Đề tài tách, tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcumin từ bột curcuminoid thương phẩm

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA – THỰC PHẨM---E D--- BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: TÁCH, TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT CURCUMIN TỪ BỘT CURCUMINOID THƯƠNG PHẨM.. K

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA – THỰC PHẨM

-E D -

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

TÁCH, TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT CURCUMIN TỪ

BỘT CURCUMINOID THƯƠNG PHẨM

CAO THỊ KIM ANH LƯU THỊ NGỌC VĨNH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA – THỰC PHẨM

-E D -

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

TÁCH, TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT CURCUMIN TỪ

BỘT CURCUMINOID THƯƠNG PHẨM

Sinh viên thực hiện : CAO THỊ KIM ANH

LƯU THỊ NGỌC VĨNH Giáo viên hướng dẫn : ThS HOÀNG MINH HẢO

ThS PHAN THỊ HOÀNG ANH

BIÊN HÒA, THÁNG 11/2010

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục các hình

Danh mục bảng biểu

Danh sách các sơ đồ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Curcuminoid 4

1.1.1 Đặc điểm và sự phân bố của cây nghệ 4

1.1.1.1 Đặc điểm cây nghệ 4

1.1.1.2 Sự phân bố của cây nghệ 5

1.1.2 Thành phần hóa học trong thân rễ của cây nghệ 5

1.1.3 Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid 6

1.1.4 Tính chất hóa lý của curcuminoid 9

1.1.4.1 Lý tính 9

1.1.4.2 Hóa tính 9

1.1.5 Hoạt tínhsinh học của curcuminoid 17

1.2 Các nghiên cứu về imin và dẫn xuất imin-curcumin 20

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp thực hiện 26

2.2.1 Phân lập curcumin 26

2.2.1.1 Quy trình phân lập curcumin 26

2.2.1.2 Kết tinh bột Curcuminoid thương phẩm 26

2.2.1.3 Sắc ký bản mỏng (TLC) 27

2.2.1.4 Sắc ký cột 29

2.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất imin – curcumin 29

2.2.2.1 Tổng hợp 3,5- Difluorophenylhydrazinocurcumin 29

2.2.2.2 Tổng hợp 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 34

2.2.3 Phân tích độ tinh khiết và cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp 38

2.2.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) 38

2.2.3.2 Khối phổ (MS) 39

2 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 39

2.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học 39

2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá 39

2.2.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Phân lập curcumin 43

3.1.1 Kết tinh curcumin 43

3.1.2 Sắc ký cột phân lập curcumin 44

3.2 Tổng hợp dẫn xuất 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 46

3.2.1 Theo dõi phản ứng 46

3.2.2 Sắc ký cột phân lập sản phẩm 48

3.2.3 Nhận danh cấu trúc 49

3.2.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 49

3.2.3.2 Biện luận cấu trúc hóa học của 3,5-Difluorophenylhydr- azinocurcumin 50

3.3 Tổng hợp dẫn xuất 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 52

3.3.1 Theo dõi phản ứng 52

3.3.2 Sắc ký cột phân lập sản phẩm 54

3.3.3 Nhận danh cấu trúc 55

3.3.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng 55

3.3.3.2 Biện luận cấu trúc của 4-Fluorophenylhydrazino- curcumin 57

3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học 59

3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH 59

3.4.2 Hoạt tính kháng tế bào gây độc 60

Kết luận và kiến nghị 62 Danh mục tài liệu tham khảo

Phụ lục

CS: Khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất

thử tính theo % so với đối chứng

DPPH: Chất thử 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

MS: Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic

resonance spectroscopy)

TLC: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây nghệ vàng Curcuma longa L .5

Hình 1.2 Công thức hóa học chung của curcuminoid 7

Hình 1.3 Đồng phân cis – trans curcumin 8

Hình 1.4 Các đồng phân enol − ceton của curcumin 8

Hình 1.5 Quá trình tautomer hóa của các hợp chất curcuminoid 8

Hình 1.6 Các dạng phân ly của curcuminoid 10

Hình 1.7 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng 11

Hình 1.8a Sự phân hủy của curcumin trong môi trương kiềm 12

Hình 1.8b Sự phân hủy của curcumin trong môi trường kiềm 12

Hình 1.9 Phản ứng cộng H2 13

Hình 1.10 Phản ứng imin hóa 14

Hình 1.11 Phản ứng của curcuminoid với gốc tự do 15

Hình 1.12 Phản ứng tạo phức với kim loại 16

Hình 1.13 Anion dicetonat 16

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của curcumin 17

Hình 1.15 Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin 20

Hình 1.16 Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin 20

Hình 1.17 Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imin từ curcuminoid 22

