Nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học từ nấm vân chi ( trametes versicolor), ứng dụng thử nghiệm bổ sung trong chế biến thực phẩm

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học từ nấm Vân chi Trametes Versicolor, ứng dụng thử nghiệm bổ sung trong chế biến thực phẩm.. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nghiên cứu ph

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN TRẦN NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT

SINH HỌC TỪ NẤM VÂN CHI (TRAMETES

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đàm Sao Mai

Người phản biện 1:

Người phản biện 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN TRẦN NGỌC MAI MSHV: 16083731

Ngày, tháng, năm sinh: 28/10/1994 Nơi sinh: Bà Rịa -Vũng Tàu Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành:60540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học từ nấm Vân chi (Trametes Versicolor), ứng

dụng thử nghiệm bổ sung trong chế biến thực phẩm

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nghiên cứu phương pháp tách chiết và tinh sạch các hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi để thu nhận hoạt chất có độ tinh khiết cao Ứng dụng thử nghiệm phối trộn hoạt chất để tạo chế phẩm bột Vân chi sấy phun có hoạt tính chống oxi hóa

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo QĐ giao đề tài số 1838/QĐ-ĐHCN ngày

28/08/2018

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 28/08/2019

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đàm Sao Mai

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

VIỆN TRƯỞNG CNSH&TP

i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Thầy Cô trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM và lòng biết ơn đến Quý Thầy Cô Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi suốt quá trình học tập, rèn luyện tại trường và luôn tạo điều kiện cơ sở vật chất- kỹ thuật tốt nhất, để tôi có thể thuận lợi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Đàm Sao Mai và ThS Nguyễn Ngọc Thuần, Thầy Cô đã hướng dẫn cho tôi từ những kiến thức, những bước cơ bản cho đến những kết quả cuối cùng của luận văn Tôi luôn muốn cảm ơn Thầy Cô vì đã luôn sát cánh tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu Đặc biệt, là thái độ nghiên cứu, làm việc khoa học nghiêm túc và hiệu quả Chắc chắn những điều này sẽ rất cần thiết và bổ ích cho quá trình học tập và công tác của tôi sau này

Mặc dù, tôi đã nổ lực, cố gắng tìm hiểu, học hỏi kiến thức mà Thầy Cô và các anh chị đi trước đã truyền đạt trong suốt quá trình học tập và làm luận văn Nhưng do thời gian có hạn, kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm thực tế còn non kém, nên trong quá trình thực hiện và hoàn thành báo cáo không thể tránh khỏi những khiếm khuyết

và thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến từ Quý Thầy

Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên cứu điều kiện tối ưu để sấy phun dịch chiết từ nấm Trametes versicolor (Vân

chi) bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) là tỷ lệ maltodextrin là 5% w / v, nhiệt độ sấy đầu vào 1600C và tốc độ dòng cấp liệu 26,05ml/phút Các giá trị thực nghiệm của Tổng hàm lượng phenolic (TPC) và Độ ẩm (MC) là 35,76 ± 0,04mg GAE / g,

4,43 ± 0,02% Từ nguyên liệu nấm Trametes versicolor Nghiên cứu đã phân lập được

3 chất tinh sạch TP12, TP13, TP22 tương ứng là Ergosterol, Cerevisterol và Methyl

3,4-dihydroxybenzoate (MDHB) Methyl 3,4-dihydroxybenzoate (MDHB) có hoạt

tính sinh học chống lại các ức chế thần kinh gây nên bệnh Alzheimer, cũng như có khả năng giúp kéo dài tuổi thọ cùng với hoạt tính chống oxy hóa

Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của Methyl 3,4-dihydroxybenzoate (MDHB) bằng hai phương pháp DPPH và ABTS là 1.972 ± 0.012 µg Trolox/g DW và 2.007 ± 0.013 µg Trolox/g DW ở nồng độ lên 4mg/ml Và sau quá trình sấy phun, hoạt chất vẫn còn hoạt tính 0.611± 0.013 µg Trolox/g DW ở 40mg/ml Chính vì vậy, phối trộn tạo ra sản sản phẩm bột nấm Vân chi sấy phun có bổ sung hoạt chất chống oxi hóa

Từ khóa: Hợp chất tự nhiên, Phenolics, Trametes versicolor, Vân Chi, Sấy phun

iii

ABSTRACT

The optimal conditions for the Spray drying from Trametes versicolor (V.C.) extracts

were determined using response surface methodology (RSM) One kilogram of product was extracted with 30L ethanol 65% for 7 hours Solids were filtered off, extract was concentrated to obtain solution containing about 20% total solid using a vacuum evaporator Study on the effects of three independent variables, namely Maltodextrin ratio (% w/v), Feed flow rate (ml/min) and inlet drying temperature (oC)

on the responses; total phenolic content (TPC) and moisture content (MC) The

optimal conditions for process spray drying from T versicolor extracts were found to

be maltodextrin ratio of 5%w/v, inlet drying temperature of 160oC and Feed flow rate

of 26.05ml/min The experimental values of TPC and MC were 35.76±0.04mg GAE/g, 4.43±0.02%

The antioxidant activity of Methyl 3,4-dihydroxybenzoate (MDHB) was tested by DPPH and ABTS by 1,972 ± 0.012 µg Trolox/g DW and 2,007 ± 0.013 µg Trolox /g

DW at concentrations of 4 mg/ml And after spray drying, the active ingredient was still active in 0.611± 0.013 µg Trolox/g DW at 40mg/ml Therefore, blending to

create spray-dried Trametes versicolor powder product with added antioxidant active

ingredients

Keywords: Antioxidant active, Trametes versicolor, Total phenolic content (TPC), Spray drying

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

Nguyễn Trần Ngọc Mai

v

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nấm Vân chi 3

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Công dụng và tác dụng dược lí 4

