Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng làm giảm cod trong nước thải chế biến thuỷ sản tỉnh tiền giang

[2] Hiện nay, công nghệ sinh học đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực xử lý nước thải, đặc biệt là những nguồn nước chứa hàm lượng hữu cơ hoà tan cao và một số chất vô cơ như H2S,

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Hùng Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày… tháng … năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trương Thành Tài MSHV: 17112151

Ngày/tháng/năm sinh: 09/01/1994 Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Kỹ thuật Môi trường Mã số: 8520320

I TÊN ĐỀ TÀI: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng

làm giảm COD của nước thải chế biến thuỷ sản tỉnh Tiền Giang.”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn từ mẫu nước thải nhiễm mặn tại tỉnh Tiền Giang

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến các chủng vi khuẩn

- Thiết kế mô hình bể hiếu khí

- Đánh giá khả năng xử lý nước thải của các chủng vi khuẩn trên mô hình

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

Theo Quyết định số 74/QĐ-ĐHCN, ngày 14 tháng 1 năm 2020 của Hiệu trưởng trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh về việc giao đề tài và cử người

hướng dẫn luận văn thạc sĩ

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 10 tháng 10 năm 2020

V NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Hùng Anh

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng ….năm 2020

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoàng Mỹ ở Viện KHCN và QLMT đã hỗ trợ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành chương trình cao học và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn các bạn học viên đã chia sẻ, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ hết mình trong quá trình cá nhân tác giả thực hiện luận văn

Các phương pháp được thực hiện trong đề tài bao gồm phương pháp nuôi cấy phân lập trên môi trường rắn, lỏng; phương pháp cố định một yếu tố khảo sát; phương pháp định danh bằng MALDI – TOF; phương pháp định lượng COD

Các kết quả đạt được trong thời gian nghiên cứu:

− Đã phân lập tuyển chọn và định được 10 chủng vi khuẩn chịu mặn từ nguồn nước

thải thủy sản tỉnh Tiền Giang: 1B1 (Staphylococuss epidermidis), 1C2 (Micrococcus luteus), 2A2 (Bacillus lichenniformis), 2B1 (Bacillus

lichenniformis), 2B3 (Bacillus subtilis), 3A5 (Arthrobacter creatinolyticus, 3B3 (Lactobacillus pentosus, 4A1 (Bacillus subtilis), 4A7 (Bacillus subtilis), 4B6 (Bacillus cereus)

− Xác định được các yếu tố thích hợp cho sinh trưởng phát triển tối ưu của các chủng: thời gian 24-48 giờ, nhiệt độ 30oC, pH=7, nồng độ muối 5%

− Thiết kế được bể hiếu khí kích thước 42 cm x 50 cm x 10,5 cm Mô hình được thiết kế gồm 15 ngăn thử nghiệm

− Đánh giá được khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của 10 chủng tuyển chọn Chủng có hiệu quả xử lý cao nhất là 4A1 đạt 92,19% sau 72 giờ Hỗn hợp G1 gồm 5 chủng 1B1, 2B1, 3B3, 4A1, 4B6 có hiệu quả xử lý tốt nhất

ABSTRACT

The thesis topic "Isolation and selection of salt-tolerant bacteria strains capable of

reducing COD of aquatic product processing wastewater in Tien Giang province"

was surveyed to isolate and select salt-tolerant strains capable of reducing COD

From there, it serves as a foundation for the application of salt-tolerant bacteria

groups in the treatment of salty wastewater in seafood production and processing

facilities

The methods implemented in the topic include culture methods isolated on solid,

liquid medium; the method of fixing a survey factor; identification method by

MALDI - TOF; quantitative method of COD

Results achieved during the study period:

10 strains of salinity tolerance bacteria were isolated and identified from aquatic

wastewater in Tien Giang province: 1B1 (Staphylococuss epidermidis), 1C2

(Micrococcus luteus), 2A2 (Bacillus lichenniformis), 2B1 (Bacillus lichenniformis),

2B3 (Bacillus subtilis), 3A5 (Arthrobacter creatinolyticus, 3B3 (Lactobacillus

pentosus, 4A1 (Bacillus subtilis), 4A7 (Bacillus subtilis), 4B6 (Bacillus cereus)

- Determining the factors suitable for the optimal growth and development of

strains: time 24-48 hours, temperature 30oC, pH = 7, salt concentration 5%

- Designing an aerobic tank with dimensions of 42 cm x 50 cm x 10,5 cm The

model is designed with 15 test compartments

- Evaluate the ability to treat saline water of 10 selected strains The strain with the

highest treatment efficiency was 4A1, reaching 92,19% after 72 hours Mixed G1,

consisting of 5 strains 1B1, 2B1, 3B3, 4A1 and 4B6, had the best treatment

efficiency

- The processing ability of strains with existing products is compared The addition

of selected strains reduces the processing time of survey preparations

LỜI CAM ĐOAN

Học viên xin cam đoan kết quả đạt được trong luận văn là sản phẩm nghiên cứu, tìm

hiểu của riêng cá nhân học viên Trong toàn bộ nội dung của luận văn, những điều

được trình bày là của cá nhân học viên và được tổng hợp từ nhiều nguồn tài liệu, có

nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định Các tài liệu, số liệu được trích dẫn được

chú thích rõ ràng, đáng tin cậy Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và

hoàn toàn chịu trách nhiệm về toàn bộ nội dung nghiên cứu

Học viên

Trương Thành Tài

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Nội dung nghiên cứu khoa học của đề tài 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nước thải nhiễm mặn 4

1.2 Tổng quan nước thải chế biến thuỷ sản tại Tiền Giang 5

1.3 Tổng quan về vi khuẩn chịu mặn Halophiles 7

1.3.1 Định nghĩa 7

1.3.2 Phân loại dựa vào độ mặn 8

1.3.3 Ứng dụng vi khuẩn chịu mặn trong môi trường 8

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Thời gian và địa điểm 17

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 17

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 17

2.2.2 Môi trường và hóa chất 18

2.3 Phương pháp thí nghiệm 18

2.3.1 Phương pháp xử lý cơ học (vật lý) 18

2.3.2 Phương pháp xử lý hóa lý 18

2.3.3 Phương pháp xử lý hóa học 19

2.3.4 Phương pháp xử lý sinh học 19

2.3.5 Bể SBR 20

2.3.6 Phương pháp lấy mẫu 20

2.3.7 Phương pháp phân lập và tuyển chọn 22

2.3.8 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển

của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 25

2.3.9 Phương pháp đánh giá khả năng làm giảm COD của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên nước thải nhiễm mặn tại địa phương 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn 34

3.1.1 Kết quả phân lập 34

3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 37

3.1.3 Kết quả định danh của các chủng vi khuẩn chịu mặn 40

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 42

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 42

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 45

3.3 Kết quả khảo sát khả năng làm giảm COD của các chủng vi khuẩn 47

3.3.1 Kết quả thiết kế mô hình 47

3.3.2 Kết quả xác định thông số đầu vào mẫu nước thải nhiễm mặn 48

3.3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ giống 50

3.3.4 Kết quả khảo sát khả năng xử lý riêng lẻ của 10 chủng với tải trọng đầu vào 52

3.3.5 Kết quả khảo sát khả năng xử lý phối hợp 55

3.3.6 Khảo sát khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của một số chế phẩm có trên thị trường 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

1 Kết luận 59

2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái một vài đại diện vi sinh vật chịu mặn 8

Hình 2.1 Hệ thống xử lý nước thải tập trung tại cảng cá Vàm Láng 21

Hình 2.2 Hệ thống xử lý nước thải tại Công ty TNHH chế biến thủy sản Minh Thắng 21

