Một trong những phương pháp có khả năng kháng vi khuẩn kháng kháng sinh đó là sự kết hợp các hợp chất thực vật với các tác nhân diệt khuẩn khác là một hướng đi mới hiện nay.. Xuất phát t
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Tên đề tài: THU NHẬN VÀ SÀNG LỌC CAO CHIẾT ETHANOL THỰC VẬT TẠI BÌNH DƯƠNG CÓ HOẠT
TÍNH KHÁNG KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
KHÁNG METHICILLIN (MRSA)
Mã số:
Tên báo cáo chuyên đề 1:
Thu nhận cao Ethanol thực vật cho hoạt tính kháng MRSA
Chủ nhiệm đề tài: Th.S Mai Thị Ngọc Lan Thanh Người chủ trì thực hiện chuyên đề: Th.S Mai Thị Ngọc Lan Thanh
Bình Dương, 22/04/2019
Trang 2MỤC LỤC
1.Đặt vấn đề……… ……….4
Vancomycin……… 5
2.Phương pháp nghiên cứu, cách tiếp cận 7
3 Nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được 8
4.Kết luận và kiến nghị………15
5 Tài liệu tham khảo……… 15
Trang 3Bảng chú giải các ký hiệu, đơn vị đo, từ viết tắt, thuật ngữ
Trang 41 Đặt vấn đề
Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi
khuẩn in vitro
Kháng sinh được phân thành các nhóm theo cơ chế ức chế phát triển vi khuẩn như sau: + Ức chế sự tổng hợp vách tế bào
+ Ức chế sự tổng hợp protein
+ Ức chế chức năng màng
+ Thay đổi con đường trao đổi chất
+ Ức chế sự tổng hợp nucleic acid
Các chủng vi sinh vật phơi nhiễm với kháng sinh một thời gian đã xuất hiện các cơ chế kháng thông qua:
+ Sản xuất enzym làm biến đổi cấu trúc hóa học của thuốc
+ Làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc
+ Thay đổi cấu trúc protein đích mà thuốc tác dụng lên
+ Tăng nhiều số lượng mục tiêu để vô hiệu hoá tác dụng của thuốc (Hiroshi Yoneyama, 2006)
Vancomycin
Vancomycin thuộc nhóm glycopeptides
Vancomycin có ái lực cao với D-ala-D-ala tại đầu C của pentapeptide, do đó nó khoá sự hình thành tiền chất sau bằng transglycosylation với peptidoglycan và ngăn cản quá trình
hình hình cross-linking bằng transpeptidation
Trang 5Vancomycin không có tính thấm qua màng tế bào chất, do đó nó chỉ tương tác với đích thuốc sau khi tiền chất được khảm qua bề mặt màng
Do vancomycin không tương tác với enzyme tổng hợp vách tế bào nhưng hình thành phức hợp với tiền chất peptidoglycan, hoạt động của nó không xác định bằng ái lực với enzyme đích nhưng bằng cơ chất đặc biệt của enzyme để quyết định cấu trúc của tiền chất peptidodlycan Kháng vancomycin là sự hiện diện của operon chứa mRNA dịch mã cho enzyme tổng hợp những tiền chất có ái lực thấp với vancomycin
Đặc biệt, ở đầu C của D-ala-D-ala được thay thế bằng D-lactate hoặc D-Serine do đó làm thay đổi vi trí gắn vancomycin và phá huỷ ái lực cao của tiền chất với vancomycin, do đó xoá bỏ đích thuốc
Như vậy, có thể thấy rằng các loại kháng sinh hiện nay nhiều nguy cơ không còn đủ khả năng kháng lại các loại vi khuẩn, ngay cả những kháng sinh thế hệ mới dùng đặc trị cho
