Enzyme có bản chất là protein, nó có khả năng xúc tác sinh học không những bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng điều kiện thích hợp để hoạt động..
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Bảo tàng giống chuẩn – Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội
NGUYÊN LIỆU
Các chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu được phân lập từ cỏ voi ủ chua ở Mộc Châu (Sơn La), Đông Anh (Hà Nội), Thanh Hóa, Nghệ An,
Hóa chất: cao nấm men, cao thịt, peptone, glucose, tinh bột tan, CMC, cazein, glyxerol, agarose, NaCl, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, (NH4)2SO4,
Na2HPO4, natri citrat, đệm phản ứng, KI, I 2 ,…
Các môi trường dùng trong thí nghiệm và phân tích bao gồm: môi trường giữ giống, môi trường dịch thể, môi trường dùng trong xác định hoạt tính enzyme, môi trường cơ chất.Các môi trường được khử trùng 121 0 C trong 15 phút
* Các lo ạ i môi tr ườ ng s ử d ụ ng:
- Môi trường phân lập và giữ giống
* Môi Tr ườ ng 1: Môi tr ườ ng th ạ ch th ườ ng
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
- Môi trường nuôi cấy lắc thử khả năng sinh enzym
* Môi tr ườ ng 2: (Môi tr ườ ng NA d ị ch th ể c ả i ti ế n)
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
* Môi tr ườ ng 3: (Môi tr ườ ng giá đỗ đơ n gi ả n):
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
* Môi tr ườ ng 4: (Môi tr ườ ng tinh b ộ t):
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
- Môi trường 5: (Môi trường Huschinson):
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
Hút 10ml dung dịch khoáng
STT Hóa chất Khối lượng (g)/1lít
- Môi trường 6: (Thử amylaza) Thạch: 17g
- Môi trường 7: (Thử proteaza) Thạch 17g
- Môi trường 8: (Thử celluloza) Thạch 17g
- Môi trường 9: Môi trường NA cải tiến (Môi trường dịch thể Azhari
Samsu): Cao nấm men 2g; Cao thịt 4g; Peptone 5g; CMC 10g; KH2PO4 1g; MgSO4 0,2g; CaCl2 3g; Na2HPO4 1g; FeCl3 0,0028g; pH 7
Các thiết bị và máy móc của Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội:
- Tủ cấy (Box laminar PII)- Đức
- Máy li tâm - Sigma- Mỹ
- Kính hiển vi - Leica- Đức
- Nồi hấp khử trùng Lequenx- Pháp
- Máy đo pH Accument- Mỹ
- Cân điện tử AL300- Mỹ
- Các thiết bị đều được đặt mua từ các hãng uy tín như Merck, Sigma Nên có độ tin cậy cao.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn
Sử dụng phương pháp pha loãng giới hạn để phân lập vi khuẩn từ các mẫu cỏ ủ chua Mẫu được pha loãng ở nồng độ 10 -3 và 10 -5 và gạt trên đĩa thạch môi trường phân lập (ở mục 3.2.3) Chọn khuẩn lạc và tinh sạch trên môi trường thạch thường Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường thạch thường Mỗi mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái và tế bào khác nhau
3.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Tiến hành: Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút với các điều kiện nhiệt độ môi trường và pH 7 Sau 2 ngày,li tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút Bản thạch chứa cơ chất (Tinh bột, CMC) được đổ trên đĩa petri.Sau khi thạch đông tiến hành đục lỗ thạch bằng các ống có đường kính 5mm Dịch enzyme đã li tâm được nhỏ vào lỗ thạch đã đục trong đĩa Petri, đặt ở tủ ấm 37 0 C Sau 24 giờ tráng thuốc thử Lugol Hoạt tính enzyme được xác định bằng kích thước vòng trong (D-d, mm) Trong đó D là đường kính vòng phân giải cơ chất, d là đường kính lỗ đục
3.3.3 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được xác định bằng mật độ tế bào trong dịch nuôi
Cách tiến hành: Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút với các điều kiện nhiệt độ môi trường và pH thích hợp Sau 2 ngày lấy dịch nuôi cấy đo OD ở bước sóng 660nm
