Nghiên cứu kỹ thuật nâng cao hệ số nhân giống lan kim tuyến anoectochilus roxburghii bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến sau 3 tuần nuôi cấy .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh

- -

ĐÀO BÁ TUYÊN

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NÂNG CAO HỆ SỐ NHÂN GIỐNG LAN

KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : 1 PGS.TS Ngô Xuân Bình

2 ThS Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH- CNTP - Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên - 2015

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian làm việc tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Ngô Xuân Bình, ThS Nguyễn Thị Tình và Ks Lã Văn Hiền đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để

đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện

Đào Bá Tuyên

LSD Least Singnificant Difference Test

MS Murashige & Skoog (1962)

NAA α-naphthalene acetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng bằng HgCl2đến hiệu quả vô trùng chồi lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 30Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến (sau 3 tuần nuôi cấy) 33Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến (sau 3 tuần nuôi cấy) 35Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 37Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 40Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 42Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng

ra rễ của lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Ảnh lan Kim Tuyến 5Hình 2.2: Hình ảnh hoa lan Kim Tuyến 8Hình 4.1: Ảnh chồi lan Kim Tuyến sống không nhiễm sau khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 31Hình 4.2: Ảnh chồi lan Kim Tuyến tái sinh khi bổ sung hàm lượng GA3 ở các công thức thí nghiệm 34Hình 4.3: Ảnh chồi lan Kim Tuyến tái sinh sau khi bổ sung hàm lượng BA ở các công thức thí nghiệm 36Hình 4.4: Ảnh chồi lan Kim Tuyến nhân nhanh khi bổ sung hàm lượng BA ở các công thức thí nghiệm 38Hình 4.5: Ảnh chồi lan Kim Tuyến nhân nhanh khi bổ sung hàm lượng NAA

ở các công thức thí nghiệm 41Hình 4.6: Ảnh chồi lan Kim Tuyến nhân nhanh khi bổ sung hàm lượng Kinetin ở các công thức thí nghiệm 43Hình 4.7: Ảnh rễ lan Kim Tuyến sau khi bổ sung hàm lượng NAA ở các công thức thí nghiệm 46

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến tỷ lệ mẫu sống của chồi lan Kim Tuyến 31Biểu đồ 4.2: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến 33Biểu đồ 4.3: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến 36Biểu đồ 4.4: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim tuyến 38Biểu đồ 4.5: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến 40Biểu đồ 4.6: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh lan Kim Tuyến 43Biểu đồ 4.7: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng

ra rễ của lan Kim Tuyến 45

MỤC LỤC

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

1.4.1.Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu về cây lan kim tuyến 4

2.1.1 Phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Đặc điểm phân bố 6

2.1.4 Số lượng quần thể 7

2.1.5 Giá trị của lan Kim Tuyến 7

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21

3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21

3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nuôi cấy mô 21

3.3.1 Hóa chất 21

3.3.2 Thiết bị 22

3.3.3 Dụng cụ 22

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Nội dung nghiên cứu 22

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 22

PHẦN 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 30

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến (sau 3 tuần nuôi cấy) 32

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến 35

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 37

4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 39

4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến 42

4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi lan Kim Tuyến (sau 4 tuần nuôi cấy) 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lan Kim Tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall) Lindl, thuộc họ lan –

Orchidaceae (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2004) [1] Chúng thường phân bố

khá rộng ở độ cao từ 500-1600m, xuất hiện nhiều ở những nơi đất giàu mùn, độ

ẩm, độ xốp cao, thoáng khí Đôi khi chúng xuất hiện cả trên các tảng đá ẩm, các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây trên các đoạn thân cây gỗ mục

Lan Kim Tuyến được biết đến nhiều bởi giá trị dược liệu, là một loại dược liệu quý dùng để điều trị một số bệnh như: đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viên thận, sốt, liệt dương…và các bệnh về tim mạch đặc biệt lan Kim Tuyến có khả năng tiêu diệt các khối u (Chun-Nian và cs, 2006) [15], (Shu-Fen Cheng và cs, 2009) [21]

Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng tăng cùng với sự khai thác ồ

ạt mà không chú ý đến việc bảo vệ và tái sinh làm cho lan Kim Tuyến vốn phân bố khá phổ biến ngoài tự nhiên đang bị suy giảm nghiêm trọng Chính vì vậy lan Kim Tuyến được đưa vào danh mục sách đỏ Việt Nam (2007) và nghiêm cấm khai thác với mục đích thương mại theo Nghị định số 32/2006/NĐ – CP thuộc nhóm IA, (2007), phân hạng EN A1a,c,d (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2004) [1], (Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, 2006) [2]