Hình 1.18 3-Nitrophenylpyrazolecurcumin 22

Hình 1.19 Hydrazinocurcumin 22

Hình 1.20 Công thức cấu tạo của curcuminsemicarbazone 23

Hình 3.1 TLC kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh 44

Hình 3.2 Sắc ký cột phân lập curcumin 45

Hình 3.3 TLC phân đoạn tinh từ sắc ký cột 45

Hình 3.4a Phản ứng 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 46

Hình 3.4b Phản ứng tổng hợp 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 47

Hình 3.5 Theo dõi bản mỏng bằng TLC 47

Hình 3.6 Sắc ký cột thô .48

Hình 3.7 Sắc ký cột tinh 48

Hình 3.8 TLC của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 49

Hình 3.9 Phổ UV-Vis của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 50

Hình 3.10 Công thức phân tử của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin, C27H22N2F2O4 (M=477,04) 51

Hinh 3.11a Phản ứng tổng hợp 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 53

Hình 3.11b Phương trình phản ứng tổng hợp 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 53 Hình 3.12 TLC của tổng hợp 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 54

Hình 3.13 Sắc ký cột thô 54

Hình 3.14 Sắc ký cột tinh 54

Hình 3.15 TLC của 4-Fluorophenylhydrazincurcuin 56

Hình 3.16 Phổ UV-Vis của 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin trong dung môi CH2Cl2 56

Hình 3.17 Cấu trúc của 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin, C27H23N2FO4 (M=458 đ.v.C) 57

Hình 3.18 Hoạt tính kháng oxy hóa của Cur, 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin, 4-Fluorophenylhydrazino- curcumin và Vitamin C theo phương pháp DPPH 59

Hình 3.19 Đồ thị tính giá trị IC50 của mẫu 60

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học các chất trong thân rễ nghệ 6

Bảng 1.2 Cấu trúc các thành phần của curcuminoid 7

Bảng 3.1 Kết quả kết tinh bột curcuminoid 43

Bảng 3.2 Một số tính chất của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 50

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin trong dung môi CDCl3 51

Bảng 3.4 Một số tính chất của 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 57

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 58

Bảng 3.6 Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH 60

Bảng 3.7 Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin và 4-Fluoropheny- lhydrazinocurcumin với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD 61

SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thực nghiệm 25

Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập cur 26

Sơ đồ 2.3 Quy trình tổng hợp 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 30

Sơ đồ 2.4 Quy trình tổng hợp 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin 34

MỞ ĐẦU

™ Lý do chọn đề tài

Từ lâu con người đã biết sử dụng nghệ như là một loại gia vị, thuốc gia truyền

và chữa được nhiều bệnh Ngày nay nhu cầu của con người ngày phát triển, nên nghệ được ứng dụng rộng rãi hơn trong các lĩnh vực như mỹ phẩm, dựơc phẩm, thực phẩm

Thành phần chính trong củ nghệ là hỗn hợp curcuminoid bao gồm curcumin 1,

2, 3, tương đối trơ và không gây độc đối với người ngay cả khi dùng với liều lượng lớn, chính vì tính an toàn nên curcuminoid ứng dụng phổ biến, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm Những nghiên cứu gần đây chứng tỏ curcuminod có nhiều hoạt tính quan trọng như: chất chống ung thư, chống oxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ và kháng viêm Ngoài ra, trong một số nghiên cứu tại Trường Y Khoa Havard cho biết dẫn xuất curcuminoid còn có tác dụng trong việc điều trị HIV, Alzheimer…

Ở nước ta, tuy trữ lượng nghệ rất dồi dào nhưng việc tổng hợp dẫn xuất curcuminoid và nghiên cứu hoạt tính sinh học vẫn còn hạn chế

Những nghiên cứu gần đây cho thấy dẫn xuất imin của curcumin có hoạt tính sinh học tăng đáng kể, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực y dược Chính

vì lí do trên mà nhóm chúng tôi nghiên cứu về đề tài "Tách, tổng hợp và khảo sát

hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcumin từ bột curcuminoid thương phẩm”

™ Tổng quan lịch sử nghiên cứu của đề tài

• Tình hình nghiên cứu trong nước

Lê Xuân Tiến[4], “Nghiên cứu tổng hợp hydrazincurcumin và isoxaxolcurcumin-

Khảo sát hoạt tính sinh học của chúng”

Trần Thanh Vũ[6], “Tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của dẫn xuất

pheny-lhydrazinocurcuminoid”

