Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong bacillus subtilis

TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong Bacillus subtilis NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh từ Bacill

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THANH LƯU

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BIẾN TÍNH

TINH BỘT GẠO CỦA ENZYME PHÂN NHÁNH

TÁI TỔ HỢP TRONG Bacillus subtilis

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã chuyên ngành: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học 1: TS Đoàn Thị Ngọc Thanh

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 16 tháng 01 năm 2021

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch Hội đồng

2 TS Phan Thế Đồng - Phản biện 1

3 PGS.TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt - Phản biện 2

4 TS Nguyễn Đức Vượng - Ủy viên

5 TS Lê Hương Thuỷ - Thư ký

SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN THANH LƯU MSHV: 17000611

Ngày, tháng, năm sinh: 13/10/1987 Nơi sinh: Tiền Giang

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: M540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong

Bacillus subtilis

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh từ Bacillus subtilis tái tổ hợp;

Khảo sát hoạt tính biến tính bột gạo bằng enzyme phân nhánh dưới ảnh hưởng của

pH, nhiệt độ, nồng độ bột gạo, nồng độ enzyme, thời gian thủy phân

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo QĐ số 1883/QĐ-ĐHCN ngày 16/10/2019 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 16/11/2020

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Người hướng dẫn 1: TS Đoàn Thị Ngọc Thanh

Người hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 …

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Đoàn Thị Ngọc Thanh và TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh - là người đã giao đề tài, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm; Lãnh đạo Trường Đại học Tiền Giang, Khoa Nông nghiệp và Công nghệ thực phẩm cùng quý thầy cô giáo giảng dạy lớp cao học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn và khóa học này

Cuối cùng, tôi xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, người thân và các người bạn của tôi, những người đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho tôi để hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2020

Trần Thanh Lưu

Trong đề tài này, tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong Bacillus subtilis và khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Tinh bột gạo

sử dụng trong nghiên cứu (gạo IR50404) có các chỉ tiêu hóa lý: tinh bột gạo hòa tan trong nước ở nhiệt độ 25oC: 6,5 ± 1,4 (mg/ml); độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột ở nhiệt độ 25oC: 1,7 ± 0,5 (cP); tỷ lệ thoái hóa của gel tinh bột biến tính là 10% khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC; hàm lượng amylose (%): 26,7 ± 0,5; amylopectin có DP 6-

12 chiếm 25%, DP 13-24 chiếm đến 44%, mạch DP 25-36 chiếm 19% và amylopectin có DP > 36 chiếm 10%

Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động thích hợp cho quá trình biến tính tinh bột gạo bằng enzyme phân nhánh: pH 7, nhiệt độ 65℃, nồng độ tinh bột 5%, nồng độ enzyme 25 U và thời gian ủ 6 giờ Phân tích cấu trúc tinh bột biến tính có tỷ lệ mạch nhánh tăng thêm 12,3% so với tinh bột gạo tự nhiên Kết quả này là bước đầu trong quá trình ứng dụng tinh bột gạo biến tính dùng trong chế biến bún, hủ tiếu có khả năng chậm tiêu hóa

Từ khóa: tinh bột biến tính, enzyme phân nhánh, Bacillus subtilis

iii

ABSTRACT

Today, people are liberated to work (reduced manual labor), advanced economic conditions but inadequate eating, especially eating too much starch will lead to many diseases such as obesity, diabetes With the desire to eat the same amount of starch but will slow digestion, modified starch techniques have been studied This

study, purification and acquisition of recombinant branching enzyme in Bacillus subtilis and investigated the conditions affecting enzyme activity Physico-chemical

properties of rice starch (rice IR50404) used in the study were: water solubility at

25oC: 6.5 ± 1.4 (mg/ml); viscosity of gelatinized at 25oC: 1.7 ± 0.5 (cP); The retrogradation rate of modified starch gel is 10% when stored at 4oC; Amylose content (%): 26.7 ± 0.5; amylopectin has DP 6-12 accounting for 25%, DP 13-24 accounts for 44%, DP 25-36 circuit accounts for 19% and amylopectin has DP> 36 accounting for 10%

Results showed that appropriate conditions for modified rice starch by branching enzymes: pH 7, temperature 65oC, starch concentration 5%, enzyme concentration

25 U and incubation time 6 hours Structural analysis of modified starch had an increase of 12.3% of the branched chain compared to natural rice starch This result

is the first step in the application process of modified rice starch used in the processing of vermicelli and noodles with the ability to slow digestion

Key words: modified starch, branching enzyme, Bacillus subtilis

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào

và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

Trần Thanh Lưu

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa của đề tài 4

5.1 Ý nghĩa khoa học 4

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Tình hình tiêu thụ tinh bột và những bệnh có liên quan đến sử dụng tinh bột 5

1.1.1 Tình hình tiêu thụ tinh bột 5

1.1.2 Các bệnh liên quan đến sử dụng tinh bột 6

vi

1.2 Tổng quan về tinh bột biến tính 7

1.2.1 Các phương pháp biến tính tinh bột 7

1.2.2 Công dụng của tinh bột biến tính 10

1.2.3 Các dạng biến tính tinh bột sử dụng enzyme 11

1.3 Enzyme phân nhánh 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu về enzyme phân nhánh 15

1.3.2 Cơ chế tác động của enzyme phân nhánh 16

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme phân nhánh 18

1.4.1 Ảnh hưởng của pH 18

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18

1.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 19

1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 20

1.4.5 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 21

1.5 Phương pháp tinh sạch enzyme mục tiêu 21

1.5.1 Phương pháp sắc ký 22

1.5.2 Thẩm tích 24

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 25

1.6.1 Trong nước 25

1.6.2 Ngoài nước 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Vật liệu 28

2.1.2 Dụng cụ thiết bị 28

2.1.3 Hóa chất 30

vii

2.1.4 Môi trường 32

2.2 Nội dung nghiên cứu 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo 34

2.3.2 Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh 35

2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới nhiều điều kiện khác nhau 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo 49

3.1.1 Phân tích tính chất hóa lý của tinh bột gạo 49

3.1.2 Cấu trúc phân tử của bột gạo 51

3.2 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi khuẩn B subtilis; nuôi cấy vi khuẩn B subtilis và thu nhận, tinh sạch enzyme phân nhánh 52

3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi khuẩn B subtilis 52

3.2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh 53

3.3 Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh 55

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 55

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 56

3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bột gạo 58

3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme 59

3.3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 60

3.3.6 Kết quả cấu trúc tinh bột sau biến tính 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

viii

1 Kết luận 63

2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ 73

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 77

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể enzyme phân nhánh trên hệ thống biểu hiện E.coli (PDB

ID:5E70) 14

Hình 1.2 Sơ đồ biến tính tinh bột gạo 16

Hình 1.3 Đồ thị Michaelis - Menten về sự tương quan giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất 19

Hình 1.4 Liên kết ái lực của đuôi 6xHis với Ni2+ 23

Hình 1.5 Hình thức các phân tử nhỏ đi qua màng thẩm tích 25

Hình 2.1 Thang chuẩn Promega 10-225 kDa 28

Hình 2.2 Cột sắc ký ái lực Ni-NTA (GE Healthcare) 28

Hình 3.1 Tốc độ thoái hóa của gel bột gạo khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC 50

Hình 3.2 Chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bột gạo 51

Hình 3.3 Kết quả biến nạp BBE vào Bacillus subtilis 1012 53

Hình 3.4 Kết quả điện di SDS-PAGE BBE trong quá trình tinh chế 54

Hình 3.5 Sự phân bố chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bột gạo tự nhiên và tinh bột gạo biến tính 62

x

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số enzyme phân nhánh thương mại 17

Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylmaide 31

Bảng 2.2 Thành phần buffer dùng trong tinh chế protein 31

Bảng 2.3 Thông số thí nghiệm a 39

Bảng 2.4 Thông số thí nghiệm b 40

Bảng 2.5 Thông số thí nghiệm c 42

Bảng 2.6 Thông số thí nghiệm d 43

Bảng 2.7 Thông số thí nghiệm e 45

Bảng 3.1 Động học phản ứng với các enzyme tiêu hóa khác nhau 51

Bảng 3.2 Mạch amylopectin trong phân tử tinh bột gạo (%) 52

Bảng 3.3 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các giá trị pH khác nhau 55