các bệnh nhiễm trùng huyết khi nhiễm Staphylococcus aureus như methicillin, vancomycin đều xuất hiện chủng Staphylococcus aureus kháng như MRSA kháng methicillin 13,6%; Staphylococcus aureus kháng trung gian vancomycin (VISA) và Staphylococcus aureus
kháng vancomycin (VRSA) 6.1% (Kính, 2010)
S aureus kháng methicillin xuất hiện 2 cơ chế kháng phổ biến:
• 1 Siêu biểu hiện β-lactamases
• 2 Thay đổi dạng bình thường của Protein gắn Penicillin (PBPs)
Sự hiện diện của protein PBP2a- Đây là cơ chế hiện diện sau cùng trong hầu hết các
chủng lâm sàng
S.aureus có 4 tiền chất PBPs thông thường trên màng tế bào chất tham gia vào quá trình
crosslinking peptidoglycan của vách tế bào Những PBPs thông thường này có hoạt động tương tự với serine của protease và có ái lực cao với những chất β-lactam Khi xảy ra việc gắn, những PBPs không có chức năng hình thành phức hợp vách tế bào, dẫn đến vi khuẩn chết
PBP2a là protein có trọng lượng phân tử 76kDa, nó được biểu hiện trong các chủng MRSA PBP2a có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam, do đó khả năng có khả năng thay thế
Trang 6chức năng sinh tổng hợp của PBPs thông thường không sự hiện diện của β-lactam, bằng cách này tế bào sẽ tránh được sự ly giải
PBP2a được biểu hiện từ gene mecA không hiện diện trong các chủng S.aureus nhạy kháng
sinh (Palavecino, 2007) Hơn nữa trong khoảng 30 năm trở lại đây, con người chưa thực
sự thành công trong việc tìm ra loại kháng sinh nào mới mà chủ yếu là các dạng sửa đổi (modify) dựa vào khung nguyên bản của thuốc kháng sinh thế hệ cũ
Đứng trước các thực trạng nói trên, việc tìm kiếm một phương pháp mới để kháng lại vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh, đặc biệt dạng siêu kháng là hết sức cấp bách Một trong những phương pháp có khả năng kháng vi khuẩn kháng kháng sinh đó là sự kết hợp các hợp chất thực vật với các tác nhân diệt khuẩn khác là một hướng đi mới hiện nay Với điều kiện thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc Thực vật dùng làm thuốc trong lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ cộng đồng đã được sử dụng từ xa xưa theo các đơn thuốc y học cổ truyền vẫn còn giá trị sử dụng cho đến ngày nay trong trị chữa các bệnh cấp tính và mãn tính Có thể
đơn cử một số bài thuốc dân gian chữa các bệnh nhiễm khuẩn như: Bù xít (Ageratum conyzoides L) chữa viêm xoang, nước sắc bằng cồn của Ngũ trảo được thử nghiệm cho thấy có tính kháng sinh đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio mimicus, Staphyllococcus aureus, Proteus vulgaris, Proteus aeruginosa, và 3 loài nấm (Aapergillus niger, Aspergillus flavon, Candida albicans) Nước sắc hoặc rượu Ngũ trảo
có tác dụng kháng sinh trên các vi khuẩn trên trị trúng thực, sình bụng, tiêu chảy, huyết trắng, nhiễm trùng da
Xuất phát từ những nguyên nhân nói trên, chúng tôi đã chọn đề tài: “Thu nhận và sàng
lọc cao chiết ethanol từ thực vật bản địa Bình Dương có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA).”
