Mục tiêu nghiên cứu luận án là phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam; Xác định mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học, từ đó hoàn thiện kỹ thuật phát hiện sự methyl hóa làm tiền đề để phát triển bộ sinh phẩm sử dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đoán UTTTL.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
Vương Diệu Linh
NGHIÊN CỨU HIỆN TƯỢNG METHYL HÓA Ở GEN
GSTP1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN
Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2017
Trang 22
Công trình được hoàn thành tại : Trường Đại học Khoa học tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Võ Thị Thương Lan
Phản biện:
Phản biện:
Phản biện:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi
giờ ngày tháng năm 20
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam;
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 3ĐẶT VẤN ĐỀ
Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách thức methyl hóa DNA và biến đổi histone Thay đổi mức độ methyl hóa DNA tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen
Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư
Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới Methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong
UTTTL, trong đó, gen được nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1
(π-class glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử các độc tố gây ung thư Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl hóa DNA mới được triển khai Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lượng đúng và điều trị đích chính xác là nhiệm vụ bất khả kháng của sinh y học hiện
đại Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa ở gen GSTP1 liên quan ung thư tuyến tiền liệt ở bệnh nhân Việt Nam” với mục đích:
- Phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư
tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam,
- Xác định mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter
GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học, từ đó hoàn thiện kỹ thuật
phát hiện sự methyl hóa làm tiền đề để phát triển bộ sinh phẩm sử
dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đoán UTTTL
Đóng góp và ý nghĩa thực tiễn của luận án: Lần đầu tiên xây dựng
và tối ưu được điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter
GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân UTTTL và PĐT người Việt Nam;
Tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở bệnh nhân UT/PĐT người Việt
Nam chiếm 66,1 % và 10,8 % Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl
hóa promoter GSTP1 với UT/PĐT; giữa methyl hóa promoter GSTP1 với phân độ Gleason; Bước đầu hoàn thiện các tiêu chuẩn cơ
sở của bộ sinh phẩm phát hiện methyl hóa promoter GSTP1; kết hợp
Trang 44
MS-PCR với lai điểm để tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát
hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa
Giới thiệu luận án: Luận án gồm 109 trang (3 chương): Đặt vấn đề 3 trang, chương 1 (tổng quan) 28 trang, chương 2 (vật liệu, phương pháp) 18 trang, chương 3 (kết quả thảo luận) 38 trang, kết luận- kiến nghị 2 trang Luận án có 39 hình, 13 bảng, 148 tài liệu tham khảo (3 tiếng việt, 136 tiếng anh, 9 trang web)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Ung thư
1.1.1 Thực trạng ung thư
Theo WHO, ước tính đến năm 2030 khả năng mắc UT mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người chết vì UT Việt Nam
có khoảng 110000 người mắc UT mới trong đó khoảng 82000 người
tử vong do UT mỗi năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân UT
1.1.2 Cơ sở tế bào học ung thư
Sáu đặc điểm cơ bản của tế bào UT: duy trì tín hiệu tăng sinh, trốn tránh các yếu tố ức chế khối u, chống lại apotosis, nhân lên bất
tử, cảm ứng tăng sinh mạch máu, xâm lấn và di căn
1.1.3 Di truyền học ung thư
Các gen liên quan đến sự hình thành tế bào ác tính và phát triển khối u được phân thành hai nhóm chính là gen ức chế khối u và gen gây ung thư
1.2 Di truyền ngoại gen và ung thư
1.2.1 Biến đổi histone trong ung thư
