Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano zno sử dụng dịch chiết lá trầu không và ứng dụng trong chỉ khâu phẫu thuật

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ QUỲNH MAI NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO ZnO SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHỈ KHÂU P

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ QUỲNH MAI

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO ZnO

SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ỨNG

DỤNG TRONG CHỈ KHÂU PHẪU THUẬT

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã chuyên ngành: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN CƯỜNG

Người phản biện 1: PGS.TS Trần Ngọc Quyển

Người phản biện 2: TS Lê Thị Thanh Trân

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 17 tháng 10 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Lê Văn Tán - Chủ tịch Hội đồng

2 PGS.TS Trần Ngọc Quyển - Phản biện 1

3 TS Lê Thị Thanh Trân - Phản biện 2

4 TS Phạm Thị Hồng Phượng - Ủy viên

5 TS Cao Xuân Thắng - Thư ký

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN THỊ QUỲNH MAI MSHV: 17112501

Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1992 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã chuyên ngành: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano ZnO sử dụng dịch chiết lá trầu không và ứng

dụng trong chỉ khâu phẫu thuật

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Tổng quan tài liệu về ZnO, lá trầu không và các vấn đề nghiên cứu

Tổng hợp nano ZnO sử dụng dịch chiết lá trầu không

Xác định cấu trúc vật liệu nano ZnO bằng các phương pháp phân tích hiện đại

Khảo sát khả năng kháng khuẩn và hiệu lực kháng khuẩn của nano ZnO và chỉ khâu phẫu thuật phủ nano ZnO

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo quyết định số 1118/QĐ-ĐHCN về việc giao

đề tài và cử người hướng dẫn LVThS của Hiệu trưởng Trường Đại học Công nghiệp TPHCM ngày 14/06/2019

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 25/08/2020

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Cường

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …

TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô ở Trường Đại học Công nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh nói chung và khoa Công nghệ Hóa học nói riêng, đã tận tình giảng dạy, cung cấp những kiến thức cần thiết cho việc nghiên cứu đề tài này Đặc biệt, tôi luôn biết ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công nghệ Hóa học đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng phòng thí nghiệm, thiết bị phân tích cũng như luôn ủng hộ và cho tôi những lời khuyên quý báu trong khoảng thời gian tôi thực hiện nghiên cứu đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy hướng dẫn của tôi PGS.TS Nguyễn Văn Cường, Thầy đã luôn quan tâm, động viên, và đóng góp ý kiến trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu và thực nghiệm để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm khuẩn vết mổ (NKVM) cao 10%) Mặc dù các biện pháp phòng ngừa đã và đang được áp dụng chặt chẽ tại các bệnh viện nhưng hiệu quả không đáng kể Một trong những nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ NKVM là việc xâm nhập vi khuẩn từ bên ngoài trong quá trình phẫu thuật, đặc biệt là từ chỉ khâu phẫu thuật (CKPT) Nano kẽm oxit (ZnO NPs) là một trong số ít các kim loại/ oxit kim loại được FDA xếp vào danh sách oxit kim loại an toàn với sức khỏe con người vì nó có khả năng phân hủy sinh học và độc tính thấp Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh được khả năng kháng khuẩn tuyệt vời của nano ZnO Hiện nay, tổng hợp hạt nano kim loại bằng phương pháp xanh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực y tế

(5-Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp ZnO NPs sử dụng dịch chiết lá trầu

không Các đặc tính của hạt ZnO NPs được phân tích bằng các phương pháp hóa lý

hiện đại như FT-IR, SEM-EDX, XRD, DLS, v.v Kết quả nghiên cứu cho thấy, kích thước và hình thái của hạt nano ZnO phụ thuộc vào thể tích dịch chiết sử dụng Nano ZnO có khả năng kháng được chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn vết mổ là

E.coli và S.aureus Bên cạnh đó, hiệu quả kháng khuẩn của ZnO NPs có thể kéo dài

đến năm ngày CKPT được phủ ZnO NPs cũng cho khả năng kháng khuẩn Kết quả

từ nghiên cứu này sẽ giúp giảm gánh nặng y tế và góp phần vào sự phát triển của ngành sản xuất thiết bị y tế kháng khuẩn tại Việt Nam

iii

ABSTRACT

Vietnam is one of countries with high incidence of surgical site infection (SSI) 10%) Despite the many decades of the application of preventions, infection at the surgical site remains a too common event The invasion of bacteria from outside, especially from surgical sutures (CKPT) increase the SSI rate Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs), which are biodegradable and low toxicity, has been approved as a safe metal oxide for human use Other than that, worldwide studies proved the antibacterial property of ZnO NPs on various bacteria Recently, green synthesis plays an important role in many domains, especially in the health care In

(5-this study, ZnO NPs were synthesized using the extract from Piper betel leaves The

characteristics of ZnO NPs were measured by FT-IR, SEM-EDX, XRD, and DLS The the volume of extract plays role in controlling morphology and size of ZnO

Other than that, the results proved ZnO NPs against S.aureus and E.coli and its

effectiveness is up to 5 days The ZnO-nanoparticle-coated sutures also exhibit good results on antibacterial properties The results of study will contribute to the ease of medical burden, the development of the medical device field in Viet Nam

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có)

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

(Chữ ký)

TRẦN THỊ QUỲNH MAI

v

MỤC LỤC

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Nhiễm khuẩn vết mổ (NKVM) 4

1.1.1 Nhiễm khuẩn vết mổ và nguyên nhân dẫn đến nhiễm khuẩn vết mổ 4

1.1.2 Ảnh hưởng của nhiễm khuẩn vết mổ đến bệnh nhân và đất nước 4

1.1.3 Các biện pháp phòng ngừa nhiễm khuẩn vết mổ 5

1.2 Tổng quan về nano kẽm oxit (ZnO NPs) 6

1.2.1 Cấu trúc của nano kẽm oxit 6

1.2.2 Phương pháp tổng hợp ZnO NPs 8

1.2.3 Ứng dụng của nano kẽm oxit 12

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn của ZnO NPs 15

1.3 Tổng quan về lá trầu không 19

1.3.1 Giới thiệu 19

1.3.2 Tính khử và tính kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không 20

1.3.3 Phương pháp chiết xuất lá trầu không 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 24

2.1.1 Hóa chất, nguyên vật liệu 24

vi

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 24

2.2 Tổng hợp ZnO NPs 24

2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết (DC) 24

2.2.2 Tổng hợp ZnO NPs 26

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình hình thành ZnO NPs 27

2.3 Quy trình phủ ZnO NPs lên CKPT 28

2.3.1 Không xử lý bề mặt CKPT 28

2.3.2 Xử lý bề mặt CKPT 29

2.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn và hiệu lực kháng khuẩn của vật liệu 29

2.5 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc vật liệu 31

2.5.1 Phương pháp phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis) 31

2.5.2 Xác định liên kết trong cấu trúc vật liệu bằng phổ hồng ngoại (FTIR) 32

2.5.3 Xác định hình thái bề mặt vật liệu bằng phương pháp kính hiển vi điện từ quét (SEM) và phương pháp tán xạ năng lượng tia X (EDX) 32