Chuyên đề 1: “Thu nhận cao Ethanol thực vật cho hoạt tính kháng MRSA”
là một chuyên đề nghiên cứu trong Đề tài Thu nhận và sàng lọc cao chiết ethanol từ thực
vật bản địa Bình Dương có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus kháng
methicillin (MRSA)
Trang 72 Phương pháp nghiên cứu, cách tiếp cận
Nuôi cấy vi khuẩn: Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhạy
methicillin (MSSA) ATCC 6538 được sử dụng như chủng đối chứng, chủng
Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 33591 được cung cấp bởi công
ty Microbiologics (USA) và MSSA được nuôi trên môi trường lỏng Trypton Soy
(Himedia, Ấn Độ), và môi trường Trypton Soy agar (Himedia, Ấn Độ) Chủng vi khuẩn được nuôi trong tủ ấm (DaiHan, Hàn Quốc), ở nhiệt độ 370C, trong vòng 18 giờ
Phương pháp thu nhận cao ethanol thực vật : Sinh khối tươi thực vật (lá, hoa, cành non)
sau khi thu hái về được rửa bằng nước cất sạch bụi bẩn, trữ tủ lạnh trong vòng 24 giờ, cho nitơ lỏng đế phá vỡ tế bào nghiền bằng máy xay FY 130, tốc độ máy 34000
vòng/phút, kích thước mắt lưới 0.074-0.25mm Sau đó bột thực vật sẽ được dùng để chiết cao theo phương pháp ngâm dầm trong ethanol ở 500C, lắc ở 100 vòng/phút trong máy lắc Ika KS 4000i (Đức), sau thời gian 24 giờ sẽ thu một lần, và chiết kiệt trong vòng 1 tuần Tỷ lệ chiết (ethanol: sinh khối thực vật khô) 2 lít: 50g, chiết lặp lại 3 lần Dung dịch thu được sẽ được lọc qua giấy lọc Whatman đường kính 110mm, với kích thước lỗ lọc 20-25µm , dịch lọc thu được sẽ được cô cao bằng máy cô quay ở 500C, trong vòng 2-3 giờ, sau đó cao sệt sẽ được để trong tủ sấy ở 500C đến khối lượng không đổi
Phương pháp thu nhận dung dịch cao thực vật khảo sát hoạt tính kháng MRSA: Cao thực
vật thu được sẽ được cân khối lượng bằng cân phân tích Sartorius (Đức) Khối lượng cân được sẽ được hòa tan trong dung dịch DMSO(Merck, Đức) 10%, Dịch hòa tan sẽ thu và đem ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong vòng 4 phút bằng máy Hermle (Đức) Sau
đó, loại cặn và thu dịch Dung dịch này sẽ được lọc qua phin lọc có kích thước lỗ lọc 0.22µm và xác định nồng độ thông qua hai phương pháp gián tiếp và trực tiếp Phương pháp gián tiếp thông qua khối lượng cặn được phơi trong tủ sấy ở 500C, và cân đến khối lượng không đổi, lấy khối lượng cao ban đầu trừ cho khối lượng cặn sẽ ra khối lượng chất tan hòa trong dung dịch DMSO 10% Phương pháp xác định nồng độ dung dịch trực tiếp bằng cách dùng pipetman lấy 1ml dịch thu được và cô đến khối lượng không đổi
Trang 8trong tủ sấy DaiHan (Hàn Quốc) ở 500C Khối lượng cân được chính là khối lượng chất tan trong 1ml dung dịch khảo sát
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Agar diffusion method): Chuẩn bị đĩa môi trường Muller-Hinton Agar (MHA) là môi trường
chuẩn dùng để khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết, có bổ sung vi khuẩn khảo sát ở nồng độ 106CFU/ml Sử dụng phương pháp Kirby-Bauer Các giếng trên đĩa thạch được khoan có kích thước lỗ 4mm Các giếng được làm đầy bằng dịch chiết với thể tích 50l ở nồng độ MIC tối thiểu của kháng sinh thử nghiệm làm đối chứng Giếng được cho vào 50l dịch chiết thực vật Sau đó, các đĩa được ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Các kích thước vòng kháng khuẩn theo milimet (mm) được đọc sau 24 giờ Hoạt tính kháng MRSA của cao thực vật so độ mạnh yếu dựa trên cơ sở
so sánh với kích thước vòng kháng khuẩn của kháng sinh chuẩn, còn hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh chuẩn sử dụng tiêu chuẩn vòng kháng khuẩn của CLSI để giải
thích.(Edition, 2012)
3 Nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được
Danh mục thực vật khảo sát kháng MSSA và MRSA
stt
sử dụng
Chủng vi khuẩn
E.coli S.aureus MRSA
1 Kinh giới Lamiaceae Elsholtzia
cristata
Toàn
2 Rẻ quạt Iridaceae Belamcanda
chinensis
Toàn
3 Mã đề Plantaginac
eae
Plantago asiatica L
Toàn cây 5.6± 0.3 6.5 ± 0.4 -
Trang 94 Tiêu lớp Piperaceae Piper longum Toàn
5 Rau sam
Portulacace
ae
Portulaca oleracea
Toàn
6 Hoa sữa Apocynacea
e
Alstonia scholaris L
Toàn
7 Chè xanh Theaceae Camellia
sinensis
Toàn cây - 13.5 ± 0.4 7.8 ± 0.2
8
Diệp ha
châu
xanh
Euphorbiac eae
Phyllanthus urinaria L
Toàn cây 7.5 ± 0.4 10 ± 0.8 6.5 ± 0.4
9 Gấc Cucurbitac
eae
Momordica cochinchinens
is
Toàn
10 Khế Oxalidacea
e
Averrhoa carambola L
Toàn cây 13 ± 0.4 15 ± 0.7 11± 0.7
11 Điều Anacardiacea
e
Anacardium occidentale L
Toàn cây 4 ± 0.8 5.3 ± 0.5 -
12 Cơm rượu Rutaceae Glycosmis
pentaphylla
Lá và
13 Đinh lăng Araliaceae Polyscias
fruticosa
Lá và cành non
14 Cỏ sữa lá
nhỏ
Euphorbiace
ae
Euphorbia thymifolia L.