Bảng 3.4 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nhiệt độ khác nhau 57

Bảng 3.5 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nồng độ cơ chất khác nhau 58

Bảng 3.6 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nồng độ enzyme khác nhau 59

Bảng 3.7 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các thời gian thủy phân khác nhau 61

xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BBE Bacillus subtilis 168 Braching Enzyme

BOS Branched Oligosaccharide

BSMA Bacillus stearothermophilus Maltogenic Amylase

DBE Starch debranching enzymes

EGTA Ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether) - N, N, N ', N' axit -

tetraacetic

IMO Isomalto- oligosaccharide

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactoside

PPA Porcine Pancreatic α-Amylase

RS Resistant Starch

SDS Slowly Digestible Starch

là đường glucose đi vào máu qua đường tiêu hóa Nhằm giải quyết vấn đề này, các nhà khoa học thực phẩm đã nghiên cứu tạo ra các loại đường thay thế saccharose từ nguyên liệu tinh bột bằng công nghệ enzyme Đường thay thế có tốc độ chuyển hóa

và hấp thu chậm hơn so với các loại đường saccharose, đường glucose, đường fructose Hiện nay, các công ty thực phẩm trong nước phải nhập các loại đường thay thế như isomalto-oligosaccharide (IMO) để phân phối tại các siêu thị, dùng làm chất ngọt thay thế cho đường saccharose dành cho người ăn kiêng, béo phì và dùng làm nguyên liệu sản xuất các loại thực phẩm chức năng cho người ăn kiêng hay các loại nước giải khát có sự thay thế một phần đường saccharose bằng đường IMO

Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu đang được tập trung gần đây là tạo ra các sản phẩm carbohydrate có cấu trúc mới từ các loại tinh bột tự nhiên, sau đó thử nghiệm những đặc tính hoá lý, hoá sinh cũng như sinh học của các sản phẩm thực phẩm tạo ra từ nguyên liệu là tinh bột biến tính này Tinh bột biến tính cần có độ hòa tan trong nước lạnh tăng cao so với tinh bột chưa biến tính, độ nhớt dung dịch tinh bột biến tính giảm, tốc độ thoái hóa của sản phẩm thấp hơn so với tinh bột chưa biến tính, đặc biệt sản phẩm có tốc độ tiêu hóa chậm hơn so với tinh bột tự nhiên

Các công ty cũng nhập khẩu các loại bột biến tính khác nhau, có tính chất vật lý khác nhau để sản xuất các loại thực phẩm khác nhau như: tương ớt (vừa tạo độ sệt vừa tránh tách nước ra khỏi sản phẩm), bánh kẹo (vừa tạo cấu trúc cho sản phẩm vừa giữ cho sản phẩm được ngon như ban đầu), hải sản tẩm bột (giúp ổn định cấu trúc sản phẩm khi lạnh đông và rã đông) Ngoài ra, việc tạo ra tinh bột biến tính có tốc độ tiêu hóa chậm sẽ rất phù hợp để sản xuất thực phẩm dành cho người béo phì

và tiểu đường, hai loại bệnh ngày càng phổ biến trong xã hội hiện nay

2

Với các ưu điểm của tinh bột biến tính và tiềm năng ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình biến tính tinh bột, việc nghiên cứu sử dụng enzyme để tạo bột gạo biến tính có tốc độ tiêu hoá chậm dùng làm nguyên liệu sản xuất các loại thực phẩm chức năng cho người bệnh đái tháo đường và béo phì là hết sức cần thiết Một trong những enzyme có hiệu quả trong việc tạo tinh bột hấp thu chậm là enzyme phân nhánh Do đó, đề tài tiến hành tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh tái tổ hợp

trong Bacillus subtilis, khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ bột gạo, nồng

độ enzyme, thời gian thủy phân đến hoạt tính biến tính tinh bột của nó Kết quả của

đề tài góp phần làm tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng công nghệ thực phẩm tạo

ra sản phẩm từ nguồn nguyên liệu bột gạo biến tính có lợi cho sức khỏe con người

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Ứng dụng công nghệ enzyme, khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với việc chuyển bột gạo tự nhiên thành bột gạo biến tính

Mục tiêu cụ thể:

- Tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh (168 branching enzyme) từ Bacillus subtilis tái tổ hợp

- Khảo sát hoạt tính biến tính bột gạo bằng enzyme phân nhánh dưới ảnh hưởng của

pH, nhiệt độ, nồng độ bột gạo, nồng độ enzyme, thời gian thủy phân

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong Bacillus subtilis và hoạt tính biến tính tinh bột

gạo của enzyme này

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi thời gian: Tháng 10/2019 - 6/2020

Phạm vi không gian: Khoa Nông nghiệp và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Tiền Giang

3

Phạm vi nội dung: Tinh sạch và thu nhận enzyme phân nhánh thông qua hệ thống

biểu hiện Bacillus subtilis và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính biến tính

tinh bột gạo

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Theo Tổ chức Y tế thế giới, Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới [1] Trong các phác đồ điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh nhân cần một chế độ dinh dưỡng không làm tăng cao đường huyết sau ăn nhưng vẫn đảm bảo đủ năng lượng để hoạt động Hiện nay, tinh bột kháng tiêu hóa (RS - Resistant Starch) hay tinh bột chậm tiêu hóa có ý nghĩa lớn trong chế độ dinh dưỡng cho người bệnh, vì đây là loại tinh bột bền với sự thủy phân của amylase Do đó, việc sử dụng thức ăn có chứa tinh bột chậm tiêu hóa sẽ khiến cho lượng glucose sinh ra sau khi tiêu hóa ít hơn nhiều so với tinh bột tự nhiên [2] Mặc khác, ứng dụng của tinh bột tự nhiên trong thực phẩm đang bị hạn chế bởi tính không ổn định của chúng trong quá trình chế biến (quá trình xử lí nhiệt, sự nén cắt,

pH và bảo quản lạnh) cũng như sử dụng (tốc độ giải phóng glucose nhanh, làm tăng nhanh và vượt giới hạn hàm lượng đường trong máu) Nhìn chung tinh bột tự nhiên yếu về mặt cấu trúc và hạn chế về mặt chức năng để ứng dụng ở phạm vi rộng lớn Do

đó, cần thay đổi cấu trúc của tinh bột Để thay đổi cấu trúc của tinh bột, các nhà khoa học thực phẩm đã biến tính tinh bột bằng các phương pháp khác nhau như vật lí, hóa học, enzyme hoặc kết hợp Trong đó, phương pháp biến tính tinh bột bằng enzyme được ưu tiên nhất vì những phản ứng enzyme có thể được kiểm soát một cách đặc hiệu dưới những điều kiện an toàn và phản ứng enzyme tạo ra ít sản phẩm phụ

Từ các vấn đề trên, đề tài “Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong Bacillus subtilis” được tiến hành, tạo tiền đề cho

nghiên cứu biến tính bột gạo - nguồn nguyên liệu dồi dào - ứng dụng sản xuất các sản phẩm từ tinh bột cho người bệnh đái tháo đường và béo phì

5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình tiêu thụ tinh bột và những bệnh có liên quan đến sử dụng tinh bột

1.1.1 Tình hình tiêu thụ tinh bột

Tinh bột là một sản phẩm thực phẩm quan trọng và là một vật liệu sinh học đa năng được sử dụng trên toàn thế giới cho các mục đích khác nhau trong nhiều lĩnh vực công nghiệp bao gồm thực phẩm, y tế, dệt may, hóa chất và kỹ thuật Tính linh hoạt của tinh bột trong các ứng dụng công nghiệp phần lớn được xác định bởi các đặc tính và chức năng hóa lý của nó Tinh bột ở dạng nguyên bản của nó có chức năng

và ứng dụng hạn chế Nhưng những tiến bộ trong công nghệ sinh học và công nghệ hóa học đã dẫn đến sự biến đổi trên phạm vi rộng của tinh bột cho các mục đích khác nhau