1.1.3 Thành phần hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi 7

1.2 Chiết xuất các hoạt chất sinh học 18

1.2.1 Cơ sở khoa học chiết xuất các hoạt chất sinh học 18

1.2.2 Kỹ thuật chiết xuất các hoạt chất sinh học 19

1.3 Phương pháp tách và tinh sạch hoạt chất sinh học từ nấm Vân chi 20

1.3.1 Cơ sở phương pháp sắc ký 20

1.3.2 Phương pháp sắc ký cột 21

1.3.3 Phương pháp sắc kí bản mỏng 22

1.4 Phương pháp Định danh – kiểm tra DNA mẫu nấm Vân chi 23

1.5 Phương pháp xác định thành phần LC-MS 24

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 26

1.6.1 Định nghĩa 26

1.6.2 Cơ sở vật lý của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân 26

vi

1.6.3 Độ dịch chuyển hóa học 27

1.6.4 Các loại phổ một chiều của NMR 27

1.6.4.1 Phổ Proton (1H – NMR) 27

1.6.4.2 Phổ Carbon-13 (13C-NMR) 28

1.6.4.3 Phổ DEPT 30

1.6.5 Các loại phổ hai chiều NMR 30

1.6.6 Ứng dụng phổ NMR trong thực phẩm 31

1.7 Phương pháp sấy phun 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu nghiên cứu 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 33

2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3.1 Phương pháp lấy và xử lí mẫu 37

2.3.2 Phương pháp tách chiết, phân lập 37

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử 38

2.3.4 Phương pháp khảo sát hoạt tính 38

2.3.5 Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 38

2.3.6 Phương pháp thử nghiệm chế biến thực phẩm bổ sung 39

2.3.6.1 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic (TPC) 39

2.3.6.2 Thiết kế thử nghiệm RSM 40

2.3.7 Phương pháp xử lí số liệu 40

vii

2.4 Quy trình thực nghiệm 40

2.4.1 Định danh nguyên liệu 40

2.4.2 Xác định thành phần có trong nguyên liệu 40

2.4.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid 41

2.4.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng triterpene 42

2.4.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol 42

2.4.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide 44

2.4.3 Tách chiết và tinh chế hoạt chất sinh học 45

2.4.4 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 50

2.4.4.1 Phương pháp DPPH 50

2.4.4.2 Phương pháp ABTS 51

2.4.5 Thử nghiệm ứng dụng chế biến thực phẩm bổ sung 53

2.4.5.1 Tối ưu hóa quá trình sấy phun 53

2.4.5.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) 55

2.4.5.3 Ứng dụng sấy phun hoạt chất tinh sạch 57

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58

3.1 Định danh nguyên liệu 58

3.2 Khảo sát một số thành phần có trong nguyên liệu 59

3.3 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của 4 cao phân đoạn 60

3.4 Phân lập các hoạt chất 61

3.4.1 Hợp chất TP12 phân đoạn 1 61

3.4.2 Hợp chất TP13 phân đoạn 1 68

3.4.3 Hợp chất TP22 phân đoạn 2 71

viii

3.5 Thử hoạt tính chống oxi hóa chất tinh sạch 73

3.6 Tối ưu hóa quá trình sấy phun 74

3.6.1 Mô hình thử nghiệm tối ưu hóa 74

3.6.2 Xác minh mô hình và tối ưu hóa 78

3.7 Thử nghiệm chế biến sản phẩm bổ sung 80

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

1 Kết luận 82

2 Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

PHỤ LỤC 91

Phụ lục A Bảng số liệu 91

Phụ lục B Đồ thị đường chuẩn 92

Phụ lục C Hình ảnh chạy sắc ký tách và tinh sạch chất 95

Phụ lục D Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 98

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình mặt trước và sau quả thể nấm Vân chi 4

Hình1.2 Công thức cấu tạo polysacharide 8

Hình 1.2 Hình chạy sắc ký bản mỏng 23

Hình 1.3 Nguyên lí làm việc của LC-MS 25

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tổng quát tách chiết và tinh chế hoạt chất sinh học 45

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thử nghiệm chế biến bột nấm Vân Chi 54

Hình 3.1 Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 với các nhánh có giá trị bootstrap > 50% được giữ lại 58

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện kết quả hàm lượng các chất có trong nấm Vân chi 59