Trong các dạng biến đổi, acetyl hóa và methyl hóa là phổ biến nhất và liên quan tới ung thư
1.2.2 Methyl hóa DNA bất thường trong ung thư
Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl vào nucleotide trên phân tử DNA Methyl hóa DNA dưới mức trong UT xảy ra tại các trình tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động Methyl hóa quá mức vùng promoter là
Trang 5gây bất hoạt các gen ức chế khối u và mức độ methyl hóa của mỗi gen trong từng loại ut cũng khác nhau
1.3 Methyl hóa DNA trong UTTTL
1.3.1 Phân độ trong ung thư tuyến tiền liệt
Hệ thống phân loại Gleason được xem như tiêu chuẩn vàng cho phân chia các giai đoạn của UTTTL, gồm hai giá trị: độ Gleason
và điểm Gleason
1.3.2 Methyl hóa DNA trong ung thư tuyến tiền liệt
Hơn 30 gen bị methyl hóa bất thường trong UTTTL, trong đó
methyl hóa promoter gen GSTP1 là phổ biến và rộng rãi nhất Methyl hóa GSTP1 có nhiều tiềm năng để phát triển thành dấu chuẩn
hỗ trợ tiên lượng UTTTL
1.4 Phương pháp phân tích methyl hóa DNA
1.4.1 Phương pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)
Khi DNA xử lý với bisulfite, các cytosine không bị methyl sẽ biến đổi thành uracil, sau phản ứng PCR, uracil thành thymine Sự thay đổi nucleotide này có thể làm xuất hiện hoặc mất đi vị trí nhận
biết của enzyme giới hạn
1.4.2 Phương pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction)
MS-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vào vùng giàu CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa với DNA không methyl hóa Kết hợp hai kỹ thuật MS-PCR với lai điểm cho phép định lượng các cytosine bị methyl hóa không cần điện di
1.4.3 Phương pháp định lượng qMS-PCR
Để tăng tính chính xác, hạn chế dương tính giả, TaqMan và các mồi kết hợp với đầu dò được xây dựng và hoàn thiện, trong đó MethylLight và HeavyLight là hai kỹ thuật định lượng phổ biến
Trang 66
1.5 Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ
1.5.1 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư
Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng ung thư đang được đặc biệt quan tâm và áp dụng phổ biến: dấu chuẩn DNA, dấu chuẩn RNA và dấu chuẩn protein
1.5.2 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư tuyến tiền liệt
PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt) là dấu chuẩn sinh học phổ biến, ngoài ra còn có alpha-methylacyl CoA racemase (AMACR), kháng nguyên màng đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSMA), protein 3 giàu cystein, Chromogranin A, PCA3…
1.5.3 Triển vọng các bộ kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA
Epi prolung ử dụng dấu chuẩn methyl hóa gen SHOX2 chẩn
đoám sớm ung thư phổi Epiprocolon dựa trên dấu chuẩn methyl hóa
SEPT9 chẩn đoán sớm ung thư đại tràng ConfirmMDx phân tích methyl hóa quá mức trên 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A nhằm hạn
chế những trường hợp sinh thiết không cần thiết trong UTTTL
1.6 Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thƣ ở Việt Nam
Nghiên cứu của Trinh HT cho thấy 87,5 % mẫu UT đại trực
tràng có sự methyl hóa quá mức ở gen ức chế khối u APC Tran THT
và cs.; Le NQ và cs phát hiện tỷ lệ methyl hóa gen ER tương ứng ở
26/28 (92,9 %) và 21/24 (87,5 %) bệnh phẩm UT vú Vi Thuật Thắng và cs nhận thấy 11/20 (55 %) mẫu UT và 2/10 (20 %) mẫu
PĐTTL có RASSF1A bị methyl hóa Phân tích methyl hóa DNA trên
từng gen riêng rẽ hay phân tích kết hợp sự methyl hóa đồng thời nhiều gen đối với UT còn rất ít Vo LT và cs phân tích đồng thời các
dấu chuẩn methyl hóa trên gen BRCA1, RASSF1A và ER ở các bệnh
nhân UT buồng trứng với tỷ lệ methyl hóa lần lượt là 11/59 (18,6 %)
ở gen BRCA1, 40/59 (67,8 %) ở gen RASSF1A và 15/59 (25,4 %) ở gen ER Tác giả cũng chỉ ra 45/59 (78 %) các bệnh nhân bị methyl
hóa quá mức ít nhất một trong ba gen này Ở Việt Nam, chưa có
công bố nào phân tích sự methyl hóa GSTP1 trong ung thư tuyến tiền
Trang 7liệt Như vậy, phân tích dấu chuẩn di truyền ngoại gen và dấu chuẩn
methyl hóa GSTP1 nói riêng vẫn là một lĩnh vực mới ở Việt Nam
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu
96 mẫu bệnh phẩm TTL, dòng tế bào PC3, mẫu máu, các nguyên vật liệu và hóa chất sinh học phân tử
2.2 Thiết bị chính
Các thiết bị chuyên dụng cho sinh học phân tử
2.3 Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA
- Nuôi cấy dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3
- Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR
- Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học
- Xác định số bản copy
2.4 Sơ đồ thí nghiệm
Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm
Trang 88
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu thập và phân loại mẫu
96 mẫu bệnh phẩm TTL đúc paraffin (59 mẫu UT và 37 mẫu PĐT), được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội Mẫu máu người khỏe mạnh chống đông với heparin, cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 được nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu
3.2 Tách chiết DNA tổng số
3.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu máu và dòng tế bào nuôi cấy PC3
Hình 3.3 (A) Kết quả điện di DNA tổng số tách từ máu (P1) và từ dòng tế
bào PC3 (P2) trên gel agarose 1 % (B) Kết quả xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ
Băng DNA tổng số sáng, rõ nét chứng tỏ DNA tách được đạt chất lượng tốt Tỷ lệ A260/A280 của các mẫu DNA đạt giá trị 1,8 - 2,0 chứng tỏ DNA có độ tinh sạch đạt yêu cầu
3.2.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin
DNA tổng số được tách chiết từ 20 lát cắt/mẫu của 96 mẫu TTL bằng kit QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) Mẫu đúc
Trang 9paraffin có nồng độ DNA thấp, bị đứt gãy và lẫn nhiều tạp chất nên điện di và xác định nồng độ bằng phương pháp đo độ hấp thụ không chính xác Trong nghiên cứu, 5 ng và 25 ng DNA tổng số tách từ dòng tế bào PC3 và 1 µl DNA tổng số mẫu đúc được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR để khuếch đại trình tự 268 bp của gen
đơn bản quản gia β-globin để đánh giá lượng DNA tách từ mẫu bệnh
phẩm Kết quả cho thấy 1 µl DNA tách từ các mẫu đúc có ít nhất 5
ng và hầu hết DNA tách từ mẫu đúc đảm bảo số lượng theo yêu cầu của kit xử lý bisulfite
Hình 3.4 (A) Kết quả điện di minh họa DNA tổng số tách từ mẫu đúc nến
UT (P1-P4) và PĐT (B1-B4) trên gel agarose 1 % (B) Kết quả xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ
Hình 3.5 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % minh họa sản phẩm PCR
khuếch đại gen β-globin
Trang 1010
3.3 Xử lý DNA tổng số với bisulfite
3.3.1 Đánh giá chất lượng DNA sau xử lý bisulfite
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin với cặp
mồi đặc hiệu cho DNA không xử lý bisulfite (A) và cho DNA sau xử lý (B) trên gel acrylamide 8 %
Quá trình xử lý yêu cầu: (1) DNA được xử lý hoàn toàn đảm bảo không còn DNA nguyên gốc và (2) DNA thu hồi sau xử lý đảm bảo đủ lượng khuôn cho phản ứng MS-PCR Để đánh giá XL bisulfite xảy ra hoàn toàn, DNA sau XL được dùng làm khuôn cho
phản ứng PCR với cặp mồi gen β-globin, cặp mồi đặc hiệu với DNA không XL bisulfite Gen β-globin không bị methyl hóa nên trình tự
nucleotide sau khi XL bisulfite sẽ có tất cả C biến đổi thành U Do
đó, cặp mồi được thiết kế theo trình tự DNA gốc không thể bắt cặp với DNA đã bị XL Vì vậy nếu quá trình XL xảy ra hoàn toàn thì không có sản phẩm PCR Ngược lại, những mẫu DNA không được
xử lý hết sẽ xuất hiện băng DNA có kích thước 268 bp Kết quả trên Hình 3.6A cho thấy không thu được băng có kích thước 268 bp cho
gen β-globin ở mẫu DNA đã qua XL bisulfite Băng 268 bp chỉ xuất
hiện với DNA không bị xử lý Điều này chứng tỏ các mẫu DNA đã được XL hoàn toàn Sau quá trình XL bisulfite, lượng DNA bị hao hụt nhiều do bị biến tính và chịu tác động của các hóa chất xử lý, các bước tinh sạch Vì vậy cần kiểm tra lượng DNA sau XL có đủ làm khuôn cho phân tích MS-PCR Quá trình kiểm tra được thực hiện bằng phản ứng PCR với cặp mồi Un – Globin được thiết kế để
khuếch đại trình tự gen đơn bản β globin từ DNA đã XL (có tất cả C
biến đổi thành U) Kết quả PCR được trình bày trên Hình 3.6B cho thấy băng DNA 244 bp được khuếch đại từ DNA đã XL Hơn nữa, kết quả âm tính không có sản phẩm PCR với khuôn là DNA chưa được XL chứng tỏ tính đặc hiệu của cặp mồi Un-globin không bắt cặp nhầm với loại DNA này Như vậy, lượng DNA sau XL đảm bảo cho phản ứng MS-PCR