2.5.4 Xác định cấu trúc vật liệu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 33

2.5.5 Xác định đường kính vật liệu bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) 33

2.6 Đánh giá ảnh hưởng của quy trình phủ đến cơ tính của sợi CKPT 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Chuẩn bị dịch chiết 36

3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn-lỏng 37

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

3.2 Kết quả tổng hợp ZnO NPs 40

vii

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình hình thành ZnO NPs và

phương pháp phân tích cấu trúc vật liệu 42

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ muối kẽm 42

3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ lỏng-lỏng (thể tích dịch chiết) đến sự hình thành của ZnO NPs 45

3.3.3 Kết quả phân tích phổ FT-IR 49

3.3.4 Kết quả phân tích phổ XRD 50

3.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn và hiệu lực kháng khuẩn của vật liệu 51

3.4.1 Xác định vai trò của DC và ZnO NPs đến khả năng kháng khuẩn 51

3.4.2 Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của ZnO NPs 54

3.5 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của CKPT phủ nano kẽm oxit 57

3.5.1 Khả năng kháng khuẩn của CKPT không xử lý bề măt trước khi phủ nano 57 3.5.2 Khả năng kháng khuẩn của CKPT được xử lý bề mặt trước khi phủ nano 58

3.6 Đánh giá ảnh hưởng của quy trình phủ lên độ bền kéo đứt của CKPT 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 71

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 74

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ảnh chụp SEM cấu trúc sợi của (a) CKPT đơn sợi và (b) CKPT đa sợi 6

Hình 1.2 Hình mô phỏng cấu trúc tinh thể wurtzite lục giác (hexagonal wurtzite) của ZnO NPs Trong đó : hình cầu màu xám là các nguyên tử Oxi (oxygen atom) và các hình cầu màu đen là các nguyên tử kẽm (Zn atom) 8

Hình 1.3 Mối tương quan giữa (a) ảnh hưởng của các thông số của ZnO-NPs đến khả năng kháng khuẩn của nó và (b) các cơ chế kháng khuẩn có thể có của ZnO-NPs: tương tác tĩnh điện; sự di chuyển của ZnO-NPs vào trong tế bào vi khuẩn; sự giải phóng Zn2+ và sự hình thành ROS 17

Hình 1.4 Hình tổng hợp các tương tác vật lý khác nhau giữa ZnO NPs và các tế bào vi khuẩn dẫn đến hiệu ứng gây chết vi khuẩn 18

Hình 1.5 Hình thái của lá trầu không 19

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của một số hợp chất hữu cơ có trong lá trầu không 20

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chuẩn bị dịch chiết lá trầu không 26

Hình 2.2 Quy trình tổng hợp nano kẽm oxit từ dịch chiết lá trầu không 27

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình phủ ZnO NPs lên CKPT 29

Hình 2.4 Hình mô tả vị trí các mẫu thử và mẫu đối chứng trên đĩa petri 30

Hình 2.5 Hình mô tả vị trí các mẫu ZnO NPs và mẫu đối chứng trên đĩa petri 30

Hình 2.6 Hình mô tả vị trí các mẫu PS và mẫu đối chứng trên đĩa petri 31

Hình 3.1 Hình ảnh dịch chiết lá trầu không: (a) trước khi lọc; (b) sau khi lọc và (c) sau khi sấy 36

Hình 3.2 Phổ hấp thụ quang học của dịch chiết 37

ix

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rắn-lỏng và thời gian đến hiệu suất

chiết xuất lá trầu không 39

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất 40

Hình 3.5 Sự hình thành của nano kẽm oxit trong hỗn hợp dung dịch phản ứng 41

Hình 3.6 Phổ hấp thụ UV-Vis của DC và ZnO NPs 41

Hình 3.7 Sự thay đổi màu sắc của ZnO NPs (a) trước khi nung và (b) sau khi nung 42

Hình 3.8 Kết quả ngoại quan của khảo sát: ảnh hưởng của nồng độ muối kẽm đến sự hình thành ZnO NPs 43

Hình 3.9 Kết quả phân tích DLS của ZnO NPs nồng độ 0.001 M 44

Hình 3.10 Ảnh chụp SEM của hạt ZnO NPs trước khi nung với các thể tích dịch chiết khác nhau 46

Hình 3.11 Hình thái hạt ZnO NPs với tỷ lệ lỏng-lỏng 1 :1 khi nung ở 600 °C trong 2h qua ảnh chụp SEM tại các độ phóng đại (a) 20k, (b) 30k, (c) 60k và (d) 150k 47

Hình 3.12 Phổ EDX của mẫu ZnO NPs (a) trước và (b) sau khi nung tại 600 °C 48

Hình 3.13 Phổ FT-IR của (a) dịch chiết (DC) và (b) ZnO NPs 49

Hình 3.14 Phổ XRD của ZnO NPs 50

Hình 3.15 Kết quả thử kháng khuẩn của DC (kí hiệu mẫu: 280), ZnO NPs (kí hiệu mẫu: 279) và đối chứng (kí hiệu mẫu: ĐK) 52

Hình 3.16 Cấu trúc thành tế bào của (a) vi khuẩn Gram dương và (b) vi khuẩn Gram âm 53

Hình 3.17 Kết quả đo thế điện cực của mẫu ZnO NPs vừa được tổng hợp 54

x

Hình 3.18 Kết quả đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của ZnO NPs trên hai chủng

khuẩn E.coli và S.aureus sau 48, 72 và 120 giờ nuôi cấy Trong đó: ĐC:

đối chứng, hai vòng tròn còn lại trên đĩa thạch là ZnO NPs 55Hình 3.19 Sự phá hủy tế bào vi khuẩn (a) Gram âm và (b) Gram dương thông qua

sự hình thành ROS 56Hình 3.20 Kết quả kháng khuẩn của các loại CKPT với số lần phủ khác nhau 57Hình 3.21 Ảnh chụp SEM của sợi CKPT chưa xử lý bề mặt tại độ phóng đại 58

Hình 3.22 ZOI của CKPT trên hai chủng khuẩn E.coli và S.aureus, trong đó PS là

CKPT phủ ZnO NPs, ĐC là đối chứng 58Hình 3.23 Ảnh chụp SEM bề mặt sợi CKPT sau khi xử lý bề mặt 59

xi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Bảng tóm tắt một số cấu trúc của ZnO NPs dựa trên phương pháp và điều

kiện tổng hợp 7Bảng 1.2 Bảng tóm tắt một số cây được sử dụng để tổng hợp hạt nano ZnO 12

Bảng 1.3 Thành phần hóa học mang tính tham khảo có trong dịch chiết lá trầu

không (chiết trong dung môi nước) được phân tích bằng phương pháp sắc

kí khí ghép khối phổ GC/MS 21Bảng 2.1 Giới hạn chấp nhận của giá trị lực kéo đứt theo USP 35

Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm của quá trình chuẩn bị dịch chiết lá trầu không, sử

dụng dung môi nước 38Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất 39Bảng 3.3 Thông số khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối kẽm đến quá trình hình

thành ZnO NPs 42Bảng 3.4 Bảng tổng hợp kết quả phân tích sự phân bố kích thước hạt của ZnO NPs

tại các điều kiện khác nhau 44Bảng 3.5 Thông số phản ứng và kết quả thu được từ khảo sát ảnh hưởng của thể tích

dịch chiết đến khả năng hình thành ZnO NPs 45Bảng 3.6 Tỷ lệ phần trăm khối lượng nguyên tử trong hợp chất ZnO NPs trước và

sau khi nung 48Bảng 3.7 Dữ liệu góc nhiễu xạ, FWHM và đường kính tinh thể trung bình của ZnO

NPs tính toán theo phương trình Schererr 51Bảng 3.8 Vùng kháng khuẩn (ZOI) (mm) của ZnO NPs và CKPT phủ ZnO NPs 56Bảng 3.9 Kết quả lực kéo đứt của CKPT trước và sau khi phủ ZnO NPs 59

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

(Xếp theo thứ tự A, B, C của chữ cái đầu viết tắt)

CKPT Chỉ khâu phẫu thuật

FDA Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ

NKVM Nhiễm khuẩn vết mổ

PDI Chỉ số phân bố kích thước

PS Chỉ khâu phẫu thuật phủ ZnO NPs

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TCS Triclosan

TEA Triethanolamin

TLTK Tài liệu tham khảo

ZnO NPs Nano kẽm oxit

ZOI Vùng kháng khuẩn

(5-Mặc dù các biện pháp phòng ngừa đã và đang được áp dụng chặt chẽ tại các bệnh viện nhưng hiệu quả không cao Một trong những nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ NKVM là việc xâm nhập vi khuẩn từ bên ngoài, đặc biệt là từ chỉ khâu phẫu thuật (CKPT) Theo đánh giá từ các nghiên cứu thì CKPT đa sợi có nguy cơ gây NKVM cao hơn so với các loại CKPT khác Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu phát triển các chất kháng khuẩn để phủ lên sợi CKPT Triclosan (TCS) là một trong những chất kháng khuẩn được cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép lưu hành trên thị trường Song, vẫn còn nhiều tranh cãi về ảnh hưởng của TCS đối với sức khỏe con người mà các nhà khoa học vẫn chưa giải đáp được Nano bạc là một trong số các vật liệu nano đã được sử dụng từ rất lâu để làm vật liệu khử khuẩn, kháng khuẩn Tuy nhiên, tương tự như TCS, vì cơ thể con người không thể đào thải bạc/ion bạc kết quả là chúng tích tụ trong cơ thể làm phá hủy DNA, cũng như tế bào hồng cầu Bên cạnh đó, hiện nay chưa có bất kì Luật định nào được đề ra để kiểm soát nano bạc cũng như an toàn sử dụng trong y tế, đặc biệt

là các thiết bị y tế cấy ghép

Nano kẽm oxit (ZnO) là một trong số ít các kim loại/ oxit kim loại được FDA xếp vào danh sách oxit kim loại an toàn với sức khỏe con người vì nó có khả năng phân hủy sinh học và độc tính thấp Ngoài ra, Zn2+ là nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh được khả năng kháng khuẩn tuyệt vời của nano ZnO Nano ZnO đã được nghiên cứu hướng

của phương pháp này Lá trầu không được trồng rất nhiều tại Việt Nam Ngoài việc

sử dụng lá trầu không để nhai, thì tiềm năng ứng dụng trong y sinh của nó cũng rất

được quan tâm nhờ vào các hợp chất hữu cơ chứa nhiều gốc –OH, cacbonyl, v.v, có khả năng kháng ung thư, kháng nấm, chống oxi hóa, v.v Bên cạnh đó, các hợp chất này còn có tiềm năng như chất bảo vệ bề mặt trong quá trình tổng hợp hạt nano kim

loại Gần đây, có nhiều nghiên cứu sử dụng dịch chiết lá trầu không để tổng hợp hạt

nao bạc, nano vàng, nano đồng oxit, v.v

Vì vậy, chúng tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp

vật liệu nano ZnO sử dụng dịch chiết lá trầu không và ứng dụng trong chỉ khâu

phẫu thuật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chế tạo vật liệu nano ZnO và ứng dụng phủ lên CKPT

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Dịch chiết lá trầu không, nano ZnO

- Vi khuẩn Gram âm và/hoặc Gram dương

- Chỉ khâu phẫu thuật (CKPT) đa sợi

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu thực hiện trong phạm vi quy mô phòng thí nghiệm

- Mẫu CKPT đa sợi được mua trên thị trường

3

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu

Phương pháp oxi hóa-khử

4.2 Nghiên cứu cấu trúc vật liệu

Phương pháp phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet–visible spectroscopy, UV – Vis); Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering, DLS)

Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray Powder Diffraction, XRD);

Phương pháp hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy, SEM)

Phương pháp tán xạ năng lượng tia X (Energy Dispersive X-Ray Analysis,EDX); Phương pháp hấp thu hồng ngoại (Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR)

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Việc tìm ra các chất kháng khuẩn an toàn và phù hợp để phủ lên các thiết bị y tế đặc biệt là thiết bị y tế cấy ghép đang nhận được sự quan tâm và hỗ trợ của các cơ quan chức năng tại Việt Nam Vì vậy, việc nghiên cứu tổng hợp nano ZnO làm chất kháng khuẩn, phủ lên CKPT là rất cần thiết Các kết quả của đề tài sẽ được ứng dụng hoặc mở ra định hướng tiếp theo trong việc sử dụng các vật liệu kim loại trong

y tế

4

1.1 Nhiễm khuẩn vết mổ (NKVM)

1.1.1 Nhiễm khuẩn vết mổ và nguyên nhân dẫn đến nhiễm khuẩn vết mổ

Nhiễm khuẩn vết mổ (NKVM) là quá trình nhiễm khuẩn xảy ra trong vòng 30 ngày đầu tiên sau phẫu thuật và ảnh hưởng đến các mô tại vị trí vết mổ hoặc tại các mô sâu nơi thực hiện phẫu thuật [1]–[3] Theo trung tâm kiểm soát dịch bệnh (Center

of Disease Control, CDC), có 3 loại nhiễm khuẩn vết mổ gồm: nhiễm khuẩn vết mổ nông (superficial incisional SSI), nhiễm khuẩn vết mổ sâu (deep incisional SSI) và nhiễm khuẩn cơ quan (Organ/ space SSI) [3], [4]

Vi khuẩn (bacteria) được xem là nguyên nhân chính gây NKVM [2], [5], [6] tiếp

theo là nấm [7] Trong số các vi khuẩn gây NKVM như Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Gram negative bacilli, Streptococcus spp, Enterococci

và Clostridium perfringens thì hơn 50% NKVM gây ra bởi vi khuẩn đa kháng thuốc

như S.aureus và E.coli [1], [6], [7] Vi khuẩn này có thể bắt nguồn từ chính cơ thể

người bệnh (endogeneous infection), đặc biệt là vùng da, màng tế bào… hoặc xâm nhập từ môi trường (exogeneous infection) bên ngoài trong quá trình phẫu thuật hoặc sau phẫu thuật Thông thường, NKVM xảy ra do sự xâm nhập của vi khuẩn trong quá trình phẫu thuật để lại hậu quả nghiêm trọng hơn, và thường diễn ra tron vòng 5 – 7 ngày sau phẫu thuật [8]