Theo phương pháp nhân giống cổ truyền lan Kim Tuyến được nhân giống bằng cách gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hóa qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ Nhưng hiện nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy

mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở lên phổ biến Nuôi cấy mô tạo ra cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được tính di truyền của cây mẹ

Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý – lan Kim Tuyến, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu kỹ thuật nâng

cao hệ số nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng phương

pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu kỹ thuật nâng cao hệ số nhân giống lan Kim Tuyến

(Anoectochilus roxburghii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3 Yêu cầu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi lan Kim Tuyến

Xác định ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (GA3, BA) đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến

Xác định ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (BA, NAA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến

Xác định ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (NAA) đến khả năng ra rễ chồi lan Kim Tuyến

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kỹ thuật nhân giống lan Kim Tuyến, nhân nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quý hiếm

Thực hiện đề tài giúp sinh viên hoàn thiện về cả kiến thức lý thuyết và thực tiễn, mang lại những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học cho công tác sau này

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây lan kim tuyến

2.1.1 Phân loại

Lan Kim Tuyến được phân loại như sau:

2.1.2 Đặc điểm hình thái

2.1.2.1 Đặc điểm nhận dạng

Lan Kim Tuyến có dạng thân thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2-4 lá mọc xòe sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3-4 x 2-3 cm,

có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu - đỏ với mạng gân màu vàng - lục hay hồng); cuống lá dài 2-3 cm Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4-10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, chóp thót nhọn đột ngột, dài 8-10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5-3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5

cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2007) [1]

Hình 2.1: Ảnh lan Kim Tuyến

2.1.2.2 Đặc điểm thân rễ

Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân dễ từ 5-12 cm, trung bình là 8,5 cm Đường kính thân rễ từ 2,5-3,5 mm, trung bình là 3,28 mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng Chiều dài của lóng từ 1-5 cm, trung bình là 2,14 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông (Phùng Văn phê và cs, 2009) [7]

2.1.2.3 Đặc điểm thân khí sinh

Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 3-7 cm, trung bình 5,63 cm Đường kính thân khí sinh từ 2,5-3,5 mm, trung bình là 3,09 mm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-5 lóng, trung bình là 3,07 Chiều dài mỗi lóng từ 1,5-4 cm, trung bình 1,87 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt

2.1.2.4 Đặc điểm của rễ

Rễ được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường từ 2-9 rễ, trung bình là 5,2 Chều dài của rễ thay đổi từ 1-9

cm, rễ dài nhất trung bình là 6,37 cm và ngắn nhất trung bình là 1,04 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 4,07 cm (Phùng Văn Phê và cs, 2009) [7]

2.1.2.5 Đặc điểm của lá

Số lượng lá trên một cây thay đổi từ 2-6 chiếc, thông thường có 4 lá Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá có hình trứng hoặc gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn Kích thước của lá cũng thay đổi, thường dài từ 3-5 cm, trung bình là 3,87 cm và rộng của lá từ 2-4 cm, trung bình là 2,93 cm Các lá trên một cây thýờng có kích thýớc khác nhau rõ rệt Chiều rộng trung bình của các lá trên một cây là 2,5 cm (Phùng Văn Phê và cs, 2009) [7]

Phân bố theo sinh cảnh: Lan Kim Tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm, độ xốp cao, thoáng khí, thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân hủy Đôi khi chúng

mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây Có thể bắt gặp lan Kim Tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng

Phân bố theo địa lý, địa hình: Phân bố hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi

Phân bố theo đai cao: Lan Kim Tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập chung chủ yếu ở độ cao trên 970m

Ở Việt Nam lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm các tỉnh: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn: Rào àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp) (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2007) [1]

Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaixia, Inđônêxia (Bộ Khoa Học và Công Nghệ, 2007) [1]

2.1.4 Số lượng quần thể

Trên thế giới chi lan Kim Tuyến có khoảng 30-40 loài phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới từ Ấn Độ tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Nhật Bản (Doris C N Chang và cs, 2007) [16] Theo Averyanov (2008), Việt

Nam đã phát hiện được 7 loài lan Kim Tuyến thuộc chi Anoectochilus, trong

đó loài A Roxburghii này có giá trị thương mại xuất khẩu cao nhất, gấp hàng

chục lần các loài khác

2.1.5 Giá trị của lan Kim Tuyến

2.1.5.1 Giá trị kinh tế

Hiện nay lan Kim Tuyến ngoài tự nhiên đã bị thu hái đến mức cạn kiệt

do có rất nhiều tác dụng dược liệu và làm cây cảnh Giá bán trên thị trường thế giới của lan Kim Tuyến khô là 3.200USD/kg, cây tươi có giá từ 300-