Trang 113.3.2 Xử lý DNA tổng số của các mẫu bệnh phẩm với bisulfite
500 ng DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm UT/PĐT để
XL với bisulfite Hình 3.7 minh họa DNA đã được xử lý hoàn toàn nên không có sản phẩm PCR 268 bp trong khi băng này xuất hiện ở DNA không xử lý
Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR minh họa DNA được xử lý
bisulfite hoàn toàn
3.4 Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát hiện methyl hóa
promoter gen GSTP1
Sau XL bisulfite có 2 loại DNA: DNA bị methyl hóa (mC giữ nguyên là C) và DNA không bị methyl hóa (C biến đổi thành U) Nguyên tắc của các cặp mồi trong kỹ thuật MS-PCR là có trình tự bổ sung với từng loại DNA xuất hiện sau XL, nhờ đó phản ứng MS-PCR sẽ phân biệt được 2 loại DNA này Đầu tiên, các cặp mồi tham khảo từ công bố quốc tế được sử dụng trong phản ứng MS-PCR với DNA tách từ PC3 và từ máu đã được xử lý Trong tế bào PC3,
promoter GSTP1 chỉ bị methyl hóa trên 1 allen; do đó, phản ứng MS-PCR sẽ có sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa và GSTP1 không bị
methyl hóa Trong tế bào máu tất cả DNA không bị methyl hóa nên
phản ứng MS-PCR chỉ có sản phẩm GSTP1 không bị methyl hóa
Tham khảo các nghiên cứu đã công bố, cặp mồi phát hiện methyl
hóa promoter GSTP1 được thiết kế từ vị trí -200 đến +50 Chúng tôi
thiết kế các mồi mới cho kỹ thuật PCR hai vòng (nested PCR) nhằm làm giàu khuôn và tăng tính đặc hiệu cho phản ứng Các mồi thiết kế bao gồm: GS Me-F1/R, GS Me-F2/R khuếch đại đoạn
MS-DNA kích thước 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa; các mồi
Trang 1212
GS Un-F1/R, GS Un-F2/R khuếch đại đoạn DNA kích thước 149 bp
đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa
Hình 3.8 Vị trí các mồi đặc hiệu cho phản ứng nested MS-PCR phát hiện
methyl hóa promoter gen GSTP1 do đề tài thiết kế
Sử dụng các cặp mồi thiết kế, phản ứng nested MS-PCR được thực hiện với DNA dòng tế bào PC3 và DNA từ mẫu máu đã được
XL bisulfite Sản phẩm MS-PCR là băng DNA rõ nét có kích thước
155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa và băng DNA 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa Tính đặc hiệu của cặp mồi
MS-PCR cần được thể hiện ở 2 tiêu chí: (1) không khuếch đại trình
tự GSTP1 chưa XL bisulfite và (2) cặp mồi đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa sẽ không khuếch đại nhầm GSTP1 không bị methyl hóa
Do đó, các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại DNA trước và sau
XL bisulfite, các loại DNA này tách từ tế bào PC3 và từ mẫu máu Hình 3.10 cho thấy DNA không XL cho kết quả âm tính trong phản ứng MS-PCR, như vậy đáp ứng tiêu chí đầu tiên Cặp mồi đặc hiệu
GSTP1 bị methyl hóa cho kết quả âm tính với DNA mẫu máu đã xử
lý có GSTP1 không bị methyl hóa, như vậy đáp ứng tiêu chí thứ hai
Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện GSTP1 bị methyl
hóa (A) và GSTP1 không bị methyl hóa (B) trên gel acrylamide 8 %
Trang 13Hình 3.10 Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi MS-PCR phát
hiện GSTP1 không bị methyl hóa (149 bp) (A) và GSTP1 bị methyl hóa
biến đổi thành TGTG Vì vậy, sử dụng enzym giới hạn có vị trí nhận biết chứa CG cho phép phân biệt trình tự bị methyl hóa/không bị
methyl hóa Phản ứng cắt BstUI xảy ra theo nguyên tắc: khi cả 2 vị
trí đều bị methyl hóa thì trình tự 155 bp sẽ bị cắt tạo nên ba đoạn có kích thước lần lượt là 90 bp, 40 bp và 25 bp Khi chỉ có một trong hai vị trí CGCG bị methyl hóa thì sẽ thu được tổ hợp của các đoạn có kích thước 115 bp, 40 bp hoặc 130 bp, 25 bp Ngược lại, nếu cả hai
vị trí nhận biết của BstUI đều không bị methyl hóa (trình tự 149 bp)
thì sẽ không có sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn Kết quả trên Hình 3.11B cho thấy sản phẩm 155 bp khuếch đại từ PC3 bị methyl hóa
hoàn toàn ở 2 vị trí nhận biết của BstUI Trong khi đó, sản phẩm 149
bp khuếch đại từ mẫu máu đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa
đều không bị cắt ở cả hai vị trí này