1.1.2 Ảnh hưởng của nhiễm khuẩn vết mổ đến bệnh nhân và đất nước

Nhiễm khuẩn vết mổ là một trong 10 nguyên nhân chính dẫn đến tử vong tại Mỹ [9] Nhiễm khuẩn vết mổ gây áp lực lớn về chi phí điều trị cũng như sức khỏe của bệnh nhân Theo ước tính, NKVM làm tăng chi phí điều trị lên 20,842 đô la Mỹ và kéo dài thời gian điều trị từ 1-2 tuần [1], [3], [9] Badia và cộng sự đã tiến hành tổng kết tác động của NKVM đến 6 quốc gia châu Âu: Pháp, Đức, Hà Lan, Ý, Tây Ban Nha, và Anh Kết quả cho thấy, NKMV làm kéo dài thời gian điều trị, ảnh hưởng đến công việc và sức khỏe của bệnh nhân, tăng áp lực lên bệnh viện và tăng chi phí

5

điều trị lên 17,434 euro tại Pháp; khoảng 20 nghìn euro tại Đức; 32,000 euro tại Ý; gần 1 triệu euro tại Tây Ban Nha và hơn 10 nghìn euro tại Anh [10] Đối với các nước khu vực châu Á như Ấn Độ, Thái Lan và các nước Châu Phi, tỷ lệ người bệnh

bị NKVM có thể lên đến 8-24% [7], một con số khá cao

Việt Nam cũng là một trong những nước có tỷ lệ NKVM cao (5-10%) và hơn 90% NKVM thuộc loại nông và sâu [7], [11] Một số nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy NKVM tăng thời gian nằm viện và chi phí điều trị ít nhất 2 lần, đó là chưa kể đến việc làm tăng nguy cơ tử vong cho bệnh nhân

1.1.3 Các biện pháp phòng ngừa nhiễm khuẩn vết mổ

Để giảm tỷ lệ NKVM, Bộ Y tế quốc gia đã đưa ra các biện pháp phòng ngừa dựa trên 2 nguyên tắc chính: giảm rủi ro vi khuẩn xâm nhập và tăng cường khả năng kháng vi khuẩn của cơ thể [1], [2], [5], [7] Các biện pháp phòng ngừa NKVM gồm: chuẩn bị trước phẫu thuật, sử dụng kháng sinh dự phòng trong phẫu thuật, kiểm soát

vô khuẩn trong quá trình phẫu thuật và chăm sóc vết mổ sau phẫu thuật

Mặc dù các biện pháp phòng ngừa đã và đang được áp dụng chặt chẽ tại các bệnh viện nhưng không đạt được hiệu quả cao vì điều kiện môi trường cũng như cơ sở vật chất tại các bệnh viện nước nhà Các nghiên cứu cho thấy rằng, chỉ khâu phẫu thuật (CKPT) đặc biệt là loại CKPT đa sợi là nguồn lây nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài trong quá trình phẫu thuật [2] Hình 1.1 mô phỏng cấu trúc sợi của CKPT đơn sợi và đa sợi Có thể thấy, cấu trúc của CKPT đa sợi có nhiều lỗ trống, là nơi mà vi khuẩn có thể bám lên và phát triển Vì vậy, các nhà sản xuất đã cho ra đời dòng CKPT kháng khuẩn Sản phẩm nổi bật được kể đến là sản phẩm CKPT phủ chất

kháng khuẩn của công ty Ethicon thuộc tập đoàn Johnson & Johnson của Mỹ [12]

Tuy nhiên, gần đây có một số tranh cãi về ảnh hưởng của TCS đối với sức khỏe con người Ngày nay, sự phát triển vượt bậc của công nghệ nano đã giúp tạo ra các vật liệu kháng khuẩn tiềm năng, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, nổi bật là nano bạc Nano bạc được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, trong đó có lĩnh vực vật liệu kháng khuẩn Hạn chế của nano bạc trong lĩnh vực y tế là khả năng phân hủy sinh học Vì

6

cơ thể chúng ta không thể tự đào thải được các ion kim loại/ oxit kim loại, khó mà ứng dụng được vào lĩnh vực y tế, đặc biệt là thiết bị y tế cấy ghép

Hình 1.1 Ảnh chụp SEM cấu trúc sợi của (a) CKPT đơn sợi và (b) CKPT đa sợi

1.2 Tổng quan về nano kẽm oxit (ZnO NPs)

1.2.1 Cấu trúc của nano kẽm oxit

Cấu trúc của nano kẽm oxit rất đa dạng và được ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau ZnO NPs có thể tồn tại ở cấu trúc 1D, 2D hoặc 3D, trong đó cấu trúc 1D chiếm nhiều nhất gồm cấu trúc que (nanorods), cấu trúc dạng kim (-needles), cấu trúc dạng xoắn (-lixes), dạng lò xo (-springs), dạng vòng (-rings), dạng ruy băng (-ribbons), dạng ống (-tubes), dạng đai (-belts), dạng sợi (-wires) và dạng lược (-combs) Cấu trúc 2D thường là cấu trúc đĩa nano hoặc mảng nano (nanoplate/nanosheet) dạng viên nano (nanopellets) Cấu trúc 3D của ZnO NPs thường gặp như cấu trúc hoa (flower), hoa tuyết (snowflakes), bồ công anh (dandelion) và nhím lá kim (conciferous urchin-like) [13], [14] Có thể nói ZnO NPs là vật liệu nano có nhiều cấu trúc nhất, và cấu trúc của nó phụ thuộc vào phương pháp và điều kiện tổng hợp Bảng 1.1 tóm tắt một số cấu trúc của ZnO NPs dựa trên phương pháp và điều kiện tổng hợp

Tính chất và ứng dụng TLTK

1

Hóa cơ

NaCl, ZnCl2,

Na2CO3

Nung trong 2 giờ ở

600 °C

Cấu trúc lục giác (hexagonal) Kích thước hạt : 21-25 nm

[15]

400-800 °C

Cấu trúc lục giác (hexagonal) Kích thước hạt : 18-35 nm

Cấu trúc wurtzite, kích thước hạt 50 nm

[17]

NaOH

Tổng hợp : 2 giờ Làm khô : 2 giờ ở

Kết tủa : 50-55 phút, 101 °C

Cấu trúc wurtzite, dạng que, hạt gạo

[19]

ZnO NPs có hai (2) dạng cấu trúc tinh thể chính, một là cấu trúc wurtzite lục giác (hexagonal wurtzite) và một là cấu trúc zincblende lập phương (cubic zincblende) [14] trong đó cấu trúc wurtzite lục giác là cấu trúc bền ở điều kiện thường Hình 1.2 minh họa cho cấu trúc wurtzite lục giác của ZnO NPs (loại B4) là mặt mạng lục giác (hexagonal lattice) thuộc nhóm không gian P63mc, đặc trưng bởi hai (2) mặt