Các sản phẩm thực phẩm từ tinh bột cung cấp 50 - 55% tổng năng lượng hàng ngày của con người Tinh bột còn là nguồn nguyên liệu cho sản xuất thức ăn chăn nuôi Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột là một thành phần thực phẩm thiết yếu do khả năng tạo gel, chất làm đặc và ổn định sản phẩm thực phẩm [3] Trong năm

2015, thị trường tinh bột công nghiệp toàn cầu, bao gồm tinh bột tự nhiên và các sản phẩm và dẫn xuất tinh bột (chất làm ngọt và tinh bột biến tính), được ước tính là khoảng 85 triệu tấn [4] Theo dự báo, thị trường tinh bột biến tính sẽ tăng trưởng với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm là 4,1% từ năm 2015 đến 2020

Tinh bột gạo (Oryza sativa L.) được tạo thành từ 70 - 80% amylopectin mạch nhánh

và 20 - 30% amylose mạch thẳng [5] Ở Indonesia, sản xuất gạo hàng năm thường đáp ứng khoảng 40% nhu cầu của người tiêu dùng Hàm lượng tinh bột trong gạo cao làm cho gạo trở thành cây lương thực được tiêu thụ nhiều nhất ở các nước Châu Á như Malaysia, Indonesia và Thái Lan [6] Được xem là nguồn nguyên liệu không gây dị ứng, tinh bột gạo được ứng dụng trong thức ăn trẻ em như một chất để tạo kết cấu và để cải thiện độ ổn định của sản phẩm về độ nhớt, kiểm soát tổng hợp và thời hạn sử dụng, ngoài ra là một nguồn calo quan trọng [7] Tuy nhiên, các ứng

6

dụng của tinh bột gạo tự nhiên trong các sản phẩm thực phẩm bị hạn chế bởi tính không ổn định trong các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau

1.1.2 Các bệnh liên quan đến sử dụng tinh bột

Hiện nay các bệnh mãn tính như béo phì, tiểu đường, tim mạch, đột qụy, ung thư đang ngày càng phát triển cả ở Việt Nam và trên thế giới Nguyên nhân chính của việc mắc bệnh tiểu đường và béo phì là do cơ thể người bệnh bị rối loạn chuyển hóa carbohydrate và biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao Cơ thể tiêu thụ một lượng tinh bột lớn là một trong những nguyên nhân làm tăng hàm lượng đường trong máu do sự chuyển đổi carbohydrate thành glucose dưới sự xúc tác của enzyme khi hormone insulin của tụy bị thiếu hụt và giảm tác động trong cơ thể Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2016, tổng số người mắc bệnh tiểu đường trên toàn cầu ước tính tăng từ 4,7% (108 triệu người) vào năm 1980 lên khoảng 8,5% (422 triệu) người trưởng thành vào năm 2014 [8] Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh thừa cân, béo phì và tiểu đường tăng lên đáng kể trong thời gian gần đây với tốc độ cao nhất thế giới, nhất là ở lứa tuổi học sinh Theo báo cáo của Bộ Y tế năm 2017 thì tỷ lệ đái tháo đường toàn quốc là 4,1% và tiền đái tháo đường là 3,6% Theo công bố của Bùi Thị Nhung và cộng sự khi nghiên cứu về bệnh béo phì trên

13 trường tiểu học nội thành Hà Nội năm 2011 cho kết quả tỷ lệ béo phì ở trẻ nam

là 25,6% và 8,4% ở trẻ nữ [9]

Đối với người mắc các bệnh mãn tính này thì ngoài việc uống thuốc hỗ trợ cần phải

có chế độ ăn hợp lý Có thể thấy rằng khẩu phần ăn hàng ngày của con người có hàm lượng tinh bột chiếm tỷ lệ cao Do đó, mục tiêu quan trọng nhất trong chế độ

ăn đối với người mắc bệnh đái tháo đường, béo phì là thiết lập một chế độ ăn uống đều đặn với lượng calo và carbohydrate phù hợp Trong đó, chế độ ăn uống lý tưởng sẽ chứa 55% - 60% tổng lượng calo dưới dạng carbohydrate [10] Tuy nhiên, việc giảm lượng carbohydrate trong chế độ ăn bằng cách ăn kiêng đối với những bệnh nhân không phải là điều dễ thực hiện Vì vậy vấn đề nghiên cứu phát triển các sản phẩm thực phẩm sinh đường thấp nhằm cải thiện sức khỏe người bệnh béo phì

và tiểu đường là rất quan trọng và cần thiết

7

1.2 Tổng quan về tinh bột biến tính

Tinh bột được tạo thành từ hỗn hợp của hai loại polysacaride là glucan amylose mạch thẳng và glucan amylopectin phân nhánh cao Tinh bột bình thường trung bình chứa từ 20% đến 30% amylose và 70% đến 80% amylopectin [5] Do ở dạng mạch thẳng, các phân tử amylose thường có một đầu khử một đầu không khử Các phân tử amylose có kích thước trung bình từ vài trăm đến vài nghìn đơn vị glucosyl tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng Amylopectin là một glucan lớn hơn nhiều bao gồm trung bình từ 2.000.000 đơn vị glucosyl trở lên Kích thước trung bình của nó cũng phụ thuộc vào nguồn gốc Do phân nhánh cao, các phân tử amylopectin có 1 đầu khử và nhiều đầu không khử Các nhánh được nối bởi các liên kết α‐1,6 và α‐ 1,4-glycosidic [11]

Trong công nghiệp thực phẩm, tính chất của tinh bột tự nhiên bị hạn chế do tính chảy tự do hay tính kỵ nước, tính không hòa tan, tính kém trương nở, độ nhớt tăng trong nước lạnh, dễ thoái hóa khi kéo dài thời gian đun nóng hay giảm pH Để phù hợp với yêu cầu sử dụng mà người ta tiến hành biến tính tinh bột Trong quá trình biến tính, cấu trúc phân tử của tinh bột bị thay đổi, sản phẩm là các phân tử polysaccharide mạch ngắn hay gắn các chất, nhóm khác dưới tác dụng của các tác nhân như nhiệt độ, acid, enzyme, các chất oxy hóa dẫn đến thay đổi cấu trúc vật lý, hóa học của tinh bột [12]

1.2.1 Các phương pháp biến tính tinh bột

Để cải thiện các đặc tính chức năng mong muốn, tinh bột gạo tự nhiên thường được

xử lý biến tính bằng hóa học, vật lý hoặc enzyme

1.2.1.1 Phương pháp biến tính vật lý và hóa học

Để làm tinh bột phân tán tốt vào nước cần trộn với chất rắn trơ, làm chúng tách biệt nhau về vật lý, cho phép chúng hydrate hóa một cách độc lập và không kết thành cục Tinh bột cũng có thể được biến tính bằng hồ hóa sơ bộ Dưới tác động của nhiệt ẩm làm đứt các liên kết giữa các phân tử, làm phá vỡ cấu trúc của các hạt tinh bột khi hồ hóa Một phương pháp vật lý khác là biến tính tinh bột bằng gia nhiệt

8

khô ở nhiệt độ cao Dưới tác dụng của nhiệt độ, tinh bột bị biến tính làm thay đổi các tính chất: độ hòa tan tăng, hàm lượng dextrin tăng, đường khử tăng rồi giảm, độ nhớt giảm, màu sắc thay đổi [13]

Tinh bột có thể được biến tính bằng acid hoặc bằng kiềm Dưới tác dụng của acid, một phần các liên kết của các phân tử trong tinh bột bị đứt, làm giảm kích thước phân tử tinh bột và tạo nên những tính chất mới Tinh bột biến tính bằng acid có độ nhớt thấp nên được ứng dụng để hồ hóa sợi trong công nghiệp dệt, sản xuất kẹo đông, làm bóng giấy để tăng chất lượng in và mài mòn Kiềm phá hủy tinh bột từ đầu nhóm cuối khử thông qua dạng enol Sự phá hủy của kiềm cũng xảy ra ngẫu nhiên ở giữa mạch nhất là khi có mặt oxy và gia nhiệt Ngoài ra còn có thể sử dụng chất oxy hóa như hypocloride để biến tính tinh bột Trong phân tử tinh bột bị oxy hóa tạo ra các nhóm cacboxyl và cacbonyl, đồng thời xảy ra phản ứng phân ly một

số liên kết D-glycosidic, do đó làm giảm kích thước phân tử [13]

