Phân lập vi khuẩn phân giải silic trong đất và ứng dụng trong canh tác lúa ở đồng bằng sông cửu long TT

1.2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải Si từ các nguồn mẫu vật khác nhau nhằm ứng dụng cho việc gia tăng khả nă

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã ngành: 62420201

TRẦN VÕ HẢI ĐƯỜNG

PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN GIẢI SILIC TRONG ĐẤT

VÀ ỨNG DỤNG TRONG CANH TÁC LÚA

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS TS Nguyễn Khởi Nghĩa

Người hướng dẫn phụ: TS Nguyễn Thị Ngọc Trúc

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở

Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án Tiến sĩ, Lầu 2 – Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ

Vào lúc 14 giờ 00 phút ngày 26 tháng 8 năm 2020

Phản biện 1: GS TS Cao Ngọc Điệp

Phản biện 2: TS Trần Đình Giỏi

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Trần Võ Hải Đường và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2018 Phân lập và tuyển chọn

vi khuẩn phân giải khoáng Silic từ nhiều môi trường sống khác nhau Tạp chí Khoa học và Công nghệ Trường Đại học Thái Nguyên, 180(4): 9-14

2 Trần Võ Hải Đường, Đào Thị The và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2018 Đánh

giá hiệu quả của năm dòng vi khuẩn phân giải khoáng Silic phân lập lên tỉ lệ nảy mầm, sinh trưởng và sinh khối của lúa trong điều kiện có và không bổ sung NaCl Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54: 227-234

3 Trần Võ Hải Đường và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2019 Hiệu quả của 5 dòng vi

khuẩn phân giải khoáng silic lên sinh trưởng và năng suất giống lúa IR 50404 trong điều kiện nhà lưới Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55(2): 10-19

4 Tran Vo Hai Duong and Nguyen Khoi Nghia, 2019 Evaluation of some

biophysical characteristics of five silicate solubilizing bacteria isolated from different ecosystems Journal of Biotechnology, 17(4): 775-784

5 Trần Võ Hải Đường và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2020 Hiệu quả của 5 dòng vi

khuẩn phân giải Silic lên sinh trưởng và năng suất lúa một bụi đỏ trên nền đất nhiễm mặn trong mô hình canh tác lúa-tôm tại huyện Phước Long, tỉnh Bạc Liêu Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 56 (Số chuyên đề: Khoa học đất): 47-57

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Dưới điều kiện đất nhiễm mặn, Silic (Si) giúp cải thiện một số đặc tính có

lợi cho cây lúa bao gồm: gia tăng hàm lượng chlorophyll trong lá lúa (Yeo et

al., 1990; Bonilla and Tsuchiya, 1998), giảm hàm lượng ion Na+ và gia tăng hàm lượng ion K+ trong sinh khối khô cây lúa (Matoh et al., 1986; Ahmad et

al., 1992), gia tăng hàm lượng các enzyme oxi hóa-khử và giảm hàm lượng

proline trong thân lúa (Tuna et al., 2008; Soylemezoglu et al., 2009; Lee et al.,

2010) Si trong đất rất dồi dào tuy nhiên hầu hết tồn tại dưới dạng không hòa tan do đó cây trồng không thể hấp thu được (Rodrigues and Datnoff, 2005;

Vasanthi et al., 2012) Bên cạnh đó, vi khuẩn phân giải Si đóng vai trò quan

trọng và hiệu quả cao trong việc phân giải Si bất động trong đất vì vậy giúp gia tăng độ phì nhiêu đất và gia tăng khả năng bảo vệ cây trồng dưới điều kiện bất

lợi của môi trường (Vasanthi et al., 2012) Mặt khác, các nghiên cứu về bổ sung

kết hợp giữa khoáng Si và vi khuẩn phân giải Si vào đất giúp phân giải khoáng

Si nhằm gia tăng khả năng chống chịu mặn cũng như sinh trưởng và năng suất cây trồng trên nền đất nhiễm mặn còn rất hạn chế Thêm vào đó, lúa là cây trồng chủ lực ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, tuy nhiên, hiện tại việc canh tác lúa

ở khu vực này đang phải đối mặt với những hậu quả do tác động của biến đổi khí hậu gây ra, dẫn đến một lượng lớn diện tích trồng lúa bị nhiễm mặn Do đó,

nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn phân giải silic trong đất và ứng dụng trong

canh tác lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn các dòng

vi khuẩn phân giải Si từ các nguồn mẫu vật khác nhau nhằm ứng dụng cho việc gia tăng khả năng chống chịu mặn cũng như sinh trưởng và năng suất của cây lúa khi được canh tác trên nền đất nhiễm mặn

1.3 Nội dung nghiên cứu

(1) Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải Si

từ các mẫu đất canh tác lúa, mía, tre lâu năm, ruột và phân trùn đất ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) gồm Cà Mau, Sóc Trăng, Hậu Giang, Cần Thơ và Trà Vinh; (2) Đánh giá mối quan hệ di truyền của 10 dòng vi khuẩn phân giải Si hiệu quả; (3) Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và một số acid hữu cơ của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn; (4) Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên mật số và khả năng phân giải Si của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si hiệu quả; (5) Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn lên khả năng chống chịu mặn của cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm; (6) Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si

tuyển chọn lên khả năng chống chịu mặn, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng

1.4 Đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Các nghiên cứu về kết hợp bổ sung phân bón Si dạng khoáng và vi khuẩn phân giải Si cho canh tác lúa trên nền đất nhiễm mặn nhằm gia tăng khả năng chống chịu mặn của cây lúa còn rất hạn chế không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới Do đó, hướng nghiên cứu của đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải Si từ các nguồn mẫu vật khác nhau giúp đa dạng nguồn

vi khuẩn phân giải Si thu thập, đồng thời, ứng dụng các dòng vi khuẩn phân giải

Si hiệu quả trong nghiên cứu này trong việc giúp gia tăng khả năng chống chịu mặn, sinh trưởng và năng suất lúa khi trồng trên nền đất nhiễm mặn nhằm góp phần giải quyết vấn đề xâm nhập mặn đang ảnh hưởng nghiêm trọng ở một số tỉnh ĐBSCL hiện nay Đây là một đóng góp mới có ý nghĩa thiết thực trong lĩnh vực nông nghiệp và môi trường

Về ý nghĩa lý luận, luận án đã khái quát được một số đặc tính có lợi như phân giải Si, cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của 5 dòng vi khuẩn phân lập từ đất chuyên canh lúa, mía, tre lâu năm, cũng như phân trùn và ruột trùn đất, góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về lĩnh vực vi sinh nông nghiệp của vùng ĐBSCL Kết quả đạt được của đề tài là bộ sưu tập gồm 387 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải Si in vitro Trong đó, 5 dòng vi khuẩn được tuyển chọn gồm MCM_15, LCT_01, TCM_39, RTTV_12 và PTST_30 phát triển mật

số và phân giải Si tốt trong dãy pH môi trường từ 5-7, nhiệt độ 35,8oC và chịu được độ mặn lên đến 0,5% NaCl Bên cạnh khả năng phân giải Si, 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn còn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA Mặt khác, chúng còn thể hiện sự kích thích gia tăng khả năng chống chịu mặn, tăng sinh trưởng và năng suất cây lúa khi được trồng trong điều kiện mặn trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng

Về ý nghĩa thực tiễn, kết quả của đề tài giúp năng suất lúa ở các nghiệm thức được chủng với các dòng vi khuẩn phân giải Si + 100 kg CaSiO3.ha-1 + 100% NPK hoặc 75% NPK gia tăng lần lượt 5,06-15,5% hoặc 2,55-7,24% so với nghiệm thức đối chứng dương (100% NPK) Do đó, 5 dòng vi khuẩn phân giải Si trong nghiên cứu này có tiềm năng rất cao trong việc ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh giúp gia tăng sinh trưởng và năng suất cây lúa khi được trồng trên nền đất nhiễm mặn ở khu vực ĐBSCL

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Các nghiên cứu trước đây cho thấy tầm quan trọng đặc biệt của Si đối với cây trồng Khi trong đất có chứa một lượng Si cao, cây trồng hấp thu và vận chuyển vào mô cùng với các nguyên tố khác như: P, K, Ca, Mg và S Hầu hết

