Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân nhiễm dioxin

Mục tiêu chính của luận án là xác định đa hình/đột biến các gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và người có nồng độ dioxin trong máu cao; Tìm hiểu mối liên hệ giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó có các bệnh liên quan đến dioxin; Bước đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên quan đến chuyển hóa dioxin.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI CỦA GEN AHR VÀ AIP

Ở CÁC NẠN NHÂN NHIỄM DIOXIN

Chuyên ngành: Di truyền học

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Nông Văn Hải

2 PGS TS Nguyễn Huy Hoàng

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam;

- Trung tâm Thông tin Thư viện - ĐHQGHN

Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể tiếp nhận dioxin

và nhiều chất ô nhiễm môi trường khác Khi AhR được hoạt hóa bởi phối tử, dẫn đến điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cơ thể Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi nhiễm với các chất độc trong môi trường như nhau, nhưng lại chịu ảnh hưởng cũng như có nguy cơ với ung thư là khác nhau Điều này

có liên quan đến đa hình gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein) Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và AIP chủ yếu trên người không phơi nhiễm dioxin Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về gen trên đối tượng phơi nhiễm dioxin.Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng như đa hình/đột biến trên toàn bộ exon gen AhR ở người phơi nhiễm có nồng độ dioxin

trong máu cao Ảnh hưởng tác động của dioxin cũng như các chất ô nhiễm môi trường qua con đường tín hiệu AhR vẫn được coi là phức tạp, chưa được biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau Hiện nay cũng chưa có dữ liệu đầy đủ về các gen chịu ảnh hưởng của tác động dioxin Xuất phát từ thực tễ trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân nhiễm dioxin”nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến các

gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và

người có nồng độ dioxin trong máu cao; (2) Tìm hiểu mối liên hệ

giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó

có các bệnh liên quan đến dioxin; (3) Bước đầu giải trình tự toàn bộ

hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng

độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên quan đến chuyển hóa dioxin

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIOXIN

1.1.1 Khái niệm dioxin và các hợp chất tương tự dioxin

Thuật ngữ “Dioxin” thường được sử dụng để nói đến 2 nhóm chất là policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) và policlodibenzofuran

(PCDF) Trong các chất dioxin có 2,3,7,

8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) là chất độc nhất

1.1.2 Đặc tính của dioxin

Dioxin có độ bền vững cao Thời gian bán hủy trong cơ thể người là từ 5-12 năm Khoảng 90% dioxin hấp thụ vào cơ thể qua con đường ăn uống

1.1.3 Ảnh hưởng của dioxin đối với sức khỏe con người

Dioxin gây tổn thương đa dạng và phức tạp, làm phát sinh nhiều bệnh lý ở các cơ quan khác nhau Dioxin không chỉ gây tổn hại tới sức khỏe của người bị phơi nhiễm mà còn gây ảnh hưởng tới con cái họ ở những thế hệ kế tiếp trong tương lai

1.1.4 Một số phương pháp định lượng dioxin

1.1.3.1 Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ độ phân giải cao,

1.1.3.2 Phương pháp DR CALUX

1.2 CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN

1.2.1 Thụ thể Aryl hydrocarbon receptor (AhR)

1.2.1.1 Cấu trúc của thụ thể AhR

Thụ thể AhR - thụ thể của dioxin được hoạt hóa bởi các phối

tử (ligand) Phối tử điển hình của AhR là TCDD AhR là một thành viên của họ protein thuộc nhân tố điều hòa phiên mã (transcription factor), có cấu trúc basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim

(bHLH/PAS) AhR có các vùng cấu trúc đảm nhiệm các chức năng: liên kết với phối tử, liên kết với DNA của gen đích, liên kết các protein thành phần và chức năng hoạt hóa phiên mã

1.2.1.2 Vai trò của protein AhR trong cơ thể

AhR là yếu tố điều hòa biểu hiện các gen tham gia đảm nhiệm các chức năng sinh lý quan trọng của cơ thể AhR tham gia biệt hóa nhiều loại tế bào trong giai đoạn sớm của quá trình phát triển cá thể (Li Y, 2011; Gargaro, 2016) AhR đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng nội môi trong tế bào Khi cơ thể tích tụ dioxin có thể chứa protein AhR được hoạt hóa lâu dài, thường xuyên, dẫn đến trạng thái ức chế miễn dịch thường xuyên và liên tục (Ridolfi, 2010)

1.2.1.3 Vai trò protein AhR đối với bệnh ung thư

Thông qua thụ thể AhR, dioxin ảnh hưởng lên các giai đoạn của ung thư Mức độ biểu hiện cao của AhR có liên quan lớn với sự tiến triển ung thư cũng như với tỷ lệ mắc ung thư (Dietrich, 2010; Safe, 2013) Ngoài ra, AhR đóng vai trò quan trọng trong giảm kết dính tế bào dẫn đến gia tăng sự xâm lần mô và di căn của tế bào ung thư Mặt khác, AhR có thể hoạt động như một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) và gen trở nên không hoạt động trong quá trình hình thành khối u ở một số điều kiện nhất định (Fan Y, 2010)

1.2.2 Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR

1.2.2.1 Con đường tín hiệu cổ điển (canocial signaling pathway)

Trong điều kiện không có phối tử, AhR trong tế bào chất, liên kết với các protein thành phần như: AIP (aryl hydrocarbon receptor interacting protein), p23 và 2 phân tử HSP90 (90-kDa heat shock

protein) Khi dioxin khuếch tán qua màng tế bào vào liên kết với AhR, phức hệ AhR được hoạt hóa, thay đổi cấu hình và vận chuyển vào trong nhân tế bào Trong nhân, AhR được giải phóng khỏi hệ thống phức hợp các protein thành phần và tương tác với nhân tố dẫn truyền nhân ARNT (AHR nuclear translocator-ARNT) Phức hệ AHR/ARNT sau đó liên kết với vị trí DNA đặc biệt trên gen đích, gọi là yếu tố đáp ứng với các chất lạ (xenobiotic respone element, XRE) hay yếu tố đáp ứng dioxin (dioxin response element, DRE), qua đó điều hòa biểu hiện các gen đích (Quintuna, 2013; Wright, 2017)

1.2.2.2 Con đường tín hiệu phi cổ điển (non-canocial signaling pathway)

AhR còn điều hòa phiên mã gen đích thông qua con đường khác không liên quan đến trình tự đáp dioxin (DRE) trên gen đích,

mà qua vị trí DRE (non-consensus DRE, NC - DRE) trên vùng promoter của gen đích Để liên kết được với trình tự này, AHR cần kết hợp một protein Kruppel-like Factor 6 (KLF6) và có sự đồng tham gia của protein carbamoyl phosphate synthase 1 (CPS1) (Wright, 2017)

1.2.3 Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền

Dioxin là tác nhân môi trường gây tổn thương vật chất di truyền

và phát sinh đột biến gen thông qua hình thành các gốc tự do chứa oxy

hoạt động (reactive oxygen species, ROS) (Mates, 2010; Franken, 2017)

1.3 TỔNG QUAN VỀ GEN AHR

1.3.1 Đặc điểm gen AhR ở người

Gen AHR ở người có kích thước khoảng 50 kb, nằm trên vai

ngắn của nhiễm sắc thể số 7 (7p21.1), gồm 11 exon và 10 intron, mã hóa protein AhR có 848 acid amin

1.3.2 Vai trò của đa hình gen AhR trong chuyển hóa dioxin và

các đa hình gen AHR mã hóa các receptor có ái lực khác nhau với

TCDD (Ridolf, 2014; Kovalova 2016)

1.4 TỔNG QUAN VỀ GEN AIP

1.4.1 Đặc điểm gen AIP

Gen AIP nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) có 6 exon mã

hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lượng phân tử là 37 kDa

1.4.2 Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở người

Các thể đột biến protein AIP mất khả năng ức chế phân bào và không có khả năng liên kết với các protein thành phần, bao gồm cả các protein trong con đường thụ thể AhR (Igreja, 2010) AIP hoạt động như là nhân tố áp chế khối u ở hầu hết các mô Đột biến gen AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên (Hernandez, 2017)

1.5 VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU THÔNG QUA THỤ THỂ AHR

AIP có vai trò ổn định phức hợp của AhR gắn kết với phối tử, duy trì AhR trong bào tương, ngăn chặn sự phân giải AhR bởi proteasome AIP có thể ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn của AhR

hoặc sự truyền tín hiệu của thụ thể AhR (Jaffrain, 2009) AIP còn

điều hòa hoạt động phiên mã của gen AhR Sự nhạy cảm của tế bào

với dioxin có liên quan tới protein AIP Đột biến mất chức năng AIP dẫn đến bất thường trong điều hòa biểu hiện các gen đích của con đường tín hiệu AhR (Nukaya, 2010; Rowland, 2011)

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM

DIOXIN Ở VIỆT NAM

Tại Việt Nam, đã có các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi nội tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trong máu, trong sữa mẹ ở những người dân sống trong vùng ô nhiễm chất da cam/dioxin Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cơ cấu bệnh tật trên đối tượng nạn nhân dioxin Các nghiên cứu phân tử đã chỉ ra nhữngthay đổi trong biểu hiện/đột biến ở một số gen trên đối tượng phơi

nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1 Đối với các gen AhR, chưa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa hình/đột biến trên toàn bộ vùng biểu hiện gen AhR Với gen AIP, cho đến nay chưa có nghiên cứu về biến đổi gen AIP ở người nhiễm

dioxin nói riêng và quần thể người Việt Nam nói chung

1.7 NGHIÊN CỨU HỆ GEN (GENOME) VÀ HỆ GEN BIỂU HIỆN (EXOME) TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN

Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các đối tượng nạn nhân dioxin đã được tiến hành ở tài cấp Nhà nước 33 (KHCN-33/11-15), theo mô hình trio (bố - con – mẹ) đã giải mã hệ gen một số gia đình nạn nhân chất độc da cam Giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) được thực hiện trên đối tượng con/cháu của các nạn nhân chất độc da cam bị thiểu năng trí tuệ trong đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu phơi nhiễm dioxin là 93 người đã được xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu (thuộc đề tài Nhà nước KHCN-33.04/11-15) Đối tượng không phơi nhiễm dioxin là 20 người dân sống ở khu vực quận Hà đông, Hà Nội Đối tượng nghiên cứu giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là 1 cựu chiến binh bị nhiễm dioxin (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.01-2014.34)

2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

Hóa chất của các hãng: Sigma, Quiagen, Fermentas…Trang thiết bị của Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

2.3.2 Đo quang phổ DNA

2.3.3 Điện di DNA trên gel Agarose

2.3.4 Nhân gen bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.3.5 Giải trình tự gen tự động

2.3.6 Phương pháp giải trình tự toàn bộ exon (WES)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chúng tôi phân tích chỉ số sinh học của 114 mẫu (94 mẫu phơi nhiễm và 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin) Các mẫu phơi nhiễm dioxin được phân thành 3 nhóm:

Bảng 3.1 Phân nhóm đối tượng nghiên cứu

Không phơi nhiễm dioxin 20 20

Phơi nhiễm

dioxin

Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10

ppt và bị bệnh liên quan dioxin 27

94

Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt

và không bị bệnh liên quan dioxin 34

Nhóm 3: dioxin trong máu <10

ppt và không bị bệnh liên quan dioxin

bệnh ung thư và đái tháo đường type II (9/27 mẫu; 33,33%) Độ tuổi trung bình của đối tượng phơi nhiễm và không phơi nhiễm tương đương nhau Độ tuổi trung bình của 3 nhóm trong vùng phơi nhiễm

có sự chênh lệch, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Nữ giới chiếm tỷ lệ cao hơn nam giới trong cả 2 nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin Tuy nhiên, ở nhóm có dioxin

≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin thì nam chiếm tỷ lệ cao hơn nữ khoảng 1,5 lần Trong khi ở 2 nhóm còn lại, nữ giới nhiều gấp 1,6 đến 1,7 lần so với nam giới Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index, BMI) liên quan đến nồng độ dioxin trong cơ thể cũng như khả năng đào thải dioxin Chỉ số BMI ở 3 nhóm đối tượng trong vùng phơi nhiễm dioxin không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0,05

Tỷ lệ người thừa cân, béo phì tương đương nhau giữa nhóm 1 và nhóm 2 Trong nhóm 3 tỷ lệ người béo phì thấp hơn, tuy nhiên khác biệt này không có ý nghĩa thống kê

3.2 ĐA HÌNH CÁC GEN AHR VÀ AIP

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số

3.2.2 Nhân bản gen các gen AHR và AIP

Sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR và 6 exon gen AIP là đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết

3.2.3 Phân tích đa hình gen AHR

Xác định được 4 đa hình trên exon và exon 10; 1 đa hình

intron 5 gen AhR Các đa hình đều xuất hiện riêng lẻ ở các cá thể

khác nhau

Bảng 3.6 Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu

Số hiệu

đa hình Vị trí

Thay đổi nucleotide

Thay đổi protein

Số mẫu (n)

Phân tích so sánh tần số các đa hình gen AR trong nghiên cứu

này và một số quần thể người trên thế giới theo Human Genetic Varition Database (HGVD), vói n=100 cho mỗi quần thể Người Việt Nam trên HGVD là người Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh

Bảng 3.7 Tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với

đa hình ở các quần thể người (theo HGVD )

Trung quốc

Nam

Á

Châu Phi

Ký hiệu -là không có thông tin tần số đa hình trên Human Genetic Varition Database

3.2.3.1 Đa hình trên exon 2 gen AhR

Đa hình trên exon 2 được phát hiện là c.132T>C, p.N44=, số hiệu rs17779352, có ở một mẫu vùng phơi nhiễm, đối tượng có nồng

độ TCDD trong máu cao (53,57ppt), chẩn đoán mắc bệnh ung thư khí quản và tiểu đường type II

3.2.3.2 Đa hình trên intron 5 gen AhR

Đa hình được phát hiện là rs3802082 (c.575-199A>T), tần số 68,2% Tần số đa hình ở quần thể người Việt Nam là 57,4 % Ở các quần thể người đa hình đều xuất hiện với 3 kiểu gen AA, AT và TT Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, đa hình chỉ thấy có 2 kiểu gen TA

và TT, không có kiểu (AA) ở tất cả các mẫu nghiên cứu

3.2.3.3 Đa hình trên exon 10 gen AhR

Phát hiện thấy có 3 điểm đa hình exon 10 đều dẫn đến thay đổi amino acid (Bảng 3.8) Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg

Bảng 3.8 Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR

HWpval (Hardy-Weinberg p value): giá trị cân bằng Hardy-Weinberg, tần

số các kiểu gen đạt trạng thái cân bằng khi p>0.001

Đa hình (1) exon 10 gen AhR: rs2066853

Đa hình rs2066853 (c.1661G>A, p.R554K) chiếm tỷ lệ cao

(64%), xuất hiện ở cả 3 kiểu gen là GG, GA và AA

Hình 3.10 Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR

ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin

Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA và AA) của đa hình rs206853 gen AhR Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng không phơi nhiễm dioxin

Kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG ở cả vùng phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin (Hình 3.10)

Bảng 3.10 Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853

gen AhR ở 3 nhóm vùng phơi nhiễm dioxin

GG GA AA Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt,

bị bệnh liên quan dioxin

55,6 % (15

Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,

không bị bệnh liên quan dioxin

Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt,

không bị bệnh liên quan dioxin