Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất tinh khiết từ dịch chiết của cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum ở núi ngọc linh, tỉnh quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐOÀN THỊ KIM NGỌC NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA P

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐOÀN THỊ KIM NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TỪ DỊCH CHIẾT

CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

Ở NÚI NGỌC LINH, TỈNH QUẢNG NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐOÀN THỊ KIM NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TỪ DỊCH CHIẾT

CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

Ở NÚI NGỌC LINH, TỈNH QUẢNG NAM

Chuyên ngành : Hóa Lý thuyết và Hóa lý

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

5 BỐ CỤC LUẬN VĂN 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ BẦU BÍ VÀ CÂY GIẢO CỔ LAM 4

1.1.1 Họ Bầu bí 4

1.1.2 Cây giảo cổ lam 4

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY GIẢO CỔ LAM 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí 15

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 17

2.2.3 Phương pháp định danh thành phần hóa học của các cao chiết 19

2.2.4 Phương pháp phân lập hợp chất tinh khiết 19

2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất 20

2.3 CÁC SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 20

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm thu các loại cao chiết 20

2.3.2 Sơ đồ phân lập cao chiết n-hexane 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ 26

3.1.1 Độ ẩm 26

3.1.2 Hàm lượng tro 26

3.1.3 Hàm lượng kim loại 27

3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾT CHƯNG NINH 28

3.2.1 Khảo sát giá trị nhiệt độ 28

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ rắn - lỏng 28

3.2.3 Khảo sát giá trị thời gian 29

3.3 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC CAO CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 29

3.3.1.Định danh thành phần các cấu tử trong cao chiết n-hexane 29

3.3.2 Định danh một số cấu tử trong cao chiết chloroform 33

3.3.3 Định danh một số cấu tử trong cao chiết ethyl acetate 36

3.3.4 Định danh một số cấu tử trong cao chiết dichloromethane 38

3.3.5 Định danh một số cấu tử trong cao chiết ethanol 41

3.3.6 Định danh một số cấu tử trong cao chiết methanol 43

3.3.7 Tổng hợp thành phần hóa học được định danh trong các cao chiết 45

3.4 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC CẤU TẠO CỦA HỢP CHẤT TINH KHIẾT 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Đào Hùng Cường đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Sau hai năm được học tập tại khoa Hóa - Trường Đại Học Sư phạm Đà Nẵng, tôi đã tiếp thu được rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm bổ ích Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Sư phạm Đà Nẵng, đặc biệt

là các thầy cô trong khoa Hóa, những người luôn ân cần, nhiệt huyết chỉ bảo và hỗ trợ chúng tôi rất nhiều trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Vì thời gian và khả năng có hạn nên trong luận văn này không tránh được những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự đóng góp chân thành của thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn

Cuối cùng, xin kính chúc tất cả các thầy cô giáo luôn dồi dào sức khỏe, công tác tốt và thành công trong công việc

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 01 năm 2020

Học viên

Đoàn Thị Kim Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đoàn Thị Kim Ngọc

EtOAc: Ethyl acetate

FT-IR: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier – Fourier Transform Infrared

TLC: Sắc ký lớp mỏng - Thin Layer Chromatography

UV-Vis: Tử ngoại khả kiến - Ultraviolet Visible

3.13 Tổng hợp thành phần hóa học đƣợc định danh trong các

3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP1 và chất tham khảo 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

1.2 Cấu trúc khung dammaran 11 1.3 Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh hở 12 1.4 Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh vòng 12 1.5 Cấu trúc của 1 trans-lutein 13 2.1 Cây khô xay thành bột 14 2.2 Sơ đồ thực nghiệm thu các loại cao chiết 21 2.3 Sơ đồ phân lập chất từ cao n-hexane 22 2.4 Cột sắc ký sau khi nạp mẫu 25 2.5 Sắc ký bản mỏng GPH5 25 3.1 Sắc ký đồ GC-MS cao chiết n-hexane của giảo cổ lam 30 3.2 Sắc ký đồ GC-MS trong cao chiết chloroform của giảo cổ lam 34 3.3 Sắc ký đồ GC-MS cao chiết ethyl acetate của giảo cổ lam 36 3.4 Sắc ký đồ GC-MS cao chiết dichloromethane của giảo cổ lam 39 3.5 Sắc ký đồ GC-MS của cao chiết ethanol của giảo cổ lam 41 3.6 Sắc ký đồ GC-MS của cao chiết methanol của giảo cổ lam 43

3.8 Phổ UV-Vis của hợp chất GP1 47 3.9 Phổ hồng ngoại (FT-IR) của hợp chất GP1 49 3.10 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất GP1 49-50 3.11 Phổ 13C-NMR (MeOD-C13CPD) của hợp chất GP1 51-52 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất GP1 53

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Những đặc thù về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam rất thuận lợi cho hệ sinh thái phát triển, vì thế nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Từ xưa đến

nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống

của con người Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v

Nam Trà My ở tỉnh Quảng Nam là vùng đất có đặc điểm tự nhiên với địa hình

đa dạng, khí hậu có độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển hệ thống thực vật học phong phú, đặc biệt là các loại cây dược liệu Núi Ngọc Linh ở huyện Nam Trà My có độ cao 2598 m so với mực nước biển, điều kiện khí hậu phù hợp cho các loại cây dược liệu phát triển như sâm Ngọc Linh, giảo cổ lam, đẳng sâm, đương quy, sa nhân, sâm nước, Huyện Nam Trà My chọn cây dược liệu là hướng đi chính và lâu dài để giúp người dân không chỉ thoát nghèo nhanh mà còn hướng đến làm giàu bền vững Trong đó có cây Giảo cổ lam là một cây thuốc quý có rất nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe, được ví như Nhân sâm Một trong những tác dụng quý của giảo cổ lam là hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, huyết áp và nhiều tác dụng khác như hạ mỡ máu, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, bảo vệ gan, giảm căng thẳng mệt mỏi, giúp tăng lực mạnh, ăn ngủ tốt, tăng khả năng miễn dịch, …