Hình thái tế bào và khuẩn lạc
- Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường thạch thường, sau 1 ngày lấy ra quan sát hình thái bề mặt, màu sắc,
- Quan sát hình thái tế bào: bằng phương pháp nhuộm Gram [6]
- Dung dịch tím kết tinh: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20ml ethanol 95%; 0,8g ammoni oxalate hòa tan trong 80ml nước cất Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối màu, sử dụng trong vài tháng
- Dung dịch Iodine: hòa tan 2g KI trong 3-5g nước cất, thêm 1g iodine, khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản trong lọ tối màu
- Dung dịch tẩy màu: ethanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml ethanol 95% với 30ml acetone
- Dung dịch nhuộm bổ sung: chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5% trước khi dung pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 để có dung dịch 0,5%
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần
- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
- Nhuộm lại bằng dung dịch iot trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
3.3.5 Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng vi khuẩn
3.3.5.1 L ự a ch ọ n môi tr ườ ng nuôi c ấ y thích h ợ p
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở 37 0 C trong 5 môi trường dịch thể được kí hiệu là: I, II, III, IV, V (thành phần môi trường như mục 2.1.3) Dịch nuôi cấy sau 2 ngày đem xác định mật độ tế bào, hoạt tính enzyme
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200vòng/ phút trên môi trường tối ưu pH được chỉnh ở các giá trị 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzyme, mật độ tế bào
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường tối ưu ở nhiệt độ
15 0 C, 20 0 C, 25 0 C, 30 0 C, 35 0 C, 40 0 C, 45 0 C trên máy lắc ổn nhiệt Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzyme, mật độ tế bào
Thay các nguồn cacbon trong môi trường tối ưu bằng các nguồn cacbon khác như: Đường glucose, saccharose, bột gạo, bột sắn, tinh bột tan, bột đậu tương Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong môi trường thay thế nhiệt độ thích hợp Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzyme, mật độ tế bào
Thay các nguồn nitơ trong môi trường tối ưu bằng các nguồn nitơ khác như: Amôn, nitrit, nitrat, urê, peptone, cao men, cao thịt, bột đậu tương Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 37 0 C Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzyme, mật độ tế bào
3.3.6 Nghiên cứu đặc tính enzyme của các chủng vi khuẩn
Các chủng được nuôi lắc trên môi trường tối ưu trong điều kiện nuôi cấy thích hợp Sau hai ngày lấy dịch nuôi lắc ly tâm 12.000 vòng/ phút trong
10 phút và thu dịch trong
3.3.6.1 pH thích h ợ p c ủ a enzyme trong d ị ch nuôi vi khu ẩ n
Dịch nuôi cấy thu được được kiểm tra độ bền pH bằng phương pháp khuếch tán trên bản thạch chứa cơ chất được chỉnh pH bằng đệm đa năng với giá trị pH từ 2 đến 10 Nhỏ dịch enzyme vào các giếng đã đục sẵn, giữ 37 0 C trong 24 giờ, xác định vòng phân giải cơ chất
3.3.6.2 Nhi ệ t độ thích h ợ p c ủ a enzyme trong d ị ch nuôi c ấ y vi khu ẩ n
Dịch nuôi cấy thu được sau khi li tâm được nhỏ vào bản thạch chứa cơ chất Sau đó, để ở các nhiệt độ là 20 0 C, 25 0 C, 30 0 C, 35 0 C, 40 0 C, 45 0 C, 50 0 C ,
60 0 C và 70 0 C Sau 24 giờ xác định vòng phân giải cơ chất
3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được được tính toán bằng các công thức thường quy trong
Sinh học phân tử của Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002) [3].