Đặng Thị Mỹ Lệ, Đỗ Thị Xuân Vui[2], “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imin 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin”[2]

• Tình hình nghiên cứu ngoài nước

S Mishra cùng các cộng sự[13] đã tổng hợp được 2 dẫn xuất: hydrazinocurcumin (HC) và 3-Nitrophenylpyprazolcurcumin có khả năng ức chế sự phát triển của

Plasmodium falciparum cao hơn so với cur

C Selvam và cộng sự [18] đã tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất imin–curcumin Kết quả cho thấy dẫn xuất hydrazinocurcumin và

isoxazolcurcumin kháng viêm cao hơn cur tương ứng

- Tổng hơp, phân lập và khảo sát hoạt tính sinh của các dẫn xuất:

3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin và 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin Sau

đó khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp được

™ Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu : Bột curcuminoid thương phẩm của Viện Dược Liệu

Hà Nội được chiết xuất từ nghệ vàng (Curcuma Longa L.)

- Phạm vi nghiên cứu: Curcumin

- Lĩnh vực nghiên cứu: Tổng hợp, phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học các dẫn xuất của curcumin

™ Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid thương phẩm

- Tổng hợp các dẫn xuất của curcumin vừa phân lập được

- Sắc ký cột phân lập sản phẩm

- Khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn xuất trên

9 Hoạt tính kháng oxi hóa

9 Hoạt tính kháng ung thư

™ Những đóng góp mới của đề tài và những vấn đề chưa làm được

Những đóng góp của đề tài:

Tổng hợp được hai dẫn xuất 4-Fluorophenylhydrazinocurcumin (4-FPHC) và 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin (3,5-DFPHC) Xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý, thử hoạt tính kháng ung thư và kháng oxi hóa của chúng

Những vấn đề chưa làm được:

- Phân lập các dẫn xuất curcumin (cur) với hiệu suất thấp

- Chưa thử nghiệm hoạt tính sinh học với các chuẩn tế bào khác nhau nhằm nâng cao khả năng ứng dụng

Nghệ là cây thảo mộc sống lâu năm, có tên khoa học là Curcuma longa L., thuộc họ

gừng Cao khoảng 0,60 đến 01 mét Thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng cam sẫm do có chứa chất màu curcumin Lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn dài tới 45cm, rộng tới 18cm, lá khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá non hẹp hơn, màu hơi tím nhạt Cụm hoa mọc từ giữa các lá lên thành hình nón thưa, cánh hoa ngoài màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy Củ nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm chứa tinh dầu (3-5%) màu vàng nhạt, thơm, ngoài ra còn có tinh bột, canxi oxalat và chất béo

Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông ở các tỉnh phía Bắc và mùa khô ở các tỉnh phía Nam Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau khi đã ra lá Hoa mọc trên những thân của những chồi năm trước Những thân đã ra hoa thì năm sau không mọc lại nữa và phần thân rễ của chúng trở thành những "củ cái" già, sau

1 – 2 năm bị thối, cho những nhánh non nảy chồi thành các cá thể mới

Hình 1.1: Cây nghệ vàng Curcuma longa L

1.1.1.2 Sự phân bố của cây nghệ

Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy từ Ấn Độ, ở đây nó được trồng ở vùng đồng bằng và trên các đảo Người Ấn dùng một loại tinh chất từ nghệ để rửa mắt trong việc chữa viêm kết mạc Từ thời xa xưa, cây nghệ đã được trồng ở nhiều nơi về sau trở nên hoang dại, trước hết là ở Trung Quốc Ngày nay, nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á

Ở Việt Nam, nghệ có trữ lượng khá dồi dào và được trồng ở khắp các địa phương, từ vùng đồng bằng ven biển đến vùng núi cao trên 1500m Ở một số nơi thuộc huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng Văn, Lâm Đồng, Mèo Vạc (Hà Giang), Sìn

Hồ, Phong Thổ (Lai Châu)… Bên cạnh nguồn cung cấp do trồng trong nhân dân, ở một số địa phương phía bắc, nghệ mọc hoang dại ước tính trữ lượng đến 1000 tấn

1.1.2 Thành phần hóa học trong thân rễ nghệ [11]

Thành phần hóa học chính quan trọng nhất của thân rễ nghệ là curcuminoid (6%), là thành phần tạo màu vàng cho nghệ, trong đó lượng curcumin chiếm khoảng 70-80% khối lượng Trong thân rễ nghệ còn chứa tinh dầu (2-7%) với các thành phần chính là artumeron, zingberen, borneol