320USD/kg, nếu được thu hái trong tự nhiên, đặc biệt có nấm cộng sinh ở rễ thì giá này sẽ cao hơn rất nhiều (Doris C N Chang và cs , 2007) [16] Cây

giống lan Kim Tuyến có thể tạo từ nhân in vitro các mắt đốt thân, hạt giống và

các bộ phận sinh dưỡng của cây Tuy nhiên sự sinh trưởng khác của cây lan

Kim Tuyến in vitro chậm, kéo dài thời gian nhân giống Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây lan Kim Tuyến từ nuôi cấy hạt in vitro Trung Quốc ,

Đài Loan, Nhật Bản đã trồng và xuất khẩu lan Kim Tuyến mang lại nguồn thu lớn

Với giá trị làm cảnh có những giỏ lan Kim Tuyến có giá trị hàng chục triệu Việt Nam đồng

Hình 2.2: Hình ảnh hoa lan Kim Tuyến

2.1.5.2 Giá trị dược liệu

Lan Kim Tuyến có rất nhiều tác dụng dược liệu do có chứa axit hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit, kinsenoside nên được dùng trong điều trị bệnh (Lazarus Agus Sukamto

kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng để chữa các bệnh về gan, chống khối u, ung thư và tính chống virus, điều trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống mệt mỏi (Lazarus Agus Sukamto và cs, 2011) [19], (Shu-Fen Cheng và cs, 2009) [21]

Gần đây, một hợp chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên thương mại là kinsenoside được chiết xuất từ lan Kim Tuyến có tác dụng chống tăng huyết áp hiệu quả và hợp chất chuyển hóa arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Lan Kim Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa, chuỗi polysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người (Hao-Yuan Cheng và cs, 2003) [17]

Cây lan Kim Tuyến sau khi thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản phẩm gồm thân, rễ và lá phơi khô để chế biến trà dược, thực phẩm chức năng, thạch lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide từ lan Kim Tuyến để sản xuất biệt dược kinsenoside

- Một số nghiên cứu về tính dược liệu:

Đại ho ̣c Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử dụng A formosanus Hayata được chiết xuất từ Lan kim tuyến làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể và kháng virus cúm A Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm và bảo vệ gan Chiết xuất của cây A formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid (Takatsuki, 1992) Gần đây, một hợp chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên

là thương mại kinsenoside được chiết xuất từ A formosanus và A

koshunensis chống tăng huyết áp hiệu quả Nhiều nhà nghiên cứu hay y học của nhiều nước cũng đã tìm hiểu về Lan Kim Tuyến

Ông Tả Mộc Thuấn - học giả người Nhật - nghiên cứu về Trung y tuyên bố năm 1924: Kim Tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong dân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt

Ông Sơn Điền Kim Trị tuyên bố năm 1932: Người dân tộc miền núi thường dùng Kim Tuyến liên sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn

Trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ

A Mộc và Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dược dụng thực vật có nói đến Kim Tuyến liên là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan

Đơn thuốc của 3 ông Vương Chánh Hùng, Hà Thiên Tống, Trần Bỉnh Diêu dùng Kim Tuyến liên 20 phân hầm với thịt nạc trị thổ huyết, bệnh phổi

Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa tuyên bố: Kim Tuyến liên tiêu đờm, giải độc, chỉ huyết, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêm gan, trị mụn dùng cây tươi sắc uống

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi

trường nuôi dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nhân giống vô tính in

vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách

lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện

vô trùng của ống nghiệm (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [6]

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân

giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những ưu điểm như tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm, chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ, có khả năng công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh (Trịnh Đình Đạt, 2009) [4]

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống

vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu (Trịnh Đình Đạt, 2009) [4]

Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một

cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

2.2.2.2 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi Trong điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi

và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa (Trịnh Đình Đạt, 2009) [4]

Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc

2.2.2.3 Sự trẻ hóa

Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn

2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1.1 Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [13]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [13]

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó, có ý nghĩa quyết định đến thành công trong nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử

lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như: HgCl2 0,1%, NaHCl 10%, cồn 70% để khử trùng Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng cấy và tủ cấy vô trùng, phòng nuôi cấy (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [13]

