào

ở nồng độ 10%, 20%, 30% vào các ống eppendof ở trên Đem bảo quản ở nhiệt

độ -210C trong tủ lạnh sâu Sau một thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa đểtheo dõi khả năng sống sót của mẫu tảo sau bảo quản

2.3.9.5 Bảo quản giống bằng phương pháp sấy đông khô

Cho giống sau khi thu hoạch vào các bình penicillin, bổ sung Glycerol đãthanh trùng theo tỉ lệ 10%, 20%, 30% vào các bình penicillin, sau đó tiến hànhsấy đông khô từ từ ở nhiệt độ 400C trong 6- 12 giờ Sau khi mẫu đã khô hoàntoàn tiến hành bảo quản trong tủ lạnh đông -210C Sau một thời gian bảo quảntiến hành hoạt hóa giống để theo dõi sức sống của chủng tảo được bảo quản

2.3.10 Xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tính trung bình cộng của 3 lần lặp lại bằngchương trình Microsoft Excel

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phương pháp hoạt hóa giống

được bảo quản trong Glycerol và ở

điều kiện lạnh sâu tại phòng thí

nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học

Giống được hoạt hóa trong ống

nghiệm và lắc bằng máy lắc khô hiệu

Stuart Obital incubator SI500 ở chế độ

350C, 150 vòng/phút trong các khoảng

thời gian khác nhau là 24h và 48h

Kết quả thu được là dung dịch tảo có

màu xanh Mẫu được hoạt hóa lắc

trong 48h thu được có màu xanh đậm

hơn mẫu hoạt hóa trong 24h

3.2 Quan sát hình dạng, kích thước tảo Spirulina platensis

3.2.1 Quan sát hình dạng giống tảo mới được hoạt hóa bằng kính hiển vi quang học

Mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa được đem đi quan sát hình thái dưới KHVquang học ở các vật kính 10x và vật kính 40x

Khi quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 10x và 40x thì thấytừng cụm tế bào màu xanh lá có di chuyển, dạng hình tròn Bên cạnh đó còn córất nhiều tế bào hình que ngắn chuyển động rất nhanh Không quan sát được sợitảo nào cả mà chỉ thấy các cụm tế bào hình tròn màu xanh Qua đó ta rút ra nhậnxét là trong quá trình sấy đông khô để bảo quản thì khi sấy ở chế độ nhiệt đó thìcác tế bào tảo đã bị phá hủy dẫn đến sự chết của tảo và bên cạnh đó nó là nguồndinh dưỡng cho các vi sinh vật nhiễm tạp phát triển Do đó, sau khi ta hoạt hóa

thì chỉ có vi sinh vật nhiễm tạp phát triển chứ không có giống tảo Spirulina mà chúng ta cần nên màu dung dịch có màu xanh chuối non giống như tảo Chlorella chứ không phải màu xanh hơi đậm như màu vốn có của tảo Spirulina.

3.2.2 Quan sát mẫu tảo mua

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Hình 3.1 Mẫu tảo được hoạt hóa

trong 24h và 48h

Spirulina platensis có dạng sợi đơn độc, trôi nổi, màu xanh lam và không có

vỏ bao, eo thắt ở vách tế bào không rõ ràng Có nhiều hoặc ít vòng xoắn đềunhau, các vòng xoắn hẹp hơn về phía cuối sợi Tế bào dài khoảng 1,5- 3µm, rộng4- 5,5µm với nhiều không bào chứa không khí Mỗi sợi có khoảng 40- 45 tế bào

Do mẫu tảo bảo quản ở phòng thí nghiệm sau khi hoạt hóa và quan sát dưới

kính hiển vi nhưng không thấy sự hiện diện của tảo Spirulina platensis nên tất cả

các nghiên cứu sau chúng tôi dùng mẫu tảo mua để tiến hành thí nghiệm

3.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy

Để khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự tăng

sinh tảo Spirulina Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 250ml môi trường trong

bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau bao gồm:môi trường 1: môi trường cơ bản (Zarrouk), môi trường 2: môi trường 0,75ml rỉđường + 16,8g NaHCO3, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3, môitrường 4: 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Đo

Hình 3.2: Hình thái tảo Spirulina platensis dưới KHV

A Vật kính 10X B Vật kính 40X

C Vật kính 100X D Tảo Spirulina platensis đang phân cắt (100X)

A

D C

B

OD để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo Spirulina platensis trong các môi

trường khác nhau Ta được kết quả đo OD ở các môi trường khác nhau được trìnhbày lần lượt ở các bảng trong phụ lục 4 Ta cũng có đồ thị như hình 3.3

Các đường dọc theo mỗi thời gian đo biểu thị sự sai số của kết quả đo vìchúng tôi tiến hành đo mẫu lặp lại 3 lần nên sẽ có sai số, đồ thị có thể dịch lêntrên hay xuống dưới tùy thuộc vào mẫu sai số âm hay sai số dương Ở đồ thị hình

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS Đặng Đức Long

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của tảo ở 4 loại môi trường theo

thời gian đo OD ở bước sóng 420 nm.