ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THẢO NHI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE GÂY BỆNH VIÊ
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5tuổi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên
- Thời gian nghiên cứu: Từ 01/01/2019 đến 30/4/2019
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
- Dụng cụ: Đĩa peptri, que cấy, đèn cồn, lamen, lam kính…
- Thiết bị: Tủ ấm 35℃và 37℃, Tủ lạnh 2-8℃, tủ đông -20℃, máy ly tâm, tủ an toàn sinh học, cân phân tích, kính hiển vi
- Hóa chất: Khoanh kháng sinh, Brilliance Uti agar, Columbia agar, Kligler iron agar, MacConkey agar,Mueller hinton agar,Manitol salt agar, Tím tinh thể, Natri Clorid 0,9%, Lugol, Fucshin
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm viêm phổi trẻ em dưới 5 tuổi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
Nội dung 2: Phân lập, tuyển chọn và xác định vi khuẩn là Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae
Nội dung 3: Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật nuôi cấy phân lập
- Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kirby-Bauer
- Diễn giải kết quả kháng sinh đồ theo hướng dẫn tài liệu CLSI năm 2018 để xác định mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc đề kháng (R)
Xử lý số liệu
- Thu thập số liệu, hồi cứu phiếu kết quả cấy vi sinh định danh vi khuẩn và - phiếu kết quả kháng sinh đồ
- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS
Phương pháp thí nghiệm
3.5.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm
-Tùy vào vị trí tổn thương, mẫu bệnh phẩm được lấy ở vị trí đường hô hấp trên hoặc đường hô hấp dưới:
- Bệnh phẩm đường hô hấp trên: dịch mũi, dịch hầu họng, dịch rửa mũi, dịch tỵ hầu, dịch mũi họng
- Bệnh phẩm đường hô hấp dưới: dịch phế quản, dịch phế nang, đờm, đầu catheter
- Mẫu bệnh phẩm cũng thể lấy ở các máy thở mà người bệnh đã sử dụng
- Sử dụng ống tăm bông chuyên dụng
- Lấy dịch tỵ hầu ở đường hô hấp trên
- Ghi nhãn lên ống đựng bệnh phẩm
- Bệnh phẩm là mẫu đờm được lấy bằng cách vỗ lưng và hướng dẫn bệnh nhân khạc đờm, có hoặc hổ trợ bằng cách cho bệnh nhân xông khí dung với NaCl 0,9% trước khạc đờm hay soi phế quản và cấy dịch rửa phế quản (BAL)
-Bệnh phẩm được đựng ở lọ nhựa trong ghi rõ thông tin
- Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy được thực hiện nuôi cấy ngay, nếu chưa nuôi cấy được luôn phải bảo quản trong tủ -4℃ Mẫu bệnh phẩm được cấy ria lên môi trường dinh dưỡng thích hợp
Bảng 3.1:Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm
Thạch máu Thạch socola Thạch Mac
Số lượng (đĩa) Tủ ấm Số lượng
(đĩa) Tủ ấm Số lượng
(Đĩa) Tủ ấm Đờm 1 CO2 1 CO2 1 Thường
- Sau khi cấy, vi khuẩn được nuôi trong tủ ấm khoảng 24 - 48 giờ
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram và định danh bằng các phương pháp khác nhau
3.5.3 Các kĩ thật trong nghiên cứu
- Dung dịch tím tinh thể (Crystal violet)
- Thuốc nhuộm Fucshin kiềm hay Safranin
- Chuẩn bị lam kính sạch, không xước vỡ
- Dán nhãn hoặc ghi thông tin mẫu bệnh phẩm
- Dùng bút viết kính khoanh tròn, đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm, mặt dưới lam kính
- Dàn tiêu bản theo hình xoáy trôn ốc từ trong ra ngoài hoặc hình zích zắc
- Để tiêu bản khô tự nhiên trong tủ ATSH hoặc làm khô ở 60℃
- Để lam kính lên máy sấy lam ở 60℃đến khi tiêu bản khô
- Cố định bằng nhiệt: Đưa tiêu bản ngang qua ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần, mỗi lần 5- 10 giây
- Nhỏ dung dịch tím Gentian, phủ kín nơi dàn bệnh phẩm, duy trì 1 phút
- Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ
- Nhỏ dung dịch lugol, duy trì 30 giây Đổ dung dịch lugol, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ
- Tẩy màu: Nhỏ cồn 96° lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia, khi màu tím trên lam kính vừa phai hết thì rửa nước ngay, loại bỏ hết cồn dưới vòi nước chảy nhẹ
- Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin hoặc safranin hoặc carbon fuchsin lên tiêu bản, duy trì trong khoảng 30 giây đến 1 phút Đổ dung dịch, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ
Soi dưới vật kính dầu (100X)
Vi khuẩn gram dương bắt màu tím sẫm gentian
Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ fucshin
3.5.4 Các phương pháp định danh vi khuẩn
3.5.4.1 Phương pháp soi tươi và nuôi cấy
Mẫu được tiến hành soi tươi nhằm phân loại và xác định tỉ lệ của tác nhân gây bệnh (vi khuẩn hoặc tác nhân khác) Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường trong
48 giờ ở 35-37℃, tiếp tục cấy trên môi trường BA và MC ở 35-37℃ trong 48 giờ để xác định Gram [7]
3.5.4.2 Phương pháp định danh bằng thử nghiệm sinh hóa
Streptococcus pneumoniae (phế cầu) là vi khuẩn hay gặp ở đường hô hấp, tính chất tan máu (tiêu huyết) không thể phân biệt được chúng với các loại cầu khuẩn và Lactobacilli Xác định sự nhạy cảm với optochin có thể phân biệt được phế cầu và các cầu khuẩn tan máu (tiêu huyết) α khác Các vi khuẩn Gram dương,
22 khuẩn lạc giống phế cầu sẽ tạo ra một vòng ức chế rõ ràng xung quanh khoanh optochin, còn những loại vi khuẩn tan máu (tiêu huyết) α khác thì không tạo vòng ức chế.[ 2 ]
Trang thiết bị, hóa chất
- Tủ an toàn sinh học (ATSH) cấp 2
- Kính hiển vi quang học
- Ống vô trùng có nắp đậy
- Đèn cồn, que cấy nhọn, lam kính, lamen bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu
+ Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc tan máu (tiêu huyết) α riêng rẽ để ria trực tiếp hoặc pha huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland
+ Dùng que cấy ria vi khuẩn hoặc tăm bông (que gòn) lấy huyền dịch vi khuẩn ria các đường sát nhau lên đĩa thạch máu, lặp lại ít nhất 2 lần
+ Dùng panh vô khuẩn đặt một khoanh optochin lên bề mặt thạch máu
Thử nghiệm từ bệnh phẩm
+ Dùng que cấy vô trùng ria bệnh phẩm lên đĩa thạch máu
+ Dùng panh vô khuẩn đặt một khoanh optochin vào rìa của vùng nguyên ủy
- Ấn nhẹ panh xuống khoanh giấy để khoanh giấy bám chắc vào đĩa thạch
- Để vào tủ ấm 35 - 37°C với 5 -10% CO2, đọc kết quả sau 18-24 giờ
- Nếu có đường kính vùng ức chế thì đo bằng thước chia mm hoặc đo bằng thước kẹp (caliper)
- Thử nghiệm dương tính (Nhạy cảm với optochin): Đường kính vùng ức chế
- Nhạy cảm mức trung gian với optochin: Đường kính vùng ức chế < 14mm
- Đề kháng với optochin: Không có vùng ức chế
Yếu tố X (heamin) và yếu tố V (nicotinamide-adenine-dinucleotide, NAD) là các yếu tố cần thiết để phân loại các loài Haemophilus, đặc biệt là dùng để xác định
- Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch
- Đặt khoanh X, V lên môi trường thạch dinh dưỡng Trypticase Soy đã cấy vi khuẩn, khoảng cách giữa 2 khoanh là 1,5-2cm
- Dương tính với Haemophilus influenzae khi thấy vi khuẩn chỉ mọc giữa 2 khoanh X và V (có thể hơi lệch về phía X vì V khuếch tán nhanh hơn), do vi khuẩn cần cả 2 yếu tố để phát triển
- Nếu vi khuẩn chỉ mọc quanh khoanh giấy X là H aphrophilus
- Nếu chỉ mọc quanh khoanh giấy V là H parainfluenzae
- Nếu chỉ mọc quanh X và V nhưng có vòng tan huyết (trên môi trường thạch chocolate) là H hemolyticus.
Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán của Kibry-Barer
- Mục đích: Tìm hiểu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh giúp đánh giá tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn đó
- Chuẩn bị môi trường: Tùy từng loại vi khuẩn cần chuẩn bị môi trường thích hợp: môi trường MHA, socola
- Pha hỗn hợp dịch vi khuẩn đạt nồng độ 106 vi khuẩn /ml so sánh với độ đục chuẩn của Mc Farland 0,5
- Cấy vi khuẩn: để khô mặt thạch bằng cách đặt thạch vào tủ ấm 15 phút trước khi cấy vi khuẩn Dùng tăm bông vô trùng, thấm huyễn dịch vi khuẩn đã pha cấy đều lên khắp mặt thạch
- Đặt khoanh kháng sinh: dùng kim tiêm đặt khoanh kháng sinh tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch, cách đều nhau khoảng 2cm, cách thành đĩa khoảng 1cm Để ở nhiệt độ phòng 20 phút trước khi nuôi trong tủ ấm
- Ủ ấm ở 37 °C, trong 18 - 24h Đọc và diễn giải kết quả [2] Đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, đường kính tính bằng milimet Đường kính này được chia thành các mức độ: Nhạy cảm (S), trung gian (I) và kháng (R) dựa vào bảng chuẩn theo hướng dẫn của CLSI 2018.
Kháng sinh đồ bằng hệ thống tự động máy Vitek 2 Compact
Mục đích: định danh vi sinh vật và xác định tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh
Chuẩn bị card xét nghiệm định danh
Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm phải thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ)
Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc: Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ 3-5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống nghiệm vô trùng 12mm x 75mm đã có 3ml nước muối được hút bằng Dípenser, lắc đều trên máy lắc để có huyền dịch đồng nhất đo độ đục đạt khoảng 0.55-0.65 McFarland (đo bằng DENSICHEK).Huyền dịch vi khuẩn sau khi pha, phải được sử dụng ngay trong vòng 15 phút
Chuẩn bị card xét nghiệm làm kháng sinh đồ
Dùng pipette 280 μl (đối với card gram dương)
Dùng pipette 145μl (đối với card gram âm)
Dùng pipette phù hợp hút huyền dịch vi khuẩn vào ống nghiệm đã có chứa 3ml nước muối (saline0,45%)
Tiến hành o Đặt ống nghiệm và card lên cassette o Đưa cassette vào buông hút o Chuyển các cassette đã được hút mẫu qua loading station
Thay vì phải đọc bằng mắt thường xem sự phát triển của vi khuẩn có hay không có trong môi trường để xác định giá trị MIC, hệ thống tự động sẽ đo độ đục của canh khuẩn hoặc đo tín hiệu huỳnh quang biến đổi có trong môi trường nuôi cấy để xác định giá trị MIC Hệ thống tự động còn có thể có thêm phần mềm hỗ trợ phiên giải kết quả và có thể rút ngắn thời gian thực hiện kháng sinh đồ xuống còn 5 -15 giờ tuỳ theo từng loài vi khuẩn Hơn nữa, hệ thống tự động có thể kết nối với phần mềm quản lý của phòng xét nghiệm để chuyển trực tiếp kết quả từ hệ thống tự động sang hệ thống phần mềm quản lý [2]
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập và định danh các chủng vi khuẩn gây bện của bệnh nhân nhi tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
Trong thời gian nghiên cứu từ ngày 1/1/2019 đến ngày 30/4/2019 nhóm nghiên cứu đã thu thập được 272 mẫu bệnh phẩm trong đó có 103 mẫu phân lập được S pneumonia và 117 mẫu phân lập được H influenza từ bệnh phẩm của bệnh nhân nhi điều trị tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
Bảng 4.1: Tỉ lệ vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhân nhi tại Bệnh viện TW
Kết quả bảng 4.1 ta thấy: Tỉ lệ vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhân nhi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên là không đồng đều và có sự chênh lệch rõ rệt
Cụ thể trong tổng số 272 mẫu bệnh phẩm phân lập thì chủng vi khuẩn H influenza chiểm tỉ lệ cao nhất lên tới 43 %, sau đó đến S pneumonia là 38%, S aureus 11%, P aeruginosa 1%, K pneumoniae 2%,, E coli 3%