2.3.1.2 Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

a Điều kiện ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của nuôi cấy mô Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18h/ngày Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux (Morein, 1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng

ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ

làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy

trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 30-40 cm (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [13]

b Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất sứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nhiều loài cây là 250

C (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

c pH môi trường

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Vũ Văn Vụ

và cs, 2008) [14]

2.3.1.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường nghiên cứu phù hợp

Từ năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, B5, WPM Ví dụ, môi trường MS là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho

cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trường B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng vi lượng và đa lượng

- Nguồn cacbon

- Các vitamin và aminoacid

- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

- Chất điều hòa sinh trưởng

a Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, aminoaxit và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một

số Enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào (Nguyễn Quang Thạch và

cs, 2009) [11]

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy của tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu

cơ, Enzym (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quan

trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

b Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

Nguồn cacbon được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào

c Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loại khác nhau là khác nhau (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các loại vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axit Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Vitamin B3 và B6 cũng có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

d Các chất bổ sung

- Nước dừa:

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [14]

- Khoai tây:

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin như vitamin C, B1, B6 và các yếu tố khoáng như kali, sắt, magie rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế bào Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác Nồng

độ khoai tây thường sử dụng là 20 mg/l

- Agar:

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường Nồng độ agar thường dùng là 0,6-1 %, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc

bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh

e Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11]

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính Auxin và Cytokinin, ngoài ra còn có Gibberlin và Etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

- Auxin:

Auxin được chia thành 2 loại: Auxin tự nhiên và Auxin tổng hợp Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và

Auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D

là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm Auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại Auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của Auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ Auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [14]

- Cytokinin:

Nhóm chất Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi Tỉ lệ Auxin/Cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các Cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (Cytokinin

tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin là một loại Cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất

đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một Cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ (Vũ Văn

Vụ và cs, 2008) [14]

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Phùng Văn Phê khi nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố của loài lan

Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Xuân Sơn, tỉnh

Phú Thọ Cho biết, lan Kim Tuyến là cây thân cỏ, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước mang 2-6 lá mọc cách Thân khí sinh và thân rễ thường nhẵn, không phủ lông; màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 5-20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa Mùa hoa nở tháng 9-12 Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau Phân bố tập trung ở các kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới

và rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, chủ yếu ở độ cao trên 900m, quanh núi Ten Nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí Có thể gặp lan Kim Tuyến ở ven các khe suối, dưới tán rừng hoặc dưới rừng sặt nơi ẩm ướt (Phùng Văn Phê, 2014) [8]

Tác giả Trương Thị Bích Phượng và cs khi nghiên cứu nhân giống in

vitro cây lan Kim Tuyến kết luận: Vật liệu nghiên cứu sử dụng là đỉnh sinh

trưởng và đoạn thân mang chồi nách (2,0-3,0 cm) Khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút là thích hợp nhất tỷ lệ mẫu sống 86,1% đối với đỉnh sinh trưởng và 84,77% với đoạn thân mang chồi nách Với mẫu là quả lan Kim Tuyến (40 ngày tuổi) khử trùng bằng HgCl2 0,2% trong 10 phút cho

tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 75,62% Môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l Kinetin thích hợp cho đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách tái sinh chồi sau 8 tuần nuôi cấy (khoảng 1,42 chồi/đỉnh sinh trưởng; 1,5 chồi/đoạn thân) và thích hợp cho hạt lan nảy mầm đạt tỷ lệ 88,3% sau 12 tuần nuôi cấy

Cụm protocorm (2,0 × 2,0 mm) sau khi hình thành từ hạt được cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cho 5,62 chồi/cụm

protocorm sau 12 tuần nuôi cấy Đoạn thân (1,0 - 2,0 cm) từ chồi in vitro

nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin và 0,3 mg/l NAA (α-naphthalene acetic acid), đạt 4,6 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi

cấy Chồi in vitro tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,3mg/l NAA đạt 3,1 rễ/chồi sau 8 tuần nuôi cấy Cây in vitro hoàn chỉnh sau

khi huấn luyện được trồng trên giá thể với tỷ lệ sống sót 70% (Trương Thị Bích Phượng và cs, 2013) [10]

Kiet Van Nguyen (2004), tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc đưa ra quy

trình nhân giống in vitro cho loài lan Kim Tuyến - Anoectochilus formosanus

như sau; môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l) + peptone 2g/l), Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ) + than hoạt tính 1% với vật liệu ban đầu là

6,5N-4,5P-từ chồi đỉnh (Kiet Van Nguyen, 2004) [18]

