Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn bacillus sinh enzyme protease nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải thủy sản trên địa bàn thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SINH ENZYME PROTEASE NHẰM ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SINH ENZYME

PROTEASE NHẰM ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng – Năm 2014

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SINH ENZYME

PROTEASE NHẰM ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Ngành: Cử nhân Sinh – Môi trường

Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Lan Phương

Đà Nẵng – Năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng, Ban Chủ Nhiệm Khoa Sinh - Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành các các nghiên cứu phục

vụ cho khóa luận

Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn đến Cô Nguyễn Thị Lan Phương cùng các thầy cô Khoa Sinh - Môi Trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, chỉ dạy, định hướng và có những góp ý cho em trong suốt quá trình thực hiện Khóa luận tốt nghiệp này

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 05 năm 2014

Nguyễn Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ NƯỚC THẢI THỦY SẢN 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ VSV SINH TỔNG HỢP PROTEASE 4

1.2.1 Vi khuẩn 5

1.2.2 Nấm 5

1.2.3 Xạ khuẩn 6

1.3 VK BACILLUS 6

1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI 9

1.4.1 Phương pháp xử lý cơ học 9

1.4.2 Phương pháp xử lý hóa lý 10

1.4.3 Phương pháp hóa học 10

1.4.3 Phương pháp xử lý sinh học 10

1.5 THỰC TRẠNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG 11

1.5.1 Thực trạng xử lý nước thải thủy sản ở Việt Nam 11

1.5.2 Thực trạng xử lý nước thải thủy sản ở Đà Nẵng 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.3 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 13

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 13

2.3.2 Phạm vi nghiên cứu 14

2.3.3 Thời gian nghiên cứu 14

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.4.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 15

2.4.2 Phương pháp phân lập và giữ giống VSV 16

2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh hoạt tính protease của VSV 16

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của VSV 17

2.4.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của VSV 17

2.4.6 Phương pháp định lượng VSV 18

2.4.7 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý nước thải bằng hệ thống bể xử lý sinh học hiếu khí 19

2.4.8 Phương pháp xác định pH trong nước thải 20

2.5.9 Phương pháp xác định COD trong nước thải 20

2.4.10 Phương pháp xác định BOD5 trong nước thải 21

2.4.11 Phương pháp xác định N tổng số trong nước thải 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VK TỪ NƯỚC THẢI THỦY SẢN 23

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỦNG VK CÓ HOẠT TÍNH PROTEASE 24

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VK H1 25

3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính protease của chủng VK H1 25

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng VK H1 26

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng VK H1 27

3.3.4 Kết quả nhuộm Gram của chủng VK H1 27

3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ VI KHUẨN CHO VÀO BỂ XỬ LÝ SINH