(SiO2.nH2O) và tham gia vào cấu tạo vách tế bào thực vật, tuy nhiên về mặt hình thái, cấu tạo vách tế bào còn tùy thuộc vào kiểu gen của cây trồng và điều kiện môi trường Si có ảnh hưởng quan trọng lên sự hấp thu và vận chuyển của nhiều yếu tố đa, vi lượng và ảnh hưởng tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Ngoài ra, Si làm giảm và ngăn chặn những ảnh hưởng có hại của sự

dư thừa P, kim loại nặng và môi trường bị nhiễm mặn bằng cách gia tăng hàm lượng các emzyme oxi hóa-khử, ổn định cấu trúc và chức năng của màng tế bào Cuối cùng, Si tham gia vào cấu tạo vách tế bào giúp cây trồng kháng lại sự tấn công của nấm bệnh và một số côn trùng (Epstein, 1994) Sự hấp thu, tích lũy Si

là khác nhau giữa các loài và nhóm thực vật (Ma et al., 2001; Richmond and

Sussman, 2003) Mặt khác, hoạt động phân giải Si của vi khuẩn là do vi khuẩn tiết ra các acid hữu cơ như acid acetic, acid gluconic, acid 2-keto gluconic và polysaccharide ngoại bào Việc chủng vi khuẩn phân giải Si vào trong đất là một trong những cách cung cấp Si hiệu quả cho nhiều cây trồng khác nhau và

vi khuẩn này được sử dụng như phân bón sinh học giúp ích cho sự tăng trưởng, bảo vệ cây trồng khỏi côn trùng, mầm bệnh và góp phần giúp cây trồng gia tăng năng suất Ngoài ra, hiện tại ĐBSCL đang phải đối mặt với vấn nạn xâm nhập mặn trên một diện tích đất canh tác lúa không nhỏ, dẫn đến việc canh tác lúa trên nền đất này ở nhiều nơi gặp bất lợi, suy giảm năng suất lúa Tuy nhiên, vẫn chưa có những nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn phân giải Si trong canh tác lúa nhằm gia tăng khả năng chống chịu mặn, kích thích sinh trưởng và năng suất cây lúa khi trồng trên nền đất nhiễm mặn ở khu vực ĐBSCL

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu thí nghiệm

Chín mươi sáu mẫu vật gồm đất chuyên lúa, mía, tre, phân trùn và ruột trùn được thu thập tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Cà Mau, Sóc Trăng, Hậu Giang, Cần Thơ và Trà Vinh) dùng để phân lập vi khuẩn phân giải Si (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Địa điểm và số lượng mẫu vật được thu thập

vật thu thập

Ký hiệu Tổng số

lượng mẫu (96)

5 Xã Ngọc Biên – Huyện Trà Cú –

Tỉnh Trà Vinh

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung nghiên cứu 1: Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn

có khả năng phân giải Si từ các mẫu đất, ruột và phân trùn đất ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải Si trong đất có nguồn gốc từ đất chuyên lúa, mía và tre lâu năm, ruột và phân trùn đất 5 tỉnh khu vực ĐBSCL gồm Cà Mau, Sóc Trăng, Hậu Giang, Cần Thơ và Trà Vinh Môi trường dung dịch đất

bổ sung 0,25% magnesium trisilicate (Mg2O8Si3) như là nguồn Si khó hòa tan

(Vasanthi et al., 2013) được sử dụng cho phân lập vi khuẩn

3.2.2 Nội dung nghiên cứu 2: Khảo sát mối quan hệ di truyền của 10 dòng

vi khuẩn phân giải Si cao

Khảo sát mối quan hệ di truyền của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ký hiệu MCM_15, LCT_01, LCT_03, TCM_39, TCM_40, RTTV_12, RTTV_13, PTTV_16, PTTV_27 và PTST_30 thông qua giải mã trình tự đoạn gene 16S RNA

3.2.3 Nội dung nghiên cứu 3: Khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và một số acid hữu cơ của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn

Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan ba nguồn lân khó tan khác nhau gồm Ca3(PO4)2, FePO4 và AlPO4, tổng hợp IAA và một số acid hữu cơ của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn trong môi trường lỏng

3.2.4 Nội dung nghiên cứu 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên mật số và khả năng phân giải Si của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn

Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát ảnh hưởng của 4 mức pH: 3, 5, 7 và 9; 4 mức nồng độ muối NaCl: 0,0, 0,15, 0,30 và 0,50%; và 3 mức nhiệt độ 25, 35 và 45oC lên khả năng phân giải Si và mật số của năm dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn

3.2.5 Nội dung nghiên cứu 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn lên khả năng chịu mặn của cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm

Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn lên sinh trưởng, sinh khối và tăng cường khả năng chịu mặn của cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm trong môi trường dung dịch dinh dưỡng lỏng Hoagland Giống lúa MTL 480 (Viện Nghiên cứu và Phát triển

Đồng bằng sông Cửu Long) được sử dụng trong thí nghiệm

3.2.6 Nội dung nghiên cứu 6: Đánh giá hiệu quả của năm dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn lên khả năng chống chịu mặn, sinh trưởng và năng suất lúa trồng trên nền đất nhiễm mặn ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng

Thí nghiệm trong điều kiện nhà lưới được thực hiện trên nền đất nhiễm mặn thu thập từ mô hình canh tác lúa-tôm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức và 4 lặp lại trong 2 vụ liên tiếp Vi khuẩn được cố định trong

xỉ than và được chủng vào trong chậu đất thí nghiệm một lần mỗi vụ vào thời điểm trước khi gieo hạt 1 ngày với mật số cuối cùng của dòng vi khuẩn TCM_39, RTTV_12, PTST_30, LCT_01 và MCM_15 trong đất thí nghiệm lần lượt đạt 12 x 107 CFU.g-1, 6 x 107 CFU.g-1, 11 x 107 CFU.g-1, 11 x 107 CFU.g-1

và 8 x 107 CFU.g-1

Thí nghiệm ở điều kiện ngoài đồng được bố trí trên nền đất nhiễm mặn trong mô hình canh tác lúa-tôm tại ấp Long Hải, thị trấn Phước Long, huyện Phước Long, tỉnh Bạc Liêu theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 15 nghiệm thức và 4 lặp lại, mỗi lô thí nghiệm tương ứng 1 lặp lại Các dòng vi khuẩn được chủng vào đất ở giai đoạn bón lót và giai đoạn 45 ngày sau khi gieo

để đạt mật số vi khuẩn 105 CFU.g-1 đất ở mỗi thời điểm chủng vi khuẩn thông

qua sử dụng chất mang bằng xỉ than

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Nội dung nghiên cứu 1: Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn

có khả năng phân giải Si từ các mẫu đất chuyên canh lúa, mía, tre, ruột và phân trùn đất ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

4.1.1 Kết quả phân lập

Từ 96 mẫu vật liệu có nguồn gốc từ các môi trường sống khác nhau gồm đất chuyên canh lúa, mía, tre, mẫu trùn đất và phân trùn đã phân lập được 387 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải khoáng Si dựa vào phương pháp định tính trên môi trường dịch đất agar bổ sung 0,25% Mg2O8Si3 như nguồn khoáng Si

Vi khuẩn có khả năng phân giải Si hình thành vòng phân giải khoáng Si trong suốt xung quanh khuẩn lạc (Hình 4.1) Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn phân giải Si hiện diện nhiều trong đất canh tác lâu năm và chuyên canh với tre, lúa

và mía Điều này cũng phù hợp vì các loại cây trồng này hấp thu số lượng lớn

và không giới hạn Si từ trong đất Do đó, sự thiếu hụt hàm lượng Si hòa tan trong dung dịch đất là điều không tránh khỏi và ở các vùng đất này xuất hiện một nhóm vi sinh vật trong đất tự thích nghi bằng nhiều cách để có thể phân giải Si trong khoáng Si của đất cũng như nguồn Si từ xác bã động, thực vật cho nhu cầu của chúng và vi sinh vật khác trong đất, cuối cùng là cho cây trồng Bên cạnh đó, số dòng vi khuẩn phân lập được trong phân và ruột trùn thu từ hệ sinh thái đất cát cũng ở mức khá cao điều này có thể là do trong hệ vi sinh vật đường ruột của trùn chứa lượng lớn vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme chuyên biệt

để phân giải Si trong lúc tiêu hóa thức ăn (một phần thức ăn của trùn đất trong vùng đất cát là đất)

Hình 4.1: Vi khuẩn phân giải Si tạo vòng phân giải khoáng Si trong suốt xung

quanh khuẩn lạc (A: vi khuẩn PTST_30; B: vi khuẩn MCM_15)