Ngoài ra còn có những thành phần với hàm lượng thấp hơn như demetoxycurcumin, bisdemetoxycurcumin, dihydrocurcumin, phytosterol, các acid

béo và polysaccharid và một số thành phần khác như bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần các chất trong thân rễ nghệ [12,11]

1.1.3 Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid [11,12,13]

Curcuminoid là nhóm chất màu chiết xuất từ thân rễ cây nghệ vàng (Curcuma

longa L.) Curcuminoid là những dẫn xuất diarylheptan gồm curcumin,

Nước Năng lượng thực phẩm

Protein Chất béo Carbohydrat Calcium Phosphorous Sodium Potassium Iron Thiamine Riboflavin Niacin Acid ascorbic

g kcal

260

30

2 47,5 0,09 0,19 4,8

50

demetoxycurcumin, bisdemetoxycurcumin và gần đây còn tìm thấy có một ít cyclocurcumin Chúng là những hợp chất phenolic, hầu hết các dẫn xuất đều khác nhau nhóm thế trên gốc phenyl

Lượng curcumin trong bột nghệ khoảng 3-6% Hỗn hợp curcuminoid khoảng

77% curcumin (cur), 17% demetoxycurcumin (DMC), 3% bisdemetoxycurcumin

(BDMC)[8]

Hình 1.2: Công thức hóa học chung của curcuminoid[7]

Bảng 1.2: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]

1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta Bisdemetoxycurcumin: 1,71-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta bis1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta (41-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta hydroxyphenyl)1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta hepta1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta 1,61-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta diene1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta 3,51-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta dione

Ngoài thành phần chính là curcuminoid như trên, trong thân rễ nghệ còn có một số

đồng phân hình học của chúng, như đồng phân cis – trans cur

Hình 1.3: Đồng phân cis – trans curcumin

Curcuminoid là những β-diceton tồn tại ở dạng đồng phân tautomer: cis –

diceton hoặc trans – diceton và dạng enol (cis – enol) Trong dung dịch, các hợp

tautomer hóa Trong cấu trúc của enol có liên kết hydro

Hình 1.4: Các đồng phân enol − ceton của curcumin

Hình 1.5: Quá trình tautomer hóa của các hợp chất curcuminoid

Các phân tử curcuminoid chứa hệ thống liên hợp mở rộng với các vòng phenyl nằm cuối mạch (trong cấu dạng enol) Ngoài ra, curcuminoid còn chứa các nhóm carbonyl, metoxy và hydroxyl, góp phần tạo nên hoạt tính sinh học đa dạng của

curcuminoid Với những đặc điểm cấu trúc trên, curcuminoid là những polyphenol

được xếp vào các hợp chất kháng oxy hóa dạng phenolic

1.1.4 Tính chất hóa lý của curcuminoid

1.1.4.1 Lý tính [9,13]

Là dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi, bền với nhiệt độ,

không bền với ánh sáng Khi ở dạng dung dịch cur dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và

nhiệt độ, tan trong chất béo, etanol, metanol, diclometan, aceton, acid acetic băng và

hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở

250C) Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngã tím, tan trong

môi trường acid có màu đỏ tươi

Các thông số lý tính đặc trưng của curcuminod[4] :

1.1.4.2 Hóa tính

™ Quá trình điện ly theo pH

Sự điện ly theo pH của cur bằng phương pháp HPLC cho kết quả sau

- pH < 1: dung dịch cur có màu đỏ do cur ở trạng thái proton hóa H4A+

- pH = 1 –7: cur ở trạng thái trung tính H3A Trong khoảng pH này cur khó tan

trong nước và tạo huyền phù màu vàng

- pH > 7,5: dung dịch cur có màu đỏ vì cur tồn tại dưới các dạng H2A-, HA2-,

A3- Giá trị hằng số phân ly proton pKa1, pKa2, pKa3 của cur (tạo thành H2A-, HA2-,

A3-) được xác định lần lượt là 7,8; 8,5 và 9,0

Hình 1.6: Các dạng phân ly của curcuminoid[20]

™ Phản ứng phân hủy

- Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng[20]

Dưới tác dụng của ánh sáng, cur phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic, acid ferulic

Cur cũng không bền ngay cả khi có và không có mặt của oxy Khi có mặt oxy và ánh sáng, cur bị phân hủy tạo thành 4-Vinylguaialcol và vanillin