Hình 2.3 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn chịu mặn 23

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ MALDI-TOF 24

Hình 2.5 Buồng đếm Neubauer 26

Hình 2.6 Mô hình bể hiếu khí thiết kế (quy mô pilot) 28

Hình 2.7 Các chế phẩm sinh học thử nghiệm 32

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn phân lập được 35

Hình 3.2 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng phân lập 38

Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 43

Hình 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 44

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 45

Hình 3.6 Mô hình bể hiếu khí 47

Hình 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ giống 51

Hình 3.8 Hiệu suất xử lý của 10 chủng riêng lẻ 54

Hình 3.9 Hiệu suất xử lý của 10 chủng ở COD đầu vào 400mg/L 55

Hình 3.10 Hiệu suất xử lý COD của các hỗn hợp giống 56

Hình 3.11 Hiệu quả xử lý COD so sánh với các chế phẩm trên thị trường 57

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng chịu mặn và ưa mặn 8

Bảng 2.1 Tỷ lệ thể tích mẫu và hóa chất dùng phân tích COD 28

Bảng 3.1 Kết quả phân lập từ mẫu nước nhiễm mặn 34

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn phân lập 39

Bảng 3.4 Kết quả định danh 10 chủng bằng phương pháp MALDI-TOF 41

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng cua thời gian nuôi cấy (đơn vị: 106 tế bào/mL) 42

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (đơn vị: 106 tế bào/mL) 44

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH (đơn vị: 106 tế bào/mL) 45

Bảng 3.8 Kết quả tăng sinh sau 48 giờ 46

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá chất lượng nước thải 48

Bảng 3.10 Kết quả COD sau 96h xử lý ở các tỷ lệ giống 51

Bảng 3.11 Hiệu quả xử lý COD của 10 chủng tuyển chọn 53

Bảng 3.12 Kết quả xử lý COD phối hợp của vi sinh vật đối với mẫu nước thải 56

Bảng 3.13 Hiệu quả xử lý COD của các chế phẩm sinh học 57

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand - nhu cầu oxy sinh hoá

COD Chemical Oxygen Demand - nhu cầu oxy hóa học

SBR Sequencing Batch Reactor – Bể phản ứng theo mẻ

TSS Total Suspended Solids - tổng chất rắn lơ lửng

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, việc phát triển kinh tế – xã hội gắn liền mật thiết với vấn đề bảo vệ môi trường; sở dĩ như vậy là do trong quá khứ lẫn hiện tại có nhiều người vẫn chưa ý thức được “môi trường” là quan trọng như thế nào đối với đời sống của con người Nước ta là một quốc gia nằm trên bán đảo của Biển Đông thông ra Thái Bình Dương, với hơn 75% dân số sống dọc theo bờ biển dài hơn 3.200 km; tại hai đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long, Việt Nam thuộc vào loại nước bị ảnh hưởng

nhiều nhất của biến đổi khí hậu toàn cầu và mực nước biển dâng

Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (2016), mực nước biển dâng lên sẽ làm triều cường tiếp tục lên cao hơn và gia tăng xâm nhập mặn Đồng bằng sông Cửu Long được xác định là vùng chịu ảnh hưởng nặng nề bởi biến đổi khí hậu Đây cũng là vùng chịu tác động rất lớn sự thay đổi về biên độ triều của mực nước biển Mực nước biển dâng lên sẽ làm triều cường tiếp tục lên cao hơn và gia tăng xâm nhập

mặn

Cùng với vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu đó là những hệ lụy phát sinh do tốc độ phát triển ngành nuôi trồng thủy sản công nghiệp Nó dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường nước ngày càng nghiêm trọng và tình hình dịch bệnh tăng cao gây ảnh hưởng lớn đến ngành nuôi trồng thủy sản [1]

Theo thông tin từ Thủy sản Việt Nam (2016), diện tích nuôi cá tra nước lợ tại Việt Nam là hơn 5.050 ha, sản lượng hơn 1.150 tấn và có hơn 500 nhà máy chế biến thủy sản trên toàn quốc Sản lượng cá tra của các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long năm

2016 chiếm 99,2% sản lượng của cả nước, ước tính đạt 1.189 nghìn tấn, tăng 4,2%

so với năm 2015, trong đó Đồng Tháp đạt 403,4 nghìn tần (+0,8%), An

ra từ những hoạt động nuôi trồng, chế biến thủy sản cũng đã là một con số rất lớn [2]

Hiện nay, công nghệ sinh học đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực xử lý nước thải, đặc biệt là những nguồn nước chứa hàm lượng hữu cơ hoà tan cao và một số chất vô cơ như H2S, các sunfit, ammoniac, nitơ… Việc sử dụng phương pháp này không những xử lý được chất ô nhiễm, còn nhiều ý nghĩa liên quan khác như là sử dụng những vi khuẩn hữu ích thông qua cơ chế hoạt động của chúng để sản xuất các hợp chất ức chế vi khuẩn nguy hại, cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi cư trú, tiết enzyme phân hủy hợp chất hữu cơ giúp cải thiện môi trường nước…

Khả năng phát triển trong nồng độ mặn rộng của vi khuẩn chịu mặn gần đây đã được chú ý vì tiềm năng ứng dụng của nó trong tương lai Những vi khuẩn này có ý nghĩa quan trọng trong chu trình dinh dưỡng khi môi trường có sự biến động về độ mặn Hơn nữa, vi khuẩn chịu mặn còn đóng vai trò thiết yếu trong việc sản xuất và cung cấp thực phẩm lên men; phân hủy và chuyển hóa các chất hữu cơ, chất ô nhiễm và sản xuất năng lượng thay thế Các loài vi khuẩn chịu mặn đã được tìm

thấy bao gồm: Pseudomonas, Flavobacterium, Virgibacillus, Staphylococcus,

Oceanobacillus, Acinetobacter, Vibrio, Micrococcus, Alteromonas, Bacillus và Escherichia Coli

Nghiên cứu vi khuẩn chịu mặn để xử lý nước thải nhiễm mặn là một đề tài còn nhiều hạn chế và vẫn chưa có nghiên cứu nào cụ thể, đặc biệt là ở nước ta hiện nay, nơi mà hằng năm bị ảnh hưởng nghiêm trọng của việc xâm nhập mặn, cùng đó là việc phát triển ngành nuôi trồng thủy sản nước mặn, nước lợ; dẫn đến việc cần xử lý

nguồn nước thải nhiễm mặn là rất quan trọng Vì thế, đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng làm giảm COD của nước thải chế biến thuỷ sản tỉnh Tiền Giang” đã được lựa chọn làm cơ sở nền tảng để có thể

ứng dụng các nhóm vi khuẩn chịu mặn trong việc xử lý nguồn nước thải nhiễm mặn tại các cơ sở sản xuất chế biến thủy hải sản

2 Mục tiêu nghiên cứu

− Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn từ nước thải chế biến thuỷ sản tỉnh Tiền Giang

− Đánh giá được khả năng làm giảm COD trong nước thải thủy sản tại địa phương trên mô hình pilot

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

− Nước thải chế biến thuỷ sản nhiễm mặn khu vực tỉnh Tiền Giang

− Các chủng vi khuẩn chịu mặn

4 Nội dung nghiên cứu khoa học của đề tài

− Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn từ mẫu nước thải nhiễm mặn

− Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến các chủng vi khuẩn

− Nội dung 3: Thiết kế mô hình bể SBR

− Nội dung 4: Đánh giá khả năng xử lý nước thải của các chủng vi khuẩn trên mô hình SBR