4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và sinh hóa của 54 dòng vi khuẩn tuyển chọn cho khả năng phân giải Si cao

Kết quả khảo sát khả năng phân giải khoáng Si của 387 dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường dịch đất lỏng bổ sung 0,25% magnesium trisilicate như là nguồn khoáng Si khó hòa tan đã tuyển chọn được 54 dòng vi khuẩn thể hiện khả năng phân giải khoáng Si tốt nhất để mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, Gram và khả năng tổng hợp enzyme catalase (Bảng 4.1, Bảng 4.2, Hình 4.2 và Hình 4.3)

Bảng 4.1: Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 54 dòng vi khuẩn phân giải

khoáng Si cao nhất trong tổng số 387 dòng vi khuẩn phân lập

Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn có sự đa dạng

về hình thái khuẩn lạc và tế bào Bên cạnh đó, vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm (-), catalase dương tính (+) chiếm ưu thế

STT Đặc điểm hình thái Chi tiết Số lượng

Bảng 4.2: Một số đặc điểm hình thái tế bào của 54 dòng vi khuẩn phân giải

khoáng Si cao nhất trong tổng số 387 dòng vi khuẩn phân lập

Hình 4.2: Hình dạng tế bào của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn

(A: TCM_39 – Hình que; B: LCT_01 – Hình que; C: PTST_30 – Hình que; D:

RTTV_12 – Hình que; D: MCM_15 – Hình que)

Hình 4.3: Phản ứng khả năng tổng hợp enzyme catalase của vi khuẩn

(A: MCM_15 âm tính với catalase; và B: TCM_39 dương tính với catalase)

4.1.3 Khả năng phân giải khoáng Si trong môi trường lỏng của các dòng vi khuẩn phân giải Si phân lập

Kết quả khảo sát cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập thể hiện khả năng phân giải khoáng Si rất khác nhau và biến động cao giữa các dòng Cụ thể như sau: khả năng phân giải khoáng Si trong môi trường nuôi cấy lỏng của 387 dòng

vi khuẩn phân lập dao động từ 0,52 mg.L-1 Si đến 55,2 mg.L-1 Si trong thời gian

từ 2 đến 8 ngày nuôi cấy Do số lượng vi khuẩn phân lập khá nhiều nên trong phần này chỉ trình bày kết quả của 25 dòng vi khuẩn tuyển chọn từ 54 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải Si cao nhất (Bảng 4.3)

Bảng 4.3: Khả năng phân giải khoáng Si của 25 dòng vi khuẩn tiêu biểu nhất

trong tổng số 387 dòng vi khuẩn phân lập trong môi trường dịch đất lỏng

STT Đặc điểm hình thái Chi tiết Số lượng

3 LCT_03 38,3ab 29,1cde 39,3defg 26,8efg

4 LCT_31 21,2efgh 16,3ijkl 10,6k 29,9cdef

5 LCT_32 20,2e-i 14,1jkl 39,1defg 25,8efgh

6 LHG_11 17,1f-k 19,4g-k 23,0j 18,1i

B

A

Do đề tài lựa chọn nguồn mẫu vật cho phân lập vi khuẩn phân giải Si gồm đất trồng lúa, mía, tre, mẫu phân trùn và ruột trùn nên 5 dòng vi khuẩn phân giải

Si cao và ổn định ở mỗi nguồn mẫu vật được lựa chọn cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo nhằm đa dạng nguồn vi khuẩn và cũng để khảo sát xem với các vi khuẩn từ các nguồn phân lập khác nhau có hiệu quả giống hay khác nhau lên đối tượng cây lúa nước Do đó, năm dòng vi khuẩn LCT_01, MCM_15, PTST_30, RTTV_12 và TCM_39 được lựa chọn như là 5 dòng vi khuẩn tiêu biểu nhất cho các nội dung nghiên cứu về gia tăng khả năng chống chịu mặn và tăng trưởng của cây lúa

4.2 Nội dung nghiên cứu 2: Đánh giá mối quan hệ di truyền của 10 dòng vi khuẩn phân giải Si cao

4.2.1 Định danh 10 dòng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng cao nhất

Trong số 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn, 2 dòng vi khuẩn Klebsiella

aerogenes LCT_01 và Citrobacter freundii RTTV_12 đều thuộc lớp

Gammaproteobacteria do đó có khả năng phân giải, phóng thích khoáng chất khó tan đặc biệt là khoáng Si thành dạng hữu dụng cho cây trồng hiệu quả (Liu

et al., 2011) Các dòng vi khuẩn còn lại là các dòng vi khuẩn mới chưa được

công bố ở các nghiên cứu trước đây về khả năng phân giải khoáng Si, do đó, cần có nghiên cứu nhiều hơn về khả năng phân giải khoáng Si của chúng (Bảng

7 MCM_15 27,1de 29,8bcde 39,1defg 27,3efg

8 MCM_28 13,5ijk 18,7h-l 32,8ghi 30,4cdef

*Ghi chú: * khác biệt ý nghĩa 5% và trong cùng một cột những số có chữ số theo sau giống nhau thì

sự khác biệt không có ý nghĩa theo phép thử Duncan ở 5%

Bảng 4.4: Định danh 10 dòng vi khuẩn phân giải khoáng Si tốt nhất theo độ

tương đồng đoạn gen vùng 16S rRNA

Dòng vi

Độ tương đồng (%)

NC015663.

1

Microbacterium neimengense

MCM_15

LCT_01 Đất lúa Cần

Klebsiella aerogenes

NR102493.

2

Klebsiella aerogenes

LCT_01

LCT_03 Lúa Cần

Bacillus megaterium

MN240409 1

Bacillus megaterium

LCT_03 TCM_39 Đất tre Cà

Ochrobactrum ciceri

NR115819.

1

Ochrobactrum ciceri TCM_39

TCM_40 Tre Cà

Staphylococcus arlettae

KX344032.

1

Staphylococcus arlettae

TCM_40

RTTV_12 Ruột trùn

Trà Vinh 100

Citrobacter freundii

AB681088.

1

Citrobacter freundii

RTTV_12 RTTV_13 Ruột trùn

Trà Vinh 100

Micrococcus luteus FJ189776.1

Micrococcus luteus RTTV_13

PTTV_16 Phân trùn

Trà Vinh 99 Agromyces ulmi

NR_02910 8.1

Agromyces ulmi PTTV_16

PTTV_27 Phân trùn

Trà Vinh 100

Rhodococcus equi

KF873018.

1

Rhodococcus equi PTTV_27

PTST_30 Phân trùn

Sóc Trăng 99

Olivibacter jilunii

NR109321.

1

Olivibacter jilunii PTST_30

4.2.2 Đánh giá mối quan hệ di truyền của 10 dòng vi khuẩn phân giải Si cao

Các dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn có sự đa dạng về mặt di truyền (thuộc vào 10 chi khác nhau) (Hình 4.4) Mặt khác, chúng được chia thành 2

nhóm chính: Nhóm 1 gồm các dòng vi khuẩn Agromyces ulmi PTTV_16,

Micrococcus luteus RTTV_13, Bacillus megaterium LCT_03, Staphylococcus arlettae TCM_40 và Rhodococcus equi PTTV_27; Nhóm 2 gồm các dòng vi

khuẩn Citrobacter freundii RTTV_12, Klebsiella aerogenes LCT_01,

Ochrobactrum ciceri TCM_39, Microbacterium neimengense MCM_15 và Olivibacter jilunii PTST_30 Điều này có thể là do: (i) các dòng vi khuẩn phân

giải Si trong ở nhóm 1 hầu hết là vi khuẩn gram dương, ngược lại các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 hầu hết là vi khuẩn gram âm, và (ii) phần lớn các dòng vi khuẩn phân giải Si thuộc nhóm 1 được biết như là những vi khuẩn mang đặc tính gây bệnh trên người nhiều hơn so với lợi ích của chúng trong nông nghiệp, trong khi

đó các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 lại cho thấy nhiều lợi ích ứng dụng như là phân bón vi sinh trong nông nghiệp hơn là chức năng gây bệnh trên người Đồng thời đây cũng là một trong những lý do giải thích cho việc tại sao 5 dòng vi khuẩn thuộc nhóm 2 được chọn để thực hiện các nội dung nghiên cứu tiếp theo