Toàn cây
15
Cây Ké Đầu
Xanthium strumarium L.
Toàn
Trang 10VK±SD (Standard deviation) = (-): không có hoạt tính kháng khuẩn
Bảng 1 Danh mục thực vật thu cao chiết ethanol cho hoạt tính kháng MRSA
Stt
Tên thực vật
Bộ phận sử dụng
Nồng
độ Cao thực vật (µg/ml)
Hoạt tính kháng MRSA
Tên thông thường Tên khoa học
1 Kim vàng Barleria lupulina Lindl Toàn cây 90.12 +
2 Trâm Tròn Syzygium glomerulatum Lá và cành
non
9.83
+
3
Trâm Dài Syzygium cumini L Lá và cành
non
50.83
+
4
Cò ke Grewia asiatica L Lá và cành
non
29.4
+
5
Xăng mã Carallia brachiata Lá và cành
non
31.34
+
Định vị
Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương 11000’33.02’’ Phía Bắc, 106039’00.37’’ phía Đông, Độ cao 11m±3m
Từ 20 loài thực vật được thu nhận tại Bình Dương, bằng phương pháp chiết ngâm dầm ethanol 99% kết hợp với lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 24h, chiết 1 lần và lặp lại trong vòng 1 tuần cho đến khi chiết kiệt Cô giảm áp còn khoảng 1/4 thể tích, sau đó cao sệt được để vào tủ sấy 500C đến khối lượng không đổi ta được cao ethanol Cao ethanol
thực vật được hòa trong DMSO 10% để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Staphylococus aureus nhạy methicillin (MSSA)ATCC 6538 và Staphylococcus aureus kháng methicillin
(MRSA) ATCC 33591 bằng phương pháp khếuch tán đĩa Kết quả đươc chỉ ra Hình 1 Và Bảng 1 có năm cao ethanol thực vật cho hoạt tính MRSA gồm: Kim vàng, Xăng Mã, Trâm
Trang 11Tròn, Trâm Dài, Cò ke với nồng độ lần lượt là 90.12 µg/ml, 31.34 µg/ml, 9.83 µg/ml, 50.83µg/ml, 29.4 µg/ml Hoạt tính kháng MRSA của năm loại thực vật này đều được báo cáo lần đầu tiên ở Việt Nam, và trên thế giới cũng đã có một số ít công trình nghiên cứu của năm loại thực vật này Thêm nữa, hoạt tính kháng MRSA của cao Kim vàng đã được báo cáo theo công trình của Keerati Joyjamras và cộng sự tại Đại Học Rangsit, Thái Lan
đã báo cáo Kim vàng không cho hoạt tính kháng MSSA và MRSA kết quả cũng tương tự
do nhóm tác giả Voravuthikunchai, Phongpaichit, & Subhadhirasakul năm 2005 cũng báo cáo các thực vật tại Thái Lan có Kim vàng cũng không cho hoạt tính kháng khuẩn (Joyjamras, Sukplang, & Thongmee; Voravuthikunchai, Phongpaichit, & Subhadhirasakul, 2005), tuy nhiên trong nghiên cứu này cho hoạt tính kháng MRSA ở nồng độ chỉ 90.12 µg/ml Điều này có thể cho thấy khả năng thổ nhưỡng có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thực vật
Hình 1 Hoạt tính kháng khuẩn của Năm cao ethanol thực vật kháng MRSA
