Luận văn thạc sĩ định lượng một số hoạt chất nhóm silymarin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.4: Một số loại thực phẩm chứ năng hứa thành phần cây Kế sữa 14 Hình 1.7: Sắ ý đồ HPTLC của các hoạt chất nhóm Silymarinvà dịch chiết hạt Hình 3.6: Sắ ý đồ phân t

-

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

ĐỊNH Ư NG ỘT HOẠT CH T NH I Y ARIN TRONG TH C PH CH C N NG BẰNG PHƯ NG PHÁP

ẮC K ỎNG HI U N NG CAO HPLC)

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá học

UẬN V N THẠC Ĩ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

ĐỊNH Ư NG ỘT HOẠT CH T NH I Y ARIN TRONG TH C PH CH C N NG BẰNG PHƯ NG PHÁP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Huyền Trâm và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được công

bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Học viên

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia Để hoàn thành luận văn Thạ s ho h n n ạnh sự cố gắng ph n đấu ủa bản th n tôi đã nhận được sự động vi n v giúp đỡ rất lớn của nhiều tập thể

v nh n

Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn s u sắc của mình tới TS Lê Huyền

Tr m (Trường Đại h c Bách Khoa Hà Nội) đã tiếp nhận và tận tình hướng dẫn, góp ý

v động viên tôi trong suốt qua trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS L Thị Hồng Hảo (Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia) và các cán bộ Khoa Nghiên cứu thực phẩm đã hướng dẫn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian h c tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo trong Viện Kỹ thuật Hoá h c và Viện Đ o tạo S u đại h Trường Đại h c Bách khoa Hà Nội đã đ o tạo v giúp đỡ tôi trong suốt thời gian h c tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gi đình người thân và bạn è đã nhiệt tình giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin trân tr ng cảm ơn!

Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hằng

1.3.1 Cấu trúc và tính chất của một số hoạt chất nhóm silymarin 6

1.3.2 Hoạt tính sinh học và dược động học của các hoạt chất nhóm

1.3.3 Một số thực phẩm chức năng chứa nhóm Silymarin trên thị trường 13

1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phân tích Silymarin trong TPCN 15

1.4.1 Phương pháp quang phổ hấp th phân tử (UV-VIS) 16

1.5.5 Một số kỹ thuật chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction) 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 hảo sát các điều kiện ph n tích Silymarin bằng HPL 28

3.1 Khảo sát và lựa ch n điều kiện phân tíchSilymarinbằng phương ph p

HPLC

34

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng, viên nén, cao khô kế s a 37

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm, cao lỏng kế s a 41

3.3.3 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tuyến tính 47

3.4 Áp dụng phương ph p HPLC x định silymarin trong mẫu thực tế 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội nh hó ph n tí h Association of Official Analytical

Chemists

Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số hợp chất chính nhóm Silymarin 9

Bảng 3.3: Kết quả thử nghiệm quy trình xử lý mẫu nhiều lipid 42 Bảng 3.4: Kết quả đ nh gi độ lặp lại của các chất phân tích 46 Bảng 3.5: Kết quả phân tích khoảng tuyến tính của các hợp chất nhóm Silymarin 48 ảng 3.6: Kết quả ph n tí h x định LOD v LOQ ủ hất 52

Bảng 3.9: Kết quả ph n tí h h m lƣợng Silymarin trong một số mẫu TPCN thu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.4: Một số loại thực phẩm chứ năng hứa thành phần cây Kế sữa 14

Hình 1.7: Sắ ý đồ HPTLC của các hoạt chất nhóm Silymarinvà dịch chiết hạt

Hình 3.6: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung môi chiết là acetone 40 Hình 3.7: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung môi chiết là ethanol 40 Hình3.8: Sắ ý đồ phân tích nhóm chất Silymarin với dung môi chiết là methanol 40 Hình 3.9: Sơ đồ các thử nghiệm xử lý mẫu phân tích TPCN viên nang mềm 41

Hình 3.11: Sắ ý đồ phân tích Silymarin trong viên nang mềm đã loại lipid

Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu trắng (viên nang cứng) thêm chuẩn Silymarin 45

Hình 3.15: Phổ hấp thụ UV (200-400nm) của các chất Silymarin 45

Hình 3.16: Sắc ký đồ ph n tí h độ lặp lại của các chất phân tích 47 Hình 3.17: Đồ thị v phương trình đường chuẩn của các hợp chất nhóm Silymarin 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển không ngừng của kinh tế - xã hội on người ngày càng phải đối mặt với nhiều ăn ệnh hó điều trị như ung thư làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống Vì vậy, vấn đề bảo vệ sức khỏe đã v đ ng l vấn đề đượ đặt l n ưu ti n h ng đầu của hầu hết các quốc gia trên thế giới Đã ó rất nhiều công trình nghiên cứu được thực hiện với mụ đí h tìm r được các loại thực phẩm bổ sung hàng ngày có tác dụng nâng cao chất lượng đời sống củ on người, phòng chống

và chữa bệnh Trong đó một lượng lớn tập trung vào nghiên cứu thành phần các thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên với hi v ng tìm r được các hợp chất có khả năng phòng và chữa bệnh hiệu quả

Trong số các loại thực vật được dùng làm thứ ăn v thuốc chữa bệnh, từ xa

xư on người đã iết đến lợi ích và tác dụng củacây Kế sữa (Silybum marianum L Gaertn.) thuộc h Cúc (Asteraceae) Đ l loại thảo dược có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải với mụ đí h sử dụng n đầu là chữa trầm cảm và các vấn đề về gan Sản phẩm thương mại cao chiết từ hạt Kế sữ đã được bán rộng rãi ở h u Âu v nước trên thế giới Các nghiên cứu hiện đại cho thấy thành phần hoạt tính chính trong hạt

Kế sữa là một số hợp chất flavonoid có khung flavonolignan được g i tên là Silymarin, bao gồm Silybin, Silydianin, Silychristin, Isosilybin Một số nước phát triển như Ho Kỳ đã ti u huẩn hó dược liệu, cao chiết dược liệu và các sản phẩm thực phẩm chứ năng hứa thành phần Kế sữa

Hiện nay, thị trường trong nước vẫn hư đ p ứng đủ nhu cầu tiêu dùng nên có rất nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ các quốc gia khác nhau trên thế giới nhập về Việt

N m Hơn nữa, nguồn nguyên liệu kế sữ để sản xuất một phần nhỏ ở Việt Nam, còn lại chủ yếu được nhập từ Trung Quố h u Âu… n n rất dễ bị làm giả, sản phẩm nhập

về chất lượng không đ p ứng được chất lượng Vì vậy, bên cạnh việc kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm chứ năng thì việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào là rất quan tr ng

Trướ tình tình đó việc chủ động giám sát, phân tích kiểm nghiệm v đ nh gi chất lượng các loại TPCN có nguồn gốc từ cây Kế sữa là hết sức cần thiết, nhằm cung cấp các thông tin hữu í h ho ơ qu n quản lý đồng thời n ng o năng lực của hệ thống kiểm nghiệm an toàn thực phẩm nói chung, góp phần đảm bảo chất lượng vệ

sinh an toàn thực phẩm đảm bảo sức khỏe và quyền lợi củ người tiêu dùng Do đó

húng tôi đã lựa ch n và thực hiện đề tài Định ng t s hoạt ch t nh

si y arin trong th c ph ch c năng ằng ph ng ph p sắc k ng hiệu năng cao (HPLC)”

 Mục tiêu của luận văn:

- Xây dựng qu trình x định h m lượng một số hoạt chất nhóm Silymarin trong thực phẩm chứ năng bằng phương ph p sắc sắc ký lỏng hiệu năng o (HPLC)

- Áp dụng qu trình đã x dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa Silymarin

 N i dung của luận văn:

1 Nghiên cứu khảo s t điều kiện điều kiện tối ưu nhằm phân tích các hoạt chất nhóm Silymarin bằng phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng o (HPLC)

2 Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu để chiết tách các hoạt chất nhóm Silymarin trong mẫu nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm chứ năng

3 Thẩm định phương pháp theo các tiêu chí của Hiệp hội các nhà hóa h c phân tích (AOAC)

4 Áp dụng quy trình xây dựng được nhằm ph n tí h h m lượng Silymarin trong một số nguyên liệu và sản phẩm TPCN có chứ h m lượng Silymarin trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về họ Cúc (Asteraceae) [2]

H Cúc (Asteraceae hay Compositae) là một trong những h lớn nhất của ngành thực vật hạt ín M glinoliph t (Arigiosperm e) Đ l một h quan tr ng của hệ thực vật trên thế giới ũng như ủa hệ thực vật Việt Nam H Cúc có khoảng 1.550 chi với 23.000 lo i Chúng sinh trưởng và phát triển ở nhiều nơi trong môi trường khác nhau, là h thực vật có vị trí tiến hóa cao nhất do đó rất đ dạng và phức tạp Trong h Cúc, phần lớn là dạng cây thân thảo hoặ l u năm í h thước nhỏ, bé nhất chỉ cao 4-8 m đến một nửa cây bụi; cây bụi thường gặp ở nhiều loài còn cây gỗ lớn rất ít Một số lo i leo trườn, một số loài là cây thủy sinh