Hình 4.4: Mối quan hệ di truyền của 10 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển

chọn dựa trên trình tự gen 16S rRNA

*Ghi chú: khoảng cách và sự phân nhóm dựa trên phương pháp neighbor-joining Giá trị Boostrap (>40%) với 1000 lặp lại được trình bày dưới dạng phần trăm ở các điểm nhánh Cây di truyền không gốc được xây dựng với độ dài nhánh = 2,23; và 0,2: scale length

Ngoài ra, hầu hết 5 dòng vi khuẩn được tuyển chọn ở nhóm 2 gồm

Citrobacter freundii RTTV_12, Klebsiella aerogenes LCT_01, Ochrobactrum ciceri TCM_39, Microbacterium neimengense MCM_15 và Olivibacter jilunii

PTST_30 đã được chứng minh các nghiên cứu trước đây là có khả năng ứng dụng như là phân bón vi sinh cho cây trồng cũng như xử lý các vấn đề môi

trường (Saleh and Glick, 2001; Babalola et al., 2003; Nguyen et al., 2003; Park

et al., 2009; Costa and Melo, 2012; Das and Adhya, 2012; Gloria et al., 2014;

Ritika and Uptal, 2014; Vajan et al., 2016; Kecskes et al., 2016; Schutz et al.,

2018)

4.3 Khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA và một số acid hữu

cơ của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn

4.3.1 Khả năng số định đạm, hòa tan 3 dạng lân khó tan và tổng hợp IAA

Kết quả khảo sát về khả năng cố định đạm, hòa tan 3 dạng lân khó tan và tổng hợp IAA và mật số của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm PTST_30, LCT_01, RTTV_12, TCM_39 và MCM_15 trong môi trường lỏng cho thấy năm dòng vi khuẩn tuyển đều có khả năng cố định đạm sinh học, hòa tan 3 nguồn lân khó tan gồm AlPO4, FePO4 và Ca3(PO4)2 trong đó chủ yếu là

Ca3(PO4)2, và tổng hợp IAA Ngoài ra, mối tương quan chặt chẽ được tìm thấy giữa các thông số hàm lượng đạm được cố định, lân hòa tan, IAA tổng hợp với mật số 5 dòng vi khuẩn trong môi trường lỏng Như vậy, 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn ngoài khả năng phân giải khoáng Si còn có khả năng cố định đạm, phân giải hiệu quả nguồn lân và tổng hợp hormone thực vật IAA

Agromyces ulmi PTTV_16 Micrococcus luteus RTTV_13 Bacillus megaterium LCT_03 Staphylococcus arlettae TCM_40 Rhodococcus hoagii PTTV_27

Citrobacter freundii RTTV 12 Klebsiella aerogenes LCT 01 Orchobactrum ciceri TCM 39 Microbacterium neimengense MCM 15 Olivibacter jilunii PTST 30

100

42 60 100

98

58 47

0.2

4.3.2 Khả năng tổng hợp một số acid hữu cơ

Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp một số acid hữu cơ của các dòng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy mỗi dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp acid hữu

cơ với hàm lượng khác nhau, và mỗi acid hữu cơ đóng vai trò mạnh hay yếu khác nhau trong việc tham gia vào tiến trình phân giải Si tùy thuộc vào từng dòng vi khuẩn Năm dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn có khả năng tiết các acid hữu cơ gồm acid lactic, acid acetic và acid citric và các acid hữu cơ này ít nhiều cũng đã góp phần trong việc hòa tan khoáng Si thành dạng hữu dụng (H4SiO4) trong môi trường lỏng có bổ sung 0,25% magnesium trisilicate

4.4 Nội dung nghiên cứu 4: Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên mật số và khả năng phân giải Si của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tốt nhất

Khả năng phân giải khoáng Si bởi các dòng vi khuẩn thử nghiệm trong môi trường nuôi cấy lỏng hầu hết được xếp hạng theo xu hướng giảm dần như sau pH 7 > pH 5 > pH 9 > pH 3 Mặt khác, 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn có thể sinh trưởng và phân giải Si tốt nhất trong điều kiện môi trường không bổ sung NaCl Đáng chú ý là 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm còn có thể sống sót và thực hiện chức năng phân giải Si khi môi trường nuôi cấy chứa nồng

độ muối NaCl lên đến 0,5% Thêm vào đó, 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm đều thể hiện khả năng phân giải Si trong môi trường nuôi cấy lỏng tốt nhất ở mức nhiệt