HỌC HIẾU KHÍ 28

3.5 KẾT QUẢ XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN BẰNG BỂ XỬ LÝ SINH HỌC HIẾU KHÍ 29

3.5.1 pH 29

3.5.2 COD 30

3.5.3 BOD5 32

3.5.4 Nitơ tổng 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

4.1 KẾT LUẬN 37

4.2 KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BOD (Biochemical Oxygen Demand) : Nhu cầu oxy sinh hoá

COD (Chemical Oxygen Demand) : Nhu cầu oxy hoá học

3.1 Hình thái khuẩn lạc của các chủng VK phân lập được từ

3.2 Vòng phân giải của các chủng VK Bacillus có hoạt tính

3.3 Đường kính vòng phân giải protein của chủng VK H1 25

3.4 Sự thay đổi pH của nước thải qua 7 ngày xử lý 29

3.5 Sự thay đổi COD của nước thải qua 7 ngày xử lý 31

3.6 Sự thay đổi BOD5 của nước thải qua 7 ngày xử lý 32

3.7 Sự thay đổi Ntổng của nước thải qua 7 ngày xử lý 33

3.8 Giá trị các chỉ tiêu của nước thải sau 7 ngày xử lý 35

2.2 Sơ đồ công nghệ bể xử lý Pilot Aeroten – KT11 19

3.1 Các chủng VK Bacillus phân lập được từ nước thải thủy

3.2 Vòng phân giải protease của 6 chủng VK Bacillus có

3.3 Đường kính vòng phân giải protein của chủng VK H1

3.4 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng VK H1 26

3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng

3.7 Sự thay đổi pH của nước thải qua 7 ngày xử lý 30

3.8 Sự thay đổi COD trong nước thải qua 7 ngày xử lý 31

3.9 Sự thay đổi BOD5 trong nước thải qua 7 ngày xử lý 32

3.10 Sự thay đổi Ntổng trong nước thải qua 7 ngày xử lý 34

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Với đường bờ biển dài 3.260 km và diện tích gần 3.500.000 km2, Việt Nam được xem là nước có tài nguyên biển khá đa dạng và phong phú [4] Nhờ thuận lợi

đó, hàng năm ngành đánh bắt, nuôi trồng, chế biến thuỷ hải sản chiếm tỷ trọng khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam Theo đó, các cơ sở sản xuất chế biến mặt hàng thuỷ sản cũng được xây dựng ngày càng nhiều, không những ở các khu vực có các ngư trường lớn mà còn ở cả những vùng lân cận, các khu dân cư, khu đô thị Nhiều yếu tố tích cực mà mô hình sản xuất này mang lại đã góp phần giải quyết công ăn việc làm cho cộng đồng, đảm bảo lương thực, thực phẩm cho trong nước và xuất khẩu [17]…Tuy nhiên, phải nhìn nhận một vấn đề còn tồn tại là nguy cơ ô nhiễm môi trường mà hoạt động này tác động khá lớn Với đặc tính dòng chất thải

là giàu hữu cơ, nhiều nitơ, photpho… trong đó đáng chú ý là hàm lượng protein cao [4], đồng thời, về cảm quan mùi rất khó chịu cho cộng đồng, nước thải phát sinh từ hoạt động chế biến thuỷ sản này đã được nhận định là nguy hiểm cho môi trường, đặc biệt là cho hệ sinh thái thuỷ vực khi mà hầu hết sông ngòi hiện nay là nơi tiếp nhận nguồn thải Và khi đó, con người cũng sẽ bị ảnh hưởng tiêu cực

Nhận thức được khả năng gây nguy hại cho các thành phần môi trường, hầu hết các nhà máy sản xuất đều xây dựng các trạm xử lý nước thải để giảm nồng độ và tải lượng ô nhiễm trước khi xả vào nguồn tiếp nhận Tuy nhiên, chi phí cho các công trình thường khá tốn kém, đồng thời hiệu quả xử lý còn chưa cao, nhiều công trình có dòng thải sau khi được xử lý vẫn còn mang những đặc tính có khả năng gây hại cho môi trường và sức khỏe con người

Xuất phát từ những nhận thức đó, với mong muốn góp phần nâng cao hiệu quả xử lý nước thải thủy sản bằng một phương pháp đơn giản hơn, hiệu quả hơn,

chi phí thấp và thân thiện với môi trường, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tuyển

chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme protease nhằm ứng dụng trong

xử lý nước thải thủy sản trên địa bàn thành phố Đà Nẵng”

2 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tuyển chọn được các chủng vi khuẩn (VK)

Bacillus có hoạt tính protease mạnh và xác định hiệu quả ứng dụng chúng trong quy

trình xử lý nước thải thủy sản bằng bể xử lý sinh học hiếu khí

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Tuyển chọn và lưu giữ được các chủng VK Bacillus có hoạt tính phân giải

protein mạnh

- Xác định được khả năng ứng dụng chủng vi sinh vật (VSV) nghiên cứu vào

xử lý nước thải thủy sản, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học vào việc xử lý môi trường – là một trong những hướng nghiên cứu chính

để giải quyết vấn đề chất thải trong những năm gần đây

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Việc phân tích các mẫu nước từ một số nhà máy chế biến thủy hải sản là cơ

sở để đánh giá hiện trạng của môi trường nước thải tại một số địa điểm thuộc các khu công nghiệp dịch vụ thủy sản (KCNDVTS) trên địa bàn thành phố Đà Nẵng trong thời gian hiện tại