Hình 3.3 Trạng thái kết tinh và bảng mỏng của TP12 62

Hình 3.4 Phần cấu trúc vòng A và B của hợp chất TP12 66

Hình 3.5 Phần cấu trúc vòng B và C của hợp chất TP12 66

Hình 3.6 Phần cấu trúc vòng C và D của hợp chất TP12 67

Hình 3.7 Phần cấu trúc vòng D và mạch carbon dài của hợp chất TP12 67

Hình 3.8 Công thức cấu tạo Ergosterol (TP12) 67

Hình 3.9 Công thức cấu tạo của Cerevisterol (TP13) 70

Hình 3.10 Công thức cấu tạo của Metyl 3,4 dihydroxylbenzoate (TP22) 72

Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của TP22 74

Hình 3.12 Bề mặt đáp ứng của TPC và MC (A) TPC, (B) MC 79

x

DANH MỤC BẢNG BIỂU

xi

Bảng 1.1: Định lượng một số hợp chất phenolic bằng HPLC-MS/MS 9

Bảng 1.1 Độ dịch chuyển hóa học của cacbon 29

Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 34

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 35

Bảng 2.3 Xây dựng đường chuẩn quercetin và đo mẫu 41

Bảng 2.4 Các bước xây dựng đường chuẩn acid oleanolic 42

Bảng 2.5 Các bước xây dựng đường chuẩn acid galic 43

Bảng 2.6 Các bước xây dựng đường chuẩn D-glucose 44

Hình 2.2 Sơ đồ tách chất sạch bằng sắc kí cột và sắc kí bảng mỏng 49

Bảng 2.7 Xây dựng đường chuẩn Trolox bằng phương pháp DPPH 51

Bảng 2.8 Bảng xây dựng đường chuẩn Trolox bằng phương pháp ABTS 52

Bảng 2.9 Xây dựng đường chuẩn Acid gallic và đo mẫu 56

Bảng 3.1 Kết quả hàm lượng các chất có trong nấm Vân chi 59

Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của 4 cao phân đoạn 61

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất TP 12 62

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TP13 68

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ của chất TP22 71

Bảng 3.5 Kết quả đo hoạt tính chống oxi hóa của chất TP22 73

Bảng 3.6 Bảng giá trị mã hóa của các yếu tố thực nghiệm 75

Bảng 3.7 Bảng thiết kế và kết quả thí nghiệm 75

Bảng 3.8 Phương trình hổi quy của TMC và MC 76

Bảng 3.9 Kết quả mô hình RSM hàm lượng phenolics TMC và độ ẩm MC 78

Bảng 3.10 Bảng tổng hợp kết quả tối ưu hóa quá trình sấy phun T.Versolor a 79

Bảng 3.11 Bảng kết quả đo hoạt tính chống oxi hóa của chất TP22 sau sấy phun 80

Nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao và cao hơn nữa, không chỉ dừng lại thực phẩm chất lượng, dinh dưỡng, an toàn mà còn đòi hỏi có những tác dụng về dược lý, cải thiện sức khỏe Vì thế, các loại thực phẩm chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học đã và đang được quan tâm nghiên cứu ngày càng nhiều Hầu hết các loại thực vật đều chứa ít nhiều các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, tuy nhiên cần chọn những loại có giá trị dinh dưỡng và dược tính cao để có thể tăng giá trị khi bổ sung vào thực phẩm Trong một thời gian dài, nấm không chỉ được sử dụng làm thực phẩm truyền thống mà còn được sử dụng như một loại dược liệu ở nhiều quốc gia Cho đến nay, nấm dược liệu vẫn được sử dụng để điều trị nhiều bệnh ở các nước y học hiện đại như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và một số nước châu Á khác

Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu thành phần để tìm cách sử dụng nấm dược liệu hiệu quả hỗ trợ trong điều trị nhiều bệnh ở người Như nấm Linh chi -

Ganoderma đã biết từ lâu đời được sử dụng như một nấm dược liệu trong y học cổ

truyền Trung Quốc hơn 2.000 năm

Tương tự Linh chi, nấm Vân chi (Trametes Versicolor (L.:Fr.) Pil) cũng là một loại nấm

dược liệu được sử dụng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại Các nghiên cứu đã

chỉ ra rằng ngoài giá trị dinh dưỡng, T Versicolor còn giàu chất phytochemical với hoạt

tính chống oxy hóa và chống viêm, hoạt động tăng cường miễn dịch, hoạt động chống ung thư, tác dụng chống vi rút và kháng khuẩn Tuy nhiên, ở Việt Nam và các nước

khác, có rất ít nghiên cứu chuyên sâu, đặc biệt là phân tích các hợp chất phenolics của

T Versicolor, thành phần quan trọng về đặc tính chống oxy hóa Chính vì vậy, Vân chi

2

sẽ là nguồn nguyên liệu thích hợp để nghiên cứu Vì thế Tôi quyết định thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học từ nấm Vân chi (Trametes versicolor), ứng dụng thử nghiệm bổ sung trong chế biến thực phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi để thu

nhận hoạt chất có độ tinh khiết cao

- Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm phối trộn hoạt chất trong chế biến chế phẩm thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

- Định danh nguyên liệu bằng phương pháp DNA và phản ứng PCR

- Xác định thành phần có trong nguyên liệu bằng phương pháp LC-MS và UV-Vis

- Tách chiết và tinh chế hoạt chất sinh học bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng

- Xây dựng quy trình thử nghiệm chế biến chế phẩm bột Vân Chi sấy phun có phối trộn hoạt chất

4 Ý nghĩa thực tiễn đề tài

- Định danh và phân tích thành phần, tính chất của giống Vân chi Việt Nam, từ đó có thể bổ sung các dữ liệu về giống Vân chi trên thế giới

- Tách chiết và tinh chế hoạt chất sinh học đến độ tinh khiết nhất định để đa dạng ứng dụng nguồn Vân chi vào chế biến các sản phẩm thực phẩm bổ sung dinh dưỡng, thực phẩm chức năng Cụ thể là thử nghiệm chế biến chế phẩm Vân chi sấy phun có phối trộn chất có hoạt tính chống oxi hóa chiết xuất từ Vân chi

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm Vân chi

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm thực vật

Chi Trametes có hơn 50 loài phân bố rộng rãi trên thế giới Riêng Trametes versicolor

có hơn 120 chủng được ghi nhận trong bản tóm tắt Chinese Materia Medica [1] [2]

Trong khoa học nghiên cứu với tên Latin là Trametes versicolor, có nghĩa là mỏng

(trametes) và nhiều màu (versicolor) Nhiều tên khác nhau được sử dụng trong các tài

liệu cho Trametes versicolor như Coriolus versicolor (L.) Quél., Polyporus versicolor (L.) Fr., Polysticutus versicolor (L.) Fr., “Yun-Zhi” (Trung Quốc) và “Kawaratake” (Nhật Bản), ngoài ra ở một vài quốc gia Châu Âu gọi là “Turkey tail” vì có hình dạng

như cái quạt [1] và tại Việt Nam có tên là Vân chi

Trametes versicolor (Vân chi) tại Vườn Quốc gia Pù Mát, Tỉnh Nghệ An, Việt Nam

thuộc lớp Agaricomycetes và Họ Polyporaceae [2]

Loài Trametes versicolor (L.) C.G Lloyd

Hình dạng có thể nhìn thấy của T versicolor là một cây nấm hình quạt với rìa lượn sóng

và các vùng màu đồng tâm (Hình 1) T versicolor là một loài hô hấp hiếu khí bắt buộc được tìm thấy ở các thân cây, gốc cây hay các khúc cây chết T versicolor mọc quanh