CHO

OH OCH3

CH

OCH3OH

OH OCH3

hv,O2

+

CO2

+

Cur có thể bị vòng hóa trong điều kiện không có mặt của oxy

Hình 1.7: Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng

- Phân hủy trong môi trường kiềm

Tonnesen và Karlsen (1985)đã nghiên cứu quá trình kiềm phân hủy của cur, sản phẩm của quá trình phân hủy trong khoảng pH từ 7 đến 10 được xác định bằng HPLC Sản phẩm của quá trình phân hủy là acid ferulic và feruloylmetan

Hình 1.8a: Sự phân hủy của cur trong môi trường kiềm

Sau đó Feruroyl metan tiếp tục bị phân hủy thành vanilin và aceton Acid ferulic bị phân hủy thành vinylguaialcol và CO2

Hình 1.8b: Sự phân hủy của cur trong môi trường kiềm[10]

Trong hợp chất cur có chứa các hydrocarbon chưa no, do đó có khả năng tham gia phản ứng cộng 1,2 hoặc 3 phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin,

tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO2), các sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá.[16]

Hình 1.9: Phản ứng cộng H2 [5]

™ Phản ứng imin hóa

Cur là hợp chất diceton nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất

(NH2NHCONH2)… để tạo thành các dẫn xuất imin (base Schiff) hoặc dẫn xuất imin tương ứng.[3,6,15].

Cơ chế phản ứng:

Hình 1.10: Phản ứng imin hóa[14]

Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên tử nitrogen của amin vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm carbonyl Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxid và cation ammonium Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian bền hơn là carbinolamin Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamin, sinh ra dạng proton hoá của imin hoặc các dẫn xuất của imin Cuối cùng là giai đoạn tách proton, hình thành sản phẩm là imin hoặc các dẫn xuất của imin.[14]

Trong cơ chế của phản ứng imin hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan trọng Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amin bị proton hoá Các amin bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không phản ứng với các nhóm ceton Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imin Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng imin hoá là khoảng pH ~ 4,5.[15]

™ Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzen

Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl trở nên linh động hơn Điều này giải thích tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của cur

Ngoài ra, phản ứng với các gốc tự do còn liên quan đến sự chuyển nguyên tử hydro của nhóm metylen ở carbon giữa mạch, làm giảm hay mất hoạt tính của các gốc này Hai hướng phản ứng này góp phần giải thích tính chống oxy hóa mạnh của curcuminoid khi ứng dụng nó trong ngành dược

Hình 1.11: Phản ứng của curcuminoid với gốc tự do[19]

™ Phản ứng tạo phức

Phức kim loại bao gồm ion kim loại trung tâm liên kết với các phân tử khác bằng liên kết cộng hóa trị Curcuminoid với cấu trúc β-diceton trong môi trường

acid hay trung tính nằm dưới dạng hỗ biến ceton – enol đối xứng và ổn định, làm cho curcuminoid có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác nhau: Mn2+,

Fe2+, Cu2+, Ga3+,… [4]Curcuminoid có khả năng cho đi một hay nhiều cặp electron

tự do trên các nguyên tử oxy của cấu trúc ceton – enol và chất nhận là các ion kim loại với lớp vỏ electron còn trống Do vậy, liên kết cộng hóa trị giữa curcuminoid

và kim loại được hình thành Sự liên kết này làm thay đổi năng lượng trường tinh thể của ion kim loại, làm thay đổi sự phân bố electron trong phân tử Kết quả là phức của kim loại và curcuminoid sẽ có nhiều màu sắc khác nhau

Hình 1.12: Phản ứng tạo phức với kim loại [5]

β-diceton có tính acid và khi các proton này bị phân ly sẽ làm cho β-β-dicetonat tích điện âm β-dicetonat mang điện âm này đóng vai trò là tác nhân tạo phức mạnh, có khả năng tạo phức với tất cả kim loại chuyển tiếp và cả các kim loại phân nhóm chính

Hình 1.13: Anion dicetonat

1.1.5 Hoạt tính sinh học của curcuminoid[8,9]:

Hoạt tính sinh học chủ yếu của curcuminoid là kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng virus và kháng một số loại ung thư

Nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm ở các nước trên thế giới đã khẳng định từ lâu rằng hoạt chất cur có tác dụng huỷ diệt tế bào ung thư vào loại mạnh Tại Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng cur điều trị ung thư và kết luận rằng cur có thể kìm hãm sự phát tác của tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang Cur còn là chất bổ cho dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương, chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn có hiệu lực Từ nǎm 1993, các nhà khoa học thuộc Đại học Harvarrd (Mỹ) đã công bố 3 chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và 1 trong 3 chất đó

là cur

Cur có giá trị hoạt tính sinh học cao là do trong công thức cấu tạo của cur có các nhóm hoạt tính sau:

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của curcumin

- Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá

- Nhóm ceton