Ở Việt Nam, h Cúc có 126 chi, 374 loài phân bố ở khắp đất nước, từ vùng núi cao, trung du tới đồng bằng, ven biển v đảo C thường sống trong rừng, ven rừng, trảng cỏ v h núi n đường đồng ruộng đất ẩm ướt hoặc khô hạn, bãi cát hoặ đất hu phèn Điều này phản nh đúng tính hất là h Cúc có sự phân bố tập trung và tiêu biểu của vùng khí hậu nhiệt đới v ôn đới

Các chi thuộc h Cúc có nhiều loài nhất ở nước ta là: Ainsliaea (5 loài), Artemisia (7 loài), Blumea (29 loài), Crepis (6 loài), Eupatorium (8 loài), Gynura (11 loài), Lactuca (10 loài), Seneco (8 loài), Veronia (17 loài)

Với v i tr qu n tr ng trong nền kinh tế quốc dân, h Cú được biết đến với gi trị sử dụng cao Nhiều lo i được sử dụng làm thuốc chữa bệnh như Thanh cao

(Artemisia carvifolia Wall.), Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua Linn.), Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Cú ho v ng (Chrysanthemumindicum L.) Cú tần (Pluchea

indica Less.), Cứt lợn (Ageratum conyzyoides L.), Atiso (Cynara scolymus L.), Hy

thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) ồ ông nh (Lactuca indica L.), v.v

Ngoài ra, các cây thuộc h Cú đặ iệt l hi Chrysanthemum do ó ho đẹp

n n n được dùng làm cảnh dùng l m r u ăn hoặ tạo hế phẩm đồ uống hè túi

l c, viên hoàn

1.2 Cây Kế sữa (Silybum marianum)

1.2.1 Đặc điểm th c vật học

Tên khoa h c: Silybum marianum L Gaertn.

T n đồng ngh : Carduus marianus L

Tên Việt Nam: Kế sữ Kế th nh Kế Đứ mẹ Cú g i

T n tiếng Anh: Milk Thistle

Hình 1.1: M t s n ảnh cây K s (Silybum marianum L Gaertn.)

(a) y (b) Hoa (c) Lá khô (d) Hạt

Mô tả thực vật:

Cây thảo h i năm o 30-150 cm, có thân thẳng và phân nhánh, có rễ trụ, to, dài

và dày Lá xanh, không có lá kèm, bóng loáng, thường có nhiều đốm trắng d c theo

g n mép ó răng dạng gai mà gai lại có màu vàng và rất nh n; các lá phía trên và

ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dưới rất to, có phiến chia thuỳ và có cuống Cụm ho đầu đơn độc rộng 3-8 cm Lá bắc ngoài và giữa có 1 phần phụ hình tam giác mà lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai nhỏ ngắn hơn ở mỗi n Ho tí hơi giống nhau, đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhuỵ phình ra ở gốc Quả bế

m u đen óng ó viền vàng nhiều hay ít [3]

Sinh thái:

Cây Kế sữa có thể được trồng bằng cách gieo hạt trực tiếp xuống đất Môi trường sinh trưởng của cây kế sữa là ở những vùng khô ráo, nhiều ánh nắng mặt trời Cây Kế sữa phát triển vào mù đông h ng năm hoặ h i năm một lần tùy thuộc vào khí hậu Quá trình nảy mầm xảy ra vào mùa thu và mùa xuân Các nghiên cứu đã hỉ ra rằng hạt giống cây Kế sữanảy mầm là bị ảnh hưởng bởi nh s ng v điều kiện nhiệt độ Hạt cây Kế sữ tươi ần bất động một khoảng thời gian sau khi chínvà nảy mầm tốt hơn ở nhiệt độ thấpso với nhiệt độ cao Những hạt giống có thể duy trì khả năng nảy mầm trong 9 năm Theo nghiên cứu của Mel'nikova (1983) báo cáo rằng nhiệt độ nảy mầm

liên tục cho S marianum là 10- 35°C và nảy mầm tối ưu xảy ra ở 20-25°C [33]

Sau khi hình thành cây giống, cây Kế sữa phát triển tăng mạnh số lượng l ơ bản vào cuối mù đông đầu màu xuân Nó bắt đầu gi i đoạn ra hoa khi có nhiệt độ lạnh kích thích, hoa sẽ nở vào khoảng th ng tư – th ng năm C hạt sẽ chín vào tháng bảy Các giai đoạn phát triển của cây Kế sữa khoảng 125-140 ngày Các hoạt chất tích

lũ trong hạt phụ thuộc vào sự phát triển củ ho v đạt tối đ ở cuối gi i đoạn ra hoa Nhựa của cây kế sữ tí h lũ rất nhiều các hợp chất nitrat, có thể gây ngộ độc cho gia súc khi ăn phải đặc biệt là khi cây bắt đầu héo tàn [36]

Phân b :

Cây kế sữa vốn m c hoang dã ở vùng Ðịa Trung Hải Kể từ khi y h c phát hiện

ra các hoạt chất silymarin trong cây Kế sữa có tác dụng chữa bệnh thì loại n đã được trồng khắp nơi tr n thế giới, ví dụ như ắc Mỹ, Iran, Châu Âu, Australia và New

Ze l nd … l những nơi trồng nhiều cây Kế sữa [8]

Cây Kế sữa là một cây thuốc có giá trị o để điều trị các bệnh hiểm nghèo về gan thận, hiện đ ng được nghiên cứu phát triển ở nước ta Hiện nay, loài c đã được

du nhập vào trồng ở Việt Nam và phát triển tốt tại vùng o ó đất tốt, khí hậu mát

mẻ như T m Đảo, Sapa,

1.2.2 C ng ụng của c y ế sữa

Trà làm từ cây Kế sữ đã được sử dụng cho việ điều trị các bệnh về gan trong thời cổ đại Các tài liệu cổ xư hỉ ra rằng cây Kế sữ được sử dụng trong các khu vực Địa Trung Hải khoảng 2000 năm trướ đ C thầy thuố người Hy Lạp cổ đại và người La Mã là những người đầu tiên sử dụng và nghiên cứu về cây Kế sữ Khi đó

hạt giống của cây Kế sữ đã được sử dụng để bảo vệ g n Nó đã trở thành một loại thuố đượ hu n dùng để điều trị các bệnh gan mật vào thế kỷ 16 v v o năm 1960

ở trung tâm châu Âu Thế kỷ 19 s E le ti (Mỹ) đã sử dụng cây Kế sữa cho giãn

t nh mạch và các rối loạn về gan, lá lách và thận [52]

Cây Kế sữa có vị đắng, tính hàn Toàn cây có tác dụng hạ nhiệt, cầm máu, trừ lỵ, quả l m tăng hu ết áp, làm giảm ơn đ u su ễn v ho đ u g n

Trong y h c cổ truyền, cây Kế sữa dùng chữ thũng ngứa và mụn nh t sưng đ u quả dùng trị viêm gan và lá lách, sỏi mật ho ng đản ho l u năm Ở Trung Quố người

ta dùng hạt trị tạng n trúng độc, viêm gan cấp và mạn tính xơ g n [3]

Hiện nay, có có rất nhiều nghiên cứu cho thấy cây Kế sữa an toàn và có nhiều lợi ích tốt sức khỏe của gan trong các bệnh như xơ g n vi m g n do rượu, gan nhiễm mỡ, nhiễm độc gan, và viêm gan do virus Các nghiên cứu sơ ộ ở động vật cho thấy, cây

Kế sữa có thể giúp bảo vệ gan khỏi bị thương ởi một loạt độc tố và làm giảm độc tính của chúng Trong các thí nghiệm gần đ tr n tế bào gan củ người, các nhà nghiên cứu thấy rằng nồng độ tương đối nhỏ các hoạt chất từ cây Kế sữa làm chậm

đ ng ể hoạt động của enzyme CYP3A4 từ 50% đến 100% [7]

1.3 Các hoạt chất nhóm Silymarin từ cây Kế sữa

1.3.1 C u trúc và tính ch t của m t s hoạt ch t nhóm silymarin

Silymarin lần đầu ti n được phân lập từ hạt cây Kế sữa bởi Wagner và cộng sự

Đ là một hỗn hợp của các chất flavonolignan [49]

Thành phần hạt cây Kế sữa có chứa 1,5-3% Silymarin; 20-30% dầu thực vật, trong đó hoảng 60% là axit linoleic, khoảng 30% là axit oleic, và khoảng 9% là acid palmitic; 25-30% chất đạm; 0,038% tocopherol; 0,63% sterol, bao gồm cholesterol, campesterol, stigmasterol, sitosterol và một số loại gum

Các hợp chất có hoạt tính sinh h c trong nhóm Silymarin là Silybin, Silychristin, Silydianin, Isosilybin và Taxifolin [8] Ngoài các chất trên, trong hạt Kế sữa còn phát hiện một số chất khác với h m lượng rất nhỏ: Dehydrosilybin, Desoxysilychristin, Desoxysilydianin, Silandrin, Silybinome, Silyhermin và Neosilymermin Hình dạng, màu sắ v í h thước của hạt Kế sữ được mô tả trong hình 1.2