4

năm, phân bố trên khắp các vùng ôn đới của châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ và có thể là

loại nấm phổ biến nhất ở Bắc bán cầu [1], [3]

Hình 1.1 Hình mặt trước và sau quả thể nấm Vân chi

Đặc điểm Vân chi cũng không có nhiều sai khác so với các loại nấm dược lí khác Là

một loại nấm polypore, có nhiều lỗ và ống, giải phóng bào tử qua nhiều lỗ nhỏ bên dưới

mũ, nắp dày, hình tam giác tròn Vân chi phát triển trên các thân cây chết với bề mặt trên mềm mượt và nổi bật với các vùng đồng tâm có màu sắc khác nhau: nâu, trắng, xám, đôi khi nó có màu nâu đỏ hay nâu sẫm với các khoảng đen hay màu xanh lá do có tảo xanh mọc trên nấm Các lề thường là lượn sóng [3] Nấm có bào tử màu trắng hình thuôn và hình trụ Chúng được tìm thấy trong các khu rừng trên khắp thế giới từ châu

Âu đến châu Á đến Mỹ và Nga T versicolor mọc quanh năm bốn mùa, phổ biến từ mùa

xuân cho đến mùa thu, và ít hơn trong trong mùa đông [1], [3]

1.1.2 Công dụng và tác dụng dược lí

Trametes versicolor không được sử dụng phổ biến như một loại thực phẩm mà được chú

ý tính mạnh về mặt dược lý và xem như một nấm dược liệu hơn Vân chi có thể ăn được nhưng vì chúng cũng rất cứng, nên theo y học truyền thống của Trung Quốc và Nhật Bản, nấm được thu hoạch, sau đó sấy khô, nghiền và pha thành trà Theo lý thuyết của

y học cổ truyền Trung Quốc (Traditional Chinese medicine - TCM), Vân chi có vị hơi nhẹ và tính hàn Khuyến cáo hằng ngày sử dụng 9 đến 15g Vân chi nấu với nước Đối với chiết xuất Vân chi khô, thì liều dùng hằng ngày từ 3g đến 6g (đã thông qua thử nghiệm lâm sàng) [1]

5

Các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật Bản đã bắt đầu một nghiên cứu lâm sàng có kiểm

soát về đặc tính chữa bệnh của chiết xuất T Versicolor và thú vị là liều lượng của các

polyme hoạt động trong trà truyền thống tương tự như được sử dụng trong thí nghiệm lâm sàng [3] Là một dược chất được ghi nhận trong một số tác phẩm kinh điển của Trung Quốc - TCM, Vân chi được coi là hữu ích để hạ nhiệt, loại bỏ độc tố, tăng cường vóc dáng, tăng năng lượng, tinh thần và chức năng miễn dịch Trong thí nghiệm lâm

sàng của Trung Quốc - TCM, Vân chi thường chỉ định cho các loại bệnh như: ung thư,

viêm gan mãn tính, nhiễm trùng đường hô hấp, đường tiết niệu và tiêu hóa [4], [5] Tác dụng chống ung thư

Đây là tác dụng nổi bật nhất của Vân chi với hàng loạt các nghiên cứu minh chứng có

thể ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư Đơn cử, nghiên cứu của Z Xu et al (2011)

cho thấy với dịch chiết xuất Vân chi thô ở mức 1mg/ml sau 72h ủ đã ức chế rõ rệt ung thư dạ dày (7907), ung thư phổi (SPC), bệnh bạch cầu (MCL) và ung thư hạch (SLY) Hay nghiên cứu một phân đoạn tinh khiết của Vân chi đã ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào ung thư bạch cầu ở người (HK-60), dòng tế bào ung thư gan (SMMU-7721)

và dòng tế bào ung thư dạ dày (SCG-7901) ở mức 100h ủ nhưng còn tác dụng rất ít đối với các dòng tế bào gan và phổi của thai nhi [6] Và có rất nhiều nghiên cứu có đồng kết quả như trên, cho thấy tầm quan trọng và giá trị của nấm Vân chi về mặt dược lý Chế phẩm Vân chi thường được coi là chất bổ sung sức khỏe và được sử dụng rộng rãi trong hỗ trợ điều trị ung thư để làm giảm các tác dụng liên quan đến xạ trị và hóa trị ở Trung Quốc và Nhật Bản, một số sản phẩm Vân chi được phân loại là thuốc cho các chỉ định điều trị cụ thể, như một liệu pháp bổ trợ và yêu cầu sử dụng kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác để điều trị ung thư [1]

Tác dụng chống oxi hóa

Tác dụng chống oxi hóa trên Vân chi trong một số ít nghiên cứu là Kobayashi et al

(1994) đã chứng minh rằng PSK (Polysaccharide Kureha) có thể làm giảm căng thẳng

oxy hóa ở chuột mang khối u Kobayashi et al (1994) đã chứng minh rằng PSK

(Polysaccharopeptide Krestin) có thể làm giảm sự mất cân bằng oxi hóa (Oxidative

6

stress) ở chuột mang khối u Theo dõi sử dụng PSK (50 mg/kg, i.p.) sau 12 ngày phát triển khối u, làm gảm nhanh chóng lượng superoxide từ các tế bào hồng cầu [4] Một tác giả khác cũng nghiên cứu thực hiện trên những bệnh nhân ung thư đại tràng và

dạ dày, có sự mất cân bằng oxi hóa gấp đôi so với những người khỏe mạnh Sử dụng PSK (3g/ngày, p.o.) khiến mức độ oxy hóa giảm xuống mức thấp Tuy nhiên sau 7 ngày, bệnh nhân cho thấy mức SOD giảm nhưng tăng mức lipoperoxide (LPO) Do đó, các tác giả cho rằng chỉ nên dùng PSK cho bệnh nhân ung thư trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 7 ngày, điều trị nên bắt đầu 7 ngày trước khi hóa trị và để ngăn ngừa thiệt hại do tác nhân chống ung thư tạo ra các gốc oxy tự do (superoxide) [4]

Tác dụng kháng khuẩn

Tác dụng kháng khuẩn được chú ý và nghiên cứu thử nghiệm thành công sau ung thư Trong một số nghiên cứu in vivo trên động vật, chiết xuất Vân chi đã được quan sát vòng kháng khuẩn và kháng nấm chống lại các mầm bệnh phổ biến như Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Listeriamonocytogenes và Streptococus pneumoniae Các tác dụng kháng

khuẩn có thể do sự kích hoạt của các tế bào đa hình và tăng sản sinh các cytokine kháng khuẩn (ví dụ: yếu tố hoại tử khối u, IL-1) [4]

Tác dụng kháng viêm

Viêm là một quá trình sinh học bình thường để đáp ứng với tổn thương mô, nhiễm mầm bệnh vi khuẩn và kích ứng hóa học Viêm được bắt đầu bằng cách di chuyển các tế bào miễn dịch từ các mạch máu và giải phóng các chất trung gian tại vị trí thiệt hại Quá trình này được thực hiện bằng cách lấy các tế bào viêm, giải phóng ROS, RNS và các cytokine tiền viêm để loại bỏ mầm bệnh ngoại lai và điều trị các mô bị thương [7] Một

số chất của flavonoid ảnh hưởng đáng kể đến chức năng của hệ thống miễn dịch và các

tế bào viêm [8] Một số flavonoid như apigenin, luteolin và quercetin được kết luận có tác dụng chống viêm và giảm đau, trong đó flavonoid ảnh hưởng đáng kể đến chức năng của các hệ thống enzyme tạo ra các quá trình viêm [9] [10]

7

Ngoài ra, chiết xuất từ nấm Vân chi cũng nổi bật trong các hoạt động chống vi rút in

vitro, giảm đau và hoạt động bảo vệ gan [11]

1.1.3 Thành phần hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi

Thành phần hóa học

Có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học cụ thể trong nấm T.verscolor Hầu hết, các

nghiên cứu chuyên về phân tích tách chiết, xác định hoạt tính các hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi Một số ít nghiên cứu thành phần hóa học trong nấm Vân chi cho biết nấm Vân chi có tỷ lệ lipid từ các carpophores chiếm 1,7% tổng trọng lượng và chứa

ergosterol (tetracyclic triterpenoid ergiter-5,7,22, trien-3-ol) là loại sterol chính; ngoài

ra còn chứa các loại Polyporaceae khác, cùng với lượng nhỏ mushisterol

(ergost-7-en-3-ol) [12], β-sitosterol, γ-5-en-3-ol và hydroxymethylquinoline [4] [5]

Thành phần hoạt chất sinh học

Nấm Vân chi được sử dụng làm thực phẩm từ lâu bởi thành phần dinh dưỡng giá trị như protein, carbohydrate, xơ, vitamin và khoáng chất cần thiết trong chế độ ăn uống cân bằng và là loại thực phẩm ít calo do hàm lượng chất béo thấp [13],[14] Bên cạnh đó, nấm rất giàu hoạt chất sinh học với các tác dụng dược lí được nghiên cứu rộng rãi Trong

số các hợp chất hoạt tính sinh học, các hợp chất phenolic được xác định hiện diện trong các giống nấm Vân chi khác nhau và có đặc tính chống oxy hóa [15]

Polysaccharide

Các hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi phần lớn thuộc nhóm polysaccharide và protein Hai phức polysaccharide -protein được nghiên cứu nhiều nhất [16], nổi bật với hoạt tính miễn dịch và kháng tế bào ung thư là PSP (polysaccharopeptide) và PSK (polysaccharide “Krestin”) với trọng lượng phân tử xấp xỉ 100 kDa PSK là một chuỗi các chuỗi glucans (polyme glucose) liên kết với chuỗi polypeptide chứa một lượng lớn acid aspartic và glutamic, cùng với lượng acid amin khác thấp hơn như threonine, serine, glycine, alanine, valine, leucine [4] Zhang và cộng sự (2001) đã xác định PSK chứa 34 -35% carbohydrate (khoảng 92% glucan), 28 -35% protein và hàm lượng một số

sở hữu cấu hình hoạt động sinh lý tương tự nhau Chúng hòa tan và ổn định trong nước nóng, dung dịch có độ nhớt thấp, nhưng không hòa tan trong methanol, pyridine, chloroform, benzene và hexane [4],[5] Các phân tử polysaccharide và peptide của PSP

và PSK có thể được phân tách bằng phương pháp PAGE và sắc ký tự nhiên [2], [3] PSK là polysaccharide đầu tiên được Chính phủ Nhật Bản sử dụng điều trị ung thư từ năm 1977 [18] PSP cũng có thành phần tương tự như PSK, cả hai loại đều được chứng minh có tác dụng miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống tế bào khối

u, di căn, ung thư hiệu quả và tác dụng chống oxi hóa [5], [19], [20]

Nhóm phenolics

Trong tất cả các nghiên cứu về tác dụng dược lí đều liên quan tới sự mất cân bằng oxi hóa (Oxidative stress) Chính vì thế mà các nhà nghiên cứu luôn tìm các nguồn tự nhiên

có khả năng chống oxi hóa mới, đặc biệt là từ nấm và vi sinh vật vì lợi thế chúng có thể

sử dụng như thực phẩm chức năng [21] Việc sử dụng nấm trong chế độ dinh dưỡng được xem là phương pháp dùng sản phẩm tự nhiên hữu hiệu ngăn ngừa nhiều bệnh do mất cân bằng oxi hóa

Theo nghiên cứu của Ljiljana Janjušević (2017), bà đã nghiên cứu tách chiết được 38 hoạt chất nhóm Phenolics trong nấm T versicolor bằng HPLC – MS/MS gồm 12

12

(8) Apiin

13

(13) Quercetrin (14) Kaempferol-3-O-Glucoside

(15) Hyperoside (16) Quercetin-3-O-Glucoside

14

(23) Genistein (24) p-hydrobenzoic Acid

(25) Protocatechuic acid (26) Gentisic acid (27) Vanillic acid

15

(28) Gallic acid (29) Syringic acid

(30) p-coumaric acid (31)o-coumaric acid

(32) Ferulic acid (33) p-coumaric acig

(34) Esculetin (35) Scopoletin (36) Umbeliferon

(37) Quinic acid (38) 5-o-caffeoylquinic acid

16

Các hoạt chất có hoạt tính chống oxi hóa trong nấm nói chung và trong nấm Vân chi nói riêng phần lớn thuộc nhóm Phenolics, nhất là Acid phenolic là các hợp chất Phenolic chính được thấy trong nấm với khả năng chóng oxi hóa mạnh Ngoài ra còn rất nhiều các nhóm chất khác như Phenol chứa các nhóm hydroxyl có khả năng chống oxi hóa cao, Anthocyanin bảo vệ lipoprotein mật độ thấp (LDL) chống lại quá trình oxy hóa, đã được chứng minh trong một số hệ thống in vitro khác nhau [23]

Theo H Y Chi et al [24] đã nghiên cứu ức chế DPPH bằng các hợp chất tiêu chuẩn

phenolic, bao gồm catechin, youperidin, acid syringic và kaempferol Bà báo cáo rằng

cả catechin và acid syringic đều có biểu hiện ức chế DPPH 81% Kết quả của Kim et

al [25] cũng cho thấy rằng catechin và axit syringic có liên quan đến đặc tính chống

oxy hóa Velioglu et al [26] cũng báo cáo rằng hoạt động chống oxy hóa của nguyên

liệu thực vật có tương quan tốt với nồng độ hợp chất phenolic của chúng

Ngoài ra còn có các nghiên cứu khác về các hợp chất phenolic điển hình là polyphenol như: Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ thần kinh của polyphenol có thể được chia thành các loại sau: hành động bảo vệ thần kinh thông qua các con đường chống oxy hóa, tương tác với các con đường truyền tín hiệu, bảo vệ thần kinh thông qua điều chế các chất trung gian thần kinh và enzyme như acetylcholine (AChE), ức chế độc tính thần kinh NMDA và tác dụng chống amyloidogen [27]

Nhóm steroid

Một số hợp chất steroid đã được phân lập và thử nghiệm hoạt tính Như ergosterol peroxide được phân lập từ nhiều loại nấm, nấm men, địa y và bọt biển và đã được báo cáo là có tác dụng ức chế miễn dịch [28], kháng virut [29], chống viêm, chống

ung thư [30] Hay 5α-Ergost-7,22-dien-3β-ol được phân lập từ Ganoderma

applanatum (Pers.) Pat và một số loại nấm khác, chúng tác động với một số vi sinh

vật gram dương và gram âm [30] Acid trametenolic B từ nấm Trametes versicolor

đã được chứng minh là có hoạt tính gây độc tế bào và kháng khuẩn [31]

17

Ba hợp chất cho thấy tác dụng in vitro chống lại L amazonensis và đặc biệt là hợp

chất acid trametenolic có hoạt tính mạnh nhất và có tính chọn lọc cao đối với cả giai

đoạn nội bào và ngoại bào của L amazonensis [31] Những phát hiện này đã chứng thực tiềm năng chống ung thư của Trametes versicolor ở nhiều nước nhiệt đới nơi có

nhiều trường hợp mắc bệnh Leishmania [32]

Nhóm terpenoid

Những nghiên cứu về các hợp chất mới tìm thấy ở nấm Vân chi của S.R Wang et al

(2017) thì tất cả các hợp chất mới được phát hiện ở nấm Vân chi đều đã được thử nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào đối với năm dòng tế bào khối u là ung thư bạch cầu dòng tủy ở người (HL-60), ung thư biểu mô tế bào gan (SMMC-7721), ung thư phổi A-549 tế bào, ung thư vú (MCF-7) và dòng tế bào ung thư đại tràng (SW480) phương pháp MTT [33], [34]

Tất cả các tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 hoặc DMEM (Hyclone, Hoa Kỳ), được bổ sung 10% huyết thanh bò (Hyclone, Hoa Kỳ) trong 5% CO2 ở 37°C Xét nghiệm khả năng gây độc tế bào được thực hiện theo phương pháp MTT (3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) trong các tấm vi

mô 96 giếng với cisplatin là đối chứng dương Kết quả cho thấy các hợp chất có hoạt tính kháng u đối với các dòng tế bào khối u đã được thử nghiệm (IC50 > 40 μmol)

Ngoài ra có các nghiên cứu cho thấy dịch chiết xuất của nấm Trametes versicolors

có thể chứa các hợp chất ức chế hoạt động acetylcholinesterase (AchE) và khả năng chống oxy hóa Hoạt tính này ở nấm được cho là do hoạt tính của terpenoids và alkaloids làm bất hoạt AChE bằng cách liên kết cho trung tâm hoạt động hoặc các vị trí liên kết ngoại vi gây ức chế AchE [35, 22]

Điều này cho thấy các hợp chất mới thuộc nhóm sequiterpenoids được tìm thấy ở trên cũng có khả năng ức chế hoạt động của acetylcholinesterase và chống oxy hóa Việc

ức chế hoạt động của AchE của hợp chất cho thấy, có thể sử dụng hợp chất như thuốc hay thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer [22]