Cây giảo cổ lam là một loài dược liệu thuộc học Bầu bí, có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum, còn có tên là cổ yếm, cây cỏ thần kỳ, thư tràng năm

lá, dây lõa hùng, trường sinh thảo hoặc ngũ diệp sâm, thất diệp đởm, cây trường thọ Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại saponin cấu trúc triterpen kiểu dammaran, trong đó có nhiều loại có cấu trúc rất giống với saponin có trong Nhân sâm và Tam thất Giảo cổ lam còn chứa nhiều flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và có tác

dụng chống lão hóa mạnh Ngoài ra còn có các acid amin tan trong nước, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se

Cho đến nay đã có một số đề tài nghiên cứu về cây giảo cổ lam trên thế giới và

ở Việt Nam nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng của các hợp chất có trong giảo cổ lam ở núi Ngọc Linh Với những lí do trên,

chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần

hóa học và phân lập chất tinh khiết từ dịch chiết của cây Giảo cổ lam

Gynostemma pentaphyllum ở núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam” nhằm góp phần

nâng cao giá trị khoa học và giá trị sử dụng của cây Giảo cổ lam, giúp phát triển kinh tế của địa phương

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất đã phơi hay sấy khô của cây giảo cổ lam, được lựa chọn một cách ngẫu nhiên trên núi Ngọc Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

3.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ cây giảo cổ lam

- Phân lập, tinh chế một số hợp chất hóa học từ dịch chiết của giảo cổ lam

- Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập được

3.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu, xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học của giảo cổ lam

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài

- Trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và sinh viên

4.2 Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp chọn, thu hái và xử lí mẫu

- Phương pháp xác định các chỉ số hóa lý: Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng; Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu; Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Chiết trích ly bằng các dung môi hữu cơ khác nhau

- Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu

- Định danh các hợp chất chính trong cao chiết từ giảo cổ lam với các dung môi chiết khác nhau (n–hexane, chloroform, ethyl acetate, dichloromethane, ethanol

và methanol) bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS

- Phân lập, tách và tinh chế hợp chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại

- Các phương pháp khảo sát cấu trúc: kết hợp các phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT–IR), sắc ký ghép nối khối phổ (GC-MS), phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1

H–NMR, 13C–NMRvà các phương pháp khác để xác định cấu trúc của các chất phân lập được

5 BỐ CỤC LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU

Chương 1 - TỔNG QUAN

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ BẦU BÍ VÀ CÂY GIẢO CỔ LAM

1.1.1 Họ Bầu bí

Họ Bầu bí Cucurbitaceae là một họ thực vật bao gồm dưa hấu, dưa vàng, dưa

chuột, bí đao, bầu, bí ngô, mướp, mướp đắng Nó là một trong những họ quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới Hiện nay người ta công nhận trong họ này có 125 chi với khoảng 960 loài phân bố rộng khắp, chủ yếu tại khu vực nhiệt đới và ôn đới Ở Việt Nam có khoảng 50 loài Phần lớn các loài trong họ này là các loại dây leo sống một năm với hoa khá lớn và sặc sỡ [8]

Trong đó, tông Gomphogyneae gồm 6 chi với khoảng 56 loài Chi Giảo cổ lam Gynostemma Blume là một chi thực vật thân thảo sống lâu năm Hiện nay, trên

thế giới có khoảng 21 loài thuộc chi này (theo các nguồn khác nhau) Ở Trung Quốc

đã ghi nhận 14 loài [13] Ở Việt Nam, chi Gynostemma có 5 loài [14] Các loài

trong chi này sinh sống trong khu vực nhiệt đới châu Á cho tới Đông Á, từ dãy núi Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea [1]

1.1.2 Cây giảo cổ lam

a Tên gọi

Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae)

Tên thường gọi là Giảo cổ lam hay còn gọi là cam trà vạn, long đởm, cổ yếm, thư tràng năm lá, dây lõa hùng, cây trường sinh (trường sinh thảo), cây cỏ thần kỳ, cây bổ đắng, sâm phương nam hoặc thất diệp đảm, ngũ diệp sâm

Phân loại khoa học: Theo các tài liệu Cây cỏ Việt Nam [6], Thực vật dược và

phân loại thực vật [9], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae (Họ bầu

bí) Vị trí phân loại của Giảo cổ lam:

- Liên giới: Sinh vật nhân thực Eukaryyota

- Giới: Thực vật Plantae

- Phân giới: Thực vật xanh Viridaeplantae

- Ngành: Thực vật có hoa, Mộc Lan, Hạt kín Magnoliophyta

- Chi: Giảo cổ lam Gynostemma

- Loài: Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum

b Phân bố:

Cây giảo cổ lam mọc ở độ cao 300-3200m, trong các rừng thưa và ẩm ở Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên và một số nước châu Á khác Tại Việt nam, cây giảo cổ lam mọc ở nhiều nơi, trên những vùng núi cao như Lào Cai, Lạng Sơn, Yên Bái, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum

c Đặc điểm thực vật [2]

Phần trên mặt đất có dạng dây leo Thân hình trụ, có góc cạnh, dài 0,3m đến 1,0m, phân đốt, khoảng cách giữa các đốt từ 6,0cm đến 10,0cm, mang tua cuốn mọc cùng phía cuống lá và lá Lá kép hình chân chim có đến 5 đến 7 lá chét, lá chét ở giữa thường lớn hơn lá chét ở bên, cuống lá dài 3,0 cm đến 5,0cm Phiến lá màu lục hay hơi vàng nâu, mép có răng cưa tròn, vị đắng, ngọt (Hình 1.1)

Giảo cổ lam bảy lá (Thất long đởm) Giảo cổ lam năm lá (Ngũ diệp sâm)

Hình 1.1 Cây giảo cổ lam

Giảo cổ lam là một loài cây thảo có thân mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách

lá Hoa đơn tính khác gốc (cây đực và cây cái riêng biệt) Lá đơn xẻ chân vịt rất sâu trông như lá kép chân vịt Cụm hoa hình chùy mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa rời nhau xoè hình sao, bao phấn dính thành đĩa, bầu có ba vòi nhụy Cây

ra hoa vào tháng 7-8, có quả chín từ tháng 8-10 Quả khô hình cầu, đường kính 5,0 - 9,0mm, khi chín màu đen [8]

d Vi phẩu [2]

Thân: Lớp biểu bì là những tế bào tròn, nhỏ đều đặn, xếp thành hàng, thành tế bào phía ngoài hóa cutin Mô dày cấu tạo khoảng 2 đến 3 lớp tế bào thành dày Mô dày phát triển ở phần lồi Mô mềm vỏ là những tế bào hình trứng có thành mỏng

Mô cứng tế bào hình đa giác thành dày hóa gỗ tạo thành vòng liên tục uốn theo chỗ lồi lõm của thân Phía trong mô cứng là mô mềm ruột có những bó libe-gỗ xếp thành vòng tương ứng với phần lồi của thân Phía trong các bó libe-gỗ xếp xen kẽ tạo thành vòng thứ 2 Bó libe-gỗ có mạch gỗ ở giữa và libe xung quanh, libe ở phía ngoài phát triển hơn phía trong

Gân lá: Biểu bì trên gồm những tế bào hình chữ nhật thường có lông che chở

đa bào, các tế bào ngắn Biểu bì dưới cấu tạo bởi những tế bào hình tròn, xếp thành hàng Mô dày sát biểu bì trên và dưới gồm 2 đến 3 lớp tế bào thành dày Bó libe-gỗ của gân chính cấu tạo bởi một cung libe bao quanh cung gỗ Mô mềm gỗ gồm những tế bào thành mỏng có hình dạng thay đổi Phiến lá: Biểu bì trên và dưới có một lớp tế bào hình chữ nhật thỉnh thoảng có lông tiết đầu đơn bào Dưới biểu bì trên là lớp mô mềm giậu gồm 1 đến 2 hàng tế bào nhỏ Mô mềm có 2 đến 3 lớp tế bào thành mỏng

Phiến lá: Biểu bì trên và dưới có một lớp tế bào hình chữ nhật thỉnh thoảng có lông tiết đầu đơn bào Dưới biểu bì trên là lớp mô mềm giậu gồm 1 đến 2 hàng tế bào nhỏ Mô mềm có 2 đến 3 lớp tế bào thành mỏng [2]

e Bột: Bột màu vàng xanh Lông che chở đa bào, lông tiết, mảnh phiến lá có

mạch xoắn, mảnh biểu bì lá mang lỗ khí, mạch xoắn, sợi xếp thành bó hay đứng riêng lẻ Mảnh biểu bì có các u lồi [2]

f Công dụng của cây giảo cổ lam

Các tác dụng của Gynostemma được cho là có được bởi saponin và flavonoid,

đặc biệt là saponin, thành phần đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc Trong các loài thuộc chi flavonoid được nghiên cứu,

giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum là loài được nghiên cứu và công bố nhiều

nhất với tác dụng dược lý đáng chú ý như sau:

- Tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống viêm và nhiễm trùng

- Tác dụng làm hạ mỡ máu, nhất là giảm cholesterol toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não (hết đau đầu, hoa mắt, giảm các cơn đau tim)

- Chống lão hóa, giảm căng thẳng mệt mỏi, giúp tăng lực, tăng khả năng làm việc Tăng cường hệ miễn dịch và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, ngăn ngừa, kìm hãm sự hình thành và phát triển của khối u một cách rõ rệt

- Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cường máu lên não, ngăn ngừa chứng lú lẫn ở người già

- Rất tốt cho tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan

- Điều chỉnh rối loạn chuyển hóa mỡ nên làm giảm béo tốt, nhất là béo bụng, đùi

Tóm lại, giảo cổ lam có công năng: Thanh nhiệt, giải độc, chỉ ho, trừ đờm Chủ trị: đợt cấp của viêm phế quản mạn tính, viêm gan virus,viêm thận, viêm dạ dày cấp, bệnh tiểu đường, chứng tăng mỡ máu…[2]

Hiện nay ở Việt Nam, giảo cổ lam được trồng trên diện rộng ở các địa phương, được chế biến thành các sản phẩm trà Giảo cổ lam đa dạng và được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Ba Tri, Tam Đảo, Huyện Nam Trà My có thương hiệu trà Giảo cổ lam Hà Vy, Mười Cường

g Cách dùng, liều lượng

Mỗi ngày dùng 15-30g giảo cổ lam đã phơi hoặc sấy khô, sắc uống hoặc tán thành nột thô hãm trà uống [2]

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 1997, GS.TS Phạm Thanh Kỳ (nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội, Chủ nhiệm bộ môn Dược liệu) đã phát hiện ra cây giảo cổ lam trên núi Phanxipang tại Lào Cai (đề tài cấp quốc gia mã số KC.07.03.03) và được giáo sư Vũ Văn Chuyên (Đại học Dược Hà nội) xác định

đúng là loại Gynostemma pentaphyllum [8], sau đó thấy ở Cao Bằng, Hà Giang…

Ngoài ra, giảo cổ lam còn được tìm thấy ở một số địa phương thuộc vùng đồi núi phía Bắc Cây giảo cổ lam cũng được Viện dược liệu Trung ương, Đại học Y Hà Nội kết hợp với Thụy Điển nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng hạ đường huyết Theo Võ Văn Chi [5], trong giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường

GS.TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự tại Hàn Quốc đã chiết tách được thành phần hoạt chất mới trong cây Giảo cổ lam Việt Nam (chưa từng được phát hiện

và công bố trên thế giới) thử nghiệm trên khối u phổi, đại tràng, vú, tử cung, tiền liệt tuyến cho kết quả rất tốt Hoạt chất mới này có khả năng kìm hãm và tiêu diệt các tế bào ung thư nói trên đồng thời nâng cao hệ miễn dịch của cơ thể GS TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã tìm ra bốn loại gypenosid có tác dụng chống u mạnh Ngoài ra, ông còn phát hiện hoạt chất glycozit là một steroid có tác dụng tăng co sợi cơ tim

Trong một nghiên cứu phối hợp giữa các nhà khoa học Việt Nam tại Viện dược liệu Trung ương và Viện Karolinski Thụy Điển, Hội đái tháo đường Thụy Điển về cây Giảo cổ lam Việt Nam, GS TS Đào Văn Phan và cộng sự đã tìm thấy một hoạt chất mới đặt tên là phanoside Chất này có tác dụng hạ đường huyết mạnh đồng thời kích thích tụy tăng tiết Insulin và làm tăng sự nhạy cảm của tế bào đích với insulin Phanoside với liều 500 µM kích thích tạo ra insulin mạnh gấp 5 lần hoạt chất glibenclamide - thuốc chữa bệnh tiểu đường thông dụng Đây là một tin vui cho những bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường tuýp 2

GS TSKH Trần Văn Sung đã tìm ra trong giảo cổ lam có hoạt chất Adenosin có tác dụng tái tạo năng lượng một cách nhanh chóng, điều hòa nhịp tim và kích hoạt giấc ngủ

Năm 2008, Phạm Tuấn Anh, Trường Đại học Dược Hà nội đã nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Sapa Đến năm 2019, ông tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác

dụng sinh học của ba loài huộc chi Gynostemma Blume ở Việt Nam, trong đó có loài Gynostemma pentaphyllum Từ loài Gynostemma pentaphyllum đã phân lập và

xác định được cấu trúc hóa học của 8 saponin dammaran, trong đó có 1 hợp chất đã biết 3ß,20S,21-trihydroxydammar-24-en3O-𝛼-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[(ß-D-

glucopyranosyl-(1→3])-𝛼-L-arabinopyranosyl-21-O-ß-D-glucopyranosid (SAP2) và

7 hợp chất mới đặt tên là gypenosid VN1-7 Saponin toàn phần chiết từ

Gynostemma pentaphyllum có tác dụng ức chế dòng tế bào OVCAR8 mức độ yếu

(112,09µg/ml), Lu mức độ trung bình (87,62µg/ml) và MCF-7 mức độ trung bình

(50,88µg/ml) Bảy saponin phân lập từ Gynostemma pentaphyllum là gypenosid

VN1-7 đều có tác dụng ức chế các dòng tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 trong đó mạnh nhất là gypenosid VN2 đạt IC50 = 19,6µM đối với dòng ung thư phổi A549 Các gypenosid VN1-7 ức chế yếu dòng tế bào HL-60 [1]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc điểm hình thái của loài Gynostemma simplicifolium [12] Từ đó đến nay, đã

có thêm nhiều loài được mô tả Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và

sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh Năm 1976, Nhật Bản tình

cờ phát hiện cây này khi nghiên cứu một bộ lạc sống trên núi có tuổi thọ bình quân rất cao mà nguyên nhân là do người dân nơi đó thường xuyên uống cây này [8] Kể

từ đó, cây giảo cổ lam được chú ý nghiên cứu kĩ lưỡng tại nhiều quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ… Cây này được dùng ở Trung Quốc với tên là 絞股藍

(Jiaogulan), Nhật Bản với tên 古代の青(Amachazuru,) ở Hàn Quốc với tên gọi 고대블루(Dungkulcha), ở Thái Lan với tên gọi (Cha-satun)

Giảo cổ lam là cây thuốc đã được dùng theo y học cổ truyền Trung Quốc Người Trung Quốc từ lâu xem cây này như thuốc trường sinh, bởi lẽ người dân ở tỉnh Quý Châu uống trà giảo cổ lam thường xuyên thì sống rất thọ Cây này còn được gọi là nhân sâm phương Nam hay nhân sâm năm lá, mặc dù thực tế loài này không có họ hàng gì với nhân sâm đích thực

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)

Makino là một loại thuốc thảo dược cực kỳ linh hoạt và đã được nghiên cứu rộng

rãi ở Trung Quốc Các saponin dammarane được phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum, cụ thể là gypenosides hoặc gynosaponin, được cho là các thành phần

hoạt động chịu trách nhiệm cho các hoạt động sinh học khác nhau của nó và báo cáo tác dụng lâm sàng Đánh giá này thử nghiệm bao gồm các tài liệu có sẵn

về Gynostemma pentaphyllum, từ việc trồng trọt đến cách ly các thực thể hóa học và

tóm tắt các đặc tính dược lý đa dạng do hàm lượng gypenoside của nó Các khía

cạnh khác như độc tính và dược động học cũng được thảo luận In vitro và in vivo bằng chứng cho thấy Gynostemma pentaphyllum có thể bổ sung cho loại thuốc thảo dược phổ biến, Panax ginseng, vì nó cũng chứa hàm lượng ginsenoside cao và thể

hiện các hoạt động sinh học tương tự [13]

Thành phần hóa học chủ yếu của giảo cổ lam là saponin và flavonoid Số sapoin của giảo cổ lam nhiều gấp 3 - 4 lần so với nhân sâm Trong đó, một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc có trong nhân sâm (ginsenozit)

Các saponin trong cây giảo cổ lam (còn gọi là gypenosid hay gynosaponin) có cấu trúc triterpen khung dammaran, trong đó có nhiều hợp chất đã được xác định có trong thành phần saponin trong nhân sâm và tâm thất Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các carotenoid, polysachachride, sterol, các acid amin tan trong nước và các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se [21] Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện phần aglycon của saponin trong giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran [17], [21]

Hình 1.2 Cấu trúc khung dammaran

Dammaran là một nhóm saponin 4 vòng (saponin triterpenoid tretracyclic) Khung cấu trúc 4 vòng và một mạch nhánh 8 carbon 4 vòng gồm 3 vòng 6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh Do có nhóm OH đính vào C-20 nên khi tác dụng bởi acid, mạch nhánh

dễ bị đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Phần đường nối vào OH ở carbon C-3 hoặc C-20 để tạo thành glycosid Các nghiên cứu về phân lập saponin từ chi

Gynostemma chủ yếu tập trung vào loài GP Saponin trong GP còn được gọi là

gynosaoni hay gypenosid, hàm lượng gypenosid toàn phần chiếm khoảng 2,4% khối lượng dược liệu khô và đã có hơn 100 loại gypenosid được phân lập

Loại đường chính trong gypenosid hầu hết là loại pyranose (βDglucose, β D-xylose, α-L-arabinose và s-L-rhammnose nối ở C-3 và C-20) Nhóm chức tiêu biểu là hydroxyl, methyl, aldehyt, alcol và ít phổ biến nhất là cetone nối vào C-19 Một nhóm hydroxyl cũng có thể đính vào C-2 [8]

-Khung triterpen dammaran của các aglycon saponin có trong cây giảo cổ lam

có thể có mạch nhánh hở (Hình 1.3) hay mạch nhánh vòng (Hình 1.4) Nhóm chức thường gặp nhất là nhóm hydroxyl, thường thấy xuất hiện ở C-3, C-20, C-21, và C-

25, ít gặp hơn là ở 2, 12, 19 và 24 Các nhóm chức khác như nối đôi (ở

C-23, C-24 và C-25), aldehyt (ở C-19) và keton (ở C-12) cũng thấy xuất hiện trong một vài hợp chất

Hình 1.3 Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh hở

Hình 1.4 Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh vòng

Nghiên cứu về flavonoid: Flavonoid là một thành phần chính có mặt trong các

loài thuộc chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu hơn saponin Đã xác

định được một số flavonoid là ombuin, ombuoside, rutin [21]

Năm 2004, Liu và các cộng sự đã xác định được 25 carotenoid có trong cây

giảo cổ lam bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là trans-lutein (Hình 1.5), cis-lutein, các carotenoid như neochrom, neoxathin, trans-𝛼-caroten, auroxathin, violaxathin, luteoxathin, ß-cryptoxathin, các đồng phân cis- và trans-ß-

caroten [18]

Hình 1.5 Cấu trúc của 1 trans-lutein

Năm 1989, Marino và các cộng sự đã xác định rong cây giảo cổ lam có sự hiện diện của các sterol thường gặp như ergostanol, sitosterol và stigmasterol với hàm lượng rất thấp (khoảng 0,0001%) [19]

 Nhận xét

Với một số lượng lớn các công trình nghiên cứu về cây cây giảo cổ lam

Gynostemma pentaphyllum đến từ nhiều quốc gia khác nhau đã cho thấy tầm quan

trọng của cây thuốc cổ truyền này trong ngành thảo dược trên thế giới Mặc dù, ở các nước có nền y học cổ truyền lâu đời như Trung Quốc, Hàn Quốc, các bài thuốc từ loài cây này đã được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên ở nước ta còn hạn chế hơn

so với hai quốc gia trên Nước ta cũng có một nền y học cổ truyền phát triển lâu đời với việc chịu khó học hỏi sử dụng các loại thảo dược Hơn nữa, khí hậu Việt Nam một số nơi cũng rất thuận lợi để loài cây này sinh sống và phát triển Nếu cây giảo

cổ lam được nghiên cứu đầy đủ và khai thác có hiệu quả thì đây sẽ là nguồn thảo dược tiềm năng của nước ta không chỉ cho nền y học cổ truyền mà còn là nguồn dược liệu quí giá trong việc điều chế các loại dược phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường, cao huyết áp, ung thư,

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Cây giảo cổ lam được thu hái tại núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam, rửa sạch, phơi khô rồi cắt đoạn ngắn 2cm đến 3cm phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50-600

C (Hình 2.1) để chiết bằng dung môi methanol, sau đó chiết lần lượt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate, diclomethane, ethanol và methanol

a Cây sau khi phơi b Cây khô sau khi cắt c Cây khô sau khi xay

Hình 2.1 Cây khô xay thành bột 2.1.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng một số hoá chất trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng trong thực nghiệm

n-hexane

C 6 H 14

chloroform CHCl 3

dichloro methane

Dung môi dùng để chạy cột chính (n-hexane) được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm

Ngoài ra còn có các hóa chất khác dùng để làm khan (Na2SO4)

Sắc ký lớp mỏng (TLC): sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 60F254, có

độ dày 0,2mm Sắc ký cột thường: silicagel cỡ hạt 197-400 mesh (0,040 – 0,063 mm)

Bộ chiết soxhlet, thiết bị cô quay chân không, tủ sấy, lò nung, cân phân tích (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng), máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc - Mỹ Phẩm - Thực phẩm Quảng Nam - số 09 Nguyễn Chí Thanh - Tam Kỳ

- Quảng Nam) và Máy đo sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS (Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 – số 2 Ngô Quyền - Đà Nẵng)

Cột sắc ký: cột thủy tinh (có lớp lọc thủy tinh frit) cao khoảng 45 cm, đường kính trong 3cm, 4cm

Đèn tử ngoại bước sóng λ= 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng tại khoa Hóa trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

+ Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy

Shimadzu tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí

a) Xác định độ ẩm

Để xác định độ ẩm, tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng

950-1100C Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu bột cây khô và lấy kết quả trung bình Chuẩn bị các cốc thủy tinh có kí hiệu sẵn, các cốc thủy tinh được rửa sạch và được sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lượng

không đổi m1

Mẫu bột giảo cổ lam để xác định độ ẩm là mẫu đã qua xử lí Lấy vào mỗi cốc thủy tinh khoảng 3g bột nguyên liệu (m2) theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén thủy tinh, sấy ở nhiệt độ trên, cứ sau 5 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi m3 Khối lượng

ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3 Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lượng mẫu bột khô ban đầu [2]

Công thức:

* Độ ẩm của mỗi mẫu: W(%) = ( ) x 100%

* Độ ẩm trung bình: W TB (%) = ∑ ( )

Trong đó:

m1: Khối lượng cốc thủy tinh (g)

m2: Khối lượng mẫu bột khô giảo cổ lam (g)

m3: Khối lượng cốc thủy tinh và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu

Wtb (%): Độ ẩm trung bình

Chỉ tiêu: Độ ẩm giảo cổ lam không quá 13% [2]

b) Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật, người ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô - ướt kết hợp Các mẫu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để tro hóa Các mẫu đựng trong chén sứ được đun trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 500-5500C trong thời gian từ 4 - 6 giờ, cho đến khi thu được tro trắng Các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng m4

% tro trung bình = ∑

Trong đó:

m4: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

Chỉ tiêu: Tro toàn phần không quá 10% [2]

c) Xác định hàm lượng một số kim loại trong giảo cổ lam bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS

Chúng tôi đã tiến hành trong điều kiện như sau: Mẫu sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 loãng và định mức đến 200 mL Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc - Mỹ Phẩm - Thực phẩm Quảng Nam - số 09 Nguyễn Chí Thanh - Tam Kỳ

- Quảng Nam

Chỉ tiêu: Pb không quá 2,0 ppm; Cd không quá 1,0 ppm; Hg không quá 0,5 ppm; As không quá 1,0 ppm [2]

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết trích ly bằng các dung môi khác nhau

Để thực hiện chiết trích ly với các dung môi khác nhau, chúng tôi thực hiện thu cao chiết methanol với một khối lượng lớn bằng phương pháp chưng ninh

a) Chiết chưng ninh với methanol

Cho m gam nguyên liệu bột giảo cổ lam và V mL methanol vào một bình cầu

có lắp sinh hàn hồi lưu Gia nhiệt hỗn hợp chiết trong một thời gian t Lọc nóng dịch chiết, sau đó làm bay hơi dung môi methanol thu được cao chiết m1 Bằng cách

thay đổi các thông số nhiệt độ chiết, tỉ lệ rắn/lỏng và thời gian chiết ta tìm ra được các thông số thích hợp nhất để thu được lượng cao chiết methanol lớn nhất

Lấy một ít cao chiết methanol đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

b) Chiết trích ly với các dung môi hữu cơ

Để thu cao chiết bằng các dung môi hữu cơ, cho vào cao chiết methanol 50mL nước cất rồi tiến hành chiết trích ly bằng các loại dung môi

- Thu cao chiết n-hexan: Cho 100mL dung môi n-hexan vào dịch chiết nước rồi cho vào một phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 1) và thu phần dịch chiết n-hexan phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết n-hexan lại với nhau và làm bay hơi dung môi n-hexan trên thiết

bị cô quay chân không thu được cao chiết n-hexan Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết chloroform: Cho 100mL dung môi chloroform vào dịch nước