Đồng thời, kết quả của đề tài cũng góp phần đề xuất giải pháp để giải quyết vấn đề xử lý nước thải thủy sản tại địa phương bằng biện pháp sinh học hiếu khí

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NƯỚC THẢI THỦY SẢN

Song song với sự phát triển mang lại nguồn lợi cơ bản về kinh tế thì ngành chế biến thủy hải sản cũng thải vào môi trường mô ̣t lượng lớn các chất gây ô nhiễm nghiêm tro ̣ng nguồn nước

Nước thải ngành này chứa phần lớn các c hất thải hữu cơ có nguồn gố c từ

đô ̣ng vâ ̣t với thành phần chủ yếu là protein và các chất béo Trong đó, ngoại trừ chất béo khó bị phân hủy bởi VSV [8], các thành phần hữu cơ khác trong nước thải chế biến thủy sản tương đối dễ phân hủy Nước thải chứa các thành phần này khi xả vào môi trường sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do VSV sử dụng ôxy này để phân hủy các chất hữu cơ Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát triển của tôm, cá… Oxy hòa tan giảm không chỉ gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp [10]

Ngoài ra, các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, làm giảm độ sâu tầng nước được ánh sáng chiếu xuống, hậu quả là cản trở quá trình quang hợp của tảo, rong rêu,… Chất rắn lơ lửng không những ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh mà còn gây tác hại về mặt cảm quan (tăng độ đục nguồn nước) và gây bồi lắng lòng sông, cản trở sự lưu thông nước và tàu bè,…[10]

Vì có nồng độ các chất nitơ, photpho cao nên nước thải thủy sản có khả năng gây ra hiện tượng phú dưỡng gây ảnh hưởng tới chất lượng nước thủy vực Ngoài

ra, sự phát triển của các loài tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng khiến cho bên dưới không có ánh sáng, khiến quá trình quang hợp của các thực vật tầng dưới

bị ngưng trệ Nhìn chung, tất cả các hiện tượng trên đều gây tác động xấu tới chất lượng nguồn nước mặt, ảnh hưởng đến hệ thủy sinh, nghề nuôi trồng thủy sản, du lịch và cả nguồn cấp nước [8]

Các VSV đặc biệt như VK gây bệnh và trứng giun sán trong nước là nguồn ô nhiễm đặc biệt Con người trực tiếp sử dụng nguồn nước nhiễm bẩn hay qua các

nhân tố lây bệnh sẽ truyền dẫn các bệnh dịch cho người như bệnh lỵ, thương hàn, bại liệt, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, tiêu chảy cấp tính,…[8]

Tính chất nước thải thường được đánh giá thông qua các chỉ tiêu pH, COD, BOD5, SS, dầu mỡ, Ntổng, Ptổng,… Đặc điểm nước thải của một số loại hình chế biến thủy sản thường gặp được trình bày ở bảng 1.1:

Bảng 1.1 Đặc điểm một số nước thải chế biến thủy sản và tiêu chuẩn cho phép

Nồng độ

QCVN 11:2008, Cột B

Tôm đông lạnh

Cá

da trơn

Thủy sản đông lạnh hỗn hợp

Nguồn: Tổng cục môi trường, 2009

1.2 TỔNG QUAN VỀ VSV SINH TỔNG HỢP PROTEASE

Protease là enzyme hiện nay được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa, làm phomat, làm mềm thịt), bổ sung

để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng VSV như là nguồn cung cấp protease

đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Enzyme protease được sinh tổng hợp ở cả động vật, thực vật và VSV Tuy nhiên, nguồn enzyme protease ở VSV phong phú và có nhiều ưu điểm như: VSV có tốc độ sinh sản nhanh, trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme lớn, enzyme

có hoạt tính cao và khả năng sinh enzyme protease có ở hầu hết các nhóm VSV:

VK, nấm mốc, xạ khuẩn

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus

subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số Clotridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các VK thường tổng hợp

protease thuận lợi nhất ở khoảng pH trung tính và kiềm yếu

1.2.2 Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus, A terricola, A

saitoi… Các nấm mốc này có khả năng sinh cả ba loại protease: acid, kiềm và trung

tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân

protein ở pH 2,5 – 3 [23] Một số nấm mốc như A candidatus, P camerberti, P

roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease làm đông tụ sữa và được sử dụng

trong sản xuất phomat

Hình 1.1 Khuẩn lạc nấm mốc

Nguồn: http://commons.wikimedia.org

1.2.3 Xạ khuẩn [23]

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng tìm ra một số chủng có khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S terimosus,…

Hình 1.2 S grieus dưới kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Khuẩn lạc S fradiae

Nguồn: http://microbcollect.lviv.ua Nguồn: http://microbcollect.lviv.ua

1.3 VI KHUẨN BACILLUS

Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí

do chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện Phần lớn các VK thuộc giống này đều có khả năng sinh ra nhiều α – amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra celllulase, chủng này không sinh ra lipase

Vi khuẩn Bacillus là VK Gram dương, hình que, kích thước khác nhau tùy

từng chủng, thường vào khoảng (0,5 – 2,5)x(1,2 – 10) µm, có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng thu năng lượng nhờ oxy hóa các hợp chất hữu cơ Chúng có thể sống hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện [24]

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh bào tử Thông thường bào tử được tạo ra

khi tế bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại

ở trạng thái bào tử trong nhiều năm Bào tử của VK không phải là một hình thức

sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức để thích nghi để giúp VK vượt qua những điều kiện sống bất lợi [24]

Đa số VK Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus

acidocaldrius [7]

Về nhiệt độ, thường gặp nhất là các chủng VK Bacillus ưa ấm (34oC – 37oC)

Ngoài ra, có nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt độ cao (45oC – 75oC) hay ưa lạnh (5o

C –

25oC) [7]

Hầu hết VK Bacillus không gây độc cho người và động vật Một số loại gây

độc cho côn trùng Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó được ứng dụng

nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp, bảo vệ môi trường …[24]

Hình 1.4 VK Bacillus bắt màu Gram dưới kính hiển vi

Cho đến nay, nhiều công trình nghiên cứu trong nước và nước ngoài có liên

quan đến các chủng vi khuẩn Bacillus cũng như những ứng dụng của chúng trong

cuộc sống đã được tiến hành và thu được những kết quả nhất định

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thiện Phú đã phân lập được 20

chủng VK Bacillus từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó tuyển chọn được 4

chủng có sự hiện diện của tinh thể độc, có khả năng ứng dụng vào việc diệt trừ sâu hại [17]

Nghiên cứu của Trần Thị Anh Thảo (2007) đã phân lập được 5 chủng VK

hiếu khí Bacillus sp và 2 chủng kị khí Clostridium sp dựa vào khả năng sinh

protease Từ đó các chủng này được chọn làm tác nhân để tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn, khả năng thủy phân và sinh hương trên môi trường nước chiết nấm rơm [22]

Một nghiên cứu khác của Lê Thị Bích Phượng (2012) trên một số chủng

Bacillus cũng đã phân lập và tuyển chọn được 10 chủng Bacillus có hoạt tính sinh

tổng hợp nattokinase để từ đó bước đầu thử nghiệm vào việc chế tạo các chế phẩm Nattokinase [18]

Năm 2010, Lê Đông Cung và cộng sự đã đánh giá vai trò của các chủng VK hữu ích trong việc làm giảm nồng độ các chất độc hại trong hệ thống ương tôm sú

nước tuần hoàn Kết quả cho thấy ở 2 nghiệm thức mật độ VK Bacillus bổ sung 10-5CFU/ml và 10-6 CFU/ml, khả năng phân hủy vật chất hữu cơ tốt hơn thông qua các chỉ tiêu COD, NO2-, NO3- và TSS Khả năng duy trì mật độ VK bổ sung ở 2 nghiệm thức này cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 10-4 CFU/ml và đối

chứng Mặt khác khả năng lấn át các dòng VK khác đặc biệt là VK Vibrio tốt hơn

và tạo dòng VK ưu thế có lợi cho môi trường [3]