Hình 1.2: Hạt cây K s a

Các thành phần chính của Silymarin là Silybinin (Silybin A và Silybin B), Isosilybinin (Isosilybin A và Isosilybin B), Silydianin, Silychristin and Taxifolin [11,22] Trong số đồng phân, Silybin là thành phần chính và chiếm khoảng 60%, tiếp theo là Silychristin (20%), Silydianin (10%) và Isosilybin (5%), Taxifolin (5%) [39]

Tên IUPAC của các chất Silymarin:

+ Silibinin (còn g i là Silybin):

Công thức phân tử chung của các hợp chất này là C25H22O10, khối lƣợng phân tử

M = 482 g/mol Chúng l đồng ph n đối quang dạng trans

Về ơ ản, cấu trúc flavonolignan của Silymarin bao gồm các dihydroflavanol taxifolin liên kết với coniferyl alcohol qua một vòng epoxid Chính nhóm epoxid này được cho là tạora các tác dụng sinh h c của Silymarin nên khi chúng bị mở vòng sẽ làm mất hoạt tính Các nhóm chức 1,4-dioxane chỉ có trong cấu trúc của Silybin và Isosilybin Trong các chất Silymarin thì Sil in được coi là thành phần lớn nhất và có hoạt tính mạnh nhất [41] Do đó, nó đã được nhiều nhà khoa h c trên thế giới nghiên cứu Cấu trúc hóa h c củ Sil in đã đượ x định v o năm 1975 C thử nghiệm

n đầu để tổng hợp Sil in đã tạo ra sản phẩm hỗn hợp Silybin và Isosilybin với tỉ lệ 57:43 Các quá trình tổng hợp ch n l c tiếp theo đã tăng tỉ lệ Silybin lên 63% nhờ kết hợp với 2,4,6-trimethoxyacetophenone tạo thành một dạng chalcone trung gian [24] Công thức cấu tạo của một số hợp chất nhóm Silymarin trong hình 1.3 dưới đ

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Silymarin

Theo qu định của Dượ điển Mỹ (USP 38) [45], hạt Kế sữa và bột khô Kế sữa phải chứ hông ít hơn 2 0% Sil m rin (tính theo Sil in) tính theo hối lượng khô Đối với dạng nguyên liệu cao khô Kế sữ được chiết từ hạt cây Kế sữa với dung môi thích hợp và loại bỏ các chất béo Dạng cao khô này phải đạt chất lượng là không thấp hơn 90% v hông lớn hơn 110% lượng Silymarin công bố trên nhãn (tính theo Sil in) trong đó hông thấp hơn 20 0% v hông lớn hơn 45 0% tổng Silychristin và Silydianin, không thấp hơn 40 0% v hông lớn hơn 65 0% Sil in hông thấp hơn 10,0% và không lớn hơn 20% Isosil in

Tại Việt Nam, hiện n hư ó t i liệu chính thứ n o đư r u ầu về chất lượng của hạt Kế sữa và các sản phẩm có nguồn gốc từ Kế sữa Phần lớn các sản phẩm thực phẩm chứ năng được các nhà sản xuất tự đăng ý về công bố chất lượng Tuy nhiên, với sự đ dạng về nguồn cung cấp nguyên liệu sản xuất ũng như phương ph p phân tích chất lượng nên có thể tạo ra những kết quả kiểm nghiệm không thống nhất

Do đó thông qu nghi n ứu n húng tôi ũng đề xuất phương ph p iểm nghiệm thực phẩm chứ năng ó nguồn gốc kế sữa thống nhất, có thể áp dụng tại các phòng thí nghiệm trên cả nước

Độ tan củ Sil m rin trong nước thấp (0,04 mg/ml), ít hòa tan trong các dung môi không phân cực (như chloroform, ether dầu hỏa) nhưng h t n trong dung môi phân cực (như EtOH MeOH Acetone, DMF, THF) [8] Silymarin không

có tính chất ư dầu mặ dù độ t n trong nước của nó thấp.Silymarin hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại - khả kiến(UV-VIS) Cự đại hấp thụ tại ước sóng 288nm [22] Tính chất vật lý của một số hợp chất chính nhóm Silymarin được trình bày trong bảng 1.1 [19]

Bảng 1.1: Tính chất vật lý của m t s hợp chất chính nhóm Silymarin

H p ch t Điểm nóng chảy

(Mp, o C)

Đ quay c c ([] D )

1.3.2 Hoạt tính sinh họcvà c đ ng học của các hoạt ch t nhóm Silymarin

a Hoạt tính sinh học:

Có rất nhiều nghiên cứu đ nh gi hiệu quả của Silymarin/Sily inin để điều trị một loạt các bệnh về gan, túi mật và rối loạn đường ruột Tác dụng của Silymarin rộng rãi và phổ biến nhất là các hoạt động bảo vệ gan chống lại bệnh viêm gan cấp tính và mãn tính xơ g n v độc tố gây ra bệnh viêm gan[7] Sil m rin đã đượ o o để bảo

vệ tế bào gan khi tiếp xúc một số loại độc tố, bao gồm acetaminophen, ethanol, asen, tetrachloride carbon [47] Sil m rin ũng đã được tìm thấ để bảo vệ tế bào gan khỏi

bị tổn thương thiếu máu cục bộ, bức xạ, ngộ độc sắt và viêm gan siêu vi [44]

Hoạt tính ch ng oxy hóa [52]

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh h c, các nhà khoa h đã thông o vềhoạt tính

chống oxy hóa in vitro của Silymarin đó l phản ứng với gốc tự do như nion

hydroxyl, các gốc phenoxy và axit hypochlorous trong các hệ thống mô hình khác

nh u như tiểu cầu củ on người, các nguyên bào sợi củ on người, vi thể gan chuột Quá trình tạo ra các gố nion superoxide v oxit nitri đã ị ức chế s u hi điều trị các tế bào Kupffer bị chuột rút bị cô lập với silybin (IC50 80 mmol/l) Cả Silymarin và Sil in đều ức chế quá trình peroxid hóa các lipid do các gốc tự do gây ra trong ti thể của tế bào hồng cầu do đó ổn định cấu trúc của màng tế bào Sự ức chế chu trình AMP phụ thuộc phosphodiesterase gây ra bởi Silybin, Silydianin và Sil hristin đã

được chứng minh trong phép thửin vitro Vì chu trình AMP được biết là ổn định màng

lysosomal nên khi tăng nồng độ của nucleoside này sẽ có thể l m tăng tính ổn định của màng tế bào Sil in ũng ức chế sự tổng hợp phospholipid và sự phân hủy trong màng gan chuột

Hoạt tính bảo vệ gan [52]

Silymarin có tác dụng ức chế độc tính gan gây ra bởi paracetamol (acetaminophen), amitriptyline, carbon tetrachloride, ethanol, erythromycin estolate, galactosamine, nortriptyline và hydroperoxide tert-butyl trong tế bào lympho chuột trong ống nghiệm Silybin làm giảm tổn thương thiếu máu cục bộ đến tế bào gan non

v tăng hứ năng s u nhồi máu ở gan lợn Độc tính của ancolallylic, quá trình peroxide hóa lipid và sự suy giảm glut thione đã được ức chế s u hi điều trị các tế bào gan chuột với Silymarin và Silybin ở các nồng độ tương ứng là 0,1 và 1,0 mmol/l

Silybin kích thích sinh tổng hợp vi tế bào in vitro v trong ơ thể, l m tăng tỷ lệ

tổng hợp ARN ribosome 20% ở gan chuột, thông qua sự hoạt hóa của RNA polymerase I phụ thuộc DNA Silybin không ảnh hưởng đến phiên mã của RNA polymerase II hoặc III Sự gi tăng sự tổng hợp ARN ribosome trong gan kích thích sự hình th nh ri osome trưởng thành, và quá trình sinh tổng hợp protein Hơn nữa, sự tổng hợp DNA tăng l n đã được quan sát thấy ở gan từ những con chuột bị cắt gan đượ điều trị với Silybin (27mg/kg thể tr ng)

Thử nghiệm Silymarin (15-800mg/kg thể tr ng) trên chó, chuộtcho thấy hiệu quả ngăn ngừa các tổn thương g n do carbon tetrachloride (CCl4) gây ra Ảnh hưởng của silymarin là do hoạt động chống oxy hoá của nó, sự giảm hoạt hóa chuyển hóa của carbon tetrachloride, và sự ổn định của màng tế bào gan Dùng Silymarin trong mật (50mg/kg thể tr ng) cải thiện sự tr o đổi chất và sự phân bố mô của aspirin ở chuột với độc tính gan do tetrachloride carbon[47] Việc tiêm Silymarin hoặc Silybin trong màng bụng cho thấy hiệu quả ức chế rõ ràng sự tổn hại gan do paracetamol