1 rồi cho vào một phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh vào cốc thủy tinh (dịch nước 2) và thu phần dịch chiết chloroform phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết chloroform lại với nhau và làm bay hơi dung môi chloroform trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết chloroform Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết ethyl acetate: Cho 100mL dung môi ethyl acetate vào dịch nước 2 rồi cho vào một phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 3) và thu phần dịch chiết ethyl acetate phía trên Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết ethyl acetate lại với nhau và làm bay hơi dung môi ethyl acetate trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết ethyl acetate Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết dichloromethane: Cho 100mL dung môi dichloromethane vào dịch nước 3 rồi cho vào một phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, để yên phễu chiết cho hỗn hợp dịch chiết phân thành hai lớp Lấy phần dịch nước phía dưới vào cốc thủy tinh (dịch nước 4) và thu phần dịch chiết dichloromethane Lặp lại thao tác này 3 lần, gom dịch chiết dichloromethane lại với nhau và làm bay hơi dung môi dichloromethane trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết dichloromethane Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

- Thu cao chiết ethanol: Cho 100mL dung môi ethanol vào dịch nước 4 rồi cho vào một phễu chiết Lắc trộn phễu chiết nhiều lần, lọc thu phần dịch chiết ethanol và làm bay hơi dung môi ethanol trên thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết ethano Cao chiết này được đưa đi định danh thành phần hóa học bằng GC-MS

2.2.3 Phương pháp định danh thành phần hóa học của các cao chiết

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành định danh thành phần hóa học của các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate, dichloromethane, ethanol và

methanol từ giảo cổ lam bằng phương pháp GC-MS

Chúng tôi sử dụng thiết bị sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS Agilent 7890A/5975C để định danh thành phần hóa học của các cao chiết Cột tách mao quản HP - 5MS (5% Phenyl Methyl Silox): 30 m x 250 μm x 0,25 μm, nhiệt độ bắt đầu tại 70oC, tăng 20oC/phút đến 160oC, sau đó tăng 1oC/phút đến 180oC, tiếp tục tăng 3oC/phút đến 290o

C kết thúc quá trình Nhiệt độ injector 300oC; nhiệt độ detector 280oC, khí mang He (20 mL/phút sau 2 phút ); áp suất : 8,1225 psi; thể tích bơm mẫu 1 μL, tỉ lệ chia dòng 10:1, tốc độ dòng chia 9,4248 mL/phút Các thông số vận hành khối phổ (MS) là điện thế ion hóa 70 eV; nhiệt độ nguồn ion 230oC, khoảng khối lượng m/z 30-600

2.2.4 Phương pháp phân lập hợp chất tinh khiết

Cao chiết n-hexane thu được sau quá trình chiết trong các dung môi khác nhau được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp và sắc ký lớp mỏng với các hệ

dung môi thích hợp Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường sử dụng silica gel 0,040 – 0,063 mm Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất

trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp [10]

2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Trong khuôn khổ đề tài, cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (GC-MS), phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều như 1H–NMR,

13C–NMR

2.3 CÁC SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm thu các loại cao chiết từ bột giảo cổ lam

Quá trình thực nghiệm khảo sát các chỉ số vật lý, thu cao chiết và định danh thành phần hoá học trong các cao chiết được trình bày trên Hình 2.2

Phương pháp chiết chưng ninh thu cao tổng methanol và ngâm chiết dịch nước lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform ethyl acetate, dichloromethane, ethanol Sau đó đuổi dung môi bằng cất quay chân không thu được các cao chiết tương ứng

Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (0,7 kg khô) được chiết với MeOH

theo tỷ lệ rắn/lỏng = 1/1.5; nhiệt độ 750C; thời gian 120 phút thu được dịch chiết, rồi đuổi dung môi bằng cất quay chân không thu được cao chiết methanol (3 lần x 5 lít) ở nhiệt độ phòng thu được 34 g cao chiết

Hình 2.2 Sơ đồ thực nghiệm thu các loại cao chiết

Chiết trích ly với dichloromethane

Bay hơi dung môi

Dịch nước 2

Chiết trích ly với chloroform

Cao (C) chloroform

Xử lý

Chiết trích ly với n-hexan

Bay hơi dung môi

Chiết trích ly với ethyl acetate

Cao (E) ethyl acetate

Dịch nước 3

Cao (D) dichloromethane

Dịch nước 4 Chiết trích ly với ethanol

Bay hơi dung môi

Bay hơi dung môi

Cao (E) ethanol

Bay hơi dung môi

phân lập

Chất tinh khiết

Đo phổ FT-IR UV-Vis

1

H-NMR

13C-NMR

để xác định cấu trúc

- Chưng ninh (MeOH)

- Xác định điều kiện tối ưu

- Bay hơi MeOH Cao (M)

methanol

Cao (H) n- hexane Dịch nước 1

H2O

GC-MS

GC-MS

2.3.2 Sơ đồ phân lập cao chiết n-hexane

Cao chiết methanol được hòa vào nước rồi chiết phân bố với n-hexane (5 x 2,5 lít), loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết n-hexane (GPH, 6 g)

và nước (GPW, 28 g) tương ứng

Quá trình phân lập chất từ cao n-hexane được thể hiện ở Hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập chất từ cao n-hexane

Lựa chọn dung môi chạy cột sắc ký

Cao chiết GPH được tách thô thành 7 phân đoạn, GPH1-GPH7, bằng cột

silica gel, rửa giải gradient n-hexane-CH2Cl2 (50:1; 25:1; 10:1; 5:1; 2,5:1; 1:1; 0:1; v/v) Phân đoạn GPH5 (93 mg) được tách tiếp bằng cột silica gel, rửa giải bằng hệ