Lazarus Agus Sukamto và cs đã nghiên cứu nuôi cấy in vitro 2 loài lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus và Anoectochilus formosanus đưa ra kết luận, đối với loài lan Anoectochilus setaceus môi trường nuôi cấy tốt nhất là

TDZ 0,1 mg/l, số lá cao nhất TDZ 0,001 mg/l, số chồi cao nhất TDZ 0,01

mg/l, số rễ cao nhất TDZ 0,001 mg/l Còn với loài lan Anoectochilus

formosanus thì môi trường nuôi cấy tốt nhất là TDZ 0,5 mg/l, số lá cao nhất

TDZ 0,005 mg/l, số chồi cao nhất TDZ 0,05 mg/l, số rễ cao nhất TDZ 0,005 mg/l (Lazarus Agus Sukamto và cs, 2011) [19]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Giống lan Kim Tuyến thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Bắc Kạn, Cao Bằng

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn thân có chứa mầm ngủ

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng

- Nghiên cứu hàm lượng chất kích thích sinh trưởng để nâng cao tỷ lệ tái sinh chồi lan Kim Tuyến

- Nghiên cứu hàm lượng chất kích thích sinh trưởng để nâng cao hệ số nhân chồi lan Kim Tuyến

- Nghiên cứu hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến chất lượng cây con hoàn chỉnh

3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa CNSH & CNTP

- Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.3.2 Thiết bị

1 Cân phân tích Olhous – Vietlabcu

4 Nồi hấp vô trùng ALP

6 Box cấy vô trùng cấp II Airtech

Cùng các dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm

3.3.3 Dụng cụ

- Panh, dao, kéo, đèn cồn, đĩa cấy

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử

trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 đến khả năng tạo mô sạch nấm, vi khuẩn

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3, BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, NAA, Kinetin đến khả

năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng

ra rễ chồi lan Kim Tuyến

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

3.4.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử

- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:

Khử trùng sơ bộ: Sau khi thu thập lan Kim Tuyến về phòng thí nghiệm Tiến hành rửa sạch bằng dung dịch xà phòng loãng sau đó tráng sạch

xà phòng dưới vòi nước và dùng nước cất tráng mẫu từ 3-4 lần

Khử trùng trong box cấy: Mẫu sau khi được rửa bằng dung dịch nước

xà phòng ta tiến hành ngâm mẫu trong dung dịch cồn 70% trong 30s và tráng sạch bằng nước cất nhiều lần Tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 ở hàm lượng, thời gian khác nhau, loại bỏ dung dịch khử trùng bằng cách tráng nước cất hấp 5-7 lần

Gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng Dùng dao cấy cắt bỏ phần bị hóa chất bào mòn rồi đặt mẫu trên bề mặt môi trường nuôi cấy

Mẫu sau khi cấy được đưa vào phòng nuôi với nhiệt độ phòng nuôi từ 22–250C, cường độ chiếu sáng 2000–2500 lux, ẩm độ: 60–65 % quang chu kì 16h sáng/8h tối Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng

bằng dung dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 10 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn

toàn gồm 12 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

3.4.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA 3 , BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến

- Phương pháp tái sinh chồi:

Các mẫu đã được cấy trong thí nghiệm trên sau 10 ngày không bị nhiễm nấm và vi khuẩn sẽ được tiến hành cấy sang môi trường tái sinh

Dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi chuyển mẫu đưa vào môi trường tái sinh đã chuẩn bị trước

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần: tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi

Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5,6g/l, pH = 5,6-5,8

Nồng độ GA3 thích hợp cho tái sinh chồi lan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 2 (ký hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA đến khả năng tái sinh chồi lan Kim Tuyến

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại

10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu BA được bổ sung vào MT nền + A ( A là nồng

độ GA3 thích hợp cho tái sinh chồi lan Kim Tuyến được xác định ở thí nghiệm 2) Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần: tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi

Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5,6g/l, pH = 5,6-5,8

3.4.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, NAA, Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến

- Phương pháp nhân nhanh:

Dùng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từ đoạn thân

Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước

Cấy chồi trên bề mặt môi trường đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả

năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình cấy 1 chồi thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần: Hệ số nhân, chất lượng chồi

Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5,6g/l, pH = 5,6-5,8

Nồng độ BA thích hợp cho nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến được xác định ở thí nghiêm 4 (ký hiệu là B) được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến

khả năng nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 chồi NAA được bổ sung vào MT nền + B (B là nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi lan Kim Tuyến được xác định ở thí nghiệm 4) Thí nghiệm được bố trí như sau: