Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là đánh giá mối liên quan giữa các dạng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đoạn lớn, mức độ đột biến đoạn lớn, sự thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Việt Nam.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trang 2ô trì ợc hoàn thành t i:
r ng Đ i h ho h nhi n ĐH GH
g i h ớng dẫn khoa h c: G r nh H ng h i
TS Tô Thanh h
Phản biện:
Phản biện:
Phản biện:
Luận án sẽ đ ợc bảo vệ tr ớc Hội đ ng cấp ơ sở chấm luận án tiến sĩ h p t i
vào h i gi phút, ngà th ng năm 201
Có thể tìm hiểu luận án t i:
- h viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - h viện Đ i h c Quốc gia Hà Nội
Trang 3số bệnh nhân ung th (globo n 2012)
Có nhiều yếu tố nguy ảnh h ởng đến U Đ nh hế độ ăn uống, nối sống, nghề nghiệp và hội chứng đ pol p theo gi đình Đặc biệt, các nghiên gần đâ đ ho thấ đột biến ADN ty thể là một yếu tố góp phần làm tăng ngu ơ mắc bệnh Kết quả nghiên cứu
về đột biến ADN ty thể cho thấ đâ là h ớng nghiên cứu tiềm năng để tìm các chỉ th
ho ung th ( umitr và s 2014; Ann và s 2010)
Ở Việt m tr n đối t ợng bệnh U Đ thì nghi n ứu chủ yếu tập trung vào các vấn đề li n qu n đến d ch tễ h lâm sàng và ph ơng ph p điều tr nh ng vẫn
h ó ông trình nào nghiên cứu về đột biến ADN ty thể và mối liên quan giữ đột biến ADN ty thể với bệnh U Đ Xuất phát từ th c tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận
2 Khảo sát các biến đổi trên một số gen: ND1, ND3, COX-1, COX-2 ở mẫu mô mẫu
m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng bằng các kỹ thuật sinh h c phân tử
3 Đ nh gi mối liên quan giữa các d ng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đo n lớn, mứ độ đột biến mất đo n lớn s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh
h c của bệnh nhân U Đ ở Việt Nam
Đố t ợ ứu ủ uậ
Nghiên cứu đ ợc th c hiện tr n 86 ặp mẫu mô và 9 mẫu máu của các bệnh nhân b bệnh U Đ ẫu ung th đ ợc cung cấp từ Bệnh viện và ệnh viện iệt Đức Hà Nội
từ năm 2012 - 2015 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh bình th ng do Bệnh viện huyết
h c và truyền m u rung ơng ung ấp
Ý ĩ k o ọc và thực tiễn củ ề t uậ
- Với những kết quả mà đề tài luận n thu đ ợc sẽ góp phần cung cấp một ngu n dữ
liệu về các biến đổi trên một số gen ty thể (ND1, ND3, COX-1, COX-2), tỷ lệ và mứ độ
mất đo n lớn, s th đối số l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ tr n ơ sở
Trang 4đó ó thể l a ch n đ ợ đột biến, biến đổi có nhiều tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn giúp cho việc hỗ trợ chẩn đo n và điều tr bệnh U Đ
Đó óp ới củ ề tài
- Đ hảo s t và x đ nh đ ợ tỷ lệ biến đổi nucleotide: A4164G, A10398G,
C6340T, G7853A trong hệ gen ty thể của bệnh nhân U Đ
- Đ x đ nh đ ợc tỷ lệ đ nh l ợng đ ợ mứ độ mất đo n lớn và s th đổi số
l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ
- Đ đ nh gi đ ợc mối liên quan giữ biến đổi nucleotide, tỷ lệ, mứ độ mất đo n lớn và s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh h c ở bệnh nhân U Đ
- Là ông trình đầu tiên phát hiện thấy một số đột biến mất đo n mới: 5094bp 5169
bp và 5104bp
Trang 5HƯƠNG 1 T NG QUAN TÀI LI U
1.1 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.1.1 Thực tr ng mắ u t i trực tràng
Ung th đ i tr tràng (U Đ ) là một trong những lo i ung th phổ biến nhất chiếm tỉ lệ cao thứ b trong tr ng hợp ung th ở nam giới, thứ hai ở n giới (Globocan, 2012) T i Việt m U Đ xếp thứ 4 ở nam giới, xếp thứ 5 ở nữ giới về tỷ
1.2 TY TH NGƯỜI
1.2.1 u tr v ứ ủ ty t ể
Ty thể là bào quan có mặt ở tế bào chất của hầu hết các tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác nhau xong hình d ng đặ tr ng là thon dài với đ ng kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm Bao b c bên ngoài ty thể là hai lớp màng lipoprotein, giữa hai lớp màng là khoang gian màng, bên trong hai màng là chất nền Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền t o thành các mào răng l ợ t thể là nhà m t o năng l ợng cho tế bào th m
gi vào qu trình l o hó qu trình t chết của tế bào và một số qu trình h ủ ơ thể
1.2.2 Hệ gen ty thể
Bào quan ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân ADN ty thể
ng i t n t i ở d ng m ch vòng, sợi đôi ó í h th ớc 16.569bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho 2 phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA và 13 phân tử protein thuộc các phức hợp của chuỗi hô hấp
1.2.3 Sự di truyền theo dòng mẹ của ADN ty thể
S di truyền các gen trên ADN ty thể là di truyền qua tế bào chất (di truyền theo dòng mẹ) g i mẹ truyền hệ gen ty thể ho ng i con và chỉ có những ng i con gái mới truyền hệ gen đó ho thế hệ tiếp theo
1.2.4 Hiệ t ợng dị tế bào ch t v ỡng biểu hiện củ t biến ADN ty thể
Trang 6Do hệ gen ty thể có nhiều bản sao: vài bản sao trong một ty thể, hàng nghìn bản sao trong một tế bào.Vì vậy, ADN ty thể có một hiện t ợng rất đặc thù - hiện t ợng d tế bào hất (heteropl sm ) tế bào hất là hiện t ợng t n t i đ ng th i cả bản sao ADN ty thể
b đột biến và bản sao ADN ty thể ở d ng d i trong cùng một mô, một tế bào Nếu tất cả các bản sao của ADN ty thể giống nhau thì g i là tính đ ng nhất (homopl sm ) Ở tr ng
th i bình th ng phần lớn A t thể t n t i ở d ng đ ng tế bào hất h i niệm ng ỡng biểu hiện củ đột biến đ ợ dùng để chỉ khả năng h u đ ng của tế bào tr ớc một tỷ lệ số bản sao ADN ty thể m ng đột biến trong tổng số bản s o ỷ lệ ty thể đột biến phải
đ t đến ng ỡng thì mới gây ra kiểu hình lâm sàng của bệnh ( l và s 1996) g ỡng biểu hiện củ đột biến th đổi phụ thuộc từng lo i đột biến và từng lo i mô ( ll e và
cs, 2013)
1.3 Đ T I N N T TH V NH UNG THƯ
hiều d ng biến đổi tr n A t thể đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến bệnh ung
th Các biến đổi có thể ở d ng đ hình ng ó thể là đột biến làm th đổi axit
amin có thể dẫn đến th đổi cấu trúc của các enzyme thuộc chuỗi hô hấp, dẫn đến việc hông đảm bảo chứ năng ó thể làm ảnh h ởng tới dòng vận chuyển điện tử bình
th ng Các biến đổi thuộ vùng ghi m đặc biệt là các biến đổi trên các gen ND1, ND3,
COX-1, COX-2 đ đ ợ x đ nh trên nhiều lo i ung th trong đó ó ung th đ i tr c
tràng
ất đo n lớn tr n A t thể trong đó ó mất đo n phổ biến 4977bp đ ợ oi là ngu n nhân hính ủ một số bệnh t thể và ó thể đóng v i tr trung tâm đối với qu trình l o hó goài r mất đo n 4977bp ng đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến nhiều
lo i bệnh ung th h nh u nh ung th v niêm m c tử cung, th c quản, d dà đ i
tr c tràng, gan, phổi, thận, da và tuyến giáp ( hen và s 2011; e và s 2008; i và s 2006; Demberg, 2015) u nhi n mứ độ ảnh h ởng ủ mất đo n đến biểu hiện bệnh
n li n qu n đến mứ độ ủ mất đo n
o trong mỗi tế bào ó từ hàng tr m đến hảng nghìn bản s o A t thể s th đổi
số l ợng bản sao ADN ty thể đ ợc coi là một dấu hiệu quan tr ng của bệnh ung th u nhiên, vai trò của s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể xảy ra trong gi i đo n đầu,
gi i đo n tiến triển của bệnh ung th nói hung và U Đ nói ri ng vẫn n h thống nhất
1.4 Á HƯƠNG HÁ HÁT HI N Đ T BI N GEN TY TH
Để x đ nh và đ nh l ợng biến đổi tr n A t thể th ng p dụng một số
ph ơng ph p s u: PCR-RFLP giải trình t gen e ltime H L và một số ph ơng
ph p h ph ơng ph p ó thể dùng ết hợp với nh u để tăng độ hính x ủ ết quả phân tí h
Trang 7HƯƠNG 2 NGU N I U V HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU
2.1 NGUYÊN LI U
2.1.1 Mẫu nghiên cứu
86 mẫu mô ung th g m mô u và lân cận u của bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam, 9 bệnh nhân có mẫu máu kèm theo Các mẫu mô và máu của bệnh nhân ung th đ ợc thu thập từ bệnh viện K và bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ năm 2012 đến năm 2015
67 mẫu máu củ ng i kh e m nh đến cho máu đ ợc thu thập từ Viện huyết h c và truyền m u rung ơng mẫu m u đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2015 Các mẫu nghiên cứu đều đ ợc bảo quản ở tủ - 800C
2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao g m: máy NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy nhân gen PCR Biorad (Mỹ), máy Realtime PCR Mygopro (IT-IS Life Science (Anh), máy ly tâm
5417 (l tâm 1 5mlendorf Đức), thiết b điện di ng ng điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad), tủ l nh -20OC và -80OC (Nuaire, Mỹ) và
m mó thiết b h thuộ ph ng roteomi s và inh h ấu tr thuộ ph ng thí nghiệm tr ng điểm ông nghệ en me và rotein- r ng ĐH H hi n
2.3 HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU
2.3.1 T ết N tổng số từ mẫu ô u t i trự tr v ẫu u
Tiến hành tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u bằng it t h hiết QIAamp
A ini it IA mp lood mini it ( IAGE Đứ ) b ớ t h hiết theo h ớng dẫn ủa nhà sản xuất
2.3.2 Tách chiết ADN plasmid
A pl smid đ ợc tách và tinh s ch bằng kit QIAprep-miniprep củ i gen
b ớ tiến hành theo theo h ớng dẫn ủ nhà sản xuất
2.3.3 Đ ện di kiể tr v ị ợng ADN tổng số
Trang 8S có mặt của ADN tổng số sản phẩm đ ợc kiểm tra bằng ph ơng ph p điện di trên gel agarose pol r l mide nhuộm ethidiumbromie
2.3.4 Nhân bả o n gen ty thể chứ t biến bằng kỹ thuật PCR
đo n ADN thuộc các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, mất đo n 4977bp thuộc
ADN ty thể đ ợc sàng l đột biến/đ hình đ ợc khuế h đ i bằng phản ứng PCR với các cặp m i đặc hiệu (bảng 2) Khuôn cho phản ứng PCR là ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu của bệnh nhân U Đ và mẫu máu củ ng i kh e m nh
2.3.5 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật ì ều o n cắt giới h n (PCR-RFLP)
Trong nghiên cứu này, các biến đổi (đột biến điểm/đ hình) tr n A t thể đ ợc phát hiện bằng kỹ thuật PCR- FL (và đ ợc khẳng đ nh bằng kỹ thuật x đ nh trình t
nu leotide) en me đ ợ sử dụng g m: NlaIII, DdeI, HincII, HincII (bảng 2 1)
Phản ứng cắt đ ợc th c hiện với các thành phần theo h ớng dẫn của nhà sản xuất
ả 2 1 zy ớ tro ứu Tên
Trang 9(v trí)
Trì tự xuô
(5’-3’)
ợ 5’-3’)
CGA CCC TAC TTC TAA CC
CGA CCC TAC TTC TAA CC