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đặt nền tảng cho các nghiên cứu ứng dụng ở giai đoạn tiếp theo, tạo cơ sở khoa học để phát triển nghiên cứu về vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính sinh học để xử lý nước bị nhiễm mặn ở đất ven biển Việt Nam và ứng dụng vào nhiều ngành khoa học khác

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tìm được các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn, khảo sát được các đặc điểm sinh hóa, khả năng thích nghi, đánh giá được khả năng xử lý

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nước thải nhiễm mặn

Đặc trưng chung của các loại nước thải có độ mặn cao hay nước thải sinh hoạt, nước thải chăn nuôi nhiễm mặn là có độ mặn tính theo nồng độ NaCl đạt từ 3–30g/l Các loại nước thải có độ mặn cao thường gặp là nước thải dệt nhuộm, nước thải thuộc da, nước thải từ các nhà máy chế biến thủy - hải sản, nhà máy chế biến rau củ quả, nhà máy sản xuất nước mắm, nước thải ao nuôi thủy sản nước mặn…Mỗi loại nước thải đều có những đặc tính riêng nên quá trình xử lý cũng được áp dụng bởi các công nghệ khác nhau

Nước thải dệt nhuộm gây ô nhiễm chủ yếu do độ đục, độ màu, lượng chất hữu cơ và

pH cao Trong đó, các loại thuốc nhuộm thường là nguồn phát sinh kim loại, muối

và màu trong nước thải Các chất hồ vải với lượng BOD, COD cao và các chất hoạt động bề mặt là nguyên nhân chính gây ra tính độc cho thuỷ sinh của nước thải dệt nhuộm [3]

Thành phần nước thải công nghiệp chế biến thủy sản chủ yếu là protein, các chất béo, vi sinh vật gây bệnh, trứng giun sán trong nguồn nước, ngoài ra còn có nồng độ muối rất cao Nước thải với hàm lượng muối cao như vậy sẽ khiến cho các tế bào vi khuẩn tham gia quá trình xử lý nước thải bị ức chế, bị mất nước do áp lực thẩm thấu dẫn đên hiệu suất xử lý giảm Đối với nước thải sản xuất nước mắm, bên cạnh các yếu tố gây ô nhiễm thể hiện qua các thông số chất lượng như COD, BOD, N tổng, P tổng có hàm lượng rất cao, với giá trị có thể đạt được là 1200- 1800mg/l (COD); BOD đạt 800- 1200mg/l; N tổng đạt 12- 45mg/l; P đạt 1- 2mg/l thì loại nước thải này còn có độ mặn cao với nồng độ 2000- 4000mg/l Nước thải bẩn cùng với nồng độ muối khá cao trong nước sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống của sinh vật trong nước, kể cả vi sinh vật [4]

Do đặc thù về vị trí địa lý, nhiều vùng biển đảo thiếu nước ngọt nên người dân vẫn thường sử dụng nước biển cho sinh hoạt và chăn nuôi Đối với nước thải sinh hoạt,

độ mặn tính theo NaCl dao động từ 3.000 - 30.000 mg/l, tùy thuộc vào lượng nước

sử dụng và tỷ lệ mặn dùng trong vệ sinh Nước thải chăn nuôi heo có COD dao động từ 3.000 - 30.000 mg/l, tùy thuộc vào lượng nước vệ sinh và tỷ lệ nước mặn sử dụng [5]

Nước thải nhiễm mặn là một đối tượng khá đa dạng và phức tạp, nhưng có đặc điểm chung là có nồng độ muối cao, đòi hỏi những công nghệ xử lý đặc biệt, phù hợp với đối tượng này Trên thế giới trong khoảng 15 năm gần đây cũng đã có một số công trình nghiên cứu về chủ đề này, tập trung chủ yếu vào các nội dung như sử dụng các

vi khuẩn chịu mặn (Halotolerant) và ưa mặn (Halophilic), cũng như một số chủng

nấm men với các kỹ thuật hiếu khí kết hợp với màng lọc, ở quy mô phòng thí nghiệm Tuy nhiên kỹ thuật kỵ khí và nghiên cứu quy mô pilot là những vấn đề còn

ít được đề cập Riêng ở Việt Nam, trong khi các đối tượng nghiên cứu khá rõ, và yêu cầu rất cấp bách, lại chưa có các công trình nghiên cứu cấp bộ và cấp nhà nước nào về công nghệ xử lý nước thải nhiễm mặn được thực hiện trong những năm gần đây [6]

Nước thải trong ngành chế biến thủy sản là nguồn nước thải từ nước rửa nguyên liệu, sơ chế nguyên liệu, chế biến sản phẩm, các nguồn nước vệ sinh nhà xưởng sản xuất, nước rửa máy móc thiết bị, dụng cụ sản xuất trong các phân xưởng nhà máy chế biến thủy sản với thành phần: BOD5 khoảng 800 – 2.000 mg/L, có lúc đạt 4.500 mg/L COD khoảng 1.000 – 2.500 mg/L, có lúc đạt 5.000 mg/L, chất rắn lơ lửng (SS) khoảng 300 – 600 mg/L, nitơ tổng số (Nt) khoảng 100 – 150 mg/L, photpho tổng số (Pt) khoảng 20 – 50 mg/L, đặc biệt vi sinh Coliforms thường lớn hơn 1.105 MPN/100mL, với lưu lượng khoảng 20 – 35 m3/tấn sản phẩm, đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng cần phải được xử lý đáp ứng quy chuẩn môi trường quy định [7]

1.2 Tổng quan nước thải chế biến thuỷ sản tại Tiền Giang

ngư dân tạo dựng nên cơ nghiệp bền vững Tiền Giang đã xây dựng và đưa vào hoạt động hai cảng cá nằm trong hệ thống các cảng cá quốc gia, đó là cảng cá Vàm Láng tại huyện ven biển Gò Công Đông và cảng cá Mỹ Tho thuộc thành phố Mỹ Tho Sau mười năm thực hiện “Chiến lược biển”, sản lượng khai thác toàn tỉnh đã đạt trên 101.000 tấn thủy sản các loại/năm, gấp 1,34 lần so với năm 2008; trong đó, khai thác hải sản gần 97.500 tấn, với sản lượng hai nghề lưới kéo và lưới vây kết hợp ánh sáng chiếm đến trên 50% tổng sản lượng khai thác [8]

Cùng với sự phát triển theo từng năm thì ngành chế biến thủy hải sản cũng đưa vào môi trường một lượng nước thải khá lớn, gây ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước Nước thải ngành này chứa phần lớn các chất thải hữu cơ có nguồn gốc từ động vật

và có thành phần chủ yếu là protein và các chất béo Trong hai thành phần này, chất béo khó bị phân hủy bởi vi sinh vật

Các chất hữu cơ chứa trong nước thải chế biến thủy sản chủ yếu là dễ bị phân hủy Trong nước thải chứa các chất như cacbonhydrat, protein, chất béo,… khi xả vào nguồn nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa

có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát triển của tôm, cá Oxy hòa tan giảm không chỉ gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp [9] Các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, nó hạn chế độ sâu tầng nước được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo, rong rêu,… Chất rắn lơ lửng cũng là tác nhân gây ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh đồng thời gây tác hại về mặt cảm quan (tăng độ đục nguồn nước) và gây bồi lắng lòng sông, cản trở sự lưu thông nước và tàu bè,…[9]

Nồng độ các chất nitơ, photpho cao gây ra hiện tượng phát triển bùng nổ các loài tảo, đến mức độ giới hạn tảo sẽ bị chết và phân hủy gây nên hiện tượng thiếu oxy Nếu nồng độ oxy giảm tới 0 gây ra hiện tượng thủy vực chết ảnh hưởng tới chất lượng nước của thủy vực Ngoài ra, các loài tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp

màng khiến cho bên dưới không có ánh sáng Quá trình quang hợp của các thực vật tầng dưới bị ngưng trệ Tất cả các hiện tượng trên gây tác động xấu tới chất lượng nước, ảnh hưởng tới hệ thủy sinh, nghề nuôi trồng thủy sản, du lịch và cấp nước [9] Amonia rất độc cho tôm, cá dù ở nồng độ rất nhỏ Nồng độ làm chết tôm, cá từ 1,2 -

3 mg/l Tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi trồng thủy sản của nhiều quốc gia yêu cầu nồng độ Amonia không vượt quá 1mg/l

Các vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn gây bệnh và trứng giun sán trong nguồn nước là nguồn ô nhiễm đặc biệt Con người trực tiếp sử dụng nguồn nước nhiễm bẩn hay qua các nhân tố lây bệnh sẽ truyền dẫn các bệnh dịch cho người như bệnh lỵ, thương hàn, bại liệt, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, tiêu chảy cấp tính,…[9]

1.3 Tổng quan về vi khuẩn chịu mặn Halophiles

1.3.1 Định nghĩa

Halophiles là các sinh vật chịu mặn hoặc ưa mặn, phát triển trong môi trường nước mặn và có thể được phân loại dựa trên đòi hỏi của chúng đối với NaCl

Vi sinh vật ưa mặn (Halophilic) bao gồm một nhóm vi sinh vật không đồng nhất và

yêu cầu muối cho sự phát triển tối ưu Chúng đã được phân lập từ môi trường độ mặn đa dạng, thay đổi nồng độ mặn từ nước biển, nước mặn trong hồ đến nồng độ

mặn bão hòa Vi sinh vật chịu mặn (Halotolerant) là nhóm vi sinh vật có khả năng

sống trong môi trường mặn hoặc không mặn.[10]

Nồng độ muối nội bào của các vi sinh vật ưa mặn (Halophilic) và chịu mặn (Halotolerant) thường thấp và chúng duy trì một cân bằng thẩm thấu giữa dịch bào

của chúng với môi trường bên ngoài bằng cách tích lũy ở hàm lượng cao các chất tan thẩm thấu hữu cơ khác nhau Do đó, việc sử dụng các vi sinh vật chịu muối trong các hệ thống xử lý sinh học có thể là giải pháp loại bỏ COD trong nước thải nhiễm mặn [11]

1.3.2 Phân loại dựa vào độ mặn

Halophiles có thể được phân loại là vi khuẩn ưa mặn nhẹ, trung bình hoặc cao, tùy thuộc vào yêu cầu của chúng đối với NaCl [12]

Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng chịu mặn và ưa mặn [13]

Vi khuẩn ưa mặn cao Phát triển bình thường nồng độ trên 15% NaCl

Vi khuẩn ưa mặn vừa Phát triển trong khoảng nồng độ 3 – 15% NaCl

Vi khuẩn ưa mặn nhẹ Phát triển tốt nhất trong khoảng 1 – 3% NaCl

Vi khuẩn chịu mặn Phát triển bình thường ở nồng độ mặn dưới 1% NaCl nhưng

cũng có thể phát triển ở nồng độ mặn cao hơn

Vi khuẩn không ưa hay

chịu mặn

Chỉ phát triển bình thường ở nồng độ dưới 1% NaCl

Hình 1.1 Hình thái một vài đại diện vi sinh vật chịu mặn

1.3.3 Ứng dụng vi khuẩn chịu mặn trong môi trường

1.3.3.1 Phân hủy sinh học dầu nặng

Một vi khuẩn Halophilic, chủng TM-1, đã được phân lập từ hồ chứa dầu Shengli ở

Đông Trung Quốc Chủng TM-1, và cho thấy có khả năng làm suy giảm lượng dầu thô Nó là một vi khuẩn cầu lớn, Gram dương phát triển ở nhiệt độ lên đến 58ºC và trong dung dịch NaCl 18% Chủng này đã được tìm thấy có khả năng hiếu khí tùy nghi phát triển dưới điều kiện kỵ khí Hơn nữa, nó còn sinh rabutylated hydroxytoluene, 1,2-benzenedicarboxylic acid-bis ester, dibutyl phthalate và có thể

sử dụng nhiều chất hữt cơ khác nhau.Các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm cho thấy chủng TM-1 có thể làm suy giảm và thay đổi tính chất của dầu và khi được sử dụng trên các loại dầu nặng có thể dẫn đến mất hydrocarbon thơm, nhựa và asphalten [11]

1.3.3.2 Tẩy trắng các chất nhuộm azo

Trong số 27 chủng vi khuẩn Halophilic và Halotolerant phân lập từ nước thải của

ngành công nghiệp dệt, ba cho thấy một khả năng đáng kể để khử màu các thuốc nhuộm azo được sử dụng rộng rãi Mô tả đặc trưng kiểu hình và phân tích phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự 16S rDNA cho thấy các chủng này thuộc về chi

Halomonas Ba chủng có thể khử màu các thuốc nhuộm azo trong một lượng NaCl

rộng (lên tới 20% w/v), nhiệt độ (25 – 40ºC) và pH (5 – 11) sau 4 ngày nuôi cấy tĩnh; Chúng cũng có khả năng khử màu một hỗn hợp thuốc nhuộm Các chủng này cũng dễ dàng phát triển và khử màu các nồng độ thuốc nhuộm cao (5.000 ppm) và

có thể chịu được nồng độ lên tới 10.000 ppm của thuốc nhuộm Sự mất màu do phân huỷ sinh học bằng cách giảm bớt liên kết azo, sau đó là phân hủy [11], [18]

1.3.3.3 Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học

Tiềm năng của các vi khuẩn chịu mặn lên men kỵ khí để sử dụng xử lý nước thải

mặn trong môi trường kỵ khí đã được báo cáo [18], [19] Vì mục đích này, vi khuẩn chịu mặn lên men có nhiều lợi thế hơn hệ thống xử lý sinh học thông thường Ví dụ, chúng có thể hoạt động ở nồng độ muối cao và có thể chịu được các kim loại nặng

và có khả năng phân hủy một loạt các hợp chất hữu cơ [18]

Theo Oren et al (1992), vi khuẩn chịu mặn đóng một vai trò chính trong phân hủy

sinh học các chất ô nhiễm trong môi trường nước mặn Tiềm năng của hai vi khuẩn

chịu mặn, H praevalens và O marismortui, để phân hủy các hợp chất thơm thay

thế gồm nitrobenzen, o-nitrophenol, m-nitrophenol, p-nitrophenol, nitroanilines, 2,4-dinitrophenol, và 2,4-dinitroaniline Ngoài ra, việc phân hủy sinh học của nhiều hợp chất thơm được nitro-thay thế (nồng độ ban đầu 50 – 100mg/L) chỉ trong vòng

24 giờ Các hợp chất khác có thể bị phân huỷ bởi các vi sinh vật chịu mặn bao gồm các hydrocacbon bão hòa và thơm (bởi các loài cổ khuẩn), và các hợp chất thơm, hợp chất hữu cơ phospho và formaldehyde bởi các vi khuẩn eubacterial Cuối cùng,

Halophiles đóng một vai trò quan trọng trong việc phân hủy PCBs [20]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trong và ngoài quân đội đã thực hiện một số nghiên cứu về chủ đề này và đã phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật

có khả năng phân hủy chất hữu cơ trong điều kiện nước mặn, thử hoạt tính protease, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ muối, nồng độ cơ chất… đến hoạt tính của các vi sinh vật này Một số chủng, chẳng hạn các chủng vi sinh vật kỵ khí chịu mặn P21, chủng P3 chủng T9 đã được phân loại, bằng cách xác định và so sánh trình tự gen mã hóa với các chủng đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế [21]

Các nhà khoa học trong và ngoài quân đội cũng đã có nhiều nỗ lực để thu gom và

xử lý chất thải và nước thải nhiễm mặn trên một số đảo nói riêng, cũng như xử lý nước thải nhiễm mặn của một số nhà máy chế biến hải sản, với công nghệ xử lý nước thải chủ đạo là sử dụng chế phẩm sinh học, hoặc các công nghệ cổ điển như bể

tự hoại, bùn hoạt tính…

Tuy nhiên các công trình này có hiệu quả khá thấp, chủ yếu do áp dụng công nghệ chưa phù hợp, chẳng hạn việc sử dụng chế phẩm sinh học có hạn chế lớn là đòi hỏi thời gian thích nghi và thường xuyên phải bổ sung, thay thế Hơn nữa, các chế

phẩm vi sinh hình thành từ môi trường nước ngọt trên bờ rất khó phát triển trong môi trường nước mặn ngoài đảo

Các hệ thống xử lý nước thải áp dụng công nghệ cổ điển cũng gặp khó khăn vì trong môi trường nước thải có độ mặn cao các vi sinh vật thường phát triển rất chậm, không đạt được mật độ sinh khối trong hệ thống đủ cao để phân hủy hiệu quả Các mô hình sử dụng bùn hoạt tính cũng gặp khó khăn tương tự Theo các nghiên cứu quốc tế được công bố, với độ mặn từ 3000 mg/l trở lên, sinh khối hiếu khí bị tác động rõ rệt, dẫn đến hiệu quả phân hủy hữu cơ giảm mạnh Nguyên nhân

là độ mặn cao có thể gây ra áp lực thẩm thấu hoặc ức chế các con đường phản ứng trong quá trình phân hủy hữu cơ [22]

TS Trần Minh Chí (Viện Nhiệt đới Môi trường) và Mà Song Nguyễn đã nghiên cứu

thành công đề tài ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải hữu cơ nhiễm mặn; xây dựng các quy trình công nghệ vi sinh để xử lý hiệu quả nước thải sinh hoạt/chăn nuôi và các loại hình nước thải công nghiệp đặc thù (chế biến thủy hải sản vv…) bị nhiễm mặn Đề tài đã phân lập các chủng vi khuẩn từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như bùn thải/ nước thải nhiễm mặn và nuôi cấy, định danh được một số nhóm vi

sinh vật hiếu khí chịu mặn như chủng vi khuẩn Staphylococcus sp BH4; nấm men

Candida sp.YH; chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp BH và vi khuẩn Anammox chịu

mặn là chủng thuộc loài vi khuẩn Uncultured anaerobic ammonium-oxidizing Các

chủng vi sinh vật này ở nồng độ muối đạt 5-10 g/L có hiệu suất xử lý giảm COD

trung bình khoảng 70 - 80% Riêng vi khuẩn Anammox, phân lập từ nước thải chăn

nuôi heo đã thích nghi và phát triển với các nồng độ muối cao dần từ 5 - 25 g/L NaCl, trong các thí nghiệm mẻ cho phép loại bỏ NH4-N, với hiệu suất giảm dần từ

35 - 40% Với thiết bị liên tục cũng cho phép loại bỏ 80 -90% COD trong trường hợp có pH ổn định 7,5 - 8,0 [21]

EcoCleanTM 102 là một trong những chế phẩm vi sinh xử lý nước thải xử lý có độ

mặn cao với hiệu lực và mật độ vi sinh cao dạng bột được chọn lọc đặc biệt để xử lý

thức ăn Chế phẩm vi sinh xử lý nước thải có độ mặn cao EcoCleanTM 102 bao gồm các chủng vi sinh được chon lọc đặt biệt, hệ enzyme hoạt tính và chất căn bề mặt Bởi sự đa dạng của các chủng vi sinh an toàn, tự nhiên và hệ enzyme hoạt tính nên EcoCleanTM 102 là sản phẩm tuyệt vời để làm sạch nguồn nước, vi sinh xử lý nước thải sinh hoạt, làm giảm BOD, COD, giải quyết các vấn đề khó khăn trong việc điều chỉnh mùi, giảm tảo và các vấn đề khó khăn có liên quan trong môi trường nước mặn từ 1-3% [23]

Aquaclean ACF-SC-MARINE là giải pháp hữu hiệu nhất cho các loại nước thải có đặc tính khó phân hủy và độ mặn cao như: chế biến rau quả, nước thải thủy sản, nước thải có độ mặn; pH: 4 -9, độ mặn < 30‰ và ACF-32: là quần hợp gồm 12 chủng vi sinh vật nuôi cấy ở dạng lỏng, được tuyển chọn ở mật độ 387/450 triệu vi sinh/ml Sản phẩm sử dụng tốt cho hệ thống nước thải công nghiệp và nước thải đô thị [24]

Một số chế phẩm còn được ứng dụng trong việc khắc phục các sự cố của hệ thống

xử lý nước thải chế biến hải sản như BFL 5100HP, BFL 5200VP, BFL 5050BC dùng để khắc phục bùn dư trong bể hiếu khí; BFL 5200VP, BFL 5700SO khắc phục mùi hôi trong bể lắng, bể hiếu khí; trong chế biến thủy sản, nước thải có độ mặn dễ gây ức chế vi sinh trong bể hiếu khí vì vậy chế phẩm BFL 5100HP có thể bổ sung các chủng vi sinh có khả năng hoạt động và thích nghi ở độ mặn trong nước thải khoảng 10% để tăng hiệu suất xử lý của hệ thống [25]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Có những loài vi sinh vật cần muối ăn để tăng trưởng được gọi là các vi sinh vật

halophilic Nồng độ muối nội bào của các vi sinh vật ưa muối (halophilic) và chịu

muối (halotolerant) thường thấp và chúng duy trì một cân bằng thẩm thấu giữa dịch

bào (cytoplasm) của chúng với môi trường bên ngoài bằng cách tích lũy ở hàm lượng cao các chất tan thẩm thấu hữu cơ khác nhau Do đó, việc sử dụng các vi sinh vật chịu muối trong các hệ thống xử lý sinh học có thể là giải pháp loại bỏ COD trong nước thải nhiễm mặn [26]

Kapdan và cộng sự (2007) đã sử dụng thiết bị dạng UAPB (Upflow Anaerobic Packed Bed) để xử lý nước thải nhiễm mặn nhân tạo với COD dao động từ 1.900 – 6.300 mg/l, hàm lượng muối dao động từ 0 – 5% , và thời gian lưu thủy lực (HRT)

từ 11 – 30h, với chủng chủ đạo là Haloanaerobium lacusrosei Với COD ban đầu

1900 mg/l và HRT 19h và hàm lượng muối 3%, hiệu quả loại COD đạt tới 94% Với COD đầu vào 3.400 mg/l và độ mặn 3%, tăng HRT từ 11h lên 30 h dẫn đến tăng hiệu quả loại COD từ 60 – 84% Không ghi nhận được hiệu ứng ức chế cơ chất Ức chế phân hủy hữu cơ quan sát được bắt đầu từ độ mặn 3% trở đi Mô hình Stover – Kincannon được sử dụng để xác định các hệ số động học Hằng số giá trị bão hòa Kb = 5,3 g/l.ngày, Hằng số tốc độ phân hủy cực đại umax= 7,05 g/L.ngày [26]

Phần lớn các nghiên cứu xử lý nước thải nhiễm mặn bằng phương pháp sinh học đã

áp dụng các vi sinh vật ưa mặn và các kỹ thuật hiếu khí Dincer và Kargi (2001) đã nghiên cứu loại bỏ COD trong nước thải nhiễm mặn bằng hệ thống đĩa sinh học quay (rotating biological discs) với sinh khối bùn hoạt tính có bổ sung dòng vi

khuẩn chịu mặn Halobacterium halobium Các tác giả cũng nghiên cứu quá trình

nitro hóa và phi nitro hóa cũng như loại bỏ dinh dưỡng trong nước thải nhiễm mặn với các kỹ thuật khác nhau [27]

Xử lý nước thải nhiễm mặn bằng phương pháp kỵ khí là một tiếp cận mới cần được nghiên cứu chi tiết Các nghiên cứu đã được tiến hành với các điều kiện môi trường

và các cấu hình quá trình sinh học khác nhau với sinh khối kỵ khí được thích nghi Tuy nhiên hiện nay có nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí ưa mặn đã được phân lập như

Haloanaerobacter chitinovorans, Haloanaerobium congolense, Haloanaerobium lacusrosei, Haloanaerobium praevalens, Haloanaerobium alkaliphilum, trong đó Haloanaerobium praevalens được ghi nhận có khả năng loại carbon cao [27]

Nước thải nhiễm dầu của tàu biển, chủ yếu từ các buồng động cơ (bilge waters) và

từ công đoạn rửa các tăng chứa dầu là loại nước thải rất ô nhiễm và khó xử lý vì

mặn tới mức 25000 mg/l Do đó công nghệ sinh học được quan tâm áp dụng nhằm

xử lý trước hết là nước thải vệ sinh tàu dầu Đặc biệt, công nghệ tái sinh sinh học đối với than hoạt tính hạt (GAC) đã bão hòa các hợp chất chứa trong nước thải cặn dầu được thải bỏ và thiết bị lọc màng sinh học (Biofilm Membrane Bioreactor) đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy việc sử dụng các vi sinh vật thích nghi với nước mặn có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm là rất khả thi [28]

Một loài vi khuẩn chịu mặn - Staphylococcus xylosus cũng đã được sử dụng làm vi

khuẩn mồi (inoculum) cho thiết bị hữu cơ dạng mẻ phân hủy nước thải nhiễm mặn nhân tạo trong điều kiện hiếu khí với ba dạng sinh khối: bùn sinh học, hỗn hợp

Staphylococcus với bùn sinh học; và Staphylococcus xylosus thuần chủng với các

mức nhiễm mặn lần lượt là 5, 10 và 15 g NaCl/L Kết quả nghiên cứu cho thấy:

− Hỗn hợp Staphylococcus thuần chủng với bùn sinh học cho phép loại bỏ 92,59%

COD với nồng độ muối 5g/L NaCl và thời gian lưu thủy lực HRT là 24h

− Với Staphylococcus xylosus thuần chủng, hiệu quả loại bỏ COD đạt 86,36% với

nồng độ muối 10g/l NaCl và đạt 72,57% với nồng độ muối 15g/l NaCl khi thời gian lưu thủy lực HRT đạt 24h

− Thời gian lưu thủy lực HRT tăng lên 48h không có hiệu ứng gì đáng kể đến hiệu quả phân hủy hữu cơ, vì vậy HRT = 24h thích hợp kể cả với nồng độ muối cao nhất (15g/l) [29]

Bên cạnh các vi khuẩn chịu mặn, các chủng nấm men đã thích nghi với nồng độ mặn tương đối cao cũng là một nguồn vi sinh vật có khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn một cách hiệu quả

Một nghiên cứu mới cho thấy sử dụng các chủng nấm men chịu mặn là một hướng nghiên cứu rất có triển vọng Tuy các chủng nấm men nói chung có hằng số tăng trưởng đặc thù cực đại – umax (tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa) tại nồng độ muối 20g/l thấp hơn so với vi khuẩn, nhưng khi nồng độ muối tăng lên đến >30g/l, hằng

số tăng trưởng đặc thù của nấm men không bị suy giảm, trong khi đại lượng này ở các vi khuẩn suy giảm rất mạnh Ngoài ra các chủng nấm men chịu mặn có thể hoạt

động trong một khoảng giá trị pH rộng hơn so với các vi khuẩn và có khả năng loại COD hiệu quả nhất trong khoảng pH: 5,0-5,5 Kết quả vận hành so sánh 2 thiết bị sinh học sử dụng màng lọc với nấm men (YMBR-Yeast Membrane Bioreactor) và

vi khuẩn (BMBR-Bacterial Membrane Bioreactor) trong điều kiện COD thấp: 1.000 mg/l và nồng độ muối cao 32 g/l NaCl cho thấy hiệu quả loại COD đạt tới 90% với HRT 5h Trong cũng điều kiện, YMBR có thể hoạt động với áp lực xuyên màng 10 lần thấp hơn và ít gây tắt nghẽn màng hơn so với BMBR [30]

Ở Nhật, trong nghiên cứu xử lý nước thải có độ mặn cao nhờ vi khuẩn chịu mặn, Motoki Kubo và cộng sự (2001) thuộc khoa Khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Ritsumeikan, Nhật Bản đã phân lập, tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn chịu mặn

từ mẫu đất để xử lý nước thải có độ mặn cao từ nhà máy chế biến Nho Các chủng

phân lập được gồm Staphylococcus sp và Bacillus cereus đều phát triển tốt trên môi

trường có độ mặn đạt 0- 15% Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nước thải được xử lý bằng các chủng vi khuẩn này trong 72h ở quy mô thực nghiệm, hàm lượng COD đã giảm 70% và khi ứng dụng ở quy mô pilot trong nhà máy với thể tích 1m3

trong thời gian 7 ngày thì hiệu suất xử lý COD là 90% [31]

Thông thường, sử dụng phương pháp sinh học để xử lý nước thải nhiễm mặn sẽ đem lại hiệu quả thấp, đặc biệt là việc loại bỏ COD do hiện tượng co nguyên sinh của vi sinh vật khi ở nồng độ muối cao Tuy nhiên, nếu sử dụng các phương pháp hóa lý để loại bỏ muối trước khi sử dụng phương pháp sinh học sẽ đem lại kết quả khả quan hơn Và ở Thổ Nhĩ Kỳ, một nhóm nghiên cứu đã sử dụng nhóm vi khuẩn cổ có khả

năng chịu mặn cao Halobacter halobium để bổ sung vào bùn hoạt tính và có thể làm

tăng hiệu suất loại bỏ COD trong nước thải nhiễm mặn ở nồng độ 1-5% Sinh khối của chủng vi khuẩn này được bổ sung theo mẻ vào bể hiếu khí Kết quả cho thấy, sau

khi bổ sung Halobacter halobium trong quá trình nuôi bùn hoạt tính, hiệu quả xử lý

COD khi có muối đã tăng hơn 2% so với lúc trước [32]

Theo Olivier Lefebvre và cộng sự (2006), nguồn nước thải từ nuôi trồng thủy sản,

chất hữu cơ cao Nếu xả nguồn nước thải này ra môi trường mà chưa qua xử lý sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hệ sinh thái nước mặt, nước sinh hoạt và hoạt động nông nghiệp Vì vậy, việc xử lý nguồn nước thải nhiễm mặn để loại bỏ cả chất hữu cơ và muối là rất cần thiết ở nhiều quốc gia Thông thường người ta xử lý bằng phương pháp hóa lý mặc dù chi phí cao vì phương pháp sinh học khó sử dụng và kém hiệu quả do hàm lượng muối trong nước thải cao Phương pháp sinh học chủ yếu là phương pháp xử lý ở điều kiện hiếu khí và kỵ khí Cho dù phương pháp sinh học có

xử lý được nguồn ô nhiễm C, N hay P ở nồng độ muối cao thì việc thực hiện vẫn phụ thuộc rất nhiều vào khả năng thích nghi và tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn chịu mặn Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp thẩm thấu ngược (RO- reverse osmosis) để loại bỏ muối cũng như một lượng lớn chất rắn lơ lửng và chất hữu cơ, điều này giúp cho việc xử lý bằng phương pháp sinh học đạt hiệu quả hơn Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu mặn cao và phân hủy chất ô nhiễm tốt là rất cần thiết và phụ thuộc nhiều vào sự thích nghi của bùn hoạt tính ở độ muối cao Các nhóm vi sinh vật này sau khi thích nghi có thể được sử dụng trước cả phương pháp hóa lý để xử lý nước thải nhiễm mặn [3]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

− Thời gian thu thập mẫu được thực hiện từ tháng 12 năm 2018 đến tháng 3 năm

2019 tại khu vực Vàm Láng, tỉnh Tiền Giang bao gồm:

 Khu xử lý tập trung nước thải cảng cá Vàm Láng

Vị trí: i Hố tập trung nước thải rửa sơ chế hải sản: 3 mẫu ký hiệu 1A, 1B, 1C

ii Đầu ra sau khi xử lý: 3 mẫu ký hiệu 2A, 2B, 2C

 Nhà máy sơ chế thủy hải sản Minh Thắng-Công ty TNHH Thủy sản Minh Thắng Địa chỉ: 487 Khu phố 1 – Thị trấn Vàm Láng – Gò Công Đông

Vị trí: i Hố tập trung nước thải sau sơ chế: 2 mẫu ký hiệu 3A, 3B

ii Đầu ra sau xử lý: 2 mẫu ký hiệu 4A, 4B

Mẫu được thu thập trong chai sạch vô trùng và vận chuyển đến phòng thí nghiệm tiến hành phân lập trong vòng 24 giờ Độ mặn, nhiệt độ và pH của nước mặt được xác định ngay lập tức tại điểm lấy mẫu bằng bộ kiểm tra nước đa năng Horiba U-10

- Thời gian các thí nghiệm tiến hành từ tháng 12 năm 2019 đến tháng 8 năm 2020 tại Viện Khoa học Công nghệ và Quản lý Môi trường, trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

− Đĩa petri

2.2.2 Môi trường và hóa chất

− Môi trường phân lập BMS: 3 g/L NaNO3, 1 g/L KH2PO4, 0,5 g/L MgSO4, 0,5 g/L KCl, 5g/L NaCl, 1 g Cao nấm men, 20g agar, pH = 7 [29]

− - Môi trường khảo sát khả năng chịu mặn: 3 g/L NaNO3, 1 g/L KH2PO4, 0,5 g/L MgSO4, 0,5 g/L KCl, 1 g/L Cao nấm men, 20% agar, pH = 7 Thành phần NaCl

- Lọc: sử dụng để loại bỏ chất cặn lơ lửng còn sót lại trong nước sau công đoạn lắng, và những vật chất hữu cơ nhỏ đang trong công đoạn phân huỷ [33]

2.3.2 Phương pháp xử lý hóa lý

Cơ chế của phương pháp hóa lý: đưa vào nước thải chất phản ứng nào đó, chất này phản ứng với các tập chất bẩn trong nước thải và có khả năng loại chúng ra khỏi nước thải dưới dạng cặn lắng hoặc dạng hòa tan không độc hại

Phương pháp này dựa trên cơ sở của quá trình hấp thụ, keo tụ, tách ly, trao đổi ion, bay hơi hay cô đặc để loại bỏ vật chất vô cơ và hữu cơ trong cả nước cấp và nước thải Trong nuôi tôm quá trình hấp thụ ít được ứng dụng Thường để làm sạch các hợp chất hoà tan nhưng ít bị phân huỷ sau khi xử lý cơ học hoặc sinh học [33]

2.3.3 Phương pháp xử lý hóa học

Sử dụng một số hoá chất đưa vào môi trường nước thải, những hoá chất này có thể tham gia oxy hoá, quá trình khử vật chất ô nhiễm hoặc trung hoà tạo chất kết tủa hoặc tham gia cơ chế phân hủy Phương pháp oxy hoá thường được sử dụng nhiều hơn, bởi vì các hoá chất có khả năng oxy hoá rất phổ biến trên thị trường Trong quá trình oxy hoá, các chất gây ô nhiễm sẽ chuyển thành những chất ít ô nhiễm hơn và tách ra khỏi nước

Tuy nhiên, quá trình này thường tốn một lượng lớn hóa chất và khó định lượng liều lượng sử dụng và không phù hợp xu hướng phát triển ứng dụng công nghệ xanh trong tương lai Do đó chỉ sử dụng trong những trường hợp khi các tạp chất gây ô nhiễm trong nước thải không thể tách bằng phương pháp khác [33]

2.3.4 Phương pháp xử lý sinh học

Đây là phương pháp sử dụng khả năng sống và hoạt động của vi sinh vật trong nước

để phân hủy các chất gây ô nhiễm hữu cơ trong nước Những vi sinh vật này sử dụng một số hợp chất hữu cơ, chất khoáng và muối dinh dưỡng làm nguồn thức ăn

và tạo ra năng lượng cho chúng phát triển Phương pháp này thường được sử dụng

để loại bỏ các hợp chất hữu cơ hoà tan hoặc chất phân tán nhỏ, keo, hợp chất lắng tụ trên nền đáy, sản phẩm cuối cùng của phương pháp sinh học là CO2, nước, nito, ion sulfat,… Tuỳ vào tính chất hoạt động của vi sinh vật, quá trình sinh học có thể xảy

ra trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí

- Quá trình sinh học hiếu khí: Là quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong điều kiện

có oxy hoà tan bởi các vi sinh vật hiếu khí

- Quá trình sinh học kỵ khí: Là quá trình phân hủy các chất hữu cơ và vô cơ trong

điều kiện không có oxy hoà tan bởi các vi sinh vật kỵ khí

- Quá trình sinh học tự nhiên: Là tổ hợp của các quá trình hoá lý và sinh hoá xảy ra

tự nhiên trong đất và nước bởi sự hiện diện của oxy hoà tan và động thực vật trong đất và nước Đây cũng có thể xem là quá trình tự làm sạch tự nhiên [33]

2.3.5 Bể SBR

SBR thực chất tà từ viết tắt của từ ( Sequencing Batch Reactor ) Đây là một trong

những loại bể phản ứng làm việc theo mẻ bằng bùn hoạt tính, đặc điểm của loại bể này là trong quá trình sục khí và lắng được vận hành và diễn ra trong cùng một bể chứa

Những bể BSR sẽ hoạt động theo chu kỳ kép kín, với 5 pha chính Trong số đó có đến 4 pha chính là dùng để làm đầy và sục khí, lắng và rút nước Một pha cong lại

chính là pha nghỉ [34]

2.3.6 Phương pháp lấy mẫu

− Mẫu được lấy từ nước thải chế biến thuỷ sản thu được ở Cảng Cá Vàm Láng và

cơ sở sản xuất chế biến thủy sản Minh Thắng, tỉnh Tiền Giang

− Vị trí lấy mẫu: tại hố tập trung nước thải và đầu ra sau xử lý của hệ thống xử lý

ở 2 khu vực

− Mẫu được cho vào chai vô trùng, đưa về phòng thí nghiệm và sử dụng trong vòng 24 giờ

