Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học một số hợp chất trong lá keo gai

Nhằm mục đích nghiên cứu thành phần hóa học, xác minh tác dụng dược lý của lá cây keo gai, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học một số hợp chất

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA - -

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA - -

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ KEO GAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Giáo viên hướng dẫn : GS TS Đào Hùng Cường

Đà Nẵng – Năm 2014

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

1 Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học một số hợp

chất trong lá keo gai

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị

- Nguyên liệu: lá keo gai tươi

- Dụng cụ: Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, ống đong, bình tam giác, bếp điện, bếp cách thuỷ, cốc sứ, bình hút ẩm, …

- Thiết bị: máy đo quang UV-VIS, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng

- Khảo sát các điều kiện chiết: phương pháp, thời gian

- Xác định thành phần hóa học có trong lá keo gai

4 Giáo viên hướng dẫn: GS TS Đào Hùng Cường

5 Ngày giao đề tài: ngày 15/ 10/ 2013

6 Ngày hoàn thành: ngày 20/ 5/ 2014

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày….tháng….năm 2014

Kết quả điểm đánh giá:

Ngày….tháng….năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy GS TS Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn và các thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian nghiên cứu làm khóa luận vừa qua

Em cũng xin chân thành cảm ơn chị Đào Thị Vân Trang là học viên cao học khóa K25 chuyên ngành hóa hữu cơ của Đại học Đà Nẵng đã hướng dẫn, hỗ trợ em hoàn thành tốt khóa luận này

Bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học, mặc dù có nhiều cố gắng xong khó có thể tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót Vì vậy em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 05 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Lệ

MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

4 Phương pháp nghiên cứu 1

4.1 Nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Phương pháp thực nghiệm 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

5.1 Ý nghĩa khoa học 2

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

6 Bố cục khóa luận 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về cây keo gai 4

1.1.1 Tên gọi 4

1.1.2 Phân loại khoa học 4

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố 4

1.1.4 Đặc điểm thực vật 5

1.1.5 Giới thiệu họ Đậu 6

1.1.6 Công dụng của cây keo gai 7

1.2 Tình hình trong nước và trên thế giới 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8

1.3 Các phương pháp phân tích 9

1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 9

1.3.1.1 Giới thiệu phương pháp 9

1.3.1.2 Nguyên tắc phép đo 9

1.3.1.3 Quy trình phép đo AAS 10

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS 11

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký 11

1.3.2.2 Sắc ký khí (GC) 13

1.3.2.3 Phương pháp khối phổ 14

1.3.2.4 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) 17

1.3.3 Phương pháp hấp thụ phân tử UV – VIS 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Thu hái nguyên liệu 19

2.1.2 Xử lý nguyên liệu 19

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 20

2.2.1 Hóa chất 20

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 20

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý 21

2.4.1.1 Xác định độ ẩm 21

2.4.2 Phương pháp chiết và khảo sát điều kiện chiết tối ưu 24

2.4.2.2 Khảo sát thời gian 25

2.4.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học của các dịch chiết lá keo gai 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá keo gai 26

3.1.1 Độ ẩm 26

3.1.2 Hàm lượng tro 26

3.1.3 Hàm lượng kim loại 27

3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết tách 27

3.2.1 Trong dung môi hexane 27

3.2.2 Trong dung môi methanol 29

3.3 Kết quả xác định thành phần hóa học các dịch chiết lá keo gai bằng phương pháp GC – MS 31

3.3.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết hexane 31

3.3.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Số hiệu

1 1.1 Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu 17

2 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của lá keo gai tươi 26

3 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro của lá keo gai tươi 26

4 3.3 Hàm lượng một số kim loại trong lá keo gai 27

5 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung

6 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung

7 3.6 Thành phần hóa học trong dịch chiết hexan 32

8 3.7 Công thức phân tử và công thức cấu tạo các cấu tử

được định danh trong dung môi hexane 33

9 3.8 Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol 37

10 3.9 Công thức phân tử và công thức cấu tạo các cấu tử

được định danh trong dung môi methanol 38

11 3.10 Tổng hợp các cấu tử định danh được của dịch chiết lá

keo gai trong dung môi hexane và methanol 40

5 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian trong

6 3.2 Dịch chiết của lá keo gai trong dung môi hexane 29

7 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết theo thời gian trong

8 3.4 Dịch chiết của lá keo gai trong dung môi methanol 31

9 3.5 Sắc ký đồ GC biểu thị thành phần hóa học trong dịch

10 3.6 Sắc ký đồ GC biểu thị thành phần hóa học trong dịch

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là nước nhiệt đới có những đặc điểm khí hậu, địa lý ở nhiều vùng khác nhau tạo nên thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Đó là nguồn cung cấp dược liệu quý giá cho ngành y dược của nước nhà Tuy nhiên chúng ta vẫn chưa khai thác triệt để được nguồn lợi này

Cây keo gai hay còn gọi là cây keo tây, me nước, găng tây có tên khoa học Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth – loại cây xanh thân gỗ, đa tác dụng Trong y dược, cây keo gai có tác dụng làm thuốc giảm đau, hạ nhiệt, thuốc chữa viêm đường

hô hấp, tiêu hóa, trị ho, trị tiêu chảy và kiết lỵ, chống viêm dạ dày, cầm máu và kháng sinh, chất làm se Dân gian ta uống nước lá cây keo gai và truyền nhau kinh nghiệm nước từ lá cây keo gai có tác dụng liền xương nhanh, rất thích hợp chữa bệnh khớp

Hiện nay, ở nước ta vẫn chưa có một nghiên cứu nào về thành phần, tác dụng của cây keo gai Trên thế giới chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về loài cây này Trong sự phát triển ngành y dược của nước ta, việc nghiên cứu các loại cây thuốc đang được chú trọng và góp phần đáng kể vào việc tìm ra các loại thuốc mới

có nguồn gốc thiên nhiên để trị bệnh tật Nhằm mục đích nghiên cứu thành phần hóa học, xác minh tác dụng dược lý của lá cây keo gai, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học một số hợp chất trong lá keo gai.”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết tách thích hợp

- Xác định thành phần hóa học của lá keo gai

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Cây keo gai có tên khoa học là Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth thuộc họ Fabaceae Lá cây keo gai nghiên cứu được lấy từ cây keo gai ở thành phố Hội An, tỉnh Quảng Nam

4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp nghiên cứu chiết tách và xác định các hợp chất thiên nhiên

4.2 Phương pháp thực nghiệm

4.2.1 Phương pháp lấy mẫu: Thu hái và xử lý mẫu

4.2.2 Phương pháp phân tích trọng lượng

- Xác định độ ẩm trong lá keo gai: phương pháp sấy khô

- Xác định hàm lượng hữu cơ trong lá keo gai: phương pháp tro hóa

4.2.3 Phương pháp tách chất

Chiết trong các dung môi có độ phân cực khác nhau: hexane, methanol bằng phương pháp chiết soxhlet

4.2.4 Các phương pháp vật lý

- Dùng phương pháp AAS xác định hàm lượng kim loại

- Dùng phương pháp hấp thụ phân tử UV – VIS để khảo sát thời gian chiết tối

6 Bố cục khóa luận

Khóa luận gồm 45 trang trong đó có 11 bảng và 10 hình Phần mở đầu 3 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, tài liệu tham khảo 2 trang Nội dung khóa luận chia làm 3 chương:

- Chương 1: Tổng quan ( 14 trang)

- Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (7 trang)

- Chương 3: Kết quả và thảo luận (19 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây keo gai

1.1.1 Tên gọi [15], [16]

- Tên khoa học: Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth

- Tên Việt Nam: keo gai, me keo, keo tây, me nước, găng tây

- Tên địa phương:

• Tiếng Anh: Blackbead, Guayamochil

• Brazil: Ingarana

• Campuchia: Am'pül tuk

• Ấn Độ: Amli, Balati, Babul dakhani, Dekhani, Hatichinch

• Hoa Kỳ: Opiuma

• Thái Lan: Makham-khong, Makham-thét

• Lào:Khaam th'ééd

• Cuba: Inga dulce, Tamarindo chino

1.1.2 Phân loại khoa học [17]

Cây keo gai có nguồn gốc ở bờ biển Thái Bình Dương, vùng cao nguyên liền

kề của Mexico, Trung Mỹ và miền Bắc Nam Mỹ, dần dần keo gai có mặt hầu hết khắp thế giới, nhất là vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Á

Ở Châu Á, cây phân bố ở Việt Nam, Lào, Campuchia, Myanmar, Thái Lan,

Ấn Độ, Indonesia, Philippines,…

Ở Việt Nam cây được trồng phổ biến khắp nước, từ các tỉnh phía Bắc đến Nam Bộ, từ đồng bằng lên đồi núi và cao nguyên

Vỏ thân màu xám nhăn sâu 3 – 4 mm hay xanh trắng, có nhiều u lồi và nhiều đường hằng vòng quanh thân, dày 2 mm Thịt vỏ thân màu trắng nhạt, dày 0.7 cm, cành mềm có gai ngắn

Lá kép 2 lần, mỗi bên 2 lá nhỏ Cuống chung dài 2 – 2.5 cm, cuống mỗi bên dài 1cm, lá nhỏ dài 2 cm, rộng 1 cm, phiến nhẵn mặt trên màu xanh nhạt, mặt dưới xanh nhợt, có 4 - 5 đôi gân màu xanh trắng mờ, gốc lá có tuyến, 2 lá kèm biến thành gai nhỏ cứng

Hoa nhỏ màu trắng mọc thành chùm ở đầu cành, gồm nhiều cụm, đường kính 0,8 – 1 cm Quả dài 5 – 8 cm, rộng 1 cm, xoắn làm 2 – 3 lần cong queo thắt lại giữa các hạt Hạt nhỏ, màu đen và bóng, nằm trong một lớp cơm quả có màu trắng Cây được trồng bằng hạt Mùa hoa quả từ tháng 8 đến tháng 3 năm sau Cơm quả (áo hạt) chín ăn được, có vị bùi và béo

Lá keo gai Cây keo gai

nữ (Mimosoideae) và phân họ Đậu (Faboideae), và chúng chiếm khoảng 9,4% trong tổng số loài thực vật hai lá mầm thật sự Ước tính các loài trong họ này chiếm 16% các loài cây trong vùng rừng mưa nhiệt đới Nam Mỹ Ngoài ra, họ này cũng có mặt nhiều ở các rừng mưa và rừng khô nhiệt đới ở châu Mỹ và châu Phi Cho đến nay vẫn còn những tranh cãi về việc họ này bao gồm 3 phân họ hay tách các phân họ của nó thành các họ riêng biệt Có rất nhiều thông tin về dữ liệu phân tử và hình thái học chứng minh họ Đậu là một họ đơn ngành Quan điểm này được xem xét không chỉ ở cấp độ tổng hợp khi so sánh các nhóm khác nhau trong họ này và các quan hệ

họ hàng của chúng mà còn dựa trên các kết quả phân tích về phát sinh loài gần đây dựa trên ADN Các nghiên cứu này xác nhận rằng họ Đậu là một nhóm đơn ngành

và có quan hệ gần gũi với các họ trong bộ Đậu là họ Viễn chí (Polygalaceae), họ Suyên biển (Surianaceae) và họ Quillajaceae

Tất cả các thành viên trong họ này đều có hoa chứa 5 cánh hoa, trong đó bầu nhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ Các loài trong họ này theo truyền thống được phân loại trong ba phân họ, đôi khi được nâng lên thành các

họ riêng trong bộ Đậu (Fabales), trên cơ sở hình thái học của hoa (đặc biệt là hình dạng cánh hoa)

Các loài trong họ này có các kiểu phát triển đa dạng từ cây thẳng, cây bụi, thân thảo, dây leo, dây leo thân thảo Các loài cây thân thảo có thời gian sinh trưởng 1 năm, 2 năm hoặc nhiều năm

Các lá thường mọc xen kẽ và khép kín khi nhìn từ trên xuống Chúng thường

có dạng kết hợp chẵn- hoặc lẻ, thường có 3 lá chét và hiếm khi có dạng hình chân vịt, còn trong các phân họ Mimosoideae và Caesalpinioideae, thường là cặp lá kép Một đặc trưng nổi bật của các loài cây thuộc họ Đậu là chúng là các loại cây chủ cho nhiều loài vi khuẩn tại các nốt sần trên rễ của chúng Các loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ (rhizobium), có khả năng lấy khí nitơ (N2) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3

hay NH3) Hoạt động này được gọi là cố định đạm Cây đậu, trong vai trò của cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ, trong vai trò của nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra một quan hệ cộng sinh

Pithecellobium là một trong 100 – 200 loài trong giống phân theo họ mimosoidae và được phân phối ở các vùng nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Á và Châu

Mỹ có khoảng 10 loài : P clypearia, Pithecellobium dulce, Pithecellobium monadelphum, Pithecellobium globosum, P unguiscati , P arboreum, P.flexicaule,

P jiringa, Pithecellobium parviflorum và P Mart thường phân bố ở Ấn Độ

Pithecellobium dulce (Roxh.) Benth là một trong những loài quen thuộc, thường được, thường gặp ở Việt Nam được gọi là “keo gai” hay “me keo” nguyên nhân là

vị hơi chua như me khi chưa chín

1.1.6 Công dụng của cây keo gai [14], [15], [16], [17]

- Theo y học cổ truyền ở Việt Nam, vỏ và rể cây keo gai đều có tác dụng hạ nhiệt Người ta có thể thu hái lá và rể quanh năm để làm thuốc Rễ thái nhỏ, phơi khô, lá thường dùng tươi Lá keo gai được dùng trị bệnh đái đường Rễ dùng trị bệnh sốt rét Thường dùng dưới dạng thuốc sắc, mỗi ngày 10 đến 20 gam

- Dân gian ta dùng lá keo gai tươi sắc nước uống chữa liền xương

- Trong y học dân gian của một số nước, nước sắc từ vỏ cây dùng chữa bệnh tiêu chảy, lá dùng đắp ngoài da để chữa đau, tấy và bệnh da liễu, nước sắc từ lá cũng được sử dụng cho chứng khó tiêu

- Ở Guyana, vỏ cây được sử dụng làm thuốc trị sốt Ở Ấn Ðộ, nước sắc vỏ dùng làm như thuốc làm se thắt trong trường hợp bệnh lỵ, thuốc hạ sốt

- Các dân tộc bản địa của Trung Mỹ sử dụng bột vỏ cây chống lại bệnh nướu răng, đau răng và xuất huyết nói chung

- Tại Mexico, lớp vỏ ngoài tử y của hạt được báo cáo là sử dụng trong việc bào chế thức uống giống như nước chanh

1.2 Tình hình trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

- Tình hình nghiên cứu khoa học về lá keo gai trong nước vẫn còn là một đề tài khá mới, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần và tác dụng của lá keo gai

- Chỉ nghiên cứu theo hướng sử dụng lá keo gai để chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian chưa có hệ thống

- Không có công trình nghiên cứu khoa học về cây keo gai được công bố

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có vài công trình nghiên cứu về Pithecellobium dulce ( Roxb.) Benth như:

- Năm 2013, công trình nghiên cứu [11] đã chứng minh rằng Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth là một nguồn của saponin tốt với hoạt tính ức chế chống lại carbohydrate thủy phân enzyme (ruột α-glucosidase và tụy α-amylase) Ức chế α-amylase và α-glucosidase hoạt động của các chiết xuất có thể là do phenolic và triterpene thành phần như axit oleanolic Những kết quả này có thể là hữu ích cho việc phát triển thực phẩm chức năng điều chỉnh chính carbohydrate thủy phân enzyme như ruột α-glucosidase và tuyến tụy α-amylase và do đó rất hữu ích cho quản lý đái tháo đường đặc biệt trong kiểm soát sau ăn tăng đường huyết

- Năm 2012, công trình nghiên cứu [12] cho thấy dịch chiết từ lá và hạt keo gai trong dung môi hexane thô, benzen, chloroform, ethyl acetate và methanol có

tiềm năng sử dụng như một phương pháp tiếp cận thân thiện với môi trường lý tưởng cho sự kiểm soát của muỗi

Tuy nhiên, số đề tài nghiên cứu trên thế giới về cây keo gai còn ít

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: thành phần của cây keo gai gồm alkaloid, flavonoid, saponin và tannin

1.3 Các phương pháp phân tích

1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS [4], [8], [9]

1.3.1.1 Giới thiệu phương pháp

Phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tương đối mới

đã và đang phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học

và kỹ thuật ở các nước phát triển Đối tượng của phương pháp phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử là lượng nhỏ các kim loại và một số á kim trong rất nhiều đối tượng mẫu: quặng, đất, nước khoáng, các mẫu sinh học, y học, các sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, nước uống, phân bón, vật liệu…

Với trang thiết bị kỹ thuật hiện nay người ta có thể định lượng hầu hết các kim loại và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb (nanogram) với sai số không lớn hơn 15%

1.3.1.2 Nguyên tắc phép đo

Phương pháp AAS được viết tắt từ phương pháp hấp thụ nguyên tử (Atomic Absorption Spectrophotometric) Các nguyên tử ở trạng thái bình thường thì chúng không hấp thụ hay bức xạ năng lượng Mỗi nguyên tử chỉ hấp thụ những bức xạ nhất định tương ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong quá trình phát

xạ của chúng Khi nguyên tử nhận năng lượng chuyển lên mức năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích Quá trình đó gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở

đo phổ hấp thụ nguyên tử của một số nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

1.3.1.3 Quy trình phép đo AAS

Để thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử cần thực hiện các quá trình sau đây:

- Quá trình nguyên tử hóa mẫu

Mục đích của quá trình này là tạo ra đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích với hiệu suất cao và không ổn định Ta có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa và bằng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS Để thu kết quả phân tích chính xác, phải nghiên cứu và chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình nguyên tử hóa mẫu sao cho phù hợp với từng nguyên tố phân tích trong mỗi loại mẫu cụ thể, đó là:

+ Thành phần và tốc của hỗn hợp khí đốt ra tạo ngọn lửa

+ Tốc độ dẫn dung dịch mẫu

+ Chiều cao của đèn nguyên tử hóa

+ Bề dày của môi trường hấp thụ

+ Độ nhớt của dung dịch mẫu Dung dịch phân tích và dung dịch dùng để lập đường chuẩn phải được chuẩn bị trong cùng một điều kiện để có cùng thành phần hóa học, vật lý, đặc biệt là thành phần nền của mẫu, độ axit dùng làm môi trường

- Nguồn phát bức xạ đơn sắc

Muốn thực hiện đo phổ hấp thụ nguyên tử, cần phải có nguồn phát tia bức xạ đơn sắc của của nguyên tố cần phân tích để chiếu qua đám hơi nguyên tử tự do Nguồn phát tia bức xạ đơn sắc phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

+ Nguồn phát tia bức xạ đơn sắc tạo ra phải là các tia phát xạ nhạy của nguyên

tố phân tích Chùm tia phát xạ phải có cường độ (I0) ổn định, lặp lại trong nhiều lần

đo khác trong cùng điều kiện và phải điều chỉnh được để có cường độ cần thiết cho mỗi phép đo

+ Nguồn phát xạ phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch của nguyên tố phân tích Phổ nền của nó phải không đáng kể

+ Nguồn phát tia bức xạ phải tạo ra được chùm tia sang có cường độ cao, nhưng phải bền theo thời gian và không bị các yếu tố vật lý khác gây nhiễu, không

bị ảnh hưởng bởi các dao động của điều liện làm việc Ngoài ra không quá đắt và không quá phức tạp khi sử dụng

- Quá trình ghi đo gồm hệ thống phân ly ánh sáng sau khi bị hấp thụ, detector,

bộ khuếch đại và ghi đo

Nhờ một hệ thống máy quang phổ, người ta thu, phân ly và chọn vạch hấp thụ nguyên tử một nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ Trong một giới hạn nhất định của nồng độ, giá trị cường độ này là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích Cường độ của các vạch hấp thụ sau khi được detector ghi nhận và khuếch đại sẽ được đưa sang hệ thống chỉ thị, ở đây nó được khuếch đại tiếp và được xử lý để có được cường độ thực của vạch phổ hấp thụ

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS [5], [7]

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký

* Giới thiệu về phương pháp sắc ký

Sắc ký là một kỹ thuật vật lý và hóa lý để tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp

Cơ sở của quá trình sắc ký là các quá trình xảy ra trong cột tách khi mẫu được nộp vào cột sắc ký Để thực hiện quá trình sắc ký có hai pha:

- Pha tĩnh thường ở dạng rắn hay lỏng, dưới dạng màng mỏng bám đều trên bề mặt chất mang trơ chứa trơ chứa trong cột sắc ký

- Pha động: Chất phân tích và dung môi thích hợp

Quá trình sắc ký xảy ra trong cột chính là quá trình tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh nằm trong cột Quá trình tương tác đó có thể theo tính chất hóa lý nhất định, đó là sự hấp phụ, trao đổi, phân bố, rây phân tử Tương ứng ta có tên gọi các phương pháp sắc ký: sắc ký hấp phụ dựa vào tính chất hấp phụ chất phân tích lên trên bề mặt pha tĩnh, sắc ký trao đổi dựa vào sự trao đổi ion cùng dấu giữa chất phân tích với pha tĩnh, sắc ký phân bố dựa vào sự phân bố của chất phân tích lên pha tĩnh…

Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký là quá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, có thể xảy ra trên giấy, trên bảng mỏng, trên cột Do vậy khả năng tách hoàn toàn và phân tích định lượng tương đối chính xác

* Nguyên tắc của sự tách trong sắc ký

Lực tương tác tổng hợp: ft = fa + fb + fc

Khi thực hiện quá trình sắc ký đối với một chất xác định thì fa = const

Do đó: ft = fb + fc

Trong đó: fa đặc trưng cho quá trình pha tĩnh giữ chất phân tích lại

fb đặc trưng cho quá trình kéo chất phân tích ra

fc là lực rửa giải chất phân tích ra khỏi cột

Chất phân tích bám càng chặt vào pha tĩnh thì rửa giải càng khó và ngược lại Khả năng chất phân tích bám trên bề mặt pha tĩnh được đặc trưng bằng ái lực của chất phân tích đối với pha tĩnh, chất bám càng mạnh thì ái lực càng lớn và rửa giải càng khó Các chất phân tích được tách và đi ra khỏi cột được ghi lại dưới dạng pic trên sắc ký đồ ngoại

* Các đại lượng đặc trưng cho quá trình sắc ký

Ci(S): nồng độ Ci trong pha tĩnh

Ci(M): nồng độ Ci trong pha động

Ki phụ thuộc vào bản chất phân tích, pha động, pha tĩnh Xảy ra 3 trường hợp: phân bố lồi, phân bố lõm, phân bố tuyến tính

Phân bố lồi, lõm xảy ra khi tín hiệu ra dưới dạng pic không cân đối, do đó không ứng dụng vào trong phân tích định lượng Pic có cân đối hay không phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất pha động, pha tĩnh, nồng độ chất phân tích (nồng độ chất phân tích càng nhỏ thì pic càng cân đối và ngược lại) do đó sắc ký không thể dùng được dung dịch có nồng độ lớn

- Thời gian lưu (tRi): là thời gian kể từ khi nạp mẫu vào cột cho đến khi chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có Cmax

- Thể tích lưu giữ (VRi): là thể tích pha chảy qua cột kể từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột, ứng với thời điểm Cmax, nghĩa

là tương ứng với thời điểm lưu giữ

Đối với pha động có thể tích lưu của pha động, đối với pha tĩnh có thể lưu của pha tĩnh

- Đĩa sắc ký: là lớp pha tĩnh rất mỏng có chiều cao h, h phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, pha động, và độ xốp của pha tĩnh, nhiệt độ, bản chất của chất phân tích

H= ×

L: chiều dài cột sắc ký chứa pha tĩnh

Wi: chiều dài đáy pic sắc ký

tRi: thời gian lưu

Số đĩa: N =

N đóng vai trò quyết định quá trình tách có hoàn toàn hay không, số đĩa càng lớn quá trình tách càng hoàn toàn

1.3.2.2 Sắc ký khí (GC)

* Giới thiệu phương pháp

Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay đùng để tách định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các chất hữu cơ

Pha động trong GC là khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi để đưa vào cột sắc ký, thường hóa hơi ở 2500C

Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột, hay 1 màng film bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản)

Phương pháp này chỉ được giới hạn vào những chất có thể bốc hơi mà không

bị phân hủy xác định dưới thể hơi

Có 2 kỹ thuật phân tích:

+ Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách hoàn toàn

+ Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng triệt để

* Máy sắc ký:

Cột sắc ký: có thể là cột nhồi hay cột mao quản Cột nhồi thường ngắn và khả năng tách không triệt để Hiện nay, sử dụng cột mao quản Cột mao quản có thể làm bằng đồng hay thủy tinh, dài khoảng 100 – 150 m, đường kính cột 1 mm, dưới dạng xoắn, một đầu nối với lò, một đầu nối với detector Ưu điểm của phương pháp: + Tách được hỗn hợp phức tạp và đặc biệt là tách được các chất có cấu tạo tương tự nhau

+ Độ tin cậy cao hơn hẳn trong việc phát hiện tạp chất

+ Độ nhạy cao và giảm được thời gian phân tích

+ Tiết kiệm pha động

+ Có thể nối với máy khối phổ để xác định cấu trúc các chất

Máy khối phổ là detector vạn năng dùng cho sắc ký khí, vì một chất bất kỳ nào

đi qua máy sắc ký đều được chuyển hóa thành ion trong máy khối phổ

Đồng thời bản chất đặc trưng của khối phổ đồ cho máy khối phổ như là 2 detector sắc ký khí đặc trưng Có thể ví máy sắc ký như một máy tách lý tưởng còn phổ khối là một detector tuyệt hảo để nhận biết Hơn nữa, giữa sắc ký khí và khối phổ có một sự tương thích cao

1.3.2.3 Phương pháp khối phổ

* Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu được ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao bằng phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó các ion này được phân tích, những dãy ion theo cùng số khối (chính xác là theo cùng tỉ

số khối trên diện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cường độ vạch), trục hoành

là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ

Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng vạch hay bảng, trong đó cường độ cao nhất gọi là đỉnh cơ sở Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát

Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng, mà căn cứ vào các mảnh phân tử được tạo thành ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử Xác định tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết tương ứng trong phân tử cũng như vào khả năng bền hóa các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau Các mảnh có độ bền lớn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu dễ bị đứt nhất Có những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khóa, chúng cho phép phân tích các phổ khối lượng dễ dàng

* Các phương pháp ion hóa mẫu trong khối phổ

- Phương pháp va đập electron

Đây là phương pháp phổ biến nhất Mẫu chất ở dạng hơi đi vào buồn ion hóa duy trì ở áp suất 0,005 torr và 250C, ở đây có một dòng electron phát ra từ catot bằng vonfram hoặc reni khi đốt nóng chuyển động vuông góc với mẫu đi về phía anot với tốc độ cao và xảy ra sự va chạm giữa chúng, biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hoặc các ion mảnh tùy thuộc vào năng lượng của dòng electron

- Phương pháp ion hóa bằng trường điện

Trong phương pháp này người ta sử dụng một điện trường rất mạnh để gây ra

sự phát xạ electron Khi phân tử đi vào khoảng không của 2 điện cực đặt sát nhau trong đó có sự có mặt của điện trường cao (107 – 108 V/cm), nó tạo ra lực hút tĩnh điện trên các đĩa tụ điện, đủ để bức 1 electron khỏi phân tử ion phân tử tạo thành cho các vạch phổ rất mảnh

- Phương pháp ion hóa hóa học

Trong phương pháp này người ta cho các dòng ion dương và ion âm va chạm với mẫu để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hoặc ion mảnh Điều khác biệt đáng lưu ý là ngoài ion phân tử tạo thành còn có những ion tựa ion phân

tử (những ion có phân tử khác ion phân tử 1 dơn vị hoặc nhiều hơn), do đó phổ khối các ion hóa hóa học chứa ít các ion mảnh

Phương pháp ion hóa hóa học có một nhược điểm chung là vắng mặt các phản ứng bẻ gãy liên kết C-C nên cho ít thông tin về khung Phổ ion hóa hóa học rất thích hợp để phân tích các hợp chất phân cực có phân tử khối tới 1000 đơn vị Các ion giàu quan hệ với phân tử khối và các ion mảnh đặc biệt thích hợp cho việc xác định cấu trúc

* Bộ phận tách khối

Sau khi bị bắn phá các ion dương được tăng tốc nhờ một bảng điện tích âm, lọt qua khe hẹp và từ trường, các ion này chuyển động tròn với bán kính r phụ thuộc vào khối lượng m, điện thế U của trường gia tốc và cường đọ từ trường H của nam châm:

r = Với U, H không đổi thì r chỉ phụ thuộc vào m/e, bằng cách thay đổi từ trường hay điện trường, ta có thể thay đổi bán kính quỹ đạo chuyển động của các ion và hướng vào các khe ion có khối lượng khác nhau

* Các hệ thống thu nhận ion (detector)

Các chùm electron đi ra từ bộ phận tách khối được thu nhận bằng kính ảnh hoặc bằng phương pháp điện Ở các máy khối phổ hiện đại, các dữ liệu được số hóa

và được thu vào băng từ hoặc trữ trong bộ nhớ của máy tính để xử lý tiếp và in ra phổ đồ biểu diễn dưới dạng phần trăm cơ sở

- Xác định công thức cấu tạo

Đây là ứng dụng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu hóa học hữu cơ Dựa vào các giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử hay ion mảnh, ta có thể xác định chính xác công thức phân tử của nhiều hợp chất

1.3.3 Phương pháp hấp thụ phân tử UV – VIS [3]

* Nguyên tắc của phương pháp:

Phương pháp hấp thụ nguyên tử UV – VIS là phương pháp phân tích dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại – khả kiến

* Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

Khi chiếu một chùm sáng vào dung dịch màu thì một phần ánh sáng bị hấp thụ bởi dung dịch, một phần bị phản xạ lại, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch

Bảng 1.1 Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

Bước sóng (nm) Màu của tia đơn sắc Màu của dung dịch