Chiết xuất và phân lập acid glycyrrhizic từ cam thảo

Dược liệu là thế mạnh của ngành công nghiệp dược nước ta vì vậy đẩy mạnh phát triển dược liệu là một trong những mục tiêu hàng đầu.Cam thảo là dược liệu truyền thống được sử dụng rộng rãi do có nhiều công dụng, gần đây y học hiện đại quan tâm đến cam thảo với hoạt tính chống virus và có nhiều triển vọng trong điều trị HIV với các kết quả nghiên cứu bước đầu trên glycrryhizic acid chiết xuất từ rễ cam thảo. Vấn đề chiết xuất và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cam thảo có vai trò quan trọng, cung cấp các hợp chất tinh khiết làm nguyên liệu để tạo ra các chế phẩm thuốc dùng trong điều trị.Bài báo cáo này được thực hiện nhằm cung cấp một số thông tin về quá trình chiết xuât, phân lập tinh khiết hoạt chất Saponin chính trong cây cam thảo – Glycrryhizic acid.

Đặt vấn đề ii

1 Tổng quan tài liệu 1

1.1 Thực vật học 1

1.1.1.Phân loại thực vật 1

1.1.2.Mô tả thực vật 1

1.1.3.Phân bố, thu hái, chế biến 2

1.2 Thành phần hóa học 3

1.3 Tác dụng – công dụng 5

1.3.1.Tác dụng chung của cam thảo 5

1.3.2.Các nghiên cứu về tác dụng của glycyrrhizin 6

2 Chiết xuất phân lập 9

2.1 Các phương pháp chiết xuất 9

2.1.1.Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (Multi–stage countercurrent extraction - MCE) 9

2.1.2.Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave-aissisted extraction) 20

2.2 Các phương pháp phân lập 26

2.2.1.Phân lập và tinh khiết hóa bằng cách chiết với dung môi hữu cơ 26

2.2.2.Phương pháp sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao (Hight speed counter-current chromatography) 37

3 Kết luận – nhận định 43

Tài liệu tham khảo 44

i

Trong xu thế Việt Nam giai nhập WTO, ngành dược nước ta có nhiều cơ hộiphát triển và cũng đối mặt với không ít khó khăn Dược liệu là thế mạnh củangành công nghiệp dược nước ta vì vậy đẩy mạnh phát triển dược liệu là mộttrong những mục tiêu hàng đầu.

Cam thảo là dược liệu truyền thống được sử dụng rộng rãi do có nhiều côngdụng, gần đây y học hiện đại quan tâm đến cam thảo với hoạt tính chống virus và

có nhiều triển vọng trong điều trị HIV với các kết quả nghiên cứu bước đầu trênglycrryhizic acid chiết xuất từ rễ cam thảo Vấn đề chiết xuất và phân lập các hợpchất có hoạt tính sinh học trong cam thảo có vai trò quan trọng, cung cấp các hợpchất tinh khiết làm nguyên liệu để tạo ra các chế phẩm thuốc dùng trong điều trị.Bài báo cáo này được thực hiện nhằm cung cấp một số thông tin về quátrình chiết xuât, phân lập tinh khiết hoạt chất Saponin chính trong cây cam thảo –Glycrryhizic acid

ii

1 TỔNG QUAN:

1.1 THỰC VẬT HỌC [1]

1.1.1 Phân loại thực vật.

Cam thảo còn có tên là Bắc cam thảo, Cam thảo, Sinh cam thảo, Quốc lão

Tên khoa học Glycyrrhiza uralensis Fish và Glycyrrhiza glabra L (G.

glandulifera Waldst et Kit) Thuộc họ đậu ( cánh bướm) Fabaceae

(Papilionaceae)

Cam thảo (Radix Glycyrhizae) là rễ và thân rễ phơi hay sấy khô của cây

cam thảo nguồn gốc Uran (Glycyrrhiza uralensis Fish.) hay cây cam thảo Châu

Âu Glycyrrhiza glabra L.

Tên Cam thảo vì cam là ngọt, thảo là cỏ, cỏ có vị ngọt

Glycyrrhiza vì do chữ Hy Lạp Glykos là ngọt và riza là rễ, rễ có vị ngọt, uralensis vì sản xuất ở vùng núi Uran, dãy núi nằm giữa Châu Á, Châu Âu.

1.1.2 Mô tả thực vật:

Hình 1: Cây Cam thảo Glycyrrhiza uralensis Fish.

Cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis) là một cây sống lâu năm thân có thể

cao tới 1m hay 1,5m Toàn thân cây có lông rất nhỏ Lá kép lông chim lẻ, lá chét

9 - 17, hình trứng, đầu nhọn, mép nguyên, dài 2 – 5,5 cm, rộng 1,5 – 3 cm Vàomùa hạ và mùa thu nở hoa màu tím nhạt, hình cánh bướm dài 14 – 22cm (cây

trồng ở Việt Nam sau 3 năm chưa thấy ra hoa) Quả giáp cong hình lưỡi liềm dài

3 – 4 cm, rộng 6 – 8 cm, màu nâu đen, mặt quả có nhiều lông Trong quả có 2 – 8hạt nhỏ dẹt, đường kính 1,5 – 2mm màu xám nâu, hoặc xanh đen nhạt, mặt bóng.Tại Trung Quốc mùa hoa tháng 6 – 7, mùa quả tháng 7 – 9

Hình 2: Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra L

Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra rất giống loài Cam thảo Glycyrrhiza

uralensis, nhưng khác ở chỗ lá chét thuôn dài hơn, dài 1,5 – 4 cm, rộng 0,8 –

2,3mm, quả giáp thẳng hoặc hơi cong, dài 2 – 3cm, rộng 4 – 4,4mm, mặt quả gầnnhư bóng hoặc có lông ngắn, số hạt ít hơn loài trên Mùa hoa tháng 6 – 8, mùaquả tháng 7 – 9

1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến:

Cây Cam thảo bắc trước đây không có ở nước ta Từ năm 1958 được du

nhập vào Việt Nam bằng những hạt giống của loài Glycyrrhiza uralensis do Liên

Xô cũ cung cấp Cây mọc khỏe vào mùa xuân hạ và thu Đến mùa đông thì lụi đihoặc kém phát triển Sang năm sau cây lại mọc mới Lượng chất trong rễ mỗinăm mỗi tăng Tuy nhiên, sau 3 năm cây vẫn chưa ra hoa Một số tài liệu nói rằngcây trồng thường không ra hoa

Trồng bằng hạt hoặc bằng thân rễ Sau 4 – 5 năm trở lên có thể thu hoạch.Đào rễ và thân rễ vào mùa xuân hoặc thu đông Nhưng mùa thu đông cam thảo tốt

hơn Mỗi hecta có thể thu hoạch 8 – 10 tấn Vì là một cây lâu năm mới thu hoạchcho nên trong 2 – 3 năm đầu người ta thường trồng xen các cây thực phẩm Khiđào thường người ta chỉ lấy rễ, nhưng nhiều khi lấy cả thân rễ Thân rễ dài, có khitới 7 – 8m.

Sau khi đào rễ, người ta xếp đống để cho hơi lên men, làm cho rễ có màuvàng sẫm hơn, là màu người ta chuộng hơn

Tại Liên Xô cũ, Trung Quốc và nhiều nước khác cây Cam thảo mọc hoang

và trở thành một thứ cỏ khó diệt trừ, chỉ một mẫu thân rể có thể trở thành bụi Camthảo và cứ như vậy lan ra rộng mãi Những khu vực Cam thảo mọc hoang là nơi

1809 dưới dạng mảnh màu vàng Glycyrrhizin tinh khiết dạng bột màu trắng dễtan trong nước nóng, cồn loãng, ít tan trong nước lạnh, nếu để nguội sẽ tạo thànhgel, không tan trong ether và chloroform Nếu cho vào nước lắc thì tạo bọt Độngọt gấp 60 lần saccharose, nhưng nếu phối hợp với mía, độ ngọt lại tăng lên và

có thể gấp 100 lần

Dưới tác dụng của acid vô cơ, acid glycyrrhizic bị đẩy ra khỏi muối của

nó Khi thủy phân bằng acid thì nó cho phần aglycon là acid glycyrrhetic ( còngọi là acid glycyrrhetinic) và 2 phân tử acid glucuronic Acid glycyrrhetic có mộtnhóm OH ở C-3 ( nối với 2 phân tử acid glucuronic) một nhóm carbonyl ở C-11,một nối đôi ở C-12-13 và ở C-30 là nhóm carboxyl

Trên thị trường, glycyrrhizin thương phẩm là amoni glycyrrhizat thuđược bằng cách chiết bột cam thảo với nước rồi acid hóa để kết tủa, rửa tủa rồi lạihòa tan trong amoniac, bốc hơi trong các khay mặt bằng sẽ thu được những vảymàu đen nhạt, bóng, tan trong nước và rất ngọt Hàm lượng glycyrrhizin là 6 –12% ( dược liệu khô).

Hình3: Glycyrrhizic acid.

Trong Cam thảo còn có các dẫn chất triterpenoid khác như: acid liquiritic(acid này khác acid glycyrrhetic bởi nhóm carboxyl ở C-29), acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic, acid 24-α-hydroxyglycyrrhetic, glabrolid, deoxyglaborid,isoglabrolid, 24-α-hydroxyisoglabroid, acid liquiridiolic, aicd 11-deoxyglycyrrhetic, acid 24-hydroxy 11-deoxyglycyrrhetic

Các flavonoid là nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong rễ Cam thảovới hàm lượng 3 – 4% Có 27 chất đã được biết, quan trọng nhất là hai chấtliquiritin (hay liquiritirosid) và isoliquiritin (hay isoliquiritirosid )

Hình 4: Flavonoid chính trong rễ cây cam thảo.

Liquiritin được Shinoda và Ueda (1934) phân lập, chất này thuộc nhómflavanon, có phần aglycon là liquiritigenin ( 4’,7dihydroxy – flavanon)

Isoliquiritin được Puri và Seshadri phân lập (1954) Chất này là đồngphân của chất trên và thuộc nhóm chalcon, phần aglycon là isoliquiritigenin( 4,4’,6’ – trihydroxy chalcon) Isoliquiritigenin ở môi trường acid thì đồng phânhóa thành liquiritigenin.

Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan bridin), isoflavon (glabron), isoflaven (glabren)

(gla-Những hoạt chất estrogen steroid: phần này tan trong ether dầu hỏa, khithí nghiệm trên chuột cống đã thiến thì thấy xuất hiện những tế bào sừng nontrong niêm dịch âm đạo

Những chất coumarin: umbelliferon, herniarin, liqcoumarin (6-acetyl – 5– hydroxy – 4 – methyl coumarin)

Glycyrrhiza uralensis Fisch.

Rễ chứa carbohydrate 4,7 – 10,97%, tinh bột 4,17 – 5,92%; glycyrrhizin 5,49 –10,04%, acid 24 – hydroxy glycyrrhetic, acid 3β – hydroxyolean – 11,13 (18) dien– 30 – oic, acid 3β hydroxyolean – 19 (11), 12 (13) dien – 30 oic; flavonoid cókhoảng 20 chất trong đó những chất chính là liquiritin, liquiritigenin , isoquiritin,isoliquiritigenin, neoliquiritin, (dl) – liquiritigenin – 7 - β – D – glucopyranosid,neo – isoliquiritin (trans – isoliquiritigenin – 4- β – D – glycopyranosyl – 2 – β –

D – apio – d (hay l ) – furanosid)

1.3.1.2. Tính vị, công năng:

Rễ Cam thảo bắc có vị ngọt, tính bình Để sống ( đồ mềm, sấy khô) có tácdụng giải độc, tả hỏa; tẩm mật, sao vàng ( chích Cam thảo), lại có tác dụng ôntrung, nhuận phế, điều hòa các vị thuốc

1.3.1.3. Công dụng:

Cam thảo sống được dùng chữa cảm, ho mất tiếng, viêm họng, mụn nhọt,đau dạ dày, ỉa chảy, ngộ độc Cam thảo chích có tác dụng bổ, chữa tỳ vị hưnhược, ỉa lỏng, thân thể mệt mỏi, kém ăn

Các nghiên cứu gần đây cho thấy Cam thảo bắc còn có thêm một số tácdụng: Chữa loét dạ dày ruột, có tác dụng giảm loét, giảm co thắt cơ trơn, giảm tiếtacid hydroclorid; chữa bệnh addison

Cam thảo bắc dùng phối hợp với cortison có thể làm giảm tác dụng củacortison Cam thảo bắc làm cho thuốc có vị ngọt, dễ uống và thường có trongthành phần các thuốc viên, thuốc phiến, kẹo ngậm, siro chữa ho

Theo tài liệu nước ngoài, trong y học Trung Quốc, Cam thảo bắc dùngphối hợp với một số dược liệu khác làm thuốc long đờm chữa ho gà, thuốc để bao

và bảo vệ niêm mạc dạ dày, thuốc chữa lao phổi và viêm phế quản, thuốc giải độcđối với ngộ độc thịt và nấm, thuốc có tác dụng làm trẻ người Rễ Cam thảo bắccòn có tác dụng nhuận tràng nhẹ, được dùng chữa các chứng bệnh xuất tiết và cácchứng kích thích niêm mạc các cơ quan đường tiết niệu Trong y học dân gian Ấn

Độ, Cam thảo bắc còn được dùng nhai với lá trầu không, nhào với bơ sữa trâuhoặc mật ong để đắp ngoài chữa vết chém, vết thương

1.3.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG CỦA

GLYCYRRHIZIN ( ACID GLYCYRRHIZIC).[4]

Giá trị y học của rễ cam thảo là do chứa các hợp chất có hoạt tính sinh họcnhư triterpen glycoside, hợp chất phenolic, oligo và polysaccharides, lipid,sterine… quan trọng nhất là triterpen glycoside, acid glycyrrhizic (GL) vàaglycone của nó, 18β-glycyrrhetinic acid (GLA), một pentacyclic triterpen thuộcnhóm β-amyrin

GA và aglycone của nó có nhiều hoạt tính sinh học (kháng viêm, chốngloét, chống dị ứng, chống giảm khả năng nhận thức, chống oxi hóa, chống virut,chống khối u),… muối monoammonium của GL (glycyram, tusillnar) được dùnglàm biện pháp khắc phục chống dị ứng, kháng viêm cho chữa bệnh hen suyễn,eczemas, và các bệnh khác Thuốc này được ứng dụng để giảm hiện tượng dung

nạp glucocorticosteroid.

Muối Natri của hemisuccinate acid glycyrrhetinic (carbenoxolone) được

sử dụng thành công cho điều trị loét dạ dày tá tràng

Sự tương đồng về cấu trúc của GL aglycone đến 11- ketosteroid xác địnhcũng tương đồng trong hoạt tính sinh học Vì thế, GL và aglycone ảnh hương đếnchuyển hóa muối nước, ức chế sự oxi hóa do nhiễm độc phospho, quá trình sinhtổng hợp mucopolysaccharic và hoạt tính của men phospholipase A2, cải thiệnhoạt tính của glutamic transaminase GL và GLA ảnh hưởng đến sự tăng acidarachidonic, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandine và leucotriene.Monoammonium glycyrrhizate ức chế hình thành PGE2 và PGF2a ở thận chuột invitro và invivo tương đương với indomethacin Tác động chống dị ứng của GL dotác dụng đối kháng với acetylcholine, histamine và các chất kích thích dị ứng.Monoammonium glycyrrhizate và GLA được ghi nhận như là một tác nhân làmgiảm lipid và chống oxi hóa Tác dụng kháng viêm của GL và aglycone của nóđược tìm thấy với tác dụng chống loét gây ra bởi quá trình tổng hợp acid nucleic

ở niêm mạc dạ dày

Hoạt tính giải độc của GL được xác định chắn bởi sư hiện diện của acidglucuronic trong cấu trúc của nó GL và muối của nó có thể chống lại liều gây

nghị sử dụng như những chất giải độc GL ngăn sự tổn thương tế bào gan ở chuột

do các chất gây độc như allylformiate, acid linolic, galatose amine, và CCl4 Tínhchất bảo vệ tế bào gan của GA được cho là liên quan đến tác dụng chống oxy hóacủa nó Vì thế GL ức chế sản phẩm aminotrasferases từ tế bào gan chuột trênvitro và chất gây độc tế bào gan trên vivo và giảm lượng lipid peroxides ở chuộtgiống như α-tokoferol

GL được sử dụng trên lâm sàng ở Nhật bằng đường tĩnh mạch để trị viêmgan siêu vi B mãn GL thay đổi sự vận chuyển trong tế bào, ngăn chặn quá trìnhsyalyl hóa của virut viêm gan siêu vi B,C trên bề mặt kháng nguyên trong ống

nghiệm Điều đó chỉ ra rằng chữa trị của SNMC cho bệnh nhân bị nhiễm virutviêm gan C làm giảm transaminase trong huyết tương hoạt động ngay cả trongcác bệnh nhân kháng trị với interferon GL kích thích sản xuất -interferon trongống nghiệm Trên lâm sàng GL tiêm tĩnh mạch kích thích -interferon diệt thôngthường (normal killers) và interferon trong huyết tương Một tác dụng kích thíchcủa GL trên sự tiết của interleukin-2 được tìm thấy trong những dòng bạch cầungoại vi nuôi cấy

GL và muối monoammonium ức chế sự tăng trưởng AND và ARN củavirut (vaccinia, bệnh New Castle, mụn nước, bệnh thủy đậu, zona, cúm…) invitro GL là một trong những glycoside thiên nhiên đầu tiên ức chế virut gây bệnhHIV type 1 (HIV-1) trong nhóm 4 loại tế bào, được chứng minh bởi các nhànghiên cứu lâm sàng học, sự kiểm soát của GL đến bệnh nhân AIDS là trì hoãn sựtiến triển của triệu chứng nhiễm HIV Điều trị đầu tiên với GL được bắt đầu sớmkhi HIV-1 chưa có triệu chứng, đã bảo vệ bệnh nhân hơn 11 năm mà không cócảm ứng của thuốc chống lại Người ta khám phá ra rằng sự trị liệu đồng thời GLcùng với azidotymidine (AZT) làm giảm tác dụng phụ của thuốc AZT Cơ chếchống lại hoạt động của HIV của GL là nối với cấu trúc polyanionic của nó GLngăn cản bằng cách bám vào virut và ức chế proteinkinase C là yếu tố phải có cho

sự liên kết của HIV-1 với các receptor của tế bào CD4

Ngày nay GL là thuốc đang được quan tâm trong việc chữa bệnh và thayđổi cấu trúc của nó sẽ tạo ra những hợp chất có hoạt tính sinh học cho y học

2 CHIẾT XUẤT – PHÂN LẬP.

2.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT.

2.1.1. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn

(Multi–stage countercurrent extraction - MCE)[6].

2.1.1.1. Thiết kế thí nghiệm.

2.1.1.1.1. Mẫu cam thảo nguyên liệu.

Mẫu rễ cam thảo thô (Glycyrrhiza uralensis Fisch) được cung cấp bởi nhóm

nghiên cứu ELION Mẫu được xác thực bởi Giáo sư ShouQuan Lin thuộc TrungTâm Cây Thuốc, Viện Hàm Lâm Khoa Học và Y Khoa Trung Quốc (Institute ofMedicinal Plants, Chinese Academy Medical Sciences) Hàm lượng GA trongmẫu cam thảo thô là 3,72% về khối lượng, được xác định bởi phân tích HPLC.Mẫu cam thảo được cắt thành lát tròn dày khoảng 3mm với đường kính từ 5-10mm

2.1.1.1.2. Thuốc thử.

Acetonitrile, acid trifluoroacetic, ethanol và nước amoniac (25% amoniactrong nước) được sử dụng trong thí nghiệm đều đạt chuẩn phân tích Thuốc thửđược cung cấp bởi công ty hóa chất Sigma Acid Glycyrrhizic được cung cấp bởinhóm nghiên cứu ELION Nước được sử dụng trong chiết xuất cam thảo và dùnglàm pha động trong phân tích HPLC đều được cất bởi thiết bị cất nước Millipore(Millipore, USA)

2.1.1.1.3. Thiết bị.

Tất cả các thử nghiệm MCE đều được thực hiện trên thiết bị MCE ModelDN-1.5 (Hangzhou Chunjiang Pharmacy Mechine Co., Ltd., Hangzhou, China).Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) được thực hiện trên thiết bị chiết xuất vi sóngModel WCD2S-1 có bộ điều nhiệt tự động và kiểm suất năng lượng (NanjingSanle Microwave Technology Co., Ltd., Nanjing, China) Chiết siêu âm (USE)được thực hiện trên thiết bị chiết siêu âm Model SK3200LH (Shanghai Kudosultrasonic instrument Co., Ltd., Shanghai, China) Chiết bằng Soxhlet (SHE) đượcthực hiện trên bình chiết Soxhlet thủy tinh thông dụng Phân Tích HPLC đượcthực hiện trên thiết bị HPLC Agilent Model 1100 (Agilent Co., Ltd., USA) baogồm thiết bị bơm, đầu dò mảng lưỡng cực (diode array detector - DAD) và bộ

phận tiêm mẫu tự động Trước khi phân tích HPLC, dịch chiết được đem đi quay

ly tâm với tốc độ cao (12000 vòng/phút) trong 10 phút bởi Máy quay li tâm đônglạnh MIKRO 22R (Hettich, Germany)

2.1.1.1.4. Các phương pháp chiết xuất thông thường khác.

Chiết xuất ở nhiệt độ thường (RTE) được thực hiện trên một cốc thủy tinh

bằng cách trộn 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16ml nước Ngâm hỗn

hợp ở 25-29C trong vòng 44 giờ, thường xuyên lắc đều USE được thực hiện bởi

bồn chiết siêu âm: 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch được trộn với 16ml nước

trong bình nón, sau đó đem chiết siêu âm trong 40 phút SHE được thử nghiệm

bằng cách trộn 4,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 64ml nước trong 4 giờ Thử nghiệm MAE với 1,0kg bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16l nước Sau

đó chỉnh nhiệt độ cho hệ thống là 60C và thời gian chiết là 54 phút

2.1.1.1.5. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai

đoạn.

Hình 5: Sơ đồ bố trí hệ thống MCE: A – G là các đơn vị chiết; 2 - bình chiết; 3 - bình dung môi; 4, 5, 8 là các vale đóng – mở; 6 – bơn tái tuần hoàn (re-circulating pump); K – đường ống chính nối các đơn vị chiết từ A đến G; 1, 7 – là các đường ống nối giữa bình dung môi với bình chiết và bơm

Các thiết bị sử dụng bao gồm các đơn vị chiết theo tuần tự từ A đến G, đượcnối với nhau bằng đường ống dẫn chung K, các đơn vị chiết có cùng một cấu trúc

và kích cỡ bao gồm một bình chiết, một bình đựng dung môi và một bơm Cácđơn vị chiết được vận hành trong một chu trình khép kín, dung môi được bơm từcác vale ở đáy bình vào bên trong, hòa trộn với bột dược liệu và chảy ra khỏi bìnhqua vale ở phía trên và quay trở về bơm Quá trình chiết xuất ngược dòng có thể

phân ra 2 giai đoạn: đầu tiên, là giai đoạn điều hòa (Conditioning stage), sau đó làgiai đoạn chiết (extraction stage).

Trong giai đoạn điều hòa mẫu khoảng 300g rễ Cam thảo được trộn với một

tỷ lệ tương ứng dung môi trong mỗi đơn vị chiết Sau quá trình này, các bã dượcliệu bên trong bình được tiếp tục chiết với một khoảng thời gian được ấn địnhtrước Những khoảng thời gian này khác nhau đối với những đơn vị chiết khácnhau và được thiết kế trước nhằm tạo ra một gradient nồng độ giữa các bình trongdãy Ví dụ, gradient nồng độ cho việc chiết xuất 5 giai đoạn (five-stage extractor)thu được bằng cách ngâm các bã (bột – slurry) dược liệu trong các bình tương ứng

A – E trong các khoảng thời gian 4T/6, 3T/6, 2T/6, T/6 và 0 phút, với T là tổngthời gian chiết xuất (total running time) của quy trình chiết xuất ngược dòng nhiềugiai đoạn Sau thời gian ngâm, dịch chiết với đơn vị A được chuyển sang E, vàdịch chiết của đơn vị B được đổi với dịch chiết của đơn vị D Cùng lúc đó, dungmôi mới được thêm vào đơn vị A

Gradient nồng độ của GA trong mẫu dược liệu và trong dịch chiết của cácđơn vị chiết khác nhau được minh họa bằng hình sau:

Hình 6: Sơ đồ minh họa cho giai đoạn điều hòa (Conditioning stage): hình

() – bình chiết, () – bình đựng dung môi chiết, () – nồng độ GA tương ứng của

dược liệu trong bình chiết và trong dung môi.

Đơn vị chiết

Trước khi chiết

Chiết xuất

Đổi dung môi

Sau khi chiết

Sau khi đổi dung môi

Sau giai đoạn điều hòa là giai đoạn chiết (extraction stage), giai đoạn nàyđược minh họa bằng sơ đồ bên dưới Quá trình từ 1 đến 5 trong sơ đồ minh họacho quá trình di chuyển của GA giữa dung môi và bã (bột) dược liệu trong từngquá trình liên tiếp Trong mỗi quá trình bao gồm 4 công đoạn cơ bản

Hình 7: Minh họa cho một quy trình chiết – five stages MCE.

Lấy quá trình 1 làm ví dụ, các công đoạn bao gồm: (1) chiết xuất dược liệuvới thời gian định trước; (2) thay bã dược liệu của đơn vị A và thu gom dịch chiếtcủa đơn vị E; (3) chuyển dung môi chiết trực tiếp từ C → E, A → C, D → A, B

→ D; (4) thêm lượng bột dược liệu mới vào A và dung môi mới vào B Tiến trìnhnày bao gồm các giai đoạn tiếp nối nhau và sơ đồ bên trên minh họa cho một chu

kỳ đầu tiên, quá trình có thể tiếp tục diễn ra với sự bắt đầu một chu kỳ mới với cácquá trình từ 1 đến 5.

2.1.1.1.6. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao.

Nồng độ GA trong dịch chiết được định lượng bằng HPLC Trước khi phântích, dịch chiết từ MCE và từ các phương pháp khác được quay li tâm 10 phút vớitốc độ 12000 vòng/phút để loại bỏ tạp rắn Cột được sử dụng là cột KromasilKR100-5 C18 (150mm x 4,6mm) Pha động là CH3CN và nước, với 0,05% acid

Trifluoroacetic Pha động được lập trình để chạy gradient như Bảng 1 Tốc độ

dòng được giữ hằng định (0,8ml/phút) Đầu dò mảng lưỡng cực (diode arraydetector - DAD) với bước sóng được thiết lập là 254nm Tổng thời gian chạy sắc

ký là 15 phút Thời gian lưu của GA là 9,9 phút, và các peak thu được của quátrình sắc ký sẽ được trình bày bởi hình bên dưới Đường tuyến tính nằm trongkhoảng 0,6 -7,2µg GA Đường chuẩn thu được là Y= 749,2m – 1,552 với hệ sốtương quan r = 0,9999 Độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,22% (n = 5)

Bảng 1: Chương trình chạy Gradient của HPLC

0,05% Acid Trifluoroacetic trong nước (Vol.%) 80 60 50 50

2.1.1.2. Kết quả và thảo luận.

2.1.1.2.1. Cơ sở lý thuyết của MCE.

Trong các công trình nghiên cứu trước đây có rất ít các nghiên cứu về cơ sở

lý thuyết của MCE Hình bên dưới minh họa cho đường đi của nguyên liệu vàdòng dung môi giữa mẫu và dịch chiết trong quá trình chiết xuất ngược dòngnhiều giai đoạn Trong bã cam thảo, một phần dung môi (nước) được tách ra từmẫu cam thảo trong khi một phần khác được cố định lại tại thể rắn (phần bã) của

cam thảo do sự hấp thu mạnh V trong hình 8 đại diện cho thể tích của phần di

động, lượng nước tách ra do thắng được lực hấp thụ Thể tích nước cố định là L Với x, y là nồng độ tương ứng của GA trong L và V

Hình 8: Quá trình trao đổi của GA giữa bột nguyên liệu và dung môi chiết.

Trong suốt quá trình MCE, L ở mỗi bình chiết có thể được xem như là một

“giai đoạn” (staged) của pha tĩnh được chiết xuất liên tục bởi dòng dung môi V ở

trên Sau khi kết thúc quá trình chiết xuất, phần bã dược liệu được lấy khỏi bình

chiết Dung môi mới được thêm vào từ cuối của giai đoạn chiết thứ N, mà sau đó

sẽ chảy từ phải sang trái và cuối cùng được lấy ra như là một sản phẩm chiết củagiai đoạn chiết thứ nhất Giả sử trong mỗi quá trình chiết đều đạt được trạng tháicân bằng ở mỗi giai đoạn, thì nồng độ GA của dung môi sẽ bằng với nồng độ GAcòn lại trong bã dược liệu Ta có:

Ở giai đoạn thứ nhất ta có:

Gọi R là tỉ lệ của V và L Và A W là thể tích của lượng nước cố định trên mỗi

đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g) m là khối lượng của mẫu cam thảo (g) và n là tỉ lệ của dung môi và cam thảo (ml/g) Ta có phương trình (3):

W

W W

W

A

A n m A

m A nm L

V

Nếu Ki là hệ số phân bố của GA trong bột cam thảo và dung môi chiết thì

Ki = y i / x i (i = 1, 2, … ,N)  1 vì x i = y i Khi đó hệ số chiết (tỉ lệ khối lượng của

GA chiết được từ bột cam thảo) có thể được viết lại như sau:



W

W i

i

A

A n R R

2 0 1

Ry x

Chứng minh tương tự ta có các phương trình sau:

2 3 0

2

1

)1(

y R

x x

1

)

1 (

2

0 1 2

1

)

1 (

2

0 1 1

2 0

Hiệu suất chiết (p), được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết

được từ tổng khối lượng của GA trong dược liệu cam thảo được tính như sau:

)

1(

)

1(

2 0

0 1

2 0

0

1

N

N N

x

y x

R x

y R p

Hy Mx p

Trong các thảo luận ở trên, ta thấy rằng AW (thể tích của lượng nước cố định

trên mỗi đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g) là một biến cần được xác

định để tính toán hiệu suất chiết lý thuyết AW được xác định thực nghiệm bằng cách trộn tương ứng 10, 15, 20, 25g bột cam thảo (gọi là m) với 40, 60, 80 và 100ml nước (gọi là V1) trong 4 bình nón 150ml Giữ hỗn hợp trên ở nhiệt độ

phòng (29C) trong 60 phút Phần nước không được hấp thu vào bột cam thảo

được gọi là V2, đo bằng bình lắng gạn AW (ml/g) được tính như sau: AW = (V1–

V2)/m Các giá trị đo được được liệt kê trong Bảng 2:

Bảng 2: A W thực nghiệm của cam thảo

Từ dữ liệu thu được ta có AW trung bình là 1,8ml/g Bởi vì rất khó để gạn

hết lượng nước không được hấp thu trong quá trình thử nghiệm, nên thể tích thậtcủa lượng nước không được hấp thu hơi lớn hơn những số liệu đã được liệt kê

Trong các tính toán của phương trình (11) ta sẽ sử dụng một giá trị xấp xỉ của AW

= 2,0 ml/g Giả sử rằng quá trình chiết đạt trạng thái cân bằng, hiệu suất chiết lýthuyết tính theo phương trình (11) ở các giai đoạn khác nhau với các tỉ lệ dungmôi / dược liệu được liệt kê trong Bảng 3:

Bảng 3: Hiệu suất chiết (% khối lượng) ở các giai đoạn

Tỷ lệ dung môi / dược liệu

2.1.1.2.2. Tối ưu hóa quá trình MCE.

Các thảo luận ở trên cho ta thấy rằng số giai đoạn (N), tỉ lệ dung môi/dược liệu (n), nhiệt độ chiết (T) và thời gian chiết (t) là những yếu tố chính ảnh hưởng

hiệu suất chiết trong phương pháp MCE Hiệu quả chiết sẽ được đánh giá bằng bachỉ số xác định sẽ được thảo luận sau đây Đầu tiên là hiệu suất chiết của GA(được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết ra được từ lượng GA cótrong mẫu cam thảo thô) Ở đây tổng lượng GA có trong mẫu cam thảo thô đượcxác định bằng cách chiết xuất hoàn toàn, lặp đi lặp lại mẫu khô của cam thảo thôbằng phương pháp chiết siêu âm và sau đó định lượng bằng HPLC (3,72% như đãđược nói đến ở 2.1.1.1.1) Chỉ số thứ hai là nồng độ cuối cùng của GA trong dịchchiết, bao gồm cả số lượng và chất lượng của GA chiết được trong cả quá trình

chiết Chỉ số cuối cùng là tốc độ, là thời gian cần thiết để đạt được hiệu suất cầnthiết.

Để tối ưu hóa các điều kiện trong quá trình chiết xuất ngược dòng nhiều giaiđoạn, phương pháp thiết kế mảng trực giao (orthogonal array design) được sửdụng, là một kỹ thuật thiết kế thử nghiệm giai thừa phân số (fractional factorialexperimental design technique) Trực giao ở đây có nghĩa là cân bằng, có thể táchrời hoặc không có trộn lẫn, tức là trong khi một tác dụng của một yếu tố đặc biệtđang được tính toán thì ảnh hưởng của các yếu tố khác được loại bỏ Do đó ảnhhưởng của riêng yếu tố đó được chọn ra một cách độc lập

Phương pháp thiết kế thử nghiệm mảng trực giao (orthogonal array design)được áp dụng là L9 (34): 4 yếu tố và 3 cấp độ Thiết kế chi tiết được liệt kê trong

phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) được tóm tắt trong Bảng 5 và Bảng

Bảng số liệu trên cũng cho ta thấy khi tăng tỉ lệ dung môi/dược liệu, nồng độ

GA trong dịch chiết giảm đáng kể từ 339µg/ml ở tỉ lệ 6ml/g xuống còn 245µg/ml

ở tỉ lệ 10ml/g, trong khi hiệu suất chiết chỉ chênh lệch một khoảng nhỏ 75% 83%

Hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết chỉ tăng nhẹ khi ta tăng thờigian chiết, như đã được liệt kê ở Bảng 5 Khi tăng nhiệt độ từ 60 đến 90 phút hiệu

suất chiết chỉ tăng 7% tức là từ 79% đến 86% Vì vậy việc tăng thời gian chiếtvượt quá 60 phút không mang đến lợi nhuận nhiều.

Số giai đoạn chiết cũng ảnh hưởng rất ít đến hiệu suất chiết và nồng độ GAtrong dịch chiết, như đã được chỉ ra trong Bảng 6 với chỉ số F chỉ là 1,0 và 2,4.Theo như các số liệu trong Bảng 3 thì với tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g thìhiệu suất chiết lý thuyết đạt 98,4% với 5 giai đoạn, nhưng chỉ có 93,3% ở 3 giaiđoạn Vì vậy ta chọn số giai đoạn là 5 để được hiệu suất chiết cao hơn

Tóm lại điều kiện tối ưu của qui trình chiết xuất GA bằng phương phápMCE là A1B1C3D1 Trong đó A1 biểu thị cho số giai đoạn chiết là 5, B1 biểu thịcho tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g, C3 biểu thị cho nhiệt độ chiết là 70C và D1biểu thị cho thời gian chiết là 60 phút

2.1.1.2.3. Ảnh hưởng của dung môi lên hiệu suất chiết GA.

Các thuộc tính của dung môi được sử dụng để chiết và kết quả chiết đượcliệt kê trong Bảng 7 Các điều kiện tối ưu đã thảo luận ở trên được sử dụng đểchiết GA bằng phương pháp MCE với bốn hệ dung môi khác nhau, cụ thể là nước

tinh khiết (SW), 10% về khối lương của Ethanol trong nước (SE), 10% về khối lượng của Ethanol và 0,5% về khối lượng của Amoniac trong nước (SEA) và 0,5%

về khối lượng của Amoniac trong nước (SA) Kết quả trong Bảng 7 chỉ ra rằngkhông có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất chiết của 4 hệ dung môi được thử nghiêm.Chính vì vậy nước tinh khiết được lựa chọn làm dung môi chiết vì cả tính an toàn lẫn tínhkinh tế

Bảng 7: Hiệu suất chiết GA bằng các hệ dung môi khác nhau

Dung môi

Hiệu suất chiết (% khối lượng) 97,2 97,8 98,3 98,6

2.1.1.2.4. So sánh với các phương pháp chiết khác.

Bảng 8 so sánh hiệu suất chiết giữa phương pháp MCE với các phương pháp chiếtxuất khác thường sử dụng trong phòng thí nghiệm Dung môi được sử dụng là nước tinhkhiết Hiệu suất chiết của phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (97,2%) là

cao nhất trong số tất cả các phương pháp, mặc dù thời gian chiết của phương pháp này(60 phút) cao hơn phương pháp MAE (54 phút) và USE (40 phút) nhưng vẫn còn thấphơn nhiều so với phương pháp SHE (240 phút) và RTE (2660 phút) Lượng dung môitiêu thụ trên mỗi đơn vị khối lượng của dược liệu của phương pháp chiết xuất ngượcdòng nhiều giai đoạn (6ml/g) cũng ít hơn nhiều so với các phương pháp khác (16ml/g).

Bảng 8: So sánh các phương pháp chiết MCE, MAE, USE, SHE VÀ RTE

Phương pháp Dung môi sử dụng (ml/g) Thời gian chiết (phút) Hiệu suất chiết (%)

So sánh phương pháp MCE với phương pháp chiết xuất một giai đoạn (SPE)

có thể thực hiện bằng cách xem xét lại dữ liệu đã được liệt kê trong Bảng 3 Hiệusuất chiết của MCE là cao hơn đáng kể so với hiệu suất chiết của SPE ở tất cả các

tỉ lệ dung môi/dược liệu Chiết bằng SPE với nhiều chu kì thì năng suất tăng cógiới hạn trong khi tốn kém rất lớn về chi phí và thời gian Ví dụ ở tỉ lệ dungmôi/dược liệu là 6ml/g, hiệu suất chiết của MCE là 98,4% so với hiệu suất chiếtcủa SPE chỉ 67,7% trong cùng thời gian chiết Lặp lại thêm một lần nữa vớiphương pháp chiết SPE thì hiệu suất năng lên 85,7%, nhưng lại tăng gấp đôi thờigian và lượng dung môi sử dụng Thể tích dung môi sử dụng cao hơn kéo theoviệc gia tăng chi phí và làm giảm nồng độ của sản phẩm chiết được

2.2.1 Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave –

assisted extraction)[7].

2.2.1.1 Thiết kế thí nghiệm.

2.2.1.1.1 Nguyên vật liệu:

Rễ Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch) mua từ công ty Tongrentang

medical Nguyên liệu được chuẩn bị với 3 kích cỡ khác nhau, được thực hiệntrong phòng thí nghiệm Nguyên liệu A: có kích thước lớn khoảng 5 – 10 mm và

bề dày khoảng 3 –5mm; nguyên liệu B: Bột cam thảo thô, được nghiền và râychọn cỡ hạt khoảng 5 – 10 mesh; nguyên liệu C: Bột cam thảo 50 mesh

2.2.1.1.2 Dung môi.

Ethanol ( analytical reagent), amonia (25% NH3, chemical reagent),glacial acetic acid (analytical reagent), acetonitrile ( dung môi cho sắc ký lỏnghiệu năng cao – HPLC), glycyrrhizic ammoniate (mua từ Viện y học và sinh phẩmTrung Hoa) Ngoại trừ các thí nghiệm về ảnh hưởng của thành phần dung môi lên

tỷ lệ glycyrrhizic acid chiết xuất được, tất cả các dung môi đều được cấu tạo gồm:60% ethanol + 1% amonia + nước

2.2.1.1.3 Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng:

Lò vi sóng sử dụng trong gia đình (National, Japan, công suất cực đại700W) được thiết kế lại với máy khuấy từ , sinh hàn, bộ phận ghi nhận nhiệt độ vàkiểm soát thời gian Rễ cam thảo được trộn với khoảng 100ml dung môi, nhưnước, ethanol, ethanol – nước, dung dịch amonia (với các nồng độ khác nhau)hoặc ethanol – nước – amonia Hỗn hợp gồm rễ cam thảo và dung môi đượcchiếu xạ bằng lò vi sóng với điều kiện thiết kế: 15 giây chiếu xạ, 15 giây ngừng,lặp lại 3 lần; nhiệt độ khoảng 85 -90ºC sau đó chiếu xạ tiếp trong 3 giây để làmnóng và 15 giây ngừng chiếu xạ để làm mát, nhưng không được để quá sôi

Hình 9: Sơ đồ thiết kế máy vi sóng dùng trong chiết xuất

2.2.1.1.4 Phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

bộ phận kiểm soát thời gian máy khấy từ