độ môi trường nuôi cấy khoảng 35,8oC

4.5 Nội dung nghiên cứu 5: Hiệu quả của năm dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn lên khả năng chịu mặn của cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm

4.5.1 Chiều dài thân và rễ lúa

Hình 4.5 (A) và (B) cho thấy hầu hết tất cả nghiệm thức được bổ sung vi

khuẩn phân giải Si cho thấy có sự kích thích gia tăng chiều dài thân và rễ cây lúa hiệu quả, đặc biệt khi có ứng dụng kết hợp bổ sung khoáng Si trong điều kiện môi trường bất lợi mặn (NaCl 0,3%)

Hình 4.5: Chiều dài thân lúa (A) và rễ lúa (B) của các nghiệm thức được bố trí

trong ống nghiệm chứa dung dịch dinh dưỡng Hoagland chứa 0,3% NaCl

*Ghi chú: ĐC: nghiệm thức đối chứng; LCT_01: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn LCT_01; RTTV_12: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn RTTV_12; PTST_30: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn PTST_30; MCM_15: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn MCM_15; TCM_39: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn TCM_39; MIX: nghiệm thức chủng hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn; Si: nghiệm thức

chỉ bổ sung Si; Si+LCT_01: nghiệm thức bổ sung Si+LCT_01; Si+RTTV_12: nghiệm thức bổ sung Si+RTTV_12; Si+PTST_30: nghiệm thức bổ sung Si+PTST_30; Si+MCM_15: nghiệm thức bổ sung Si+MCM_15; Si+TCM_39: nghiệm thức bổ sung Si+TCM_39; Si+MIX: nghiệm thức bổ sung Si+hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn

4.5.3 Sinh khối thân và rễ lúa

Sinh khối thân và rễ cây lúa ở nghiệm thức chỉ bổ sung vi khuẩn phân giải

Si dạng đơn lẻ hoặc tổ hợp và nghiệm thức vừa bổ sung khoáng Si vừa bổ sung

vi khuẩn phân giải Si dạng đơn lẻ hoặc tổ hợp đều cao hơn so với các nghiệm thức đối chứng (không chủng Si và vi khuẩn) (Hình 4.6 A và B) Điều này có thể giải thích là do cây lúa ở các nghiệm thức này hấp thu được lượng lớn hơn

Si hòa tan trong môi trường nuôi cấy do vi khuẩn phóng thích ra từ nguồn khoáng Si và do đó Si đã thể hiện vai trò và chức năng trong việc bảo vệ cây lúa, giúp cây lúa không bị ngộ độc muối NaCl và gia tăng về sinh trưởng (Ma and Takahashi, 2002; Ma, 2004)

Hình 4.6: Sinh khối thân lúa (A) và rễ lúa (B) của các nghiệm thức được bố trí

trong ống nghiệm chứa dung dịch dinh dưỡng Hoagland chứa 0,3% NaCl

*Ghi chú: ĐC: nghiệm thức đối chứng; LCT_01: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn LCT_01; RTTV_12: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn RTTV_12; PTST_30: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn PTST_30; MCM_15: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn MCM_15; TCM_39: nghiệm thức chỉ chủng dòng vi khuẩn TCM_39; MIX: nghiệm thức chủng hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn; Si: nghiệm thức chỉ bổ sung Si; Si+LCT_01: nghiệm thức bổ sung Si+LCT_01; Si+RTTV_12: nghiệm thức bổ sung Si+RTTV_12; Si+PTST_30: nghiệm thức bổ sung Si+PTST_30; Si+MCM_15: nghiệm thức bổ sung Si+MCM_15; Si+TCM_39: nghiệm thức bổ sung Si+TCM_39; Si+MIX: nghiệm thức bổ sung Si+hỗn hợp 5 dòng vi khuẩn

4.5.4 Hàm lượng Si trong thân cây lúa

Hầu hết các nghiệm thức được bổ sung vi khuẩn phân giải Si có hàm lượng

Si trong thân cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại không chủng vi khuẩn (Hình 4.7) Trong đó, nghiệm thức bổ sung Si+vi khuẩn phân giải Si cho hàm lượng Si trong thân cao hơn so với nghiệm thức chỉ

có vi khuẩn phân giải Si