(acetaminophen), các chất độc Amanita phalloides (ví dụ như ph lloidin v

m nitin) eth nol g l tos mine h loth ne h dro r on thơm đ v ng im loại đất hiếm (ví dụ: cerium, praseodymium và lanthanum ) và tali trong các mô hình gặm nhấm h nh u Hơn nữ ti m t nh mạch muối natri sulbin hemisuccinate (50 mg/kg thể tr ng) ho hó đượ ngăn ngừa sự gi tăng nồng độ các men gan trong máu và giảm các yếu tố đông m u Sự hấp thu của [3H] dimethyl phalloidin trong tế bào gan chuột đã đượ ngăn hặn bởi 79% trong các tế o đượ điều trị với silic este (100 μg/ml)

Dùng silymarin (50mg/kg thể tr ng) cho chuột nhắt đã ức chế sự tích tụ collagen trong xơ mật sớm v xơ mật trung gian sớm hơn do l m tắc ống mật hoàn toàn do natri amidotrizoate gây ra Sil m rin l m tăng trạng thái và tổng lượng glutathione trong gan, ruột và dạ dày của chuột sau khi cho vào trong ổ bụng (200mg/kg thể tr ng) Trong một cuộc thử nghiệm cấy ghép, gan lợn được phát hiện đã ị thiếu máu lạnh do lưu trữ gan ở nhiệt độ 4oC trong 24 giờ s u đó l sự tái tổ chứ ngo i ơ thể trong 4 giờ Ti m t nh mạ h 500 mg sil in este trước khi lấ đi g n tiếp theo là 400 mg/l trong suốt quá trình bảo quản lạnh và 100mg/h trong khi truyền máu, làm giảm các tổn thương mô h đến các tế o g n (đo ằng sản xuất mật) và cải thiện chức năng g n trong qu trình t i 24-66% (đượ đo ằng bài tiết acid mật)

Hoạt tính ch ng viêm và ch ng dị ứng [52]

Silybin ức chế sự phóng thích histamin trung gian gây ra bởi peptit f-met và chống IgE từ bạch cầu lympho bào ở người Tác dụng ức chế giảm đ ng ể (P <0,05) bằng cách nâng nồng độ canxi ngoại bào Tuy nhiên, không thấy hiệu quả khi phóng thích histamin gây ra bởi ionophan A23187 Silymarin ức chế sự phóng thích histamine trung gian làm trung gian kích hoạt bởi N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine từ các tế bào màng trong phúc mạc ở chuột với nồng độ 25 μg/ml Silybin ức chế sự tổng hợp của leukotriene B4 (IC50 15 mmol/l) ở các tế bào Kupffer ở chuột nhưng hông ảnh hưởng đến sự hình thành prostaglandin E2 ở nồng độ l n đến

100 μmol/l Silymarin, Silybin, Silydianin và Silychristin hoạt tính in vitroức chế các enzym lipoxygenase và prostetaglandin synthetase Hoạt tính kháng viêm in vitrocủa

sil in ũng đượ đ nh gi trong ạch cầu đ nh n Tuy nhiên, hợp chất n đã ức chế

sự phát quang hóa h tăng ường luminol, cho thấ ơ hế hoạt tính chống viêm liên

qu n đến việc ức chế sự hình thành hydrogen peroxide dùng Silymarin trong ruột làm giảm phù chân (ED50 62,42 mg/kg thể tr ng) Việc sử dụng Silymarin tại chỗ đã ức chế viêm tai do xylen gây ra ở chuột, và hoạt tính củ nó tương tự như indomet in (25 mg/kg thể tr ng) Ngoài ra, Silymarin ức chế sự tích tụ bạch cầu trong các chất dịch viêm sau khi dùng cho chuột

b.Dược đ ng học [51]

Trong một nghiên cứu cắt ngang một cách ngẫu nhiên, không có kiểm soát, với các liều duy nhất là 102, 153, 203 hoặc 254 mg Sil in dùng đường uống với các nam

giới khỏe mạnh Silybin và nồng độ Isosilybin trong huyết tương đượ đo dưới dạng các hợp chất không liên kết ũng như đồng phân tổng số sau khi thủy phân bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng o C vùng dưới đường cong tuyến tính với liều, và chỉ có 10% tổng số Silybin trong huyết tương l ở dạng liên hợp Thời gian bán thải của thuốc không liên hợp ít hơn 1 giờ; tổng số Sil in ước tính là 6 giờ Khoảng 5% liều được bài tiết v o nước tiểu dưới dạng tổng số Silybin

Sau khi uống một liều duy nhất 560 mg Sil m rin (tương đương với 240 mg silybin) cho sáu tình nguyện viên khỏe mạnh, nồng độ silybin trong huyết thanh thấp nhất d o động từ 0 18 đến 0 62 μg/ml Chỉ 1-2% liều được bài tiết trong nước tiểu trong 24 giờ sau khi uống Sau khi uống một liều duy nhất 140 mg Sil m rin (tương đương với 60mg Silybin) cho 14 bệnh nh n đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ túi mật, mật lấy từ ống dẫn ống T chứa 11-47 μg/ml Sil in tương đương 7-15% liều, sau 24 giờ Sau khi dùng liều duy nhất một chế phẩm chuẩn Silymarin chuẩn (140 mg) cho chín bệnh nh n đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ túi mật Sil hristin được bài tiết qua nước tiểu và mật Sự bài tiết Silybin và Silychristin ở nước tiểu l hông đ ng ể Cả hai Silybin và Sil hristin đều được bài tiết trong mật dưới dạng các hợp chất lưu huỳnh và glucuronide Tổng số loại bỏ Sil in đượ ước tính là 20-40% và Silychristin

là 4-10% Sự bài tiết Sil m rin trong nước tiểu xảy ra trong khoảng thời gian 24 giờ, với lượng bài tiết tối đ xảy ra trong khoảng từ 2 đến 9 giờ sau khi dùng [46]

Khả dụng sinh h c của Silym rin h nh u đ ng ể và phụ thuộc vào sự hình thành của sản phẩm

1.3.3 M t s th c ph m ch c năng ch a nhóm Silymarin trên thị tr ờng

Trên thị trường Việt N m đã xuất hiện rất nhiều loại thực phẩm chứ năng ó

nguồn gốc từ cây kế sữ Đ phần trong số này chứa kế sữ dưới dạng cao (extract) và

có các dạng bào chế khác nhau, chủ yếu là viên nang cứng (capsule), hoặc viên nang mềm (soft gel), ngoài ra còn có các dạng h như viên nén (tablet), dung dịch (solution),…

Các thực phẩm chứ năng hứa các hoạt chất từ Kế sữa rất đ dạng và phong phú Chúng có thể là dạng đơn th nh phần (chỉ chứa các thành phần của cây Kế sữa) hoặ được kết hợp với các loại dược liệu và hoạt chất khác trong các sản phẩm bổ gan Các loại thực phẩm chứ năng n ó thể được nhập ngoại hoặ được sản xuất trong

nướ H m lượng Silymarin nói riêng và cây Kế sữa nói chung rất khác nhau giữa các sản phẩm Sự đ dạng về các loại sản phẩm thực phẩm chứ năng hứa thành phần Kế

sữ được thể hiện trong hình 1.4

Dạng viên nang cứng (capsule) Dạng viên nang mềm (softgel)

Dạng viên nén (tablet) Dạng dung dịch (solution)

Dạng sản xuất trong nước Dạng sản xuất trong nước

Dạng viên nang cứng kết hợp với thảo dược khác

Dạng viên nang cứng kết hợp với hoạt chất tân dược

Hình 1.4: M t s loại thực phẩm chức năng c ứa thành phần cây K s a

1.3.4 M t s yếu t ảnh h ởng đến phân tích Silymarin trong TPCN

- Các nhà sản xuất thực phẩm chứ năng trong nước hiện vẫn hư hủ động được nguồn nguyên liệu sản xuất, chủ yếu vẫn phải nhập khẩu từ nước khác trên thế giới Chất lượng nguyên liệu phụ thuộc rất nhiều v o đơn vị cung cấp

- Nhiều nhà sản xuất hư đạt tiêu chuẩn GMP trong TPCN Do đó rất hó hăn trong kiểm so t v đảm bảo chất lượng sản phẩm

- Các chất nhóm Silym rin thường không bền, dễ bị phân hủ Do đó thời gian

v điều kiện sản xuất lưu thông v ảo quản ảnh hưởng rất lớn đến không chỉ nguyên liệu n đầu mà còn ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm

- Nền mẫu thực phẩm chứ năng rất phức tạp đặc biệt là dạng phối hợp với các thảo dược khác gây nhiều hó hăn trong qu trình ph n tí h

- C nướ ó qu định khác nhau về tiêu chuẩn chất lượng dạng nguyên liệu (thường là dạng cao chiết) và nhãn hiệu công bố Do đó, các sản phẩm nhập khẩu từ các quốc gia khác nhau khi phân tích sẽ cho các kết quả khác nhau

- Nướ t hư n h nh phương ph p ti u huẩn (Tiêu chuẩn Việt Nam hoặc chuyên luận trong Dượ điển Việt N m) để qu định chất lượng và phân tích các chất nhóm Silymarin trong thực phẩm chứ năng Trên thế giới đã ó nhiều nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật h nh u để ph n tí h h m lượng các hợp chất nhóm Silymarin.Vì vậy, việc xây dựng và chuẩn hó phương ph p x định h m lượng Silymarin trong TPCN là rất cần thiết nhằm phục vụ cho việc quản lý chất lượng sản phẩm ũng như bảo vệ quyền lợi cho người tiêu dùng

1.4 Một số phương pháp phân tích Silymarin

Dịch chiết thu được từ hạt kế sữ đã được sử dụng rộng rãi trên thị trường dược phẩm thế giới dưới các dạng thuốc chống các bệnh về gan với rất nhiều nhãn hiệu khác nhau Có một số sản phẩm chứa Silymarin có thể dưới dạng từng thành phần hoạt chất riêng lẻ hoặ dưới dạng hỗn hợp các chất H m lượng Silymarin có thể chứ đến 80%

phần chiết được từ Kế sữa (S marianum) Vì vậy, đã ó nhiều nghiên cứu trên thế giới

ph n tí h định tính v định lượng các thành phần các hoạt chất Silymarin, thông thường được biểu thị qua tổng h m lượng của Silybin, Isosilybin, Silychristin và Silydianin Một số phương ph p thường được sử dụng phân tích Silymarin là:

Phương ph p qu ng phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), phương ph p điện di mao quản (CE),phương ph p sắc ký lỏng –khối phổ (LC-MS),phương ph p sắc ký lớp mỏng (TLC và HPTLC) và phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng o (HPLC)

1.4.1 Ph ng ph p quang phổ h p thụ phân tử (UV-VIS)

Nhà nghiên cứu của Meghreji và cộng sự [29] đã sử dụng phương ph pqu ng phổ hấp thụ phân tử UV-VIS để ph n tí h h m lượng Silymarin trong các dạng tinh khiết và các dạng bào chế dược h Phương ph p n dựa trên khả năng h t n ủa Silymarin trong MeOH Chất ph n tí h đượ định lượng tại ước sóng 287nm Khoảng động h c củ phương ph p từ 6 0 đến 16 µg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,29 và 0,90 µg/ml Phổ hấp thụ UV-VIS của Silymarin tại các nồng độ trong khoảng động h được mô tả trong hình 1.5

Hình 1.5: Phổ hấp thụ UV-VIS của Silymarin

Tác giả Somia Gul và cộng sự [42] đã nghi n ứu và phát triển kỹ thuật UV-VIS

để x định Silymarin trong các sản phẩm nhiều thành phần thảo dượ như o hiết nước, dung dịch uống (siro), viên nang Mẫu phân tích dạng cao chiết được chiết bằng MeOH, dạng lỏng và dạng vi n được chiết bằng chloroform, cô cạn, hòa cặn trong meth nol v đượ định lượng tại ước sóng 287nm Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng củ phương ph p lần lượt là 0,015 và 0,06 mg/ml

H m lượng Silymarin trong Silybum marianum nuôi trồng trong các ô huyền phù

đã được Hasanloo và cộng sự [18] phân tích bằng phương ph p đo qu ng phổ hấp thụ phân tử và tính toán kết quả dựa trên E1%1cm = 537 Mẫu được chiết bằng methanol và

tạo dẫn xuất với 2,4-dinitriphenilhydrasine-sulfuri id v đượ đo tại ước sóng 490nm H m lượng Silymarin sẽ được tính theo công thức:

% silymarin = (A × 50 × 50 × 10 × 100) /(A1% 1 cm × 100 × M)

Trong đó: A: độ hấp thụ đo được, M: khối lượng mẫu

C phương ph p ph n tí h h m lượng Silymarin trong kế sữa sử dụng kỹ thuật quang phổ UV-VIS đều ó ưu điểm l đơn giản, nhanh chóng dễ thực hiện Tuy nhiên, nhượ điểm củ phương ph p n l độ lặp lại hư được tốt v hư định lượng được từng thành phần hoạt tính Hơn nữa, với các sản phẩm chứa nhiều dược liệu khác nhau

có thể mắc sai số hi đo UV-VIS vì có thể lẫn một số flavonoid khác

1.4.2 Ph ng ph p điện di mao quản (CE)

Nhóm nghiên cứu của Kvasnicka và cộng sự [22] đã tiến hành phân tích các hoạt chất silymarin bằng phương ph p điện di mao quản với phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng o Qu trình ph n tí h ằng CE được thực hiện trên cột polymer FEP và phát hiên tại ước sóng 254nm Kết quả xác nhận giá trị sử dụng củ phương ph p ho thấy giới hạn định lượng củ phương ph p l 0 5 µg/ml; hoảng tuyến tính củ phương pháp: 10-200 µg/ml; độ thu hồi trong khoảng 98 ± 3,0% So với kỹ thuật HPLC, các tác giả nhận thấy: thời gian phân tích của CE chỉ bằng một nửa so với HPLC CE cho khả năng t h Silychristin và Silydianin tốt hơn HPLC nhưng lại không thể tách các đồng phân của Isosilybin Kết quả triển khai áp dụng phân tích các mẫu thực tế cho thấ h m lượng Silymarin khi sử dụng kỹ thuật CE chỉ bằng từ 75% đến 95% khi sử dụng kỹ thuật HPLC Kết quả phân tích các hợp chất nhóm Silymarin bằng phương pháp CE được thể hiện trong hình 1.6

Hình 1.6: Điện di đồ t u được khi phân tích silymarin

Các nghiên cứu sử dụng phương ph p điện di mao quản cho thấy khả năng ph n tích nhanh, có thể phân tích từng thành phần của Silymarin Tuy nhiên kỹ thuật này

hư ho thấ độ ổn định cao, ảnh hưởng của nền mẫu t động lớn đến khả năng t h của các chất ph n tí h đỏi hỏi phải thử nghiệm nhiều ph động khác nhau và có quá trình xử lý mẫu tốt Do đó hiệu quả sử dụng của kỹ thuật CE cần phải cân nhắc và

đ nh gi th m

1.4.3 Ph ng ph p sắc ký l ng –kh i phổ (LC-MS)

Sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS) là một phương ph p phân tích hiện đại đ ng ph t triển rất nhanhtrên thế giới và tại Việt Nam để định lượng các chất phân tích với hàm lượng rất nhỏvới các nền mẫu phức tạp Đ l sự kết hợp giữa khả năng t h ủa phần sắc ký và khả năng x định chính xác số khối của các mảnh ion tạo ra từ chất phân tích

Trong một nghiên cứu năm 2009, Xiu Lan Cai và cộng sự [43] đã sử dụng cả kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng o v phương ph p sắc ký lỏng khối phổ để phân tích các

chất chiết được từ hạt Silybum marianum Cả hai phương ph p n đều sử dụng cột

sắ ý C18 (150mm x 4 6mm; 5µm) v ph động là gradient của MeOH và acid acetic

0 1%/nước cất với tố độ dòng là 1,0 ml/phút Kỹ thuật HPLC định lượng các hoạt chất tại ướ sóng 280nm C điều kiện của detector khối phổ (MS):

+ Chế độ ion hóa: ESI(-) với thế ion hóa mao quản là 4000 V;

+ Nhiệt độ và tố độ khí phun bổ trợ: 3500C và 10 L/phút;

+ Phổ khối đượ i đặt chế độ full-scan trong khoảng từ 105 m/z đến 800 m/z; + Taxifolin có 02 mảnh ion là [M-H]- (303 m/z) và [M-H+Na-H]- (325 m/z); + Các chất h đều có 02 mảnh ion là 481 m/z và 503 m/z

Kết quả thẩm định phương ph p ho thấ : độ thu hồi củ phương ph p hoảng từ 98% đến 102% độ lặp lại củ phương ph p với giá trị RSD từ 1 26% đến 1,96% Phương ph p n ho thấ độ tin cậ o nhưng thời gian phân tích lại quá dài (60 phút) so với một phương ph p LC-MS thông thường

Tác giả Lajos Nagy và cộng sự [23] đã nghi n ứu và phát triển phương ph p sắc

ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) để phân tích các thành phần hoạt tính

trong hạt cây kế sữa Mảnh ion n đầu (procusor ion) được tạo thành là [M-H]- là 481

m/z Một số mảnh ion con (product ion) tạo thành là 453, 301, 152 và 125 m/z Mảnh

ion 301 m/z có trong phổ MS/MS của Silybin, Isosilybin và Sil di nin nhưng hông

có trong phổ của Silychristin Một phát hiện quan tr ng khác là mảnh ion 419 m/z chỉ

có trong phổ MS/MS của Silychristin và mảnh ion 169 m/z chỉ có trong phổ của Silydianin Phổ MS/MS của Silybin và Isosilybin rất giống nh u nhưng mảnh ion 451 m/z và 355 m/z chỉ có trong phổ của Sil in nhưng hông ó trong phổ của Isosilybin Với những khác biệt trên thì có thể x định các chất phân tích tốt hơn

Tại Hoa Kỳ, Kevin Anthony và Mahmoud Saleh [20] đã sử dụng phương ph p sắc

ký lỏng-khối phổ để phân tích các thành phần có tác dụng chống oxy hóa trong các sản phẩm thực phẩm chứ năng hứa thành phần kế sữa Cột ph t nh sử dụng là loại cột

si u o p C18 (100mm x 4 6mm; 2 6 µm) giúp tăng hả năng t h hất, rút ngắn thời gian phân tích Nghiên cứu này sử dụng nguồn ion hóa ESI (+) với chế độ SIM để định lượng các chất: ion 327 m/z [M+Na]+ đối với Taxifolin và ion 505 m/z [M+Na]+đối với các chất còn lại Phương ph p p dụng ph n tí h được trên 40 mẫu thực phẩm chứ năng tr n thị trường với kết quả thu đượ : h m lượng Silymarin trong khoảng từ

57 8 mg/vi n đến 850 mg/vi n Điều này cho thấy ngay tại một nước phát triển thì hàm lượng chất phân tích trong các sản phẩm ũng đã h nh lệch nhau rất lớn Do đó ần có một phương ph p hính x tin ậ để có thể khảo s t đ nh gi hất lượng các sản phẩm thực phẩm chứ năng hứa thành phần kế sữa trên thị trường Việt Nam

Nói chung,việc sử dụng phương ph p sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích Silymarin thường ho độ hính x o v độ nhạy rất tốt Hơn nữa, việ x định chất phân tích dựa vào số khối củ ion thu đượ ho độ đặc hiệu rất cao Tuy nhi n đ l một phương ph p hiện đại, vận hành phức tạp n n đ i hỏi phải có sự đ o tạo hiệu quả và chi phí sử dụng rất lớn Do các chất Silymarin có cùng công thức cấu tạo n n phương ph p ph n tí h húng lại phụ thuộc nhiều vào quá trình tách sắc

ký, vì thế, thời gian phân tích rất khó rút ngắn.Bên cạnh đó,việc triển h i phương pháp LC-MS hó đạt hiệu quả cao vì phương ph p n hư được phổ biến nhiều tại các phòng thí nghiệm tại đị phương ở Việt Nam

1.4.4 Ph ng ph p sắc ký lớp m ng (TLC)

Theo nghiên cứu của Wagner và cộng sự (2009) [8] các chất nhóm Silymarin

đã được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là chloroform-acetone-acid formic (75:16,5:8,5, v/v/v) và phát hiện bằng thuốc thử

polyethylene glycol Quan sát tại ƣớc sóng 365nm, có 02 vết có huỳnh quang màu xanh của Silybin/Isosilybin (Rf = 0,6), Silychristin (Rf = 0,35) và có 01 vết màu vàng cam của Taxifolin (Rf = 0,4)

Tác giả Merle Zimmermann [6] thuộc Hiệp hội các sản phẩm thảo dƣợc Hoa Kỳ

(American herbal products association – AHPA) đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký lớp

mỏng hiệu năng o (HPTLC) để phân tích các hoạt chất trong hạt kế sữ Trong đó mẫu đƣợc nghiền nhỏ và chiết bằng meth nol s u đó hấm dịch chiết lên bản mỏng silica gel F254 Dung môi triển h i ũng giống nhƣ trong nghiên cứu của Wagner

C điều kiện khác là khoảng cách khai triển 70mm, kiểm so t độ ẩm 33%, sử dụng tấm bão hòa dung môi Kết quả thu đƣợc các giá trịRf ~ 0.20 là Silychristin, Rf ~ 0.29 Silydianin, Rf ~ 0.38 là Silybin RiêngTaxifolin cho hai vết chất tại Rf ~ 0.26 (màu cam) và tại Rf ~ 0.40 (màu xanh lá cây) Hình ảnh sắc ký đồ HPTLC khi phân tích các chất nhóm Silymarin trong hạt kế sữ đƣợc thể hiện trong hình 1.7

Hình 1.7: Sắc ký đồ HPTLCcủa các hoạt chất nhóm Silymarin

Hiện n phương ph p n đã đượ ph t triển th nh sắ ý lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC với việ ải thiện v n ng o hả năng định lượng Tu nhi n, trong

nghi n ứu về dị h hiết hạt Kế sữa(Silybum marianum) nói hung v hoạt hất

Silymarin nói riêng, phương ph p sắ ý lớp mỏng đượ sử dụng để định tính đ nh giá sơ ộ th nh phần ủ dị h hiết hạt ế sữ đồng thời s ng l n định lượng hoạt hất Silymarin

1.4.5 Ph ng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao (HPLC)

Đ l ỹ thuật phổ biến nhất hiện nay được áp dụng để phân tích các hoạt chất flavonolignan trong hạt Kế sữa Các nghiên cứu tiến hành chủ yếu bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) với 02 loại ph t nh l C18 và C8 Cột phân tích C18 cho khả năng t h tốt giữa Silybin và Isosil in nhưng hả năng t h giữa Silychristin và Sil di nin hông được tốt Khi tăng lượng nước trong thành phần ph động thì sẽ tăng khả năng t h giữ đồng phân quang h c của Silybin Cột ph t nh C8 ph n ực hơn ó hả năng t h tốt các hoạt chất nhóm Sil m rin nhưng lại không có khả năng

t h đồng phân quang h c

Trong nghiên cứu của Mohamed và cộng sự [32], kỹ thuật HPLC được áp dụng

để ph n tí h đồng thời Silymarin và Curcumin trong các dạng đóng gói h nh u Các chất ph n tí h được phân tách trên cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5,0 µm) và pha động là gradient của MeOH, ACN và dung dị h đệm KH2PO40,05M (pH = 2,3) Nghiên cứu này sử dụng dete tor DAD để định lượng các chất tại ước sóng 288nm Phương ph p ho độ chính xác cao với độ thu hồi khoảng từ 99% đến 102% v độ lặp

lại có giá trị RSD từ 0,22% (intra-day) đến 0,87% (inter-day) Giới hạn phát hiện và

giới hạn định lượng củ phương l 0 003 v 0 01 mg/ml Tu nhi n, phương ph p n mới chỉ tập trung nghiên cứu về hai đồng phân của Sil in m hư đề cập đến các hoạt chất Silymarin khác

Tác giả Yasin Ghafor và cộng sự [48] đã sử dụng cột sắc ký C18 (50 mm x 4,6

mm; 3 0µm) để phân tích thành phần hóa h c của cây Silybum marianum Các chất

ph n tí h được phân tách khi qua cột sắc ký với gr dient ph động của methanol và

id formi 0 1%/nước cất với tố độ dòng 1,0 ml/phút Dete tor UV được sử dụng để định lượng các hoạt chất Silymarin tại ước sóng 254nm Phương ph p này có thể

ph n tí h được 07 chất Silymarin là Silychristin A, Silychristin B, Silydianin, Silybin

A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B Tuy nhiên trên sắ đồ phân tích cho thấy các

pi tương ứng của các chất ph n tí h n hư t h r hết, chân pic bị doãng n n độ đặc hiệu hư o

H m lượng Silymarin trong hạt cây Kế sữa với gi i đoạn hín h nh u đã được Ahlam Elwekeel và cộng sự [9] nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng o ph đảo (RP-HPLC) Các tác giả đã sử dụng cột sắc ký ODS-3 (250mm x

4 6mm; 5 0µm) v ph động ở chế độ isocratic giữa acetonitril:acid phosphoric

0 5%/nước cất (3:7, v/v) với tố độ d ng 1 0 ml/phút để phân tích các chất Nghiên cứu n ũng sử dụng dete tor UV để định lượng các chất tại ước sóng 288nm Kết quả cho thấy với các hạt chín hoàn toàn (chuyển từ màu trắng kem sang màu nâu sẫm)

ho h m lượng Silymarin cao nhất: Silybin 311 mg/g; Isosilybin 107 mg/g; Silychristin 56,5 mg/g và Silydianin 207 mg/g Tuy nhiên một số nghiên cứu hiện nay cho thấ h m lượng Silymarin trong hạt kế sữa trong khoảng từ 1 5% đến 3,5% (với các hạt ó h m lượng từ 3-6% là loại chất lượng cao)

Tác giả E e Ç ğd ş cùng cộng sự [14] đã nghi n ứu x định h m lượng Silymarin và hoạt tính chống oxy hóa của phần chiết được của hạt kế sữ Ph t nh sắc

ý được sử dụng là C18 (125mm x 4,0mm; 5,0µm) Các chất ph n tí h được rửa giải

ra khỏi cột nhờ gr dient ph động giữ meth nol nước và acid o-phosphoric Một số điều kiện sắc ký khác: tố độ d ng 0 8 ml/phút ướ sóng định lượng là 288nm Điểm nổi bật củ phương ph p n l t giả chỉ sử dụng một đường chuẩn duy nhất của Sil in để tính to n h m lượng của các chất Silymarin h Điều này có thể dẫn tới hai vấn đề cần quan tâm, thứ nhất, cần phải x định chính xác các pic của các chất nhóm Silymarin; thứ hai, phải oi độ hấp thụ của các chất nhóm Sil m rin l tương đương nh u

Chuyên luận “Milk Thistle” trong Phần “Thực phẩm chứ năng” củaDượ điển Hoa Kỳ (USP) là một trong những tài liệu tham khảo có giá trị nhất sử dụng phương pháp HPLC để phân tích các hoạt chất trong hạt Kế sữa [45] Trong đó đã qu định phương ph p ph n tí h ho 04 dạng là hạt Kế sữa, cao chiết Kế sữa, viên nang chứa

Kế sữa và viên nén chứa Kế sữa C điều kiện sắc ký gồm có:

+ Ph t nh: ột C18 (150mm x 4,6mm; 5,0µm);

+ Ph động: gradient giữ meth nol nước cất và acid phosphoric;

+ Detector UV với ướ sóng định lượng là 288nm;

+ Nhiệt độ buồng cột: 400C, tố độ dòng 1,0 ml/phút

Phương ph p HPLC trong USP ũng hỉ sử dụng duy nhất một ngoại chuẩn là Sil in để xây dựng đường chuẩn định lượng tất cả các hoạt chất nhóm Silymarin Tuy nhi n để x định hính x pi tương ứng với các hoạt chất phương ph p n sử dụng dịch chiết từ cao Kế sữ đã được tiêu chuẩn hó v đư r mức thời gi n lưu tương đối của các chất ph n tí h để kiểm tra lại

Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật HPLC với detector UV-VIS cho thấy khả năng t h tốt các chất ph n tí h ho phép x định hính x h m lượng của từng thành phần hoạt chất Silymarin Hơn nữ phương ph p n ũng cho thấ độ nhạy tốt v độ chính xác cao Ngoài ra, dựa vào phổ UV của detector DAD có thể x định thêm đượ độ tinh khiết của các pic sắc ký, l m tăng độ đặc hiệu củ phương ph p

Hiện nay, kỹ thuật HPLC đã ó mặt ở hầu hết các phòng thí nghiệm trong cả nướ Do đó, việc chuyển giao công nghệ, triển khai áp dụng trong thực tiễn phương pháp phân tích bằng kỹ thuật HPLC sẽ thuận lợi và có tính khả thi cao Vì vậy, trong

đề tài này, chúng tôi lựa ch n phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng o HPLC để phân tích các hoạt chất Sil m rin trong đối tượng mẫu nghiên cứu

1.5 Một số kỹ thuật xử lý mẫu trong phân tích Silymarin

Trong phân tích thực phẩm nói chung và trong thực phẩm chứ năng nói ri ng quá trình xử lý mẫu đóng mộtvai trò rất quan tr ng, ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Đ l gi i đoạn tốn nhiều thời gian nhất trong qu trình ph n tí h Đặc biệt khi kết hợp với phương ph p ph n tí h hiện đại như HPLC thì mẫu phân tích phải được loại tạp, làm sạch thì kết quả phân tích mới cho hiệu quả mong muốn Với mỗi đối tượng phân tích cần có các quá trình xử lý mẫu phù hợp với từng nền mẫu đó

1.5.1 Kỹ thuật chiết hồi u (Ref ux)

Đ l một kỹ thuật truyền thống được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hóa thực vật với một số ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp Xiu Lan Cai và cộng

sự [42] đã sử dụng kỹ thuật này với dung môi chiết l nước Mẫu bột hạt Kế sữ được đun hồi lưu với nước tại nhiệt độ 1000

C trong bể chiết cách thủy với thời gian 10 phút

S u đó l m nguội, gạn tách riêng lấy dịch và tiến hành thêm nhiều lần lặp lại nữa (07

lần) Kết quả phân tích cho thấy hầu hết các hoạt chất nhóm Silymarin có tỉ lệ chiết được ở lần đầu tiên là thấp nhất, trừ Taxifolin Sil hristin v Sil di nin đạt tỉ lệ chiết được cao nhất ở lần thứ h i s u đó giảm dần ở các lần tiếp theo Silybin và Isosilybin

có hiệu quả chiết tăng dần đến lần thứ tư s u đó giảm dần ở lần chiết thứ sáu và thứ

bả Điều này cho thấ độ tan của Taxifolin trong nước nóng rất tốt Khi so sánh với cách chiết bằng dung môi hữu ơ ho thấy lựa ch n nước nóng là dung môi chiết Taxifolin thì tốt hơn Tu nhi n, với các chất nhóm Silymarin còn lại thì h m lượng khi chiết bằng nước nóng sau 07 lần chỉ bằng hơn 30% so với khi chiết bằng dung môi hữu ơ Kết quả ph n tí h h m lượng các chất nhóm Silymarin sau mỗi lần chiết hồi lưu được thể hiện trong hình 1.8

Hình 1.8: M i quan hệ tương đ i gi a diện tích pic của các chất phân tích với thời gian chi t

1.5.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet (Soxhlet extraction)

Kỹ thuật chiết Soxhlet lần đầu ti n được Franz Ritter von Soxhlet áp dụng để tách lipid từ sữ (1879) S u đó ỹ thuật chiết n được áp dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm để chiết xuất các hợp chất thiên nhiên Trong các nghiên cứu chiết xuất các chất Silymarin, chiết Soxhlet áp dụng cho phần lớn dạng mẫu là hạt Kế sữa và một số mẫu có chứa nhiều lipid

Thông thường quá trình chiết Soxhlet sẽ gồm 02 gi i đoạn Gi i đoạn đầu tiên mẫu hạt Kế sữ được chiết bằng ether dầu hỏa trong 04 giờ để loại éo S u đó phần

dung môi được loại bỏ, phần mẫu rắn đượ để khô rồi tiến hành chiết Soxhlet tiếp trong thời gian 05 giờ [9] Phương ph p hiết n ho h m lượng Sil m rin thu được cao, tuy nhiên, lại tốn nhiều thời gian và dung môi chiết

1.5.3 Kỹ thuật chiết kết h p vi sóng (MAE)

Chiết xuất l gi i đoạn đầu tiên của quá trình phân tách và tinh chế các hoạt chất trong các nền mẫu Theo nghiên cứu của Wang Xin và cộng sự [50], các chất

Sil m rin được chiết từ hạt Kế sữa sử dụng kỹ thuật chiết kết hợp vi sóng (Microwave

-Assisted Extraction - MAE) Mẫu ph n tí h được cho vào bình chiết, thêm dung môi

chiết với tỉ tệ rắn/lỏng nhất định s u đó đun nóng đến nhiệt độ i đặt Quá trình chiết tiếp tục với sự t động của vi sóng rồi được làm mát trong 10 phút Kết quả nghiên cứu cho thấy:các chất Silymarin có thể ổn định ở nhiệt độ 1300C nhưng với nhiệt độ

o hơn đến 1500C thì sẽ bị phân hủy một phần Trong một lần thử nghiệm, nếu có dưới 03 mẫu thì năng lượng vi sóng n n i đặt ở mứ 500W nhưng nếu có nhiều hơn

03 mẫu thì n n để ở mức 1000W Các thông số của quá trình chiết đã được tối ưu như sau: thời gian chiết 50 phút, nhiệt độ chiết 1300C, dung môi chiết xuất l eth nol:nước cất (85:15, v/v), tỉ lệ rắn:lỏng l 1:40 (g/ml) Phương ph p này đơn giản, hiệu quả và linh hoạt, phù hợp với nhiều nền mẫu So với một số kỹ thuật chiết kh như Soxhlet thì kỹ thuật MAE tốn ít thời gian và dung môi chiết hơn Tu nhi n,các thiết bị sử dụng trong chiết vi sóng có chi phí lớn hơn thiết bị chiết xuất khác và vận hành ũng phức tạp hơn Do đó hiện n phương ph p MAE hư được phổ biến tại nhiều phòng thí nghiệm

1.5.4 Kỹ thuật chiết kết h p siêu âm (UAE)

E e Ç ğd ş v ộng sự [14] tại trường Đại h c Ege (Thổ Nh Kỳ) đã sử dụng

kỹ thuật chiết kết hợp siêu âm (Ultrasonic-Assisted Extraction -UAE)để tách các thành

phần Silymarin từ hạt Kế sữa Trong nghiên cứu này, các tác giả đã tiến hành thử nghiệm với hạt Kế sữ đã được loại lipid Dung môi chiết xuất được lựa ch n là MeOH Thời gian chiết được thử nghiệm tại các mức 30, 60, 90, 120 và 150 phút Kỹ thuật UAE ó t động tạo vi khuấy, xâm thực tạo các khoảng trống để dung môi tăng ường tiếp xúc với nền mẫu Kết quả cho thấ h m lượng Silymarin có sự tăng nhẹ thu đượ hi tăng thời gian chiết (từ 0 77 đến 1,11g/100g hạt đã loại lipid) Tuy nhiên, khi so sánh với kỹ thuật chiết Soxhlet ( ũng sử dụng dung môi chiết là

MeOHtrong thời gian là 04 giờ) thì kỹ thuật UAE ho h m lượng Silymarin thấp hơn (chiết Soxhlet đạt đượ h m lượng 1,37 g/100g hạt kế sữ đã loại lipid) Điều này cho thấy cần phải nghiên cứu thêm về kỹ thuật UAE để áp dụng trong phân tích Silymarin trong hạt Kế sữa

Nhóm nghiên cứu của Saleh và cộng sự [40] đã tiến hành thử nghiệm và so sánh hiệu quả chiết Silymarin trong hạt Kế sữa bằng kỹ thuật UAE với một số kỹ thuật chiết truyền thống khác như chiết ngâm Với kỹ thuật UAE, mẫu được cho vào bình cầu 250ml, dung môi chiết là EtOH 80%, cho vào bể siêu cách thủ được duy trì nhiệt độ

ở mức 250C Kết quả cho thấy kỹ thuật UAE có một số ưu điểm như hiệu quả chiết cao, tiết kiệm được thời gi n v lượng dung môi chiết sử dụng

Trong một số nghiên cứu gần đ thực hiện trên các mẫu cao Kế sữ đã được chuẩn hóa, mẫu hạt Kế sữ đã loại lipid được xay thành bột mịn hay các sản phẩm thực phẩm thực phẩm chứ năng với các dạng bào chế khác nhau cho hiệu quả cao Với các dạng viên nén, mẫu được nghiền nhỏ và trộn đồng nhất Với các dạng mẫu viên nang, phần lõi được lấy riêng và trộn đồng nhất S u đó mẫu được cho vào ình định mức, thêm dung môi chiết là MeOH, tiến hành siêu âm cách thủy trong 15 phút s u đó được định mức và phân tích tiếp trên HPLC

Trong một nghiên cứu khác, các nhà khoa h c của Iran [39] đã thử nghiệm chiết các thành phần Silymarin trong hạt Kế sữa với sự trợ giúp của kỹ thuật UAE Hạt Kế

sữ được nghiền nhỏ v được cho vào bình cầu có chứa acetonitril Quá trình chiết được diễn ra trong bể siêu âm cách thủy trong thời gian là 30 phút Dịch chiết thu được

s u đó l c qua màng l c và phân tích trên hệ thống HPLC Phương ph p ho thấy sự đơn giản, thực hiện nhanh chóng và hiệu quả cao

1.5.5 M t s kỹ thuật chiết - l ng (liquid-liquid extraction)

Nghiên cứu của Meghreji và cộng sự [29] trên các dạng thuốc (viên nén và viên

n ng) đã thực hiện bằng cách lắc mẫu phân tích với dung môi chiết là chloroform Mỗi mẫu được chiết 03 lần, gộp dịch chiết, cô cạn bằng chân không và hòa cặn bằng MeOH, pha loãng và tiến h nh định lượng bằng phương ph p UV-VIS Nhượ điểm

củ phương ph p n l phụ thuộc nhiều vào thành phần t dược của các dạng thuốc Với t dược ít ảnh hưởng như tinh ột, tinh bột biến tính, bột talc,… thì phương

ho độ chính xác cao Tuy nhiên, với các mẫu có nhiều t dượ m ng m u như o thảo dược hay có nhiều lipid thì phương ph p sẽ kém hiệu quả

Một số mẫu ph n tí h dưới dạng lỏng chứa thành phần kế sữ như dịch chiết, dạng siro … đượ ph n tí h nh nh hóng đơn giản bằng cách chiết trực tiếp bằng dung môi hữu ơ ít ph n ực Mẫu được pha loãng bằng nước cất để làm giảm độ nhớt, cho vào phễu chiết và lắc với chloroform Quá trình chiết được lặp lại 03 lần Dịch chiết được l c qua natri phosphate, cô cạn và hòa cặn bằng MeOH Tuy nhiên khi áp dụng phương ph p n để phân tích các sản phẩm chứa nhiều thành phần từ thảo dược

có thể bị nhiễm các tạp như chlorophyll và nhóm m ng m u như rotenoid … h các các chất béo ảnh hưởng đến hiệu quả phân tích trên HPLC

Trong hạt Kế sữa, ngoài thành phần Silymarin còn có các thành phần h như các acid béo, carbohydrate, aminoacid và một số hợp chất phenolic khác Hơn nữa, đối với đối tượng mẫu là TPCN thì ngoài thành phần cao chiết Kế sữa hoặc nhóm chất Silymarin thì các thành phần khác (cao chiết dược liệu khác, phụ gi …) ũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất Do đó dựa trên các nghiên cứu ở trên, chúng tôi sẽ lựa

ch n, tiến hành thử nghiệm v đ nh gi các quy trình xử lý phù hợp với từng nền mẫu

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương ph p x định hàm lượng của Silymarin trong đối tượng mẫu phân tích:

- Mẫu nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chứ năng: cao khôKế sữa

- Mẫu thành phẩm: sản phẩm TPCN dạng viên nang cứng và viên nang mềm có chứa thành phần Kế sữa được sản xuất trong khoảng thời gian từ th ng 6 năm 2016 đến th ng 6 năm 2017 v hạn sử dụng trong khoảng thời gian từ th ng 6 năm 2018 đến

th ng 6 năm 2019

Các mẫu ph n tí h được lấy ngẫu nhiên tại các nhà thuốc trên thị trường Hà Nội

và một số mẫu nguyên liệu Kế sữ được lấy tại các công ty nhập khẩu, một số nhà máy sản xuất TPCN

Các mẫu lấy về được mã hóa để đảm bảo tính khách quan: viên nang cứng (NCxx), viên nang mềm (NMxx), viên nén (VNxx), nguyên liệu (NLxx) trong đó xx

là số thứ tự của mẫu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo s t c c điều kiện phân tích Silymarin bằng HPLC

Do Silymarin là hỗn hợp nhiều thành phần nêntrong nghiên cứu này khi xây dựng quy trình phân tích Sil m rin húng tôi đặt mục tiêu cần khảo s t điều kiện

sắ ý ho phép t h ri ng đồng phân của Silymarin nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tế của quy trình

- Ph t nh: húng tôi h n là cột C18 Symmetry Waters (150mm x 4,6mm; 5µm)

- Ph động: khảo sát chế độ gradient nồng độ bằng việ th đổi thành phần (%) + Kênh A: thử nghiệm dung dịch acid acetic 0,1% và acid phosphoric 0,1% + Kênh B: tiến hành thử nghiệm 03 loại: MeOH, ACN và hỗn hợp MeOH:ACN (1:1,v/v)

- Dung dịch chuẩn: sử dụng chuẩn hỗn hợp các chất Silymarin

2.2.2 Khảo s t c c điều kiện xử lý mẫu

Dựa vào khả năng h t n ủa Silymarin và tham khảo nhiều bài báo, nghiên cứu [19, 27, 32, 33, 40] chúng tôi khảo sát khả năng hiết Silymarin từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau:MeOH, EtOH và acetone Quá trình chiết sử dụng kỹ thuật siêu

âm cách thủ để đảm bảo thu được tối đ dạng tồn tại của chất phân tích

* Quy trình chiết Sil m rin ho đối tượng phân tích là TPCN dạng bột (nang cứng,

vi n nén …) v cao khô nguyên liệu Kế sữa với ướ như s u:

- X định khối lượng trung bình viên, nghiền nhỏ đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu s u hi đồng nhất (cân khoảng 0,1-1g, tùy thuộc

lượng Silymarin công bố) vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 25 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

- Lắ xo Vortex 1 phút s u đó lắc siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm, gạn tách riêng lấy phần dịch phía trên, phần cặn chiết lặp lại lần 2 với

15 ml dung môi chiết

- Gộp dịch l định mức 50 mL và l c qua màng l c 0,45 µm

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

* Quy trình chiết Silymarin áp dụng ho đối tượng phân tích là TPCN dạng viên nang mềm, và cao lỏng nguyên liệu Kế sữ Điểm khác biệt trong đối tượng mẫu này

là có chứa nhiều lipid, ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả phân tích nên cần ó gi i đoạn làm sạch mẫu Chúng tôi tiến hành 03 thí nghiệm sau:

- X định khối lượng trung bình viên, nghiền nhỏ đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu s u hi đồng nhất (cân khoảng 0,1-1g, tùy

thuộ lượng Silymarin công bố) vào ống ly tâm 50 mL

- Gi i đoạn loại lipid thử nghiệm theo 03 cách sau:

+ Loại lipid sử dụng dung môi hexan bằng kỹ thuật siêu âm cách thủy Phần dung môi s u đó được loại bỏ, phận cặn để khô và chiết như mẫu dạng bột

+ Loại lipid sử dụng dung môi hexan bằng kỹ thuật đun hồi lưu Phần dung môi s u đó được loại bỏ, phận cặn để khô và chiết như mẫu dạng bột

+ Mẫu được chiết nóng với EtOH 80% s u đó để nguội chiết loại béo bằng ete dầu hỏa (petroleum ether) Phần dịch phía trên loại bỏ, phần dị h phí dưới được định mứ v đem ph n tí h tr n HPLC