1.2.1.2 Biến tính tinh bột bằng enzyme

Trong những thập kỷ gần đây, phương pháp biến tính bằng enzyme đã được áp dụng, một phần thay thế các phương pháp hóa học và vật lý để sản xuất tinh bột biến tính do tính an toàn và đảm bảo hơn đối với cả môi trường và người tiêu dùng thực phẩm Ngoài ra, các phản ứng enzyme không chỉ trung tính và rất đặc hiệu đối với cơ chất là tinh bột có trong hệ thống thực phẩm phức tạp mà chúng còn cho hiệu suất cao và ít sản phẩm phụ hơn [14]

Có nhiều ứng dụng từ các enzyme như α‐amylase (EC 3.2.1.1), β-amylase (EC 3.2.1.2), glucoamylase (EC 3.2.1.3), α‐glucosidase (EC 3.2.1.20), pullulanase hoặc amylopullulanase (EC 3.2.1.41) và cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) trong việc tách các liên kết α‐1,4‐ hoặc α‐1,6 trong tinh bột [15-17] Sản phẩm của phương pháp này là các loại đường glucose, fructose, sorbitol, mannitol; các amino acid như lysin; MSG; các rượu; các acid

Enzyme α-amylase thủy phân liên kết α-1,4 trên nhiều mạch và tạo nhiều vị trí của cùng một mạch, giải phóng glucose và các olidosaccharide có từ 2-7 đơn vị glucose, trong đó có 1 glucose khử tận cùng ở dạng α Kết quả tác động của α-amylase

- Giai đoạn 2, các dextrin vừa được hình thành sẽ thủy phân tiếp tạo thành các phân

tử có phân tử lượng nhỏ hơn hoặc các đường Giai đoạn này, độ ngọt của dịch thủy phân tăng nhanh nhưng quá trình thủy phân sâu sắc thành đường bởi các enzyme này chậm và không triệt để Cách thức tác động của α-amylase phụ thuộc nguồn gốc enzyme và bản chất của cơ chất Khi thủy phân amylase, sản phẩm cuối cùng chủ yếu là maltose và maltotriose

Cơ chế tác động lên amylose trong dung dịch: cơ chế tác động nhiều lần và cơ chế tác động ưu tiên Trong cơ chế tác động nhiều lần, sự tiếp xúc giữa các enzyme và

cơ chất xảy ra một cách ngẫu nhiên và tất cả các liên kết đều có thể bị thủy phân Sau khi thủy phân, chỉ có một phân tử được giải phóng khỏi enzyme, còn phân tử kia được giữ lại trong lòng của enzyme thì trượt dọc theo trung tâm hoạt động để chịu sự thủy phân mới Sau nhiều lần lặp lại quá trình này, chuỗi mạch được giải phóng hết Trong cơ chế tác động ưu tiên, sự tiếp xúc giữa các enzyme và cơ chất chỉ dẫn tới một lần thủy phân duy nhất, cả hai phân tử được giải phóng ra ngay sau khi xúc tác Đối với enzyme, không phải liên kết nào cũng mẫn cảm như nhau, nhất

là các liên kết ở đầu chuỗi thường bền hơn Trong trường hợp chuỗi mạch thẳng có mức độ trùng hợp thấp thì cơ chế tác động nhiều lần có xác suất rất thấp (0,1 - 0,27) đối với nhiều α-amylase Trong trường hợp này hai chuỗi mạch rời khỏi trung tâm hoạt động ngay sau khi thủy phân, nhưng do bị vây bởi các phân tử dung môi nên xác suất để cho phần thủy phân trở lại lớn [14]

Khi thủy phân amylopectin trong dung dịch ngoài glucose, maltose và maltitriose còn có dextrin giới hạn có nhánh Các α-dextrin giới hạn này có chứa các liên kết α-1,6 của polimer ban đầu cộng với các liên kết α-1,4 kề bên thường bền vơi thủy phân Kết quả tác động của α-amylase thường làm giảm nhanh độ nhớt của dung dịch tinh bột

10

1.2.2 Công dụng của tinh bột biến tính

Tinh bột là một sản phẩm nông nghiệp được sử dụng rộng rãi, sở hữu các đặc tính cần thiết cho một số ứng dụng công nghiệp, nhưng đối với hầu hết các ứng dụng, các tính chất của tinh bột cần phải được cải thiện Mục đích của hầu hết của việc biến tính tinh bột là để thay đổi cấu trúc của các phân tử amylose và amylopectin từ

đó có thể dự đoán và kiểm soát được các thuộc tính hóa lý của tinh bột [18]

Trong những năm vừa qua, các nhà nghiên cứu đang phát triển các sản phẩm thực phẩm thay thế có hàm lượng chất béo ít hơn Tinh bột được xử lý bằng amylomaltase được sử dụng chất thay thế cho chất béo trong thực phẩm có nguồn gốc từ sữa Theo J.H Park và Jane (2007) các gel hình thành từ tinh bột được xử lý bằng amylomaltase có dạng lỏng hơn, trong khi các gel hình thành từ tinh bột ngô bình thường có độ đàn hồi và rắn hơn [19] Tinh bột khoai tây được xử lý bằng amylomaltase có hiệu quả gấp 4 lần so với maltodextrin thương mại được bán trên thị trường dưới dạng chất thay thế chất béo trong sữa chua có chứa 3% chất béo,

giúp giảm từ 21,5-45 kcal/100g sản phẩm [20] Theo Mun et al (2009), tinh bột gạo

được xử lý bằng amylomaltase có thể được sử dụng như một chất thay thế chất béo làm giảm lượng calo trong mayonnaise [21]

Gạo được phân thành ba loại theo hàm lượng amylose (Viện Nghiên cứu Lúa gạo Quốc tế, IRRI): gạo có hàm lượng 25 - 30% được xếp vào loại gạo có hàm lượng amylose cao, trong khi 10 - 20% được xếp vào loại gạo có hàm lượng amylose thấp

và gạo có hàm lượng amylose trung bình (20 - 25%) là loại gạo được ưa chuộng ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới Tuy nhiên, tinh bột gạo có hàm lượng amylose cao tiêu hóa nhanh hơn so với loại tinh bột gạo có hàm lượng amylose thấp Nói cách khác, các loại gạo có hàm lượng amylose cao sau khi nấu sẽ dễ dàng

bị thủy phân bởi các enzyme amylase và sinh ra lượng đường lớn hơn so với các loại gạo có hàm lượng amylose thấp Do đó, các nhà khoa học luôn mong muốn sản

xuất in vitro các sản phẩm gạo ít amylose bằng cách biến tính tinh bột gạo bằng loại

enzyme có thể thủy phân chọn lọc amylose nhưng không thủy phân amylopectin Việc biến tính tinh bột nhằm ngăn sự kết tinh của amylopectin và làm giảm kết nối

Tinh bột biến tính bằng enzyme phân nhánh có độ phân nhánh cao, cấu trúc tinh thể

tăng để làm chậm khả năng tiêu hóa Theo Englyst et al (1992), đối với mục đích

dinh dưỡng, tinh bột trong thực phẩm được phân loại thành tinh bột tiêu hóa nhanh (RDS - Rapidly Digestible Starch), tinh bột tiêu hóa chậm (SDS - Slowly Digestible Starch) và tinh bột kháng tiêu hóa (RS - Resistant Starch) dựa theo tốc độ giải phóng glucose và hấp thu của nó trong đường tiêu hóa [23] Dựa trên mức năng lượng, các loại tinh bột này đã được đề xuất như một thành phần trong chế độ ăn có thể giúp giảm cân [24], phòng tránh suy giảm lớp nhầy bảo vệ ruột kết, giảm nguy

cơ mắc ung thư ruột kết và hỗ trợ kiểm soát bệnh đái tháo đường [25] giảm cholesterol trong máu, giảm chỉ số đường huyết, tăng hấp thu chất khoáng [26]