18

1.2 Chiết xuất các hoạt chất sinh học

1.2.1 Cơ sở khoa học chiết xuất các hoạt chất sinh học

Nấm Vân chi trong nghiên cứu và sử dụng có hai dạng: quả thể (fruiting bodies) và sinh khối (biomass) Trong đó, các nghiên cứu chiết xuất từ quả thể, cũng như các tài liệu về phân tích các hợp chất sinh học đều từ quả thể, phổ biến và tập trung nhiều hơn sinh khối [36], [37] Cả hai đều chứa β-glucans (ví dụ: lentinan, schizophyllan

và griscratchan), kết hơp tăng cường miễn dịch hoạt động của enzyme (ví dụ: cytochrom P-450, cytochrom reductase, peroxidase, glucoamylase, b-glucanase, glucose 2-oxyase, laccase, superoxide effutase và protease) và các chất chuyển hóa thứ cấp (ví dụ: terpen, steroid, anthraquinone, dẫn xuất acid benzoic và quinolone) Tuy nhiên, trong sinh khối chứa một lượng đáng kể hơn [38] Do đó, dạng sinh khối của nấm được coi là có lợi hơn trong việc thúc đẩy giải độc, chống oxi hóa giảm stress

và tăng trưởng tế bào [39]

Chọn điều kiện tách chiết các hoạt chất sinh học rất quan trọng, vì tác dụng và hiệu quả của các hợp chất sinh học phụ thuộc vào cấu trúc bậc ba rất lớn, đặc biệt là loại

và hàm lượng của sản phẩm cuối cùng Do đó dung môi và nhiệt độ trong quá trình chế biến khác nhau có thể thay đổi hoặc phá vỡ hoàn toàn chúng Các biến đổi không

rõ ràng và không biết chính xác của các hợp chất khác nhau này dẫn đến hiệu quả của phản ứng điều hòa miễn dịch, chứ chưa nói đến hiệu quả lâm sàng ở người [3] Theo các nghiên cứu, nấm Vân chi có cấu tạo chủ yếu là các cenllulose, độ nhớt vừa phải nên các chất trong nấm Vân chi dễ hòa tan khi được trích ly bằng nước, enzyme hay ethanol… mà không bị mất hoạt tính của các chất sinh học Ngoài ra, còn có các hợp chất rất bền đối với nhiệt Các chế phẩm truyền thống của các loài dược liệu, thường chiết xuất bằng nước nóng (thuốc sắc) và họ cho rằng có thể giữ lại ít nhất một phần của hoạt chất Nhưng ngày nay, các chế phẩm thương mại chiết xuất bằng nước nóng, cô đặc và tinh chế có thể loại bỏ các polysacaropeptide chịu nhiệt [3]

19

Vì vậy, để so sánh cũng như nâng cao hiệu suất tách chiết các hoạt chất sinh học, nghiên cứu sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để tách chiết, tinh chế bằng phương pháp sắc kí để thu hồi hoạt chất dạng tinh khiết Các nghiên cứu cho thấy các sản phẩm tinh khiết thường được cô đặc và sấy phun, vì việc loại bỏ các chất

có trọng lượng phân tử thấp khá quan trọng, các chất này không góp phần vào hoạt động sinh lý mà lại vị đắng và mùi khó chịu cho sản phẩm

1.2.2 Kỹ thuật chiết xuất các hoạt chất sinh học

Hiện nay có hai kỹ thuật chiết xuất chính là kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và chiết lỏng, kỹ thuật phụ thuộc vào loại nguyên liệu và dung môi sử dụng [40]

rắn-Vì mục đích của đề tài là chiết xuất các hoạt chất sinh học trong nấm Vân chi dạng quả thể nên sẽ sử dụng kỹ thuật chiết rắn-lỏng theo phương pháp cổ điển là ngâm kiệt Sau đó kết hợp phương pháp chiết lỏng- lỏng để thu các cao phân đoạn Hai phương pháp này phải có các yêu cầu sau:

Kỹ thuật chiết rắn – lỏng:

Nguyên liệu rắn được ngâm với dung môi trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy Tiến hành chiết nhiều lần, mỗi lần khoảng 7-12h là đủ Dung môi sau khi được thu hồi bằng máy cô quay áp suất thấp và tiếp tục sử dụng để chiết những lần sau [40]

Yêu cầu đối với dung môi: An toàn và được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm, phải có tính hoà tan chọn lọc, không độc, không ăn mòn thiết bị và giá thành hợp lí

Cơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào dược liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan và dung môi Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH-COOH) dễ tan trong dung môi phân cực (nước, cồn, ethyl ) Các chất có nhiều nhóm không phân cực (chất béo, CH3-C2H5- và đồng đẳng) dễ tan trong dung môi không phân cực [40]

Nhược điểm của phương pháp: phải lắc lỏng nhiều lần nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lỏng dễ tạo nhũ tương gây khó khăn trong việc tách pha

1.3 Phương pháp tách và tinh sạch hoạt chất sinh học từ nấm Vân chi

1.3.1 Cơ sở phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh (stationary phase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase) Sắc ký tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh và không hòa lẫn vào nhau [41], [42]

Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách ra khỏi nhau theo thời gian Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu

Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp phân bố trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc

1.3.2 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là kỹ thuật phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm Phương pháp này rất đơn giản và có thể phân lập các hợp chất khỏi hỗn hợp một cách nhanh chóng Tuy nhiên, giống như nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để có thể thiết lập và chạy một cột sắc ký nhanh và hiệu quả lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm

Cơ sở phương pháp sắc ký cột: Phương pháp sắc ký cột dựa trên tính chất hấp phụ

khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách Giữa nồng độ chất trong dung dịch

và nồng độ chất bị hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ có một cân bằng động, cân bằng được xác định giữa một pha rắn (thường là vật liệu bằng nhựa) hay pha tĩnh ( cố định trong cột), và các phân tử hòa tan trong pha lỏng, pha lỏng chảy qua pha rắn, được gọi là pha động [42], [43]

Trong sắc ký cột thì phương pháp rửa giải có ứng dụng rộng rãi nhất Phải chọn tốc độ tối ưu đối với dung môi rửa giải để đảm bảo thiết lập cân bằng hấp phụ, đồng thời giảm độ khuếch tán dọc [42], [43]

Phân loại sắc kí cột [43]

- Hấp phụ: Silica gel (pha bình thường), ODS (pha đảo), nhôm, floridil,

- Phân vùng: bột cellulose, celite, silica gel, than, tinh bột,

- Trao đổi ion: Nhựa trao đổi ion (Amberite, Dowex, )

- Tương tác trao đổi không ion: Diaion HP-20, MCI gel; Sephadex LH-20,

- Polyamide,

22

- Lọc gel, sắc ký lượng loại trừ (SEC): Sephadex, JA Igel,

Cơ chế của chất nhồi: Các hợp chất phân cực sẽ tương tác với silica mạnh hơn với

các hợp chất không phân cực nên sẽ đi ra khỏi cột (hoặc rửa giải) sau các hợp chất không phân cực Ví dụ chất nhồi là silicagel có gắn nhóm OH thì có xu hướng giữ chất phân cực hơn, các chất kém phân cực sẽ liên kết với silica yếu hơn nên sẽ chạy

ra trước, các chất phân cực mạnh hơn sẽ ra sau

Cột được chạy bằng dung môi thích hợp Dung môi các chất được tách ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bộ phận hứng phân đoạn Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các khoang sau đó giải hấp bằng dung môi để thu các chất [43]

1.3.3 Phương pháp sắc kí bản mỏng

Cơ sở phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC):

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký nhanh và tiện lợi Nó giúp nhận biết được số lượng thành phần có trong hỗn hợp mẫu

Sắc ký bản mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn –lỏng Trong

đó pha động là chất lỏng đi xuyên qua một lớp chất hấp phụ trơ là pha tĩnh như silicagel, aluminium oxit, hoặc cellulose, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng và đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp

và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch Việc chọn dung môi phụ thuộc vào bản chất pha tĩnh và tính chất dung dịch phân tích [43]

Đại lượng đặc trưng về mức độ tách là hệ số di chuyển Rf [43]

𝑅𝑓 = 𝑙

𝑙0 ℎ𝑜ặ𝑐 𝑅𝑓 =

𝑣

𝑣0

23

Trong đó: l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký, lo là khoảng cách

từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi, v là tốc độ di chuyển của chất tan, vo là tốc độ của dung môi

Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:

+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp phụ

+ Bề dày của lớp mỏng

+ Chất lượng và độ tinh khiết của pha động

Hình 1.2 Hình chạy sắc ký bản mỏng [43]

1.4 Phương pháp Định danh – kiểm tra DNA mẫu nấm Vân chi

Kỹ thuật chiết DNA là một trong những kĩ thuật sinh học phân tử đầu tiên vô cùng quan trọng góp phần cho sự thành công trong những bước nghiên cứu tiếp theo Nguyên tắc ly trích DNA: Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Các nucleic acid

24

cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn Quá trình kết tủa kết với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn [44]

Các bước cơ bản để tách DNA: Chuẩn bị mẫu, phá vỡ tế bào, hòa tan DNA, loại bỏ tạp chất ( protein, polysaccharide…), tủa DNA, rửa DNA, làm khô, kiểm tra chất lượng DNA

Ở đây ly trích DNA được ly trích từ mẫu quả thể nấm bằng bộ kít Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Master Mix theo quy trình của nhà sản xuất cung cấp Và phương pháp PCR thì khuếch đại vùng trình tự ITS1 bằng cặp mồi ITS1-2 với kích thước lý thuyết là 300 bp.[45]

Quá trình PCR được thực hiện trên máy Mastercycler (hãng Eppendorf, Đức) Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự 2 chiều bằng phương pháp Sanger trên máy 3130XLGENETIC ANALYER (16 mao quản), hãng ABI (Mỹ) Sau đó sẽ xử lí kết quả giải trình tự 2 chiều của vùng gen ITS1 được kiểm tra độ chính xác và thiết lập trình tự consensus bằng phần mềm FinchTV và Seaview [46]

Và cuối cùng sẽ xây dựng cây phả hệ để thể hiện mối quan hệ di truyền giữa mẫu

nghiên cứu và các loài thuộc chi Coriolopsis và một số taxa thuộc họ Polyporales

hiện có trên dữ liệu GenBank (Phụ lục A) Cây phả hệ được xây dựng bằng phần

mềm MEGA5 với nhóm ngoại là loài Boletopsis leucomelaena [47], [48]

1.5 Phương pháp xác định thành phần LC-MS

Nguyên lý: Sắc ký lỏng / Khối phổ (LC / MS) là một kỹ thuật phân tích mạnh kết hợp

khả năng phân tách của sắc ký lỏng với khả năng phát hiện đặc hiệu của phổ khối lượng Sắc ký lỏng (LC) tách các thành phần mẫu và sau đó đưa chúng vào máy đo phổ khối (MS), MS tạo và phát hiện ion tích điện Dữ liệu LC/MS cung cấp thông tin

Hình 1.3 Nguyên lí làm việc của LC-MS [49]

Ứng dụng LC-MS [49]

Các hệ thống LC-MS có độ nhạy cao, cung cấp định lượng chính xác với tốc độ phân

tích cao trong thực phẩm, dược phẩm, hóa học và phân tích môi trường

Kiểm tra lượng thuốc và chất độc: LC-MS được sử dụng phát hiện thuốc ức chế miễn dịch bao gồm tacrolimus, cyclosporin, everolimus, sirolimus và acid mycophenolic Các phân tích tương tự đối với aminoglycosid, thuốc chống ung thư và thuốc kháng retrovirus Steroid Hormones: Phân tích LC-MS rất hữu ích trong các phân tích steroid, trong khi các xét nghiệm miễn dịch truyền thống không hiệu quả LC-MS có độ nhạy cao đo mức dihydrotestosterone và testosterone thấp ở phụ nữ và trẻ em

Ngoài ra, LC-MS là một phương pháp ưu tiên để đo lường vitamin D và các chất chuyển hóa của nó LC-MS phân tích cho 25-hydroxyvitamin D2 và D3 trong huyết