Hệ thống xử lý nước thải thủy sản bắt đầu với song chắn rác, song chắn rác để loại

bỏ các tạp chất thô có kích thước lớn ra khỏi dòng thải để tránh làm tắc nghẽn

Nước thải thủy sản được đưa qua bể tuyển nổi để tách dầu mỡ có trong nước ra khỏi dòng thải Thiết bị sục khí được đặt dưới đáy bể, các bọt khí hòa tan nổi lên trên mặt nước kéo theo các chất bẩn bám trong bọt khí ra khỏi dòng thải

Sau khi ra khỏi bể tuyển nổi, nước thải được dẫn qua bề điều hòa để ổn định lại lưu lượng và nồng độ các chất bẩn có trong nước thải Tải bể điều hòa có đặt thiết bị sục khí để xáo trộn đều nguồn nước, tránh hiện tượng lắng cặn, xảy ra phân hủy yếm khí dưới đáy bể

Nước thải sẽ được đưa sang bể xử lý sinh học hiếu khí Tại bể Aerotank, quá trình phân giải chất hữu cơ còn lại trong nước thải nhờ các vi sinh vật hiếu khí sử dụng chất hữu cơ làm nguồn dĩnh dưỡng để phát triển sinh khối dưới điều kiện được cung cấp oxi đầy đủ Nước thải từ bể Aerotank tự chảy qua bể lắng sinh học để lắng bùn

từ quá trình xử lý sinh học trên Phần bùn cặn được đưa qua bể chứa bùn để xử lý Sau khi ra khỏi bể lắng, nước thải được đưa đi khử trùng để tiêu diệt vi khuẩn còn sót lại trong bể

Công nghệ chủ yếu áp dụng trong hệ thống xử lý nước thải thủy sản là công nghệ sinh học, phù hợp với nước thải chứa hàm lượng chất hữu cơ cao có khả năng phân hủy sinh học hiệu quả

2.3.7 Phương pháp phân lập và tuyển chọn

2.3.7.1 Phương pháp phân lập

Mẫu nước thải sau khi thu được, tiến hành pha loãng theo phương pháp pha loãng bậc 10 với dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng Sau đó, cho 0,1mL mẫu đã pha loãng vào các đĩa môi trường BMS dung que thủy tinh trải đều đến khi khô Ủ các đĩa môi trường ở 30ºC trong 24 – 48h để vi khuẩn phát triển trên bề mặt môi trường thạch Thực hiện tách ròng từng chủng vi khuẩn bằng phương pháp cấy truyền nhiều lần

để thu được từng dòng thuần

Hình 2.3 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn chịu mặn

2.3.7.2 Phương pháp khảo sát khả năng chịu mặn

Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên môi trường BMS với

sự thay đổi nồng độ NaCl là 1, 3, 5 và 7% Theo dõi khả năng phát triển của khuẩn lạc trên bề mặt thạch để xác định khả năng chịu mặn Lựa chọn 10 chủng vi khuẩn

có khả năng chịu mặn tốt nhất Tiến hành định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn được

So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 chủng vi sinh vật khác nhau, MALDI được phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn G (+), vi khuẩn G (-), vi khuẩn kỵ khí, hiếu

MALDI BIOTYPER là hệ thống máy định danh đầu tiên trên thế giới sử dụng công nghệ dấu ấn phân tử trong phân tích và đinh dạnh vi sinh vật do tập đoàn Bruker Daltonics sản xuất Hệ thống máy cho phép định danh vi sinh vật trực tiếp từ mẫu bệnh nhân trong thời gian một vài phút so với các phương pháp truyền thống từ 6h-8h

Được xem là công nghệ định danh vi khuẩn của thế kỷ 21, MALDI BIOTYPER được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới tại các viện nghiên cứu, bệnh viện và trung tâm y khoa hàng đầu hiện nay [35]

 Nguyên tắc

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ MALDI-TOF Ban đầu, mẫu được xử lý, làm tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau Sau đó mẫu phân tích được trộn với các chất nền (các axit yếu như sinapinic) chứa các phân tử hữu cơ nhỏ có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở những bước sóng nhất định Hỗn hợp mẫu và chất nền được đưa lên khay và bay hơi tạo thành các hạt tinh thể bám với peptid Dưới tác dụng của nguồn năng lượng laser cực lớn chiếu vào làm cho các chất nền (axit yếu) hấp thụ năng lượng và bật ra các photon Mẫu được hấp thụ photon và năng lượng sẽ được đi vào hệ thống khối phổ TOF Các ion dương thường được tạo ra đối với mẫu dạng các peptid/protein Mỗi peptid có xu hướng hấp thụ một photon kết quả là ion peptid sẽ tích điện dương +1

Phương pháp MALDI-TOF và MALDI-TOF MS thường được sử dụng cho các mẫu protein đơn giản, và khá tinh sạch Ưu điểm là có thể giải trình tự axit amin mảnh peptid và đo chính xác khối lượng, nhưng nó lại không thích hợp cho việc phân tích hỗn hợp protein phức tạp [36]

2.3.8 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của

các chủng vi khuẩn tuyển chọn

2.3.8.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Phương pháp tiến hành: phương pháp đếm trực tiếp mật độ tế bào là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm

Cách tiến hành:

- Đặt lamelle sạch phủ lên khung đếm Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch môi trường chứa vi sinh vật đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lamelle

- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lamelle, hơi thừa một ít Nếu bị bọt mắc lại trong lamelle thì phải làm lại

- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm

- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm

- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa) đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên trái của ô

- Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (Trường hợp: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ)

- Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (Trường hợp: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)

2.3.8.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường BMS lỏng, xác định mật độ vi khuẩn sau các khoảng thời gian 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và

96 giờ Vẽ biểu đồ tăng trưởng để xác định thời gian nuôi cấy tối ưu

2.3.8.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường BMS lỏng, xác định mật độ vi khuẩn sau các khoảng nhiệt độ 300C, 350C, 400C Vẽ biểu đồ tăng trưởng để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

2.3.8.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Sử dụng môi trường phân lập BMS lỏng trong ống nghiệm, thay đổi pH của môi trường là: 6, 7, 8 và 9 sau đó ủ ở nhiệt độ tối ưu Sau thời gian phát triển tối ưu, xác định mật độ vi khuẩn để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đối với vi khuẩn

Sau các thí nghiệm xác định được điều kiện tối ưu, tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường BMS, xác định lại mật độ tế bào sau tăng sinh Đánh giá hiệu quả tăng sinh của các chủng trong điều kiện tối ưu đã chọn Các chủng sau tăng sinh được sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo

2.3.9 Phương pháp đánh giá khả năng làm giảm COD của các chủng vi khuẩn

tuyển chọn trên nước thải nhiễm mặn tại địa phương

Các thí nghiệm khảo sát quy mô pilot được thực hiện với mẫu nước thải nhiễm mặn lấy từ hố thu gom công ty chế biến thủy sản Minh Thắng, tỉnh Tiền Giang

2.3.9.1 Thiết kế mô hình

Dựa trên mục đích nghiên cứu và định hướng áp dụng, tôi đã thiết kế mô hình thí nghiệm hiếu khí với kích thước Dài×Rộng×Cao: 42 cm × 50 cm × 10,5 cm Mô hình được thiết kế gồm 15 ngăn thử nghiệm có kích thước:

Dài×Rộng×Cao: 14cm × 10cm × 10,5cm với thể tích nước thử nghiệm 500ml như hình

Nhằm duy trì điều kiện hiếu khí, các ngăn thử nghiệm được bố trí thanh phân phối khí ở đáy ngăn và được cung cấp khí qua hệ thống bơm sục khí liên tục trong quá trình thử nghiệm