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến (2012)cho thấy tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh cao nhất là H infuenzae chiếm tỷ lệ 37,1%, sau đó là S pneumoniae 24,5% Kết quả trên cũng cho thấy nguyên nhân gây viêm phổi do vi khuẩn ở trẻ dưới 5 tuổi tại cộng đồng chủ yếu vẫn là H.infuenzae và S pneumoniae, từ đó cần có những chính sách hợp lý để kiểm soát tốt chương trình nhiễm khuẩn cấp tính đường hô hấp ở trẻ em
Bảng 4.2 Tỉ lệ phân lập S pneumoniae và H influenzae theo mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm S pneumonia H influenza Tổng
Từ bảng 4.3 kết quả trên cho ta thấy, tỷ lệ phân lập S pneumoniae và H influenza cao nhất từ bệnh phẩm dịch tỵ hầu (chiếm tỷ lệ 99%), tiếp đến là bệnh phẩm đờm (1%) Tỷ lệ phân lập H influenzae và S pneumoniae được từ bệnh phẩm dịch tỵ hầu là cao nhất (99%)
Bảng 4.3 Tỷ lệ phân lập đc các loại vi khuẩntheo nhóm tuổi tại Bệnh viện TW
Kết quả bảng 4.3 cho ta thấy: Ở nhóm tuổi khác nhau tỷ lệ nhiễm vi khuẩn khác nhau.Trong số 272 bệnh nhân viêm phổi nhi do vi khuẩn, tỷ lệ phân lập được
28 vi khuẩn cao nhất là H infuenzae cao nhất (43%) Viêm phổi do S pneumonia chiếm (38%)
Tỷ lệ phân lập H infuenzae ở nhóm trẻ em từ 1tuổi đến 5 tuổi (45,5%), tiếp đến là nhóm dưới 1 tuổi (21,0%) Tỷ lệ phân lập S pneumonia cao nhất ở trẻ từ 1 tuổi đến 5 tuổi (chiếm tỷ lệ 40,3%), tiếp đến là nhóm dưới 1 tuổi (17%).
Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh viêm phổi bệnh viện phân lập được tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
Trong số các chủng vi khuẩn đã phân lâp được so sánh với các nghiên trước đây cho thấy S Pneumonia và H influenzae là những vi khuẩn gây viêm phổi ở bệnh nhân nhi phổ biến nhất Do vậy sử dụng 2 chủng này được tiến hành khảo sát tình hình kháng kháng sinh và đưa ra kết quả như sau:
4.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
Hình 4.1 kết quả kháng sinh đồ của Streptococcus pneumoniae
Bảng 4.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
TT Tên kháng sinh Số xét nghiệm
Kết quả bảng 4.4 cho thấy:
- Tỷ lệ kháng của S pneumoniae có tỷ lệ kháng cao với các kháng sinh thông thường để điều trị như Trimethopirm/sulfameethoxazole 99%, Erythromycin 98%, Clindamycin 94%, Tetracycline 93%, Chloramphenicol 12%
- S.pneumoniae nhạy cảm với Vancomycin 100%, Linezolid 100%,
Theo nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự (2011) vi khuẩn S pneumonia kháng Tetracycline 78,6% Clindamycin 86,4 % và chưa thể kháng với Vancomycin So sánh với kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương đồng nhạy cảm với thuốc vancomycin
4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Hemophilus influenza được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
Hình 4.2 Kháng sinh thử nghiệm chủng vi khuẩn Haemophilus influenza Bảng 4.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Haemophilus influenzae được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên
- H infuenzae có tỷ lệ kháng cao với các kháng sinh thông thường để điều trị ampicillin/ sulbactam 97%, Amoxicillin/ clavulaic acid 96%, Ampicillin 100%, Trimethoprim/ sulfamethoxazole 93%,Cefepime 100%, Ceftriaxone 94%
- H infuenzae nhạy cảm với Ofloxacin 90%,Azithromycin 50%, Imipenem
Theo nghiên cứu của Nguễn Thị Yến (2012) H influenzae kháng rộng rãi với các khánh sing trong các bệnh viện như Ampicillin/ sulbactam 78,6%, cefuroxime
Nghiên cứu của Trần Đỗ Hùng (2008) cho thấy tỷ lệ đề kháng kháng sinh của
H.infuenzae 95,8% với Ampicillin,45,7% vớiAmox/acidclavulanic, Ceftriaxone
68,6%, Cefuroxime 75%, ceftazidim 67,6%, Cefotaxime 51,5%, Co-trimoxazol 59,4%, Norfoxacin 70,6%, Ciprofoxacin 62,9%, Gentamicin 68,6%, Imipenem 0%
Kết quả của các nghiên cứu có sự thay đổi là do sự kháng kháng sinh của H
Infuenzae ở các bệnh viện khác nhau Nếu so sánh theo thời gian qua các kết quả trên cho chúng ta thấy tỷ lệ kháng cao và ngày càng gia tăng của H infuenzae từ năm 2008 đến 2019 với các kháng sinh như Ampicillin từ 95,8 % lên 100%,
Amoxicillin/ clavulaic acid từ 45.7 lê tới 96%, Ceftriaxone từ 68, 6% lên tới 94%