GPH5

93 mg SKC, silicagel,

MeOH/H2O =6/1, 5 phân đoạn

n-hexane-CH2Cl2 (10:1; 15:1; v/v; 3,5 lít) thành 5 phân đoạn, GPH5A-GPH5E Tinh chế phân đoạn GPH5C (31 mg) bằng dung môi acetone thu được hợp chất

GP1 (12mg)

Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy giải ly phù hợp chúng tôi sử dụng sắc ký bản mỏng với các bước sau:

+ Hòa tan một lượng rất nhỏ cao chiết (H) trong dung môi n-hexane

+ Dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi bản mỏng với lượng tương đương nhau

+ Các bản mỏng được chạy với các loại dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexane, n-hexane/ethyl acetate (với các tỉ lệ 10/1; 15/1; 20/1; 25/1; 30/1), n-hexane /acetone (với các tỉ lệ 5/1; 10/1; 15/1; 20/1; 50/1), n-hexane /dichloromethane (với các tỉ lệ 50:1; 25:1; 10:1; 5:1; 2,5:1; 1:1; 0:1; v/v)

+ Tiếp theo hiện hình các vết trên bản mỏng bằng đèn UV

+ Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với các hệ dung môi giải ly khác nhau,

chúng tôi đã chọn dung môi giải ly phù hợp cho cột đầu tiên (phá mẫu) là n-hexane-

dichloromethane (50:1; 25:1; 10:1; 5:1; 2,5:1; 1:1; 0:1; v/v) và hệ dung môi methanol/nước (6/1) cho cột 2

Chuẩn bị mẫu

Phần cao n-hexane (6g) được hoà tan hoàn toàn trong dung môi n- hexane trong bình cầu cổ 29, thêm dần dần 10,5g silica gel Merck cỡ hạt 0,04 - 0,06mm vào bình cầu, lắc đều sao cho hỗn hợp trong bình cầu đồng nhất, sau đó cất quay dưới áp suất thấp đến khô hoàn toàn sao cho chất được gắn đều lên silica gel Cạo lấy phần silica gel đã gắn mẫu rồi làm tơi mịn bằng đũa thủy tinh trước khi đưa vào cột sắc ký

+ Silica gel sau khi được sấy ở 110oC trong khoảng 4 giờ, được bảo quản trong bình hút ẩm

+ Đổ silica gel vào cột để ước chừng lượng silica gel sẽ nhồi (khoảng tầm 2/3 chiều cao cột sắc ký), cột thứ nhất sau khi ước lượng đổ ra đem cân khoảng 140gam silica gel với kích thước cột khoảng 45cm - 4cm; cột thứ hai sau khi ước lượng đổ ra đem cân khoảng 70gam silica gel với kích thước cột khoảng 45cm – 3cm

+ Dùng cốc có mỏ 250mL, đong một lượng dung môi chạy cột ban đầu (cột 1:

n-hexane, cột 2: n-hexane/dichloromethan = 20/1) gấp khoảng 1,5 lần lượng silica gel, sau đó rót từ từ silicagel vào cốc, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng đũa thủy tinh để khuấy lên mà không làm ngược lại, để yên cốc trong vòng một đêm

+ Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột

+ Rót hỗn hợp sệt vào cột nhờ một phễu lọc có đuôi dài, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một cốc trống ở bên dưới để rót trả lại lên đầu cột Vừa rót vừa dùng thanh cao su gõ nhẹ vào cột để bột khí thoát ra và silicagel lắng xuống Tiếp tục đổ hỗn hợp sệt vào cột đến khi hết Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột kết hợp rửa thành cột khoảng 3 lần để cột được nạp chặt chẽ, đồng nhất Đóng van khóa ở dưới để yên để cột ổn định [10]

Nạp mẫu vào cột

Trong đề tài này, chúng tôi nạp mẫu ở dạng bột khô như sau:

+ Để lượng dung môi trong cột cao hơn mặt thoáng silica gel khoảng 2-3 cm,

đổ thật chậm silica gel khô đã bão hòa mẫu vào cột và để nó lắng xuống, phải đảm bảo mức dung môi luôn ở phía trên của silica gel, để ý xử lí bột khí (nếu có)

+ Sau khi cho xong mẫu lên đầu cột, nhẹ nhàng cho một lớp cát vào khoảng 6mm để tránh cho bề mặt của lớp silica gel bị ảnh hưởng khi thêm dung môi

3-+ Sử dụng pipet thêm từ từ dung môi vào cột để mức dung môi đạt khoảng 10mm phía trên lớp cát Để dung môi chảy xuống tới khi mức dung môi còn lại khoảng 1-2mm trên lớp cát, lặp lại khoảng 2 lần để đảm bảo toàn bộ mẫu đã được

hấp thụ lên silica gel Cuối cùng thêm lượng dung môi vào đầu cột và bắt đầu chạy cột (Hình 2.4)

Hình 2.4 Cột sắc ký sau khi nạp mẫu

Chạy cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane: dichloromethan (100:00:100) thu được các lọ, gom lại mỗi phân đoạn Các phân

đoạn này được kiểm tra trên sắc ký bản mỏng và được gộp thành 7 phân đoạn lớn

Các phân đoạn được kiểm tra trên sắc ký bản mỏng với hệ dung môi

methanol/nước = 6/1cho thấy phân đoạn GPH5 cho các vệt rõ ràng (Hình 2.5) Các phân đoạn còn lại cho vệt sát nhau Vì vậy chúng tôi chọn phân đoạn GPH5 để tiếp

tục tinh chế

Hình 2.5 Sắc ký bản mỏng GPH5