A10398G
246 (10307- 10552)
CTG CCA CTA ATA GTT ATG TC
GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA
(8196 -13553)
ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC
GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC
2.3.6 Nhân dòng trực tiếp o n gen chứ t biến vào vector pJet1.2
Nhân dòng phân tử g m một nhóm ph ơng ph p nhằm:
Phân lập một đo n gen (A ) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử A b n đầu
đ ợc tách chiết từ các mẫu sinh h c có thành phần phức t p
Nhân bản đo n trình t A đ ợc quan tâm lên một l ợng đủ lớn để có thể tiến hành phân tích về cấu trúc và chứ năng gen t ơng ứng
2.3.7 G ả trì tự o ứ t biến
Trang 10ết quả - FL đ ợ hẳng đ nh bằng ph ơng ph p giải trình t gen
2.3.8 Đ ện di ADN trên gel polyacrylamide
- ùng để x đ nh s ó mặt ủ băng A đ ợ nhân l n từ ặp m i sử dụng trong ph ơng ph p - FL và băng ủ sản phẩm ắt en me
p o â ể ự ờ u
TCT ACT ATC AACA
ACC CTC ACC ACT ACA ATC TTC C
ATA GGC AGA GAG A
GTC AGA AGC AAA TGT AAG CAA TAGA
p o r t R
Trang 11AAG GAG TG CTA CAC GA
CGT CAA C
CCT TAA ACC TGT CTT GTA CGG AA
TCT CCC AA
GTG ATA GTG GTT CCA TGG ATA AGT
hu trình nhiệt và thành phần ho phản ng re ltime : hản ứng đ ợc th c hiện riêng biệt cho từng cặp m i Hỗn hợp phản ứng đ ợc th c hiện trong tổng thể
tí h 10μl b o g m: 2X Green I: 5μl 0 2µ mỗi m i, 0,1~0,2 (ng/ µl) khuôn ADN tổng số Chu trình nhiệt cho phản ứng e ltime : 95° trong 2 ph t s u đó 40 hu
kỳ g m 95°C trong 10 giây, 60°C trong 30giây Ch èm theo h ơng trình phân tích đỉnh chả ( elting urve) để x đ nh độ đặ hiệu ủ m i: tr ớc tiên bu ng ủ nhiệt sẽ
đ nhiệt độ lên 950C trong 60 giây biến tính hoàn toàn tất cả các sản phẩm khuế h đ i
u đó h nhiệt độ xuống 600 trong 60 giâ để tất cả các sản phẩm khuế h đ i này thành sợi đôi u đó th c hiện h ơng trình phân tí h nhiệt độ chảy (melt- urve) đ nhiệt độ bu ng ủ từ 600C lên 970C với tố độ ra nhiệt 0,10 /1 giâ gi p phân tí h độ đặc hiệu của m i
g m ó: gi i đo n 1 (n=30) gi i đo n 2 (n=21) gi i đo n 3 và 4 (n=33) heo mứ
đô biệt hó g m mứ độ biệt hó r (n=10) mứ độ biệt hó vừ (n=39) mứ độ biệt hó thấp (n=6)
ADN tổng số của mẫu máu và mẫu mô U Đ đ ợ t h hiết bằng kit tách chiết
th ơng phẩm củ h ng i gen ết quả t h hiết đ ợ minh h trong hình 3 1
Hình 3.1 cho thấy sản phẩm ADN tổng số thu đ ợ từ các mẫu nghiên cứu đều có một băng A r nét hứng t ADN tổng số t h đ ợ đều nguyên vẹn Hàm l ợng ADN trung bình (ng/µl) trên mô u, mô lân ận u và tr n mẫu m u t ơng ứng lần l ợt là 50,69 và 41,67 và 17,78 ng/µl
Trang 12Hì 3.1: ện di ADN tổng số ợc tách chiết từ ẫu ứu
(điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide)
Giếng 1-4; 5-8: ADN tổng số từ mô u, lân cận u của 4 bệnh nhân UTĐTT,
giếng 9-12; 13-15: ADN tổng số t h từ ủa người khỏe mạnh, máu của bệnh nhân UTĐTT, Giếng M: thang ADN chuẩn 1kb
3.2 T ệ t o 4977 p tr N ty t ể ở ệ â u t trự tr
ằng ph ơng ph p với 4 cặp m i: mtDNA, 4977-1; 4977-2 và 3 trong đó
cặp m i mt A bắt ặp đặ hiệu với đo n A thuộ gen ND1 t thể (gen thuộ vùng
rất hiếm xả r đột biến mất đo n) dùng để khẳng đ nh s ó mặt ủ A t thể trong mẫu ADN tổng số Hai cặp m i 4977-1, 4977-2 dùng trong phản ứng PCR l ng để xác
đ nh mất đo n 4977 bp trong mẫu nghiên cứu ặp m i 3 nhân đo n A thuộ vùng mất đo n 4977 bp dùng để l i trừ d ơng tính giả (nếu ặp m i 4977-2 hông l n băng
