Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống chuyển gen tối ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội - 2019

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Trần Văn Tuấn

2 PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con người nhưng chúng cũng có thể gây ra những thiệt hại khôn

lường cho sản xuất nông nghiệp Nấm sợi Aspergillus niger được sử

dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp nhiều loại enzyme và axit

hữu cơ, trong khi đó nấm Penicillium chrysogenum lại là loài nổi

tiếng trong sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh β-lactam đầu tiên được phát hiện và sản xuất ở quy mô công nghiệp Việc khai thác các loài nấm sợi sẵn có trong tự nhiên để sản xuất enzyme, axit hữu cơ và các chất có hoạt tính sinh học là có giới hạn Mặc dù nhiều

chủng đột biến của A niger và P chrysogenum có khả năng sinh

tổng hợp hàm lượng cao sản phẩm đã được tạo ra nhờ phương pháp vật lý và hóa học Tuy nhiên các phương pháp này tạo ra các thể đột biến ngẫu nhiên và khó xác định được gen đích đã bị gây hỏng Do

đó nghiên cứu cải tiến, nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên bằng cách can thiệp trực tiếp, có định hướng vào hệ gen nấm là việc làm cần thiết, mang tính ứng dụng cao Bên cạnh đó, đối sản xuất nông nghiệp, vi nấm liên quan mật thiết đến năng suất cây trồng và

bảo quản sản phẩm sau thu hoạch Nấm Penicillium digitatum được

coi là tác nhân gây hỏng nghiêm trọng đối với các loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch Việc nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các

gen gây bệnh ở P digitatum sẽ góp phần trong việc định hướng phát

triển các giải pháp “xanh” hiệu quả trong bảo quản nông sản sau thu hoạch

Nghiên cứu này hướng đến phát triển giải pháp chuyển gen

nhờ vi khuẩn A tumefaciens có thể sử dụng chung cho nhiều loài

nấm sợi khác nhau Việc phối hợp giữa tối ưu hóa phương pháp

chuyển gen và xây dựng được hệ thống các vector nhị thể mới sẽ là nền tảng để triển khai các nghiên cứu chuyên sâu về điều tra chức năng của các gen ở vi nấm

2 Mục tiêu của đề tài

- Tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống

chuyển gen tối ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho

ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum

- Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi

nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên được thực hiện một cách có hệ thống tại Việt Nam và trên thế giới về phát triển các vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền ba loài nấm sợi

sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đề tài đã chứng minh hiệu quả của hệ vector tạo được

bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở cả ba loài nấm sợi khác nhau

4 Những đóng góp mới của luận án

* Đã tạo thành công các vector nhị thể mới dùng cho biểu

hiện gen, xóa gen và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A niger, P chrysogenum và P digitatum

* Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử

dụng vi khuẩn A tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu Lần đầu

tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dưỡng

uridine/uracil được thiết lập ở nấm sợi A niger và P chrysogenum

Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh ở

P chrysogenum và P digitatum được tối ưu và hiệu quả chuyển gen

đạt đươc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trước đây

* Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên chứng minh việc

xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA được thực hiện thành công ở ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum và P digitatum nhờ

sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trò hoàn toàn mới của gen laeA trong điều hòa biệt hóa hình thái tế bào nấm,

trao đổi chất và kiểm soát khả năng gây bệnh trên quả sau thu hoạch

5 Bố cục của luận án

Bố cục của luận án gồm 163 trang, 2 bảng và 43 hình Cụ thể: Mở đầu 4 trang; Chương 1 Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 trang; Chương 3 Kết quả

và thảo luận 70 trang; Kết luận và kiến nghị 3 trang; Danh mục các công trình 2 trang; Tài liệu tham khảo 30 trang

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM A niger, P chrysogenum VÀ

tử và các cơ chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm

P digitatum là nấm gây bệnh thực vật đầu tiên thuộc loài Penicillium được giải mã toàn bộ hệ gen Nhiều nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của nấm P digitatum ở mức độ phân tử cho thấy một

số gen đóng vai trò quy định độc lực của nấm P digitatum Tuy

nhiên cho tới hiện nay, việc điều tra vai trò của các gen quy định độc

lực gây bệnh của nấm P digitatum vẫn đang tiếp tục được thực hiện

Nấm P chrysogenum được nghiên cứu từ rất lâu, tuy nhiên

tới năm 2008 hệ gen của loài nấm này mới được giải trình tự toàn bộ

Ứng dụng nổi bật nhất của nấm mốc P chrysogenum là khả năng

sinh kháng sinh penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng

hợp cao, đặc biệt sau khi đã được xử lý đột biến

1.2 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG

QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT)