F Soundra Josephine và cộng sự (2012) đã phân lập được chủng Bacillus sp

từ các mẫu đất, đồng thời cũng nghiên cứu các đặc điểm sinh học, ảnh hưởng của

pH và nhiệt độ tác động đến chủng Bacillus sp Theo đó, pH ở khoảng 7 – 7,5 và

nhiệt độ ở khoảng 25 – 300C là thích hợp cho sự phát triển tối ưu của VK [30]

Cũng trên đối tượng là chủng Bacillus sp., nhóm nghiên cứu của Udandi

Boominadhan (2009) đã nghiên cứu cho ra những kết quả nhằm tối ưu hóa khả năng

sản xuất protease của một số chủng VK Bacillus như: đường là nguồn carbon tối ưu cho hoạt động sản xuất protease của B subtilis, còn tinh bột là nguồn carbon tốt nhất cho hoạt động sản xuất protease của B licheniformis, hay nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất làm tăng khả năng sản xuất protease của Bacillus sp là từ cao thịt bò [35]

Năm 2009, J P Chenel và cộng sự đã phân lập được hai chủng VK ưa nhiệt nhằm nghiên cứu sản xuất enzyme protease chịu nhiệt từ bùn nước thải đô thị, hai chủng này cho thấy sự tăng trưởng mạnh nhất ở 55oC trên môi trường thạch dinh dưỡng Nghiên cứu sơ bộ cũng cho thấy hai chủng này không hình thành bào tử VK Gram âm, trái ngược với các chủng VK thường sử dụng để sản xuất các loại enzyme Đồng thời bước đầu thử nghiệm chế tạo các chế phẩm sinh học xử lý môi trường [31]

Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đã tạo một nền tảng cơ bản cho việc phân lập và tuyển chọn các chủng VSV có hoạt tính protease, tuy nhiên những nghiên cứu này tập trung nhiều vào việc thu sinh khối protease để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm hay các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, ngư nghiệp…, trong khi đó, những nghiên cứu về việc ứng dụng VSV phân giải protein vào xử lý nước thải thủy sản còn tương đối hạn chế Do vậy, đề tài được tiến hành với mong muốn phát triển hơn nữa những ứng dụng của VSV vào phục vụ cuộc sống

1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI

Hình 1.5 Bể điều hòa Hình 1.6 Bể lắng Lamen

1.4.2 Phương pháp xử lý hóa lý [21]

Bản chất của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp hóa lý là áp dụng các quá trình vật lý và hóa học để loại bớt các chất ô nhiễm mà không thể dùng quá trình lắng ra khỏi nước thải Các công trình tiêu biểu của việc áp dụng phương pháp hóa lý bao gồm: bể keo tụ, tạo bông, bể tuyển nổi, phương pháp hấp phụ…

1.4.3 Phương pháp hóa học [1]

Xử lý nước thải bằng phương pháp hóa học thường là khâu cuối cùng trong dây chuyền công nghệ trước khi xả vào nguồn tiếp nhận yêu cầu chất lượng cao hoặc khi cần thiết sử dụng lại nước thải Các quá trình xử lý hóa học được trình bày trong bảng 1.2:

Bảng 1.2 Ứng dụng của quá trình xử lý hóa học

Các quá trình

khác

Nhiều loại hóa chất được sử dụng để đạt được những mục tiêu nhất định nào đó Ví dụ như dùng hóa chất để kết tủa các kim loại nặng trong nước thải

1.4.4 Phương pháp xử lý sinh học [21]

Các chất hữu cơ dạng keo, huyền phù và dung dịch là nguồn thức ăn của VSV Trong quá trình hoạt động sống, VSV oxy hóa các hợp chất hữu cơ này để kiến tạo nên cơ thể, kết quả là làm sạch nước thải khỏi nguồn ô nhiễm các chất hữu

cơ Quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học có thể được tiến hành trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí

Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học hiếu khí được dựa trên sự oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước thải nhờ oxy tự do hòa tan Còn xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học kỵ khí là quá trình xử lý được dựa trên cơ sở phân hủy các chất hữu cơ giữ lại trong công trình nhờ sự lên men kị khí Đối với các hệ thống

xử lý nước thải quy mô vừa và nhỏ người ta thường dùng các công trình kết hợp với việc ngăn tách cặn lắng với phân hủy yếm khí các chất hữu cơ trong pha rắn và pha lỏng

Xử lý nước thải bằng con đường sinh học có thể xảy ra trong điều kiện tự nhiên hoặc nhân tạo Trong điều kiện tự nhiên, đó là các công trình xử lý nước thải trong đất hay hồ sinh học Trong điều kiện nhân tạo, có thể xử lý bằng phương pháp sinh học hiếu khí với hệ VSV bám dính (bể lọc sinh học nhỏ giọt, đĩa quay sinh học,

bể lọc sinh học có vật liệu ngập trong nước), xử lý sinh học bằng hệ VSV sinh trưởng lơ lửng (xử lý sinh học bằng phương pháp bùn hoạt tính, bể Aeroten) hay xử

lý bằng phương pháp sinh học kỵ khí với sinh trưởng lơ lửng (phương pháp tiếp xúc

kị khí, bể UASB), xử lý kỵ khí với phương pháp sinh trưởng gắn kết (lọc kỵ khí với sinh trưởng gắn kết trên giá mang hữu cơ, lọc kị khí với lớp vật liệu giả lỏng trương nở)

1.5 THỰC TRẠNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI THỦY SẢN Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

1.5.1 Thực trạng xử lý nước thải thủy sản ở Việt Nam

Thành phần nước thải chế biến thủy sản chứa chủ yếu các hợp chất hữu cơ có khả năng phân hủy sinh học, các hợp chất nitơ và photpho Vì thế, lựa chọn biện pháp sinh học để xử lý nước thải thủy sản được xem là hợp lý và có thể đem lại hiệu quả cao Trên thực tế, một số quy trình công nghệ xử lý nuớc thải thủy sản theo hướng này cũng đã được áp dụng tại Việt Nam [10]:

- Kết hợp cả hai quá trình kỵ khí và hiếu khí như cụm bể UASB và bể bùn hoạt tính lơ lửng hiếu khí (activated sludge) và bể thiếu khí (bể anoxic)

- Xử lý sinh học hiếu khí như cụm bể bùn hoạt tính lơ lửng hiếu khí (activated sludge) và bể thiếu khí (bể anoxic)

- Mương oxy hóa, tùy thuộc vào nguồn tiếp nhận nước thải theo QCVN 11:2008, cột B hay cột A, hay quy định của khu công nghiệp đối với các nhà máy chế biến thủy sản nằm trong khu công nghiệp mà hệ thống xử lý nước thải không

cần hoặc cần phải có các bước tiền xử lý hay quá trình xử lý bậc ba

Mặt khác, tùy thuộc vào đặc thù của từng loại nước thải thủy sản để xem xét

bổ sung thêm những công đoạn xử lý riêng nhằm mục đích đạt hiệu quả xử lý chất hữu cơ cao nhất

1.5.2 Thực trạng xử lý nước thải thủy sản ở Đà Nẵng

Tại Ðà Nẵng, hầu hết các nhà máy chế biến thủy sản thường lựa chọn công nghệ sinh học hiếu khí bùn hoạt tính lơ lửng hay kết hợp kỵ khí và hiếu khí Một số doanh nghiệp chỉ xử lý sơ bộ nuớc thải bằng biện pháp keo tụ, tạo bông rồi đấu nối vào hệ thống xử lý nuớc thải tập trung của KCNDVTS

Theo đánh giá chung, hầu hết các công trình xử lý nước thải của các nhà máy chế biến thủy sản trên địa bàn thành phố Ðà Nẵng hiện nay hoạt động vẫn chưa đạt hiệu quả Đặc biệt là nước thải từ các nhà máy chế biến thủy sản trong KCNDVTS Thọ Quang vẫn chưa được xử lý đạt yêu cầu, trạm xử lý nước thải tập trung quá tải, thuờng xuyên xảy ra các sự cố về kỹ thuật KCNDVTS Thọ Quang đang là điểm nóng về môi trường của thành phố [10]

Hình 1.8 Bể Aeroten tại công ty TNHH Bắc Đẩu

Tại công ty TNHH Bắc Đẩu – là một trong hai địa điểm thu mẫu và nằm trong KCNDVTS Thọ Quang, nhận thấy bể xử lý tại chỗ của công ty hoạt động vẫn chưa đạt hiệu quả cao, dẫn đến cảm quan mùi rất khó chịu, gây ô nhiễm cho môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe của công nhân trong nhà máy và người dân xung quanh

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Nước thải từ công ty TNHH Bắc Đẩu và trạm xử lý nước thải thủy sản tập trung KCNDVTS tại Đà Nẵng

- Các chủng VK Bacillus sinh hoạt tính protease có trong nước thải thủy sản

trên địa bàn Thành phố Đà Nẵng như: công ty TNHH Bắc Đẩu, trạm xử lý nước thải thủy sản tập trung KCNDVTS Thọ Quang

- Quy trình xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học sử dụng các chủng VSV 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài tập trung vào các nội dung sau:

- Phân lập, tuyển chọn các chủng VK Bacillus có khả năng phân giải protein

trong nước thải thủy sản

- Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng VK có hoạt tính protease mạnh nhất

- Ứng dụng khả năng phân giải protein của chủng được chọn trong quy trình

xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm và so sánh hiệu quả với khi không bổ sung dịch nuôi cấy VSV vào quy trình xử lý Từ đó tạo cơ sở nền tảng cho việc sản

xuất các loại chế phẩm môi trường phục vụ cho việc xử lý nước thải thủy sản

- Xử lý số liệu thực nghiệm và đưa ra kết luận về các thông số động học của

quá trình

2.3 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu

a Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa

- Công ty TNHH Bắc Đẩu

- Trạm xử lý nước thải thủy sản tập trung KCNDVTS Thọ Quang

b Địa điểm tiến hành thí nghiệm

Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sử dụng VSV để xử lý nước thải thủy sản và phân tích các chỉ số được tiến hành ở các

phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng:

- Phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh

- Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học

- Phòng thí nghiệm Phân tích môi trường

2.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tập trung vào:

- Đối tượng VK Bacillus là loại VSV hiếu khí thường gặp trong nước thải thủy

sản, đồng thời chú trọng nghiên cứu đến khả năng sinh hoạt tính phân giải protein,

là thành phần hữu cơ chủ yếu có trong loại nước thải này

- Thu thập các mẫu nước thải từ 2 địa điểm chính là công ty TNHH Bắc Đẩu

và trạm xử lý nước thải thủy sản tập trung KCNDVTS Thọ Quang – Đà Nẵng

- Tập trung vào các chỉ tiêu pH, COD, BOD5 và Ntổng qua thời gian xử lý, đây được xem là các yếu tố chính được xem xét khi đánh giá tiêu chuẩn vệ sinh nguồn nước

2.3.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10/2013 – 4/2014 bao gồm nghiên cứu tài liệu (tháng 10/2013), nghiên cứu thực nghiệm (11/2013 – 4/2014), viết và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp (4/2014 – 5/2014)

Bổ sung dung dịch nuôi cấy lắc của VK vào bể xử lý sinh học

Đo các thông số của nước thải sau quá trình xử lý

Xử lý số liệu, rút ra kết luận

Thu mẫu nước thải thủy sản thực địa

Phân lập các chủng VK

Khảo sát các đặc điểm sinh học của chủng VK được chọn

Xác định hoạt tính protease của các chủng VK phân lập được,

tuyển chọn chủng có hoạt tính mạnh nhất

Nuôi cấy lắc chủng VK được chọn

Bố trí thí nghiệm trên

bể xử lý sinh học

Xác định mật độ VK Đo các thông số của nước

thải trước quá trình xử lý

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình thực hiện của nghiên cứu được tiến hành theo các bước sau:

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa [6], [23]

Do đặc tính dòng thải tại công ty TNHH Bắc Đẩu là chỉ xả thải tại một cống chính duy nhất trước trước khi đưa vào hệ thống xử lý sơ bộ, tương tự ở khu xử lý nước thải tập trung KCNDVTS Thọ Quang, nước thải từ các nhà máy thủy sản đưa

đến cũng đều đấu nối chung vào một cống trước khi đưa qua xử lý Vì vậy, tiến hành thu mẫu tại cống với những vị trí cách xa nắp xả 0m; 0,2m; 0,4m ở độ sâu khoảng 10 – 20 cm

Mẫu nước thải được cho vào chai nhựa đã được tráng lại 2 – 3 lần bằng nước thải, ướp lạnh trong thùng xốp và mang về phòng thí nghiệm Do đặc thù của đề tài cần tiến hành phân lập các chủng VSV hoặc phân tích các chỉ tiêu như BOD5, COD,… nên mẫu được tiến hành phân tích và phân lập ngay Trong trường hợp cần thiết phải lưu mẫu, mẫu nước thải được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC và sử dụng trong vòng 24h sau đó

2.4.2 Phương pháp phân lập và giữ giống VSV

Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov [6], [23]

- Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều,

Theo phương pháp Egorov, để bảo quản chủng giống VSV cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành cấy lại định kì trên môi trường thạch nghiêng có cùng môi trường để ở tủ ấm ở 35oC – 39oC trong 2 – 3 ngày Sau đó bảo quản trong

tủ lạnh ở 4oC, cấy chuyền định kì để giữ giống

2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh hoạt tính protease của VSV

Để xác định các chủng VSV có hoạt tính protease, chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi enzyme protease thủy phân casein có trong môi trường thạch sẽ tạo vòng phân giải màu trong suốt quanh

lỗ thạch Dựa vào hiệu số đường kính vào phân hủy và đường kính lỗ thạch mà ta xác định được hoạt tính enzyme protease của các chủng VSV

a Môi trường xác định hoạt tính protease:

d, mm) mà ta xác định được hoạt tính của chủng VSV Trong đó, D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính khuẩn lạc (mm)

Quan sát hiệu số (D – d) của chủng VSV để xác định chủng VSV nào có hoạt tính Hiệu số (D – d) càng lớn thì chủng đó có hoạt tính càng mạnh

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của VSV [23]

Cấy chủng VSV trên môi trường LB Broth có bổ sung agar ở nhiệt độ 30 –

350C Sau 1 – 2 ngày xuất hiện các khuẩn lạc, quan sát màu sắc, kích thước, hình dạng của chúng

Nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào và xác định VK Gram (+)/(-)

2.4.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của VSV [6], [23]

a Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng phát triển của VSV

Để xác định giá trị pH mà tại đó sự sinh trưởng của VSV đạt tối ưu, chúng tôi tiến hành bổ sung 200µL dung dịch nuôi cấy lắc VSV vào lần lượt vào 9 bình tam giác có 150ml môi trường LB Broth đã được chuẩn pH với các giá trị lần lượt

từ 5 đến 9 Sau đó tiếp tục nuôi cấy lắc trong 24h rồi tiến hành do mật độ quang (chỉ

số OD) 9 mẫu theo từng pH ở bước sóng 420nm Cuối xùng xác định khoảng pH

mà tại đó chỉ số nhất (VSV nhiều nhất), đó chính là khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng của VSV

b Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng phát triển của VSV

Tương tự như đối với khảo sát ảnh hưởng của pH, tiến hành đặt dung dịch nuôi cấy lỏng đã cấy VSV ở các môi trường nhiệt độ khác nhau: 200C, 250C, 300C,

350C, 400C Sau 48h, tiến hành đo mật độ quang Ở khoảng nhiệt độ mà chỉ số OD đạt giá trị cao nhất (số lượng VSV nhiều nhất) thì đó là khoảng nhiệt độ tối ưu cho

sự sinh trưởng phát triển của VSV

c Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính protease của VSV

Tương tự như “Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh hoạt tính protease của VSV”, tiến hành nuôi cấy VSV trong môi trường lỏng, sau đó theo các mốc thời gian 24h, 48h, 72h lần lượt cho dung dịch nuôi cấy vào lỗ thạch Tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp trên rồi dựa vào hiệu số đường kính thủy phân và đường kính lỗ thạch (D – d, mm) để xác định thời điểm chủng VSV sinh hoạt tính mạnh nhất