1.2.3 Các dạng biến tính tinh bột sử dụng enzyme

Maltogen amylase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bột tạo maltose, lượng maltotetraose và maltotriose ít hơn, đồng thời làm tăng tỷ lệ chuỗi ngắn amylopectin Nó có khả năng tạo ra loại tinh bột gạo biến tính có độ phân nhánh cao, cấu trúc tinh thể tăng để làm chậm khả năng tiêu hóa Hiệu quả thủy phân tinh bột của enzyme phụ thuộc vào nhiều điều kiện, đặc biệt là nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme thủy phân [27]

Sự biến tính tinh bột bởi amylosucrase dẫn đến giảm tỷ lệ các chuỗi phân nhánh ngắn và tăng các chuỗi nhánh dài, do đó chuyển các đơn vị glucosyl đến các đầu không khử của các mạch nhánh khác của amylopectin Các phân tích về quá trình

tiêu hóa in vitro của tinh bột biến tính bởi amylosucrase cho thấy rằng các mạch

12

nhánh dài có hàm lượng RS (Resistant Starch) và tinh bột tiêu hóa chậm cao do sự hình thành một phần cấu trúc tinh thể theo trật tự thông qua sự liên kết giữa các chuỗi nhánh kéo dài Các sản phẩm từ tinh bột biến tính theo cách này nếu trải qua quá trình gia nhiệt cao có thời gian bảo quản dài, lớp vỏ mềm hơn và đàn hồi hơn Tinh bột gạo sau biến tính có hàm lượng amylose thấp (5% - 15%) có độ ổn định khi đông lạnh tốt, thích hợp cho quá trình nấu chín đông lạnh [28]

Branched oligosaccharide (BOS) hoặc Isomalto - oligosacarit (IMO) là các maltooligosacaride được liên kết chủ yếu bởi các liên kết α‐1,4 nhưng chứa ít nhất một liên kết α‐1,6 tại một điểm nhánh, bao gồm isomaltose, isomaltotriose, panose

và một số oligosacaride khác bao gồm 4 đến 5 đơn vị glucosyl [29] Vì chúng là oligosacaride nên chúng có độ nhớt thấp Giống như nhiều maltodextrin, BOS có khả năng chống kết tinh và có độ ngọt thấp, nhưng lại có lợi ích sức khỏe nhất định như chỉ số đường huyết thấp và kích thích tăng trưởng của vi khuẩn có lợi đại tràng (tác dụng prebiotic) [30]

Ở quy mô thương mại, quy trình sản xuất bao gồm hai bước Đầu tiên, tinh bột được thủy phân bằng enzyme thành các phân tử đường disaccharide, trisaccharide và oligosaccharide có các liên kết α- (1, 4) - glycosidic, liên kết α- (1, 4) - glycosidic của sản phẩm tiếp tục được chuyển đổi thành các liên kết α- (1, 6) -glycosidic bằng phản ứng enzyme và tạo thành BOS Maltogenic amylase có khả năng chuyển một gốc đường α -1, 4 được giải phóng từ tinh bột sang các phân tử đường nhận bằng liên kết α -1,6 - glycosidic Theo cách tương tự, các đặc tính xúc tác này của các enzyme có thể được áp dụng để tạo ra hỗn hợp oligosaccharide phân nhánh cao, với nhiều liên kết glucosidic khác nhau Các sản phẩm của quá trình này có tác động tích cực đến đường ruột Ngoài ra, hỗn hợp BOS có thể được sử dụng làm chất giữ

ẩm cho các sản phẩm bánh kẹo, các sản phẩm thực phẩm khác có độ ngọt thấp và trong nước ngọt [31]

Tinh bột ít amylose là tinh bột không có chuỗi glucan mạch thẳng hoặc có nhiều chuỗi khác nhau, nhưng ít hơn so với số lượng bình thường Hầu hết các amylose có

13

trọng lượng phân tử trung bình từ 106-107 Da [32] Một số phân tử amylose có một vài nhánh (thường là các nhánh dài), phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng Tỷ lệ amylose/amylopectin sẽ ảnh hưởng đến các tính chất hóa lý và dinh dưỡng của thực phẩm Nhiều nghiên cứu được thực hiện để phát triển các enzyme từ vi sinh vật mới

có khả năng loại bỏ amylose một cách chọn lọc Auh et al (2006) chỉ ra rằng trong

tinh bột gạo, cyclomaltodextrinase tác động tới amylose mạnh hơn so với amylopectin Enzyme làm giảm hàm lượng amylose từ 28,5% xuống 9% trong quá trình tạo maltose, trong khi amylopectin không thay đổi đáng kể về chiều dài mạch [33] Nhiều nghiên cứu tương tự về sự giảm hoặc thay đổi của phân tử amylose

được thực hiện như: enzyme phân nhánh từ Rhodothermus obamensis cho thấy

enzyme có tác động lên amylose lớn hơn gấp 6 lần so với amylopectin [34];

amylase maltogenic từ Bacillus licheniformis có khả năng thủy phân có chọn lọc amylose tinh bột khoai tây [35]; 4‐α‐glucanotransferase từ Thermotoga maritima

làm thay đổi cấu trúc của cả amylose và amylopectin của tinh bột ngô làm chúng phân nhánh nhiều hơn và có trọng lượng phân tử thấp hơn [36]

Tốc độ tiêu hóa carbohydrate phụ thuộc vào tỷ lệ amylose/amylopectin, trọng lượng phân tử trung bình của amylose và amylopectin, mức độ phân nhánh, chiều dài mạch amylopectin, mức độ hồ hóa của amylose [37] Dựa trên xét nghiệm Englyst, tinh bột có khả năng tiêu hóa giảm bao gồm tinh bột tiêu hóa chậm (SDS) và tinh

bột không tiêu hóa (RS) Theo Potocki Veronese et al (2005), amylosucrase được

sử dụng để điều chỉnh chức năng, hình thái, cấu trúc và tính chất hóa lý của

α-glucans với cơ chất sucrose [38] Theo Rolland Sabaté et al (2004) hàm lượng RS

cao (22% - 57%) thu được sau phản ứng với amylosucrase trên các polymer glucose

có liên kết α‐1,4, α‐1,4 và α‐1,6 [39] Khi sử dụng kết hợp maltogenic amylase và enzyme phân nhánh tạo ra các bó amylopectin phân nhánh nhiều hơn và có độ nhạy

cảm với amylase giảm so với tinh bột tự nhiên [40] Kajiura et al (2008) đã nghiên

cứu một quy trình sản xuất glycogen in vitro từ enzyme, trong đó các phân tử mạch thẳng, ngắn được sản xuất từ tinh bột hoặc dextrin bằng cách xử lý isoamylase, sau

đó enzyme phân nhánh và amylomaltase đã được thêm vào để tổng hợp một sản

khác Theo C.K Lee et al (2008), các nhóm amylose và amylopectin phân nhánh

cao đã thu được bằng cách kết hợp 4‐α‐glucanotransferase với maltogenic amylase hoặc enzyme phân nhánh với maltogenic amylase [44]

1.3 Enzyme phân nhánh

Enzyme từ lâu đã được xem là một tác nhân sử dụng để thủy phân tinh bột Nhiều enzyme thủy phân các liên kết trong amylose và amylopectin làm thay đổi cấu trúc polysacaride tinh bột và sản xuất các sản phẩm mới với chức năng mới, trong đó có enzyme phân nhánh Một số nghiên cứu đã được thực hiện để nhân bản các gen mã

hóa tổng hợp enzyme và biểu hiện chúng trên Escherichia coli và Bacillus subtilis

đã mở ra hướng mới nhằm tăng khả năng sản xuất và hoạt động của enzyme

Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể enzyme phân nhánh trên hệ thống biểu hiện E.coli (PDB

ID:5E70)

15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu về enzyme phân nhánh

Sinh tổng hợp tinh bột liên quan đến hoạt động của các enzyme: ADP-Glc pyrophosphorylase, tổng hợp tinh bột (SS), enzyme phân nhánh tinh bột (SBE và DBE [45] Sự phối hợp chức năng của các enzyme này tạo ra hai dạng phân tử tinh bột: amylose-một chuỗi glucan tuyến tính bao gồm các liên kết α-1,4 và amylopectin- một chuỗi glucan phân nhánh cao được hình thành bởi các liên kết α-1,6 Nhiều enzyme thủy phân các liên kết trong amylose và amylopectin làm thay đổi cấu trúc polysacaride tinh bột và sản xuất các sản phẩm mới với chức năng mới Dựa trên cơ chế phản ứng, tính đặc hiệu cơ chất và trình tự protein, các hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột được phân loại thành 2 nhóm: hydrolase glycosyl (EC3.2.1.X) phân tách các liên kết α‐1,4 hoặc α‐1,6 glycosidic và glycosyl transferase (EC2.4.XY) tách liên kết α-1,4-glycosidic và tạo thành liên kết α‐1,3, α‐1,4 hoặc α‐1,6 mới [46] Các enzyme thủy phân tinh bột trên tinh bột được phân lập từ nhiều nguồn như vi khuẩn, nấm, nấm men, vi khuẩn cổ và thực vật (trang web của cơ sở dữ liệu enzyme xúc tác phản ứng cho carbohydrate [https://www.cazy.org/])

Enzyme phân nhánh (BE, 1,4-a-D-glucan: 1,4-α-D-glucan, 6-a-D-(1,4-α-D-glucano) -transferase, EC 2.4.1.18) được biết là chất xúc tác sự hình thành các liên kết α-1,6-glucosidic bằng cách chuyển hóa đường trong amylopectin, do đó tạo ra các phân tử glucan phân nhánh Hơn nữa, BE phân cắt liên kết α-1,4 glucosidic của phân đoạn giữa các cụm để tạo ra cụm amylopectin từ amylopectin Khi BE từ vi sinh vật tác dụng với tinh bột chứa amylose và amylopectin, cả phản ứng transglycosyl hóa và phân cắt dẫn đến hình thành glucan phân nhánh và cụm amylopectin [44] Ba dạng đồng dạng của SBE (SBEIa, SBEIIa và SBEIIb) đã được xác định trong ngô [47]

Hoạt động của BE được xác định đầu tiên trong khoai tây bởi Haworth et al (1944)

[48] Do đó SBE có ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc cuối cùng của tinh bột tạo thành Để có được cấu trúc tinh bột mong muốn, hoạt động của SBE có thể thay đổi bằng cách thay đổi mức độ biểu hiện của nó, thay đổi di truyền hoạt động của chính enzyme hoặc thay đổi độ dài của chuỗi chuyển Có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi

16

mức độ biểu hiện của SBE ở thực vật bằng cách sử dụng RNA can thiệp (RNAi)

[49] Guan et al., (1997) đã sử dụng các enzyme mSBEIIa đột biến được biểu hiện

và tinh chế từ E coli trong điều kiện in vitro để tạo thành glucan nhánh từ

MAZACA amylopectin và mạch thẳng glucan có chứa liên kết α-1,4 của amylose khoai tây đã phân nhánh [50]

1.3.2 Cơ chế tác động của enzyme phân nhánh

Enzyme phân nhánh tinh bột (SBEs) là một trong bốn loại chính các nhóm enzyme liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật và tảo, các hoạt động của chúng đóng vai trò quyết định trong việc xác định cấu trúc và tính chất vật lý của hạt tinh bột SBEs tạo ra các liên kết α-1,6 nhánh trong α-glucans thông qua sự phân tách liên kết α-1,4 và chuyển các đầu khử được giải phóng sang hydroxyl C-6 [51] Enzyme phân nhánh tinh bột (SBEs; 1,4- α-glucan: 1,4-α-glucan 6-glucosyl transferase; EC 2.4.1.18) biến đổi cấu trúc của tinh bột bằng cách xúc tác cho sự hình thành các nhánh α-1,6 với tần số khác nhau và chiều dài nhánh (Hình 1.1)

Hình 1.2 Sơ đồ biến tính tinh bột gạo

Amylopectin Amylose

Enzyme phân nhánh

Glucan phân nhánh

Enzyme phân

nhánh

Bó amylopectin

17

Enzyme phân nhánh (1,4-α‐D‐glucan: 1,4-α‐D‐glucan 6-α‐D- (1,4‐α‐D‐glucano) transferase, EC2.4.1.18) là glucan transferase có nhiều trong thực vật và vi sinh vật Chúng xúc tác các phản ứng chuyển để tạo thành các điểm nhánh α‐1,6 trong các cụm của amylopectin (3,5%) và glycogen (8% - 9%) Các enzyme này thường thuộc họ GH 13 [52,53] Enzyme phân nhánh xúc tác quá trình chuyển liên kết α-1,4-glucoside trong 1,4-α-D-glucan để tạo thành chuỗi maltooligosacarit (MOS) đầu không khử, sau đó được chuyển sang nhóm hydroxyl C-6 trong phản ứng không thể đảo ngược dẫn đến hình thành các nhánh α-1,6 trong α-1,4-polyglucans [54] Các enzyme phân nhánh tách liên kết α‐1,4 trong phân tử và chuyển đoạn cuối không khử của chuỗi sang O6 của chuỗi glucan liên kết α‐1,4 khác đóng vai trò là chất nhận, làm hình thành của một chuỗi liên kết α‐1,6 Một số loại enzyme thương mại (Branchzyme® từ Novozyme, Đan Mạch) được sản xuất bằng cách lên men

của chủng B subtilis mang gen từ enzyme phân nhánh mã hóa R obamensis có sẵn

[55]

Bảng 1.1 Một số enzyme phân nhánh thương mại

Enzyme phân nhánh Branchzyme® Bacillus subilis

Maltogen amylase

Novamyl® Bacillus stearothermophilus

VERON® xTender Bacillus subilis

Grindamyl ™ Bacillus subilis

pH cũng là một yếu tố tạo nên sự ổn định của các enzyme Mỗi enzyme cũng có một vùng cấu trúc ổn định ở pH tối ưu Các enzyme thuộc nhóm amylase thường có

pH tối ưu nằm trong khoảng 6,0 - 7,0 (riêng amylase có nguồn gốc từ đại mạch có

pH tối ưu là 4,6 - 5,2)

Tất cả các protein đều lưỡng tính, tính chất này phụ thuộc vào pH của môi trường, các nhóm acid hoặc base của enzyme đều có khả năng ion hóa Khi pH môi trường thay đổi sẽ xảy ra liên kết với H+ hay OH- Do đó, mức độ ion của các amino acid trong trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi thì sự tạo thành liên kết giữa enzyme-cơ chất sẽ bị ức chế và do đó ảnh hưởng tới quá trình thủy phân [56]

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh huởng rất lớn đến phản ứng enzyme Giống như hầu hết các phản ứng hóa học, tốc độ của một phản ứng được xúc tác bởi enzyme tăng lên khi nhiệt độ tăng Nhiệt độ tăng 10ºC sẽ làm tăng hoạt động của hầu hết các enzyme từ 50 - 100% Sự thay đổi nhiệt độ phản ứng nhỏ chỉ từ 1 - 2ºC có thể làm thay đổi hiệu suất phản ứng từ 10 - 20% Tốc độ enzyme chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định, vượt quá giới hạn đó tốc độ enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu [57] Nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng đạt cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ mà tại đó enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính là nhiệt độ tới hạn

Do enzyme có bản chất protein nên khi nhiệt độ thủy phân vượt qua nhiệt độ giới hạn của enzyme đó thì vận tốc phản ứng sẽ giảm do sự biến tính của enzyme Trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính thì hệ số truyền nhiệt của đa số enzyme khoảng 1,4 - 2 Khi bắt đầu có sự biến tính enzyme thì xảy ra hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự gia tăng nhiệt độ, mặt khác tốc độ biến tính enzyme cũng nhanh hơn Kết quả là tốc độ phản ứng giảm dần đến ngưng hoàn

19

toàn Đối với các enzyme phân nhánh như maltogenic amylase có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với enzyme thông thường (nhiệt độ phản ứng tối ưu của MAase

chịu nhiệt từ Thermus sp strain IM6501 là 60°C khi β-cyclodextrin được sử dụng

làm chất nền trong natri 50 mM acetate buffer pH 6,0) [58]