Để thực hiện các nghiên cứu về cải biến di truyền nấm sợi thì phương pháp chuyển gen là một công cụ không thể thiếu Hiện nay, một số phương pháp chuyển gen được sử dụng phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen trung

gian qua vi khuẩn A.tumefaciens Với phương pháp chuyển gen

thông qua tế bào trần, các đoạn DNA hoặc các vector mang gen mong muốn được chuyển trực tiếp vào tế bào Tuy nhiên, quá trình chuẩn bị tế bào trần cũng như các bước chuyển gen khá phức tạp, tốn nhiều công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ Phương pháp chuyển gen vào nấm

gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens kể từ khi công bố đến

nay đã được áp dụng thành công trên nhiều loài nấm khác nhau, bởi đây thực sự là phương pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu quả đạt được cao

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI

LaeA (loss of aflR-expression A) là một protein có vai trò đa năng ở nấm sợi nói chung LaeA được xem như một protein điều hòa

quan trọng bởi nó tương tác với nhiều protein khác, trong đó có phức

hệ velvet nổi tiếng Xét về khía cạnh protein, LaeA sở hữu vùng chuyển nhóm methyl và tham gia vào việc điều hòa các quá trình trao đổi chất và phát triển của nấm Trong cấu trúc protein, một vùng cấu trúc phụ thuộc S-adenosylmethione (SAM) có hoạt tính chuyển nhóm methyl khá tương đồng với các enzyme chuyển nhóm methyl cho axit amin arginin

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng LaeA và các protein velvet gồm VeA, VelB, VelC và VosA hoạt động như những protein điều hòa chủ chốt của quá trình phát triển và trao đổi chất bậc hai ở nấm thông qua việc hình thành các phức hệ như LaeA/VeA/VelB, VeA/VelB, VelB/VosA, VelB/VelB, VelC/VosA, VelC/VeA

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens AGL1, Penicillium digitatum PdVN1, Penicillium digitatum N11,

Penicillium chrysogenum VTCC-F1170, Penicillium chrysogenum VTCC-F1172, Aspergillus niger N402, Aspergillus niger CBS 113.46 và Staphylococcus aureus ATCC25923

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân lập, định danh chủng nấm mốc gây hỏng cam 2.2.2 Thu bào tử và hệ sợi nấm

2.2.3 Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh

2.2.4 Tách chiết DNA

2.2.5 Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen

2.2.6 Tối ưu quy trình chuyển gen ở nấm A niger, P digitatum và P chrysogenum và thông qua vi khuẩn A tumefaciens

2.2.7 Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu

2.2.8 Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen

2.2.9 Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên

cứu

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO

SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH

3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng

phương pháp ATMT và marker là gen kháng kháng sinh

Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra tỷ lệ dương tính giả khi

chuyển gen vào A niger với marker chọn lọc là gen kháng kháng

sinh Đồng thời, nhận thấy nồng độ kháng sinh hygromycin dùng trong chuyển gen khá cao Như vậy, việc chuyển gen thông qua vi

khuẩn A tumefaciens sử dụng marker chọn lọc là gen kháng hygromycin tỏ ra không hiệu quả với chủng A niger

3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm

P chrysogenum và P digitatum sử dụng marker kháng kháng

sinh

Hình 3.6 Quy trình chuyển gen tối ưu vào nấm P chrysogenum

và P digitatum

Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình chuyển gen hiệu

quả cao cho chủng P digitatum PdVN1 và chủng P chrysogenum VTCC-F1172 (Hình 3.6) Với quy trình này, ở P digitatum PdVN1,

hiệu suất chuyển gen đạt 1240 ± 165 thể chuyển gen, cao hơn 20 lần

so với công bố trước đây trên chủng Pd01 Với P chrysogenum

VTCC-F1172, hiệu suất chuyển gen đạt 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử, cao gấp 10 lần so với công bố trước đây trên chủng DS17690 Tính tới thời điểm hiện tại, đây được coi là quy trình

chuyển gen hiệu quả nhất đối với loài nấm P digitatum và P chrysogenum

Đồng thời, đây là báo cáo đầu tiên về việc biểu hiện thành

công gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed ở P digitatum và

huỳnh quang xanh GFP ở nấm P chrysogenum bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Đặc biệt trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh gen kháng phleomycin là một marker mới hiệu quả cho chuyển gen và

biểu hiện gen ở cả nấm P chrysogenum và P digitatum

3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG

MARKER TRỢ DƯỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum

Lần đầu tiên việc xóa gen pyrG tạo thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil được thực hiện thành công trên hai loài nấm là A niger

và P chrysogenum bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens

Nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng được hệ thống

chuyển gen mới với hiệu quả cao dựa trên gen trợ dưỡng pyrG sinh tổng hợp uridine/uracil (marker trợ dưỡng pyrG) ở hai loài nấm A niger và P chrysogenum Các thông số tối ưu cho hệ thống chuyển

gen này là nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml, đồng nuôi cấy ở 22°C trên môi trường cảm ứng (induction medium, IM)

bổ sung 0,02% uridine và 0,02 % uracil, IM của cả 2 giai đoạn cảm ứng đều bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ Đây là nghiên cứu đầu tiên thiết lập thành công hệ thống chuyển gen trợ dưỡng uridine/uracil mà không cần sử dụng đến gen kháng kháng sinh ở hai loài nấm này Đây là một bước tiến vượt trội và hệ thống chuyển gen thiết lập được có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tái tổ hợp mang tính ứng dụng trong tương lai

Hình 3.15 Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A niger

3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum

3.3.1 Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A niger

Hình 3.18 Xác nhận xóa gen laeA ở A niger

Với kết quả xác nhận bằng PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu như

trên, chúng tôi đã xóa thành công gen laeA theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng ở nấm A niger Đây là lần đầu tiên trên thế giới gen laeA

ở nấm A niger được xóa thành công theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens Đồng thời với phương pháp này, gen laeA đã được phục hồi và quá

mức thành công Sử dụng các chủng này, chúng tôi đã phát hiện một

loạt các vai trò mới của gen laeA ở A niger

* Gen laeA ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trên các nguồn cacbon của A niger

Hình 3.23 Sự sinh trưởng và hình thành bào tử của các chủng

A niger trên các nguồn cacbon khác nhau

Trên môi trường có galactose, lactose, tinh bột và xylan,

chủng xóa gen laeA hình thành ít bào tử Đặc biệt bào tử chủng xóa

gen trên nguồn cacbon là lactose giảm tới 93,75% và trên nguồn

cacbon là xylan giảm 70,55% so với chủng tự nhiên

* Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng trên các nguồn nitơ

Hình 3.24 Sự sinh trưởng và hình thành bào tử của các chủng

A niger trên nguồn nitơ nitrat và ammonium

Đây là lần đầu tiên mối liên quan giữa gen laeA với các nguồn nitơ được nghiên cứu ở nấm A niger Chúng tôi phát hiện một điểm mới chưa từng được công bố trước đây về vai trò của gen laeA trong biệt hóa hình thái và hình thành bào tử ở nấm A niger trên

nguồn nitơ ammonium

* Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng phân giải cellulose của A.niger

Hình 3.25 Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng A

niger

Việc xóa gen laeA làm mất khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ở A niger Đây là phát hiện mới chưa từng được công bố về vai trò của gen laeA trong điều hòa kiểm soát khả năng sinh enzyme cellulase ở A niger

* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng gây hỏng quả của A niger

Sau 10 ngày, thông qua xác định đường kính vết lây nhiễm

nhận thấy khả năng gây hỏng táo của chủng xóa gen laeA giảm so

với chủng tự nhiên và chủng phục hồi trung bình khoảng 44,25%

(Hình 3.26A) Tương tự, chủng xóa gen laeA cũng giảm khả năng

gây hỏng trên nho khoảng 53,33% (Hình 3.26B) Điều này chứng tỏ

gen laeA đóng vai trò nhất định trong việc gây hỏng quả sau thu hoạch ở nấm A niger Phát hiện này chưa từng được công bố trước

đây

Hình 3.26 Khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của các chủng

A niger

(A) Gây hỏng trên táo (B) Gây hỏng trên nho

3.3.2 Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P chrysogenum

Đây là lần đầu tiên gen laeA được xóa bỏ khỏi hệ gen của P chrysogenum sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

A tumefaciens

Đồng thời, chủng phục hồi gen laeA cũng đã được tạo thành

công, giúp chúng tôi phát hiện một số điểm mới về vai trò của gen

laeA ở loài nấm sợi này mà chưa từng được công bố trước đây

Hình 3.30 Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR

(A) Sơ đồ trao đổi chéo và vị trí các cặp mồi dùng để kiểm tra (B)

Sự sinh trưởng của các chủng nấm trên môi trường PDA và CD sau 3

và 6 ngày (C) Kết quả PCR kiểm tra M: 1 kb DNA marker, (-) Đối

chứng âm sử dụng nước cất vô trùng

* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh kháng sinh penicillin

Việc phát hiện ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình khôi phục kiểu hình và khả năng sinh kháng sinh penicillin kháng vi

khuẩn S aureus ở chủng P chrysogenum xóa gen laeA chưa từng

được nhắc đến, do vậy kết quả này góp phần bổ sung thêm sự hiểu

biết về vai trò điều hòa của gen laeA ở P chrysogenum