Trong Bốn Cây còn lại thì Trâm Dài là có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ cao methanol kháng MRSA cũng đã được báo cáo là 100mg/ml cho kích thước vòng kháng MRSA là 13.15±0.21(mm) (Priya, Devi, Eganathan, & Kingsley, 2013), trong khi đó hoạt tính kháng MRSA của đề tài này là 50.83 µg/ml cho kích thước vòng kháng là 12mm Hướng khác Cao trâm tròn vẫn chưa công trình nghiên cứu nào báo cáo trước đó Còn lại hai loài thực vật là Xăng Mã và Cò ke, thì ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về hoạt tính MRSA của Cao chiết từ Cò Ke, cũng như Cò ke, Xăng Mã được Ruchi Tiwari và công sự báo cáo về hoạt tính làm lành vết thương, bước đầu xác định các nhóm hợp chất có trong cao Xăng Mã gồm Tannins, flavonoids and glyceroglycolipids (Tiwari, Chakraborty, & Dhama) Như vậy từ kết quả nghiên cứu này có thể thấy tiềm năng
Trang 12về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol các loài thực vật bản địa Bình Dương, đặc biệt là hoạt tính kháng MRSA
1 Khảo sát khả năng kết hợp của các cao ethanol năm loài thực vật trên hoạt tính kháng MRSA
Xăng Mã-Trâm Tròn
Xăng Mã-Kim Vàng
Cò Ke-Trâm Tròn
Cò Ke-Kim Vàng
1
1
1
1
Trang 13Trâm Dài-Trâm Tròn
Trâm Dài-Kim Vàng
Hình 2 Hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kết hợp của dịch chiết cao Xăng Mã, Cò Ke,
Trâm Dài với Cao Trâm Tròn, Kim Vàng kháng MRSA
Bảng 2 Khảo sát khả năng kết hợp của Cao Xăng Mã, Cò Ke, Trâm Dài với Trâm Tròn,
Kim Vàng trên chủng MSSA và MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa
Tên thực vật
Bán kính vòng kháng khuẩn (rA) (mm)
Bán kính vòng kháng khuẩn (rB) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn theo công thức (D) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn mở rộng (C) (mm)
Kết hợp
vi khuẩn Trâm
Tròn
Kim Vàng
MSSA
MRSA
Theo công thức của Farrukh Aqil và cộng sự (Aqil et al., 2006) Kích thước vòng kháng
1
1
Trang 14Cao Xăng Mã trên chủng MSSA lần lượt là 4mm và 6mm, rB của Trâm Tròn và Kim Vàng lần lượt là 9mm và 4mm Theo công thức thì kích thước vòng kháng khuẩn D là 13mm và
10mm nhỏ hơn kích thước vòng kháng khuẩn mở rộng của cao Xăng Mã với Trâm Tròn là
17mm và Xăng Mã với Kim Vàng là 12mm Vì vậy có sự kết hợp hoạt động của cao Xăng
Mã với Trâm Tròn và Kim Vàng trong hoạt tính kháng MSSA Tương tự, Cao Cò ke có sự kết hợp với Cao Trâm Tròn và Cao Kim vàng, Cao Trâm Dài cũng có sự kết hợp với Cao
Trâm tròn nhưng không có kết hợp với Cao Kim vàng trên hoạt tính kháng MRSA
Hình 3 Hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kết hợp của dịch chiết cao Xăng Mã với
Cao Trâm Tròn, Kim Vàng kháng S.aureus
Xăng Mã-Trâm Tròn
Xăng Mã-Kim Vàng
Tương tự Xăng Mã, Cò Ke, Trâm Dài cho khả năng kết hợp với Trâm Tròn trong hoạt tính kháng MRSA Riêng đối với Kim Vàng thì chỉ có Xăng Mã và Cò Ke cho khả năng kết
1
1