8

phụ Zn2+ và O2- kết nối với nhau (interconnecting sublattices) mà tại đó, mỗi ion Zn được bao quanh bởi bốn (4) ion O2- và ngược lại Sự phối hợp này làm phát sinh đối xứng cực dọc theo trục lục giác Sự phân cực này là nguyên nhân dẫn đến một số tính chất của ZnO, bao gồm tính điện phân và sự phân cực tự phát của nó, và cũng

là yếu tố chính trong sự phát triển tinh thể, ăn mòn và tạo ra khuyết tật Bốn mặt kết thúc của cấu trúc tinh thể ZnO wurtzite thường là mặt phân cực Zn (0001) và O (000.1) (định hướng trục c, c-axis), mặt không phân cực (11.20) (trục a, a-axis) và (10.10) thường chứa số nguyên tử Zn và O bằng nhau Các mặt phân cực có các đặc tính vật lý và hóa học khác nhau, còn mặt có tận cùng là ‘O’ sở hữu cấu trúc điện tử khác một chút so với ba mặt ‘O’ còn lại

Hình 1.2 Hình mô phỏng cấu trúc tinh thể wurtzite lục giác (hexagonal wurtzite) của ZnO NPs Trong đó : hình cầu màu xám là các nguyên tử Oxi (oxygen atom) và

các hình cầu màu đen là các nguyên tử kẽm (Zn atom) [14]

1.2.2 Phương pháp tổng hợp ZnO NPs

Vì hoạt tính sinh học của hạt nano phụ thuộc vào hóa học bề mặt, kích thước hạt, hình thái hạt cũng như tương tác của hạt trong dung dịch Vì vậy, việc phát triển các phương pháp tổng hợp hạt nano ổn định nói chung và ZnO NPs nói riêng là rất cần

9

thiết Có rất nhiều phương pháp tổng hợp hạt nano kẽm oxit đã và đang được phát triển nhưng nổi bật là phương pháp kết tủa hóa học, phương pháp sol-gel, phương pháp hóa cơ không dung môi (solution-free mechanochemical method) và phương pháp xanh

1.2.2.1 Phương pháp hóa cơ

Phương pháp hóa cơ là phương pháp đơn giản và rẻ tiền để thu được hạt nano với quy mô lớn [13] Nguyên liệu đầu vào của quy trình này thường là kẽm clorua khan (ZnCl₂) và natri cacbonat (Na₂CO₃) được cho vào thiết bị nghiền năng lượng cao (high-energy dry milling), tại đây phản ứng xảy ra dưới tác động của các bi nghiền (ball mill) ở nhiệt độ thấp Muối natri clorua (NaCl) được thêm vào đóng vai trò môi trường phản ứng và giúp tránh tình trạng kết tụ của các hạt nano Sản phẩm sau phản ứng được nung ở 400-800 °C để tạo ra ZnO Phản ứng minh họa được thể hiện trong chuỗi phản ứng sau:

(1) ZnCl2 + Na2CO3 → ZnCO3 + 2NaCl

(2) ZnCO3 → ZnO + CO2

Nhược điểm của phương pháp này là khó kiểm soát độ đồng nhất của các hạt sau khi nghiền và khó kiểm soát kích thước hạt mong muốn

1.2.2.2 Phương pháp kết tủa hóa học

Hiện nay, đa số hạt nano ZnO đều được tổng hợp bằng phương pháp hóa học vì phương pháp này có độ lặp lại cao và dễ điều khiển các thông số phản ứng hơn [13] Phương pháp này dựa trên quá trình khử nhanh và tự phát của muối kẽm như muối kẽm nitrat [Zn(NO3)2], kẽm acetat [Zn(CH3COO)2] hoặc kẽm sunfat (ZnSO4) nhờ việc sử dụng chất tạo kết tủa như NaOH hoặc NH4OH [13], [20] Thông thường, chất tạo kết tủa được nhỏ giọt vào dung dịch muối kẽm đến khi pH = 8 Sau đó, dung dịch được khuấy liên tục thu được sản phẩm trung gian Zn(OH)2 Sau khi nung sản phẩm trung gian, ta sẽ thu được ZnO

10

Có khá nhiều các nghiên cứu tổng hợp hạt nano ZnO dựa trên phương pháp này [21], [22], [23], và các nhà nghiên cứu đã rút ra kết luận về các thông số cần quan tâm trong phương pháp này là nồng độ muối kẽm và nồng độ của chất tạo kết tủa, tỷ

lệ giữa hai (2) tiền chất và nhiệt độ nung

Bên cạnh các ưu điểm nổi bật, phương pháp này vẫn còn tồn đọng một số vấn đề cần xem xét như tính độc hại của dung môi sử dụng hoặc độ tinh khiết của sản phẩm [24]

Bước 2-Tạo cụm ZnO: hỗn hợp khan ở bước 1 được pha loãng trong dung dịch ethanol trong sự có mặt của LiOH.H2O Dưới tác động của bể siêu âm, huyền phù chuyển từ trắng sang trong suốt Quy trình này có thể tăng khả năng giải phóng ion

OH và tạo ra dung dịch ZnO

Bước 3-Phát triển tinh thể: giai đoạn này là bước tự phát và xảy ra ở nhiệt độ thường Tuy nhiên, lượng LiOH ảnh hưởng nhiều đến tốc độ phát triển mầm, hình dạng và kích thước mầm

Về mặt lý thuyết, phương pháp này có thể tạo được hạt nano kích thước nhỏ nhưng việc sử dụng dung môi methanol và LiOH cũng như việc đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền là những hạn chế của phương pháp này

11

1.2.2.4 Phương pháp thủy nhiệt

Phương pháp này không yêu cầu việc sử dụng dung môi hữu cơ hoặc các bước phụ sau phản ứng (nghiền hoặc nung) nên phương pháp này có thể được xem là phương pháp thân thiện với môi trường [13] Quy trình tổng hợp được tiến hành trong máy hấp (autoclave) áp suất cao Ở đó, hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt dần đến 100-

300 °C và để trong vài ngày Sau phản ứng, bình phản ứng được làm nguội hình thành nên mầm tinh thể Mặc dù đây là phương pháp có thể tạo được hạt nano ZnO độ tinh khiết cao nhưng thời gian phản ứng dài là một trong những hạn chế trong quá trình nghiên cứu cũng như khả năng mở rộng quy mô ứng dụng công nghiệp

Lá cây khô, nghiền nhỏ

[28]

4 Aloe vera Nha đam

Vỏ cây đã được đông khô

[30]

1.2.3 Ứng dụng của nano kẽm oxit

Nhờ vào các tính chất hóa học và vật lý nổi bật như độ ổn định hóa học cao, hấp thụ dải bức xạ rộng và độ ổn định quang học cao mà kẽm oxit được biết đến rộng rãi như vật liệu đa chức năng [13], [14] Trong ngành khoa học vật liệu, ZnO được xếp vào nhóm chất bán dẫn nhóm II-VI, nhóm có đồng hóa trị nằm trên ranh giới giữa chất bán dẫn ion và chất bán dẫn cộng hóa trị Bên cạnh đó, ZnO có độ cứng cao và hằng số điện áp cao nên nó cũng được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghiệp gốm sứ [13] Ngoài ra, kẽm oxit (ZnO) là một trong số ít các kim loại/ oxit kim loại

13

được cục quản lý dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp vào danh sách oxit kim loại an toàn với sức khỏe con người [25], [31] vì ZnO có khả năng phân hủy sinh học và độc tính thấp [14], [32] Zn2+ là nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể Tại Mỹ, người dân được khuyến khích nên cung cấp 9-11 mg Zn2+ một ngày để hỗ trợ quá trình trao đổi chất của cơ thể [32] Về mặt hóa học, bề mặt của ZnO giàu nhóm –

OH, dễ dàng gắn các nhóm chức Vì vậy, ZnO đã và đang được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực như: hình ảnh y sinh (biomedical imaging), dẫn truyền thuốc (drug delivery), dẫn truyền gen (gene delivery) và cảm biến sinh học (biosensor) hoặc trong lĩnh vực mỹ phẩm, vải sợi, xúc tác, v.v [13], [32], [16]

1.2.3.1 Ứng dụng của ZnO NPs trong lĩnh vực hình ảnh sinh học

ZnO NPs có khả năng phát xạ ánh sáng xanh (blue) và phát xạ tia UV gần UV), các nguồn ánh sáng có sự phát huỳnh quang xanh lá (green) hoặc vàng (yellow) do các lỗ trống oxy (oxygen vacancies) [20], [33] Vì vậy, ứng dụng của ZnO NPs được mở rộng trong lĩnh vực hình ảnh sinh học

(near-Sol-gel là phương pháp phổ biến để tổng hợp ZnO NPs ứng dung trong lĩnh vực hình ảnh sinh học, vì phương pháp này được thực hiện gần nhiệt độ phòng nên không gây ra khuyết tật bề mặt của ZnO NPs Mặc dù polyvinylpyrrolidon (PVP), oleic axit (OA), diethanolamin (DEA), polyethylene glycol methyl ete (PEGME), polymethylmethacrylat (PMMA) và polystyren (PS) là các chất bảo vệ/ ổn định được sử dụng phổ biến trong quá trình tổng hợp hạt nano kim loại, nhưng chúng vẫn không thích hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực hình ảnh sinh học vì một số chất

ổn định không tan hoặc không bền trong nước, trong khi một số khác lại không cho hiệu suất phát huỳnh quang cao dẫn đến chúng sẽ bị các tế bào tự phát quang che khuất Xiong và các cộng sự lần đầu tiên tổng hợp được nano ZnO NPs có cấu trúc lõi-vỏ (core-shell) ZnO@poly(MMA-co-PEGMEMMA) không chỉ có hiệu suất lượng tử (quantum yield) cao, mà còn có khả năng phát quang cao ổn định dung dịch (aqueous solution), tính chất mà chưa có nghiên cứu nào trước đó đạt được [20], [33], [34]

14

1.2.3.2 Ứng dụng của ZnO NPs trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc

Việc ứng dụng vật liệu nano vào lĩnh vực dẫn truyền thuốc mở ra cơ hội mới cho phương pháp trị liệu hiệu quả và an toàn hơn, đặc biệt là chữa bệnh ung thư Các vật liệu có cấu trúc nano mang thuốc như Fe₃O₄ NPs, ống nano cacbon (carbon nanotubes), viên nén polyme cấu trúc nano (polymer nanobeads) giúp tiết kiệm được lượng thuốc sử dụng, giảm các biến cố bất lợi (side effect) và quan trọng là khả năng xâm nhập vào đúng tế bào qua con đường nội bào (intracellular endocytic pathways) và giải phóng thuốc tại các vị trí đích (target site) một cách hiệu quả, đặc biệt là khi bản thân thuốc đó không được tế bào hấp thụ [20], [33]

Do giá trị pH trong các khối u (tumor tissue) hoặc mô viêm thấp hơn nhiều so với máu hoặc các mô bình thường, vì vậy hệ dẫn truyền thuốc ứng dụng chữa trị ung thư cần có khả năng đáp ứng pH (pH-responsive) Các hệ dẫn truyền thuốc đáp ứng

pH thường sử dụng các chất nhạy pH, được xem như cầu nối giữa vật chủ và vật bám (host and guest) ZnO NPs là một trong số những chất mang thuốc đáp ứng pH được ứng dụng rộng rãi từ năm 2010 nhờ vào đặc tính nhạy pH, khả năng phân hủy sinh học và tính tương thích sinh học [33]

Nhạy pH vừa là ưu điểm, cũng là nhược điểm của ZnO NPs khi ứng dụng trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc Zhu và Guo cùng các cộng sự của họ từng tạo ra hệ dẫn truyền thuốc nano silica kích thước mao quản trung bình (mesoporous silica nanoparticles, MSNs) mang doxorubicin (DOX) trong đó ZnO NPs đóng vai trò làm chất bảo vệ thuốc (DOX@ZnO@MSN) ZnO NPs bền trong điều kiện môi trường trung tính, nhưng khi giảm giá trị pH thì ZnO NPs tan nhanh chóng dẫn đến lượng thuốc giải phóng không kiểm soát Hơn nữa bản thân ZnO không gây độc, nhưng khi bị phân hủy, nó giải phóng ion Zn²⁺ gây độ tế bào Để khắc phục nhược điểm này, các nhà nghiên cứu đã đồng quan điểm rằng đề bảo vệ được ZnO trong

môi trường in vivo, hệ dẫn truyền thuốc cần được thiết kế hai lớp bảo vệ gồm : lớp

kị nước (hydrophobic) bao quanh hạt nano kẽm oxit để ngăn sự hòa tan ZnO NPs,

15

lớp ưa nước (hydrophilic) bên ngoài để giúp hệ ổn định trong dung dịch (aqueous solution) [33], [35]

1.2.3.3 Ứng dụng ZnO NPs làm vật liệu kháng khuẩn

Cùng với sự phát triển của công nghệ nano, các nhà khoa học đã phát hiện ra các tính năng vượt trội của nano kẽm oxit (đặc tính về điện, quang học, cơ tính, v.v) so với kẽm oxit thô Nhờ vào sự bất đối xứng tâm trong cấu trúc wurtize, kết hợp với liên kết cơ điện lớn nên tính chất áp điện và nhiệt điện mà ZnO được ứng dụng rộng rãi trong các thiết bị chuyển hóa năng lượng, cảm biến, xúc tác quang, v.v Gần đây, không ít nghiên cứu đều kết luận rằng nano ZnO là một trong số 3 loại hạt nano có hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt nhất [20], [31], [36] Mặc dù nano vàng (Au NPs) và nano bạc (Ag NPs) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn nano ZnO nhưng chúng rất khó mở rộng ra quy mô công nghiệp do chi phí cao cũng như Ag NPs và Au NPs không có khả năng phân hủy sinh học [31] Bên cạnh đó, ZnO NPs có khả năng

kháng được nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram dương như : Escherichia coli,

S.enteritidis, Streptococcus pyogenes, Aeromonas hydrophila, B.subtillis, S aureus, L.monocytogenes, Klebsiella pneumonia, P.aeruginosa, Salmonella typhimurium,

v.v Khả năng kháng khuẩn của ZnO NPs có thể nhờ vào quá trình giải phóng ion kim loại, sự hình thành các gốc tự do oxi hóa (reactive oxygen species, ROS), quá trình gây rối loạn chức năng màng tế bào, hoặc do sự thâm nhập của các hạt nano (nanoparticles penetration), cũng có thể do sự tắc nghẽn, gián đoạn của quá trình vận chuyển điện tử qua màng (blockage, interruption of transmembrane electron transportation), v.v [37]