381 bp ùng bệnh nhân đó m i 3 l n băng 246 bp thì hẳng đ nh bệnh nhân đó hông
ó mất đo n ết quả PCR với 3 cặp m i ở một số mẫu nghiên cứu đ ợc minh h a theo hình 3.2
Hì 3.2: ện di sản ph m PCR m i mtDNA, 4977-2, ND3 trên
t số mẫu nghiên cứu ( ệ tr ros 1 7 % u t r)
Trang 13Hình A: Giếng 1: Đối chứng âm của cặp mồi mtDNA, giếng 2: Sản phẩm PCR mồi mtDNA,
giếng M: Thang ADN chuẩn 100bp, giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2, giếng 4,5: sản phẩm PCR của cặp mồi 4977-2 của 2 mẫ ô UTĐTT, giếng: 6,7: sản phẩm PCR của cặp mồi
4977-2 của 2 mẫ đối chứng Hình B: Giếng M: Thang chuẩn ADN 100bp, giếng 1-4: bệnh nhân 1 #16675: (giếng 1,2: sản phẩm PCR với kí h thước 433 bp và 381 bp của mô u; giếng 3,4: sản phẩ PCR tương ứng của mẫu máu) Giếng từ 5-8: bệnh nhân 2 #16678 (giếng 5,6: sản phẩm PCR 433 bp và 381 bp của mô u; giếng 7,8 sản phẩ PCR tương ứng của mẫu
máu) : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 ệnh nhân không ó t hiện ng
381 bp
rong nghi n ứu nà h ng tôi x đ nh thấ mất đo n 4977bp là lo i mất đo n phổ biến, tỷ lệ cao (95,35%) ở mô ủ bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam và thuộc d ng đột biến sôm (hình 3 2) goài mất đo n 4977 bp, chúng tôi còn phát hiện đ ợc một số mất
đo n lớn khác trên ADN ty thể ở mô U Đ với tỷ lệ 38 37 trong đó x đ nh chính xác 3 mất đo n mới (5169bp 5094bp 5104bp) (hình 3 3 và hình 3 4)
Hì 3.3: Sản ph m PCR m 4977-2 tr ẫu mô
có m t o k t o 4977 p k t ớ k 381 p)
ệ tr ros 1 5% u t r)
M: Thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: Sản phẩm PCR mồi t , giếng : Đối hứng ương
ủa ệnh nhân hứa t đoạn p đ đư kh ng đ nh ng giải tr nh t Giếng 3 -16: Sản phẩ PCR ủa ặp ồi - nh ng ệnh nhân hứa t đoạn kh t đoạn p
Trang 14Hì 3.4: o n trình tự ADN ty thể của bệnh nhân UTĐTT t o
A: m t đoạn 4977bp (bệnh nhân #4169B), B: m t đoạn 5169bp (bệnh nhân #36924), C: m t đoạn 5094bp (bệnh nhân #42308), D: m t đoạn 5104bp (bệnh nhân # 10731
( ũi tên hỉ v trí nối sau khi m t đoạn
T ệ t o 4977 p t o ể ệ ọ â s
heo độ tuổi: ỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân ít hơn 50 tuổi là 100 o hơn so với nhóm bệnh nhân tr n 50 tuổi (93 9 ) ỷ lệ mất đo n ở n m giới là 97 6 o hơn so với nữ giới (93 3 ) ở nhóm ung th đ i tràng và đ i tr tràng ó tỷ lệ mất đo n t ơng
đ ơng với nhóm ung th tr tràng heo mứ độ biệt hó ở nhóm bệnh nhân ó mứ độ biệt hó r và biệt hó ém ó tỷ lệ mất đo n 100 o hơn so với nhóm bệnh nhân ở
mứ độ biệt hó vừ (94 9 ) heo í h th ớ hối u ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ u
nh hơn 3 m ó tỷ lệ mất đo n o nhất (100 ) s u đó đến nhóm bệnh nhân ó í h
th ớ hối u lớn hơn 3 5 m thấp nhất ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ hối u từ 3,5cm heo gi i đo n tỷ lệ mất đo n giảm dần theo thứ t lần l ợt là 98 ở gi i đo n
3-No, 96 4 ở gi i đo n 1 và 75 ở gi i đo n 2 heo gi i đo n : tỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân ở gi i đo n 1 o nhất (100 ) tiếp đó đến nhóm bệnh nhân ở gi i
đo n 3 và 4 (97 5 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n 2 (94 3 ) heo
gi i đo n bệnh: tỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n II o nhất (100 ) tiếp đến là ở nhóm bệnh nhân gi i đo n I (96 7 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ
gi i đo n III và I