1.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến tốc độ chính và năng suất của quá trình thủy phân bằng enzyme Nồng độ cơ chất cao có thể dẫn đến ức chế cơ chất, làm giảm đáng kể tốc độ thủy phân Nồng độ cơ chất sẽ ảnh hưởng đến các vấn đề liên quan đến giảm nhiệt và hiệu suất truyền khối, các vấn đề về lưu biến và tăng nồng độ chất ức chế [59]

Năm 1913, Michaelis và Menten đã đề ra giả thuyết về vai trò của nồng độ cơ chất trong việc hình thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) (Hình 1.2)

Hình 1.3 Đồ thị Michaelis - Menten về sự tương quan giữa tốc độ phản ứng và nồng

độ cơ chất

(Với K m = hằng số Michaelis của enzyme đối vối cơ chất)

Khi nồng độ cơ chất thấp hơn KM rất nhiều, nghĩa là với số lượng enzym vượt quá số lượng cơ chất, trong phương trình Michaelis-Menten, ta có thể bỏ [S] ở mẫu số, phương trình trở thành dạng v=Vmax [S]/ KM, đây là phương trình tuyến tính dạng y =

20

ax, nghĩa là tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất [S] Lúc này phản ứng

là phản ứng động học bậc 1 bởi vì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất tăng lên đến mức đạt giá trị bằng giá trị KM thì phương trình Michaelis-Menten trở thành dạng V = Vmax/2, có nghĩa là tốc độ phản ứng bằng 1/2 tốc độ tối đa

Khi nồng độ cơ chất lớn hơn KM rất nhiều thì ta có thể bở KM ở mẫu số của phương trình Michaelis-Menten, và phương trình trở thành dạng V = Vmax, có nghĩa là tốc độ phản ứng đạt tốc độ tối đa (Vmax) Lúc này tất cả các phân tử enzyme đều bão hoà cơ chất, phản ứng đạt động học “bậc không”, bởi vì, dù có tiếp tục tăng nồng độ

cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng không thay đổi và lúc này tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ enzyme

Trong điều kiện nồng độ cơ chất thích hợp thì vận tốc phản ứng tuyến tính với nồng độ enzyme Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme tăng đến một giới hạn thì tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [60] Giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thừa, vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, hàm luợng chất khô hòa tan tăng Càng về sau sản phẩm tạo thành tăng lên, vừa đóng vai trò chất ức chế không cạnh tranh, vừa làm cho luợng cơ chất trong môi truờng giảm nên khi tiếp tục tăng nồng dộ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng không đáng kể

1.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Nồng độ của enzyme rất quan trọng trong phản ứng hóa học vì nó cần thiết để phản ứng với cơ chất Thông thường, một lượng nhỏ enzyme có thể phân giải một lượng lớn cơ chất Khi tăng nồng độ enzyme thì hiệu quả cũng tăng lên Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng, cơ chất phải có một lượng dư thừa, nghĩa là phản ứng phải độc lập với nồng độ cơ chất Bất kỳ sự thay đổi nào về lượng sản phẩm được tạo thành trong một khoảng thời gian nhất định sẽ phụ thuộc vào mức độ có mặt của enzyme Lượng enzyme có trong một phản ứng được đo bằng hoạt động mà nó xúc tác

1.4.5 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Tất cả các enzyme đều có thời gian phản ứng tối ưu để hiển thị hoạt tính xúc tác tối

đa của nó Trong sản xuất việc xác định được thời gian thủy phân hợp lý có ý nghĩa quan trọng về mặt kỹ thuật Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme gồm nhiều giai đoạn Ban dầu cơ chất bị thủy phân tạo lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh Sau đó các dextrin này bị phân cách tiếp tục tạo các mạch ngắn dần và bị phân giải chậm dến glucose và maltose [57]

1.5 Phương pháp tinh sạch enzyme mục tiêu

Trong dịch chiết enzyme thô thu được ngoài protein mục tiêu còn lẫn các tạp chất khác trong quá trình tách chiết (protein tạp, polysaccharide, nucleic acid, lipid, muối khoáng v.v ) Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, các phương pháp khác nhau được kết hợp như biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, tủa phân đoạn bằng, sắc ký, điện di,…

22

1.5.1 Phương pháp sắc ký

Thuật ngữ “sắc ký” lần đầu được sử dụng bởi nhà khoa học người Nga Mikhail Tsvet vào năm 1900 để mô tả hiện tượng hỗn hợp các sắc tố được mang theo bởi một dung môi để di chuyển trên giấy và tách ra khỏi nhau Sắc ký bao gồm hai pha pha động và pha tĩnh Pha động điều khiển các hợp chất chảy qua bề mặt của pha tĩnh và sự di chuyển của các hợp chất bị chậm lại do tương tác với pha tĩnh Các chất nền khác nhau tùy thuộc vào tương tác và cuối cùng được tách ra Pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn được gọi là sắc ký lỏng và được sử dụng rộng rãi trong việc tách các hợp chất nhỏ hoặc các đại phân tử sinh học

Các kỹ thuật khác nhau tách protein tùy thuộc vào các tính chất khác nhau bao gồm điện tích bề mặt, tính kỵ nước, kích thước phân tử và tương tác ái lực Trong đó, sắc

ký ái lực là kỹ thuật sắc ký nhanh và hiệu quả Hoạt tính sinh học đặc hiệu cao mang lại cho sắc ký ái lực độ chọn lọc cực cao, nhờ đó protein hoặc một nhóm protein có thể được tách ra khỏi mẫu thô trong một bước và đạt đến độ tinh khiết Tuy nhiên, những khó khăn trong việc thu nhận và cố định phối tử phù hợp, kỹ thuật sắc ký này không được sử dụng rộng rãi như các kỹ thuật khác

Sắc ký ái lực đề cập đến một loạt các kỹ thuật tách protein trên cơ sở tương tác thuận nghịch giữa các protein và các phối tử cụ thể của chúng kết hợp với một chất nền [62] Các tương tác ái lực bắt nguồn từ một loạt các phản ứng sinh học, gồm các tương tác giữa enzyme và các chất tương tự cơ chất, chất ức chế, cofactors, kháng thể và kháng nguyên, thụ thể và kháng nguyên màng, nucleic acid và trình tự bổ sung, histones, hoặc nucleic acid polymerase, protein liên kết nucleic acid, phân tử nhỏ sinh học và các thụ thể hoặc protein vận chuyển, ion kim loại và protein có trình tự polyhistidine

Tương tác ái lực là kết quả của sự kết hợp các loại tương tác khác nhau, bao gồm tương tác tĩnh điện, tương tác kỵ nước, lực van der Vaals hoặc liên kết hydro Các tương tác có độ đặc hiệu cao luôn cung cấp độ chọn lọc cực cao, nhờ đó protein mục tiêu có thể dễ dàng tách ra trong một bước với độ tinh khiết tăng hàng nghìn

23

lần và độ thu hồi cao Sắc ký ái lực tách protein thông thường trên cơ sở tương tác giữa các phối tử và vùng domain của protein đích Các tương tác không bị can thiệp bởi các vùng khác trong hầu hết các trường hợp Đầu tiên, protein đích được biểu hiện là protein gắn đuôi ở dạng dung hợp Sau đó, protein mục tiêu được tinh chế bằng cách sử dụng cột ái lực dành riêng cho protein gắn đuôi Nếu cần phải loại bỏ đuôi, protease hạn chế được sử dụng để thủy phân protein và giải phóng đuôi His, tách chúng ra khỏi protein mục tiêu bằng cách đi qua lại cột Các protein gắn đuôi dung hợp thường được sử dụng là His tag, GST tag, FLAG tag, S tag, Strep tag,…[63]

* Sắc ký ái lực kim loại cố định Ni-NTA

Hình 1.4 Liên kết ái lực của đuôi 6xHis với Ni2+

Trong quá trình tạo dòng, protein tái tổ hợp được gắn đuôi polyHistidine (his-tag) ở cuối đầu N hoặc C để tạo điều kiện cho tinh sạch và phát hiện Khi cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các protein mang đuôi ái lực His His-tag thường gồm 6 histidine, có thể được đặt ở nhóm amino cuối hoặc nhóm carboxyl cuối của protein, nơi chức năng của protein