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn của ZnO NPs

Vật liệu nano kẽm oxit có thể tương tác hóa học hoặc tương tác vật lý để thể hiện khả năng kháng khuẩn của nó Tương tác hóa học của vật liệu ZnO NPs với tế bào

vi khuẩn dẫn đến việc sản sinh các gốc tự do oxi hóa (ROS), sự hình thành của H₂O₂ và giải phóng ion Zn²⁺ Ngược lại, tương tác vật lý thể hiện khả năng kháng khuẩn thông qua việc phá vỡ màng tế bào (cell envelope) (gồm màng tế bào trong

16

và thành tế bào của vi khuẩn), nội hóa vi khuẩn (cellular internalization) và phá hủy

cơ học (mechanical damage)

1.2.4.1 Tương tác hóa học của ZnO NPs với tế bào vi khuẩn

a Sự hình thành các gốc tự do oxi hóa (ROS)

Đa số các nghiên cứu đề đồng ý rằng khả năng hình thành ROS như anion surperoxide (O2), gốc hydroxyl tự do (·OH) và hydro peroxit (H2O2) là cơ chế kháng khuẩn chính của ZnO-NPs [20], [36], [37] Dưới tác động của ánh sáng, ZnO tạo ra các electron tự do và lỗ trống Các electron và lỗ trống có thời gian sống đủ

để gây ra sự quang hóa của các gốc tự do oxi hóa (ROS) trên bề mặt của ZnO thông qua quá trình hấp phụ các phân tử nước và oxi trong môi trường Các phân tử Oxy sản sinh ra gốc peroxit anion phản ứng với H+ tạo ra HO2· Sau đó, HO2· này kết hợp với các electron tạo ra hydro peroxit (·HO2) Gốc tự do này tiếp tục kết hợp với

H+ tạo thành H2O2 Các phân tử này sau đó đi qua thành tế bào phá vỡ cấu trúc của màng tế bào làm chết vi khuẩn Quá trình hình thành ROS được tóm tắt trong chuỗi phản ứng sau:

giải phóng Zn2+ và sự hình thành ROS [36]

1.2.4.2 Tương tác vật lý của ZnO NPs và tế bào vi khuẩn

a Phá vỡ màng sinh chất (plasma membrane) của vi khuẩn

Thuyết này được dựa trên tương tác tĩnh điện giữa bề mặt tế bào vi khuẩn và kẽm oxit Nghiên cứu của Stoimenov [38] và Tsuneda [39] cho thấy trong điều kiện cơ thể, bề mặt tế bào vi khuẩn tích điện âm do sự phân ly của nhóm chức carboxylic và các nhóm chức khác trong khi vật liệu kẽm oxit tích điện dương Sự đối nghịch điện tích giúp cho ZnO NPs dễ dàng bám lên mặt ngoài của màng plasma và trung hòa điện tích bề mặt của màng vi khuẩn, làm tăng sức căng bề mặt Kết quả, kết cấu màng tế bào bị trương phồng, hình thái màng tế bào bị thay đổi, rò rỉ dịch nội bào

và các thành phần bên trong của vi khuẩn Cơ chế này được minh họa trong hình 1.4

18

Hình 1.4 Hình tổng hợp các tương tác vật lý khác nhau giữa ZnO NPs và các tế bào

vi khuẩn dẫn đến hiệu ứng gây chết vi khuẩn [37]

b Nội hóa tế bào của ZnO NPs

Cơ chế này thường đúng đối với cấu trúc nano có kích thước nhỏ hơn 10 nm Vì kích thước nhỏ nên ZnO NPs có thể đi xuyên qua màng nguyên sinh (cytoplasmic membrane), và tích tụ bên trong tế bào vi khuẩn Tại đây, chúng sẽ phá hủy các thành phần nội bào (intracellular) của vi khuẩn như axit nucleic hoặc làm tăng khả năng trương của tế bào gây chết vi khuẩn Cơ chế nội hóa tế bào cũng được minh họa trong hình 1.4

c Phá hủy cơ học màng tế bào

Sự xuất hiện của các khuyết tật bề mặt như khuyết tật về kết cấu, góc cạnh trên bề mặt của vật liệu ZnO NPs tạo hiệu ứng mài mòn bề mặt vi khuẩn tốt hơn so với ZnO thô Kết quả nghiên cứu của Padmavathy và cộng sự [40] đã chứng minh rằng ZnO NPs kích thước 12 nm có khả năng kháng khuẩn cao hơn ZnO kích thước 45

nm và kích thước 2 µm Phá hủy cơ học màng tế bào được cho là cơ chế chính gây

ra sự chết tế bào vi khuẩn

các nước khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam Một vài sản phẩm có giá trị

(bột, lá, chiết xuất, tinh dầu) từ lá trầu không có lợi ích rất lớn đối với sức khỏe con người Lá và bột lá trầu không có tác dụng giảm đau và làm mát, được dùng để trị

nhức đầu, viêm khớp, đau họng, suy nhược thần kinh Nước súc miệng và viên nén

làm từ lá trầu không cũng được dùng để chữa các bệnh về răng miệng Tinh dầu chiết xuất từ lá trầu không chứa nhiều hợp chất phenol, các hợp chất có đặc tính

chống oxi hóa và chống nấm nên được ứng dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh như thương hàn, tả, lao, v.v Các công bố khoa học cho thấy trong

lá trầu không chứa hợp chất polyphenol giúp chống oxi hóa, và ức chế một số

nguyên nhân gây loét dạ dày [42]–[48] Hình 1.6 thể hiện một số hợp chất hữu cơ

thường có trong lá trầu không Thành phần hóa học tham khảo có trong dịch chiết lá

trầu được biểu thị trong bảng 1.3 [43], [45], [46]

Hình 1.5 Hình thái của lá trầu không

20

(d)Quercetin

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của một số hợp chất hữu cơ có trong lá trầu không

1.3.2 Tính khử và tính kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không

Như đã đề cập, lá trầu không rất có tiềm năng ứng dụng trong y sinh nhờ vào khả

năng kháng ung thư, kháng nấm, chống oxhi hóa, v.v Năm 2007, Nalina và các cộng sự [44] đã công bố kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá

trầu không trên vi khuẩn Streptococcus mutans Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch

chiết lá trầu không gây ra sự phá hủy màng sinh chất (plasma cell membrane) và sự

đông tụ của các nucleoid làm chết vi khuẩn Đến năm 2008, Nair và cộng sự [49]

tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá bàng (Terminalia

catappa), lá cây hồng xiêm (Manilkara zapota) và lá trầu không (Piper betel) khi

chiết bằng nước và bằng methanol trên 10 vi khuẩn Gram dương, 12 vi khuẩn Gram

âm và một (1) nấm Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn cao hơn hai (2) dịch chiết còn lại Subashkumar và cộng sự [50] đã khảo sát

ảnh hưởng khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không bằng nước đến các vi

khuẩn gây bệnh Công trình nghiên cứu này được đăng năm 2013 với kết quả kháng

21

khuẩn cao nhất trên Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus

aureus

Vì trong dịch chiết lá trầu không chứa nhiều hợp chất có tính khử Các hợp chất này

còn đóng vai trò chất bảo vệ bề mặt trong quá trình tổng hợp hạt nano kim loại theo phương pháp xanh Gần đây, có nhiều nghiên cứu sử dụng dịch chiết lá trầu không

để tổng hợp hạt nao bạc [51]–[53], nano vàng [53], nano đồng oxit [54], v.v Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đề cập đến khả năng điều khiển hình thái và kích

thước của hạt nano của dịch chiết lá trầu không

Bảng 1.3 Thành phần hóa học mang tính tham khảo có trong dịch chiết lá trầu

không (chiết trong dung môi nước) được phân tích bằng phương pháp sắc kí khí

Dựa trên các yếu tố về độ phổ biến của nguyên liệu tại Việt Nam, tính khử và khả

năng bảo vệ bề mặt của các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá trầu không cũng như tính kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không, chúng tôi đã lựa chọn nguyên

liệu này để nghiên cứu tổng hợp nên ZnO NPs

22

1.3.3 Phương pháp chiết xuất lá trầu không

Chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ dược liệu là một quá trình phức tạp được sử dụng để tìm ra các hợp chất hoạt tính sinh học có thể ứng dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, v.v., quá trình này bao gồm các bước khác nhau như lựa chọn loài thực vật, thu hái và xác định vật liệu, hoạt động đơn vị, khai thác và mô tả đặc điểm [41] Việc lựa chọn các loài thực vật dựa trên các tài liệu hiện có, các nghiên cứu phân loại hóa học, tuổi và độ chín của cây, các đặc tính truyền thống và dược liệu cũng như cách sử dụng

Để chiết xuất hiệu quả, cần phải tối ưu hóa các điều kiện quy trình, như thời gian chiết, nhiệt độ, tỷ lệ rắn - lỏng, loại dung môi, v.v Các loại quy trình chiết khác nhau, gồm kỹ thuật chiết cổ điển và kỹ thuật chiết nâng cao [55] Các quy trình chiết xuất cổ điển bao gồm thấm ướt, phân hủy, đun hồi lưu, truyền dịch cùng với quá trình chiết xuất là những quy trình chiết xuất đơn giản nhất Hạn chế của các quy trình này là thời gian chiết xuất dài Các kỹ thuật chiết xuất tiên tiến bao gồm chiết xuất soxhlet, chiết xuất bằng sóng siêu âm (chiết xuất có hỗ trợ siêu âm), chiết xuất dung môi gia tốc, chưng cách thủy, chưng cất hơi nước, chưng cất vi sóng và chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn được áp dụng để tránh những hạn chế của kỹ thuật chiết xuất cổ điển Song, các kỹ thuật tiên tiến này yêu cầu chi phí đầu tư cao, nên chưa được ứng dụng rộng rãi

Trong số các kỹ thuật chiết xuất, chưng cách thủy (hydro-distillation) là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhờ vào một số ưu điểm như: đơn giản, dễ sữa chữa và bảo trì, chi phí thấp, và dịch chiết thu được có độ tinh khiết cao [41] Quy trình

Clevenger thường được dùng để chiết xuất tinh dầu từ lá trầu không Tuy nhiên,

quy trình này diễn ra chậm, thời gian chiết xuất dài (3-8 giờ), hiệu suất làm nguội thấp Để khắc phục các nhược điểm này, một số kỹ thuật cải tiến như chưng cách thủy có hỗ trợ vi sóng [56] hoặc chưng cất thủy có hỗ trợ của siêu âm [57], trong đó

kỹ thuật chưng cách thủy có hỗ trợ của siêu âm là kỹ thuật hiệu quả trong việc tăng năng suất thu hồi các hợp chất hoạt tính sinh học cũng như tiết kiệm thời gian chiết

23

xuất, tiết kiệm dung môi Quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Ultrasound-assisted extraction, UAE) dựa trên hiện tượng tạo lỗ hổng âm thanh và các hiệu ứng cơ học để chiết xuất các hợp chất từ các nguồn thực vật Bong bóng trọng lực trên bề mặt chất nền thực vật bị phá vỡ làm cho thành tế bào bị vỡ, dẫn đến sự thâm nhập của dung môi vào nguyên liệu thực vật cao hơn và nhanh hơn Do

đó, việc chiết xuất các hợp chất mong muốn được đẩy nhanh nhờ vào sự truyền khối tổng thể được tăng cường [58]

24

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

2.1.1 Hóa chất, nguyên vật liệu

Muối kẽm nitrate [Zn(NO3)2] và các hóa chất khác được mua từ nhà sản xuất TCI,

Nhật Bản Bột lá trầu không được mua từ Tây Nguyên (593 Phạm Văn Đồng,

Phường Trần Hưng Đạo, Kon Tum, Việt Nam) CKPT đa sợi được mua trên thị trường

CKPT đa sợi: sử dụng sản phẩm hiện có trên thị trường như CKPT Surgisorb (Polyglycolic acid, PGA) (Nitcho Kogyo, Nhật Bản), CKPT Mazter (Polyester, PET) (Mazzaferro, Brazil)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy khuấy từ gia nhiệt;

- Tủ sấy;

- Cân cân phân tích (4 số);

- Bộ lọc chân không;

25

Sau đó, dịch lọc được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút để loại bỏ tạp chất còn sót lại Cuối cùng, dịch lọc được lọc qua màng lọc 0.45 µm, thu được dịch chiết (DC) Dịch chiết được bảo quản tại nhiệt độ 4 – 8 °C nếu chưa sử dụng ngay Dịch chiết thu được sẽ được pha loãng, tiến hành đo độ hấp thu bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis Để tính hiệu suất, dịch chiết được sấy chân không tại nhiệt độ 40-50 °C đến khi thu được cao khô và tính toán dựa trên Dược điển Việt Nam, phụ lục 12.10 Quy trình chuẩn bị DC được thể hiện trong hình 2.1

Như đã đề cập trong mục 1.3.3, khi tiến hành chiết xuất lá trầu không cần chú ý đến

ảnh hưởng của các yếu tố (1) thời gian chiết (phút), (2) nhiệt độ (°C), (3) tỷ lệ rắn - lỏng (g/ml), (4) loại dung môi, v.v Trong nghiên cứu này, dung môi nước được lựa chọn để hạn chế việc dùng hóa chất trong quy trình Các yếu tố (1), (2), (3) được lựa chọn để khảo sát như sau:

- Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ rắn-lỏng và thời gian chiết xuất đến quy trình, nhiệt độ chiết xuất được giữ cố định 90 °C, tỷ lệ rắn-lỏng được khảo sát lần lượt

là 1:5, 1:10 và 1:15, thời gian chiết xuất lần lượt là 15, 30 và 60 phút

- Sau khi đã kết luận được tỷ lệ rắn-lỏng và thời gian chiết phù hợp, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến quy trình chiết lần lượt là 70, 80 và 90 °C