ít bị suy giảm nhất Do có kích thước nhỏ (0,84 kDa ở hexahistidine) và không tích điện ở pH sinh lý bình thường, his-tag thường không ảnh hưởng đến việc gấp cuộn của protein Phương pháp tinh chế này được sử dụng trong các trường hợp không can thiệp đến cấu trúc hoặc chức năng của protein tái tổ hợp [64]

Đuôi 6xHis

24

Ion kim loại được sử dụng phổ biến nhất cho IMAC là Ni2+ do có ái lực cao với protein tái tổ hợp có đuôi 6xHis, trong khi hầu hết các protein khác sẽ liên kết với ái lực thấp hoặc hoàn toàn không liên kết Trong một số trường hợp có thể sử dụng các ion kim loại khác, ví dụ là Zn2+, Co2+,… vì ái lực gắn còn phụ thuộc vào bản chất của protein có đuôi histidine Khi đưa dịch chiết protein qua cột sắc ký chứa các ion

Ni2+, các ion này liên kết chọn lọc với đuôi histidine (Hình 1.3), những protein có đuôi histidine sẽ được giữ lại, sử dụng dung dịch đệm rửa có nồng độ imidazole thấp, rửa giải các protein nào liên kết yếu với cột nickel Sau đó thực hiện quá trình rửa protein có gắn his-tag bằng cách cho imidazole nồng độ cao đi qua cột Các phương pháp rửa giải khác bao gồm giảm độ pH, để histidine bị proton hóa và không còn có ái lực với nickel, hoặc sử dụng các tác nhân tạo chelate mạnh như EDTA và EGTA [64]

Thông thường, imidazole được thêm vào cả ba dung dịch đệm là binding buffer, washing buffer và elution buffer để can thiệp đến liên kết yếu của các không phải protein đích với cột và để rửa giải protein liên kết yếu đó Ở nồng độ cao hơn, imidazole cũng có thể làm giảm sự gắn kết của protein được gắn đuôi histidine Do

đó nồng độ imidazole phải được tối ưu hóa để đảm bảo độ tinh khiết cao và năng suất cao Các protein được gắn đuôi histidine khác nhau có nồng độ tối ưu là khác nhau (Histrap guide book)

1.5.2 Thẩm tích

Trong quá trình tích chiết protein và nucleic acid, thường còn sót lại các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như DTT, 2-mercaptoethanol, biotin,… hoặc chất bảo quản như natri azide, thimerosol, các chất này có thể gây ảnh hưởng đến bước tiếp theo trong quy trình thí nghiệm, hoặc muốn đổi hệ thống đệm khác cho mẫu protein để chuẩn bị cho điện di, trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực thì người ta thường sử dụng phương pháp thẩm tích Đây là kỹ thuật loại bỏ các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ, không mong muốn khỏi mẫu trong dung dịch bằng cách khuếch tán chọn lọc

và thụ động qua màng bán thấm Mẫu và dung dịch đệm (dung dịch thẩm tích, thường gấp 200 đến 500 lần thể tích của mẫu) đặt ở hai bên đối diện của màng [65]

25

Hình 1.5 Hình thức các phân tử nhỏ đi qua màng thẩm tích Thẩm tích hoạt động trên phương thức khuếch tán - quá trình phát sinh từ sự chuyển động nhiệt ngẫu nhiên của các phân tử trong dung dịch dẫn đến chuyển động ròng

từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp cho đến khi đạt được trạng thái cân bằng Trong thẩm tích, các phân tử không mong muốn bên trong màng khuếch tán

ra ngoài màng bán thấm vào dung dịch đệm Các phân tử lớn không thể đi qua các

lỗ của màng Ngược lại, các phân tử nhỏ sẽ tự do khuếch tán qua màng, làm giảm nồng độ của các phân tử không mong muốn trong mẫu (Hình 1.4) Màng thường được sử dụng cho thẩm tách trong phòng thí nghiệm dày 12 đến 30µm

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.6.1 Trong nước

Tác giả TS Hoàng Kim Anh đã triển khai nghiên cứu công nghệ sản xuất IMO và polydextrose từ bột và glucose bằng công nghệ sinh học và hoá học phục vụ cho mục tiêu phát triển công nghệ thực phẩm chức năng Tuy nhiên, sản phẩm này có phạm vi ứng dụng hẹp, không thể tạo cấu trúc dai, giòn, dẻo cho các sản phẩm Do

đó, hạn chế trong ứng dụng sản xuất các sản phẩm có tính chất cảm quan cao, có tốc

độ tiêu hóa chậm cho người bệnh đái tháo đường [66]

Các đề tài nghiên cứu trong nước như tác giả Vũ Thị Thuận và cộng sự đã sử dụng các enzyme dịch hóa trên thị trường Việt Nam như: Termamy (Đan Mạch), Amylex

HT (Trung Quốc) và SEB-Star HTL (Mỹ) để lựa chọn enzyme thích hợp cho việc sản xuất bột biến tính (2010) Tuy nhiên, tác giả chỉ sử dụng enzyme để dextrin hóa và chỉ dừng lại ở mức độ sản xuất bột biến tính, chưa phù hợp ứng dụng sản phẩm trong

26

công nghệ thực phẩm chức năng [67] Bên cạnh đó tác giả Nguyễn Thị Minh Hạnh (Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng) đã nghiên cứu sản xuất bột biến tính bằng enzyme Veron M4 (Đức) và Termamyl (Đan Mạch) (2008) Tuy nhiên, đề tài

chỉ dừng lại ở việc sử dụng từng loại enzyme để tiến hành dextrin hóa [68]

Tác giả Trương Thị Thảo Nguyên và Trần Hữu Dũng ở Trường Đại học Y - Dược Huế cũng đã tiến hành nghiên cứu điều chế tinh bột biến tính bền vững với enzyme amylase (Tạp chí Dược học, 9/2012) Tuy nhiên, tác giả sử dụng phương pháp hóa học để sản xuất bột biến tính: dùng POCl3 theo các tỉ lệ khác nhau để tạo liên kết chéo, ngăn cản sự phản ứng giữa bột và enzyme Tuy nhiên, đề tài chỉ dừng lại ở mức độ tạo bột biến tính bền vững với hệ enzyme α-amylase, chưa ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường [69]

1.6.2 Ngoài nước

Năm 1997, Hiroki Takata đã công bố kết quả nghiên cứu một số đặc tính và sản xuất dextrin có dãy phân bố mạch hẹp Kết quả nghiên cứu đã biến đổi thành công amylopectin thành dextrin bằng cách sử dụng phản ứng tuần hoàn của enzyme phân

nhánh (BE) từ Bacillus stearothermophilus TRBE14 Enzyme đã thủy phân

amylopectin rất hiệu quả ở nồng độ cơ chất cao (20 - 30% w/w) Những kết quả này cho thấy BE có thể hữu ích như một loại enzyme sản xuất tinh bột mới [70]

Tác giả Kwang Yeon Lee (2006) đã nghiên cứu và công bố trên tạp chí

Carbohydrate Polymer về khả năng trở lại trạng thái đầu khi biến đổi nhiệt cũng

như độ ổn định khi làm lạnh đông và rã đông của gel bột gạo sau khi biến tính bằng enzyme α-glucanotransferase [71]

Năm 2007, Jung-Ah Han và James N Bemiller đã nghiên cứu và công bố kết quả

trên tạp chí Carbohydrate Polymer về việc tạo ra những loại bột biến tính chậm tiêu

cũng như tính chất vật lý của sản phẩm [72] Tác giả Seo, N S (2007) đã nghiên cứu về cấu trúc của bột gạo trong bánh được biến tính bằng enzyme 4-α-

glucanotransferase của vi sinh vật Thermus scotoductus Cấu trúc phân tử tinh bột,

kết cấu và sự thoái hóa ngược của sản phẩm sau khi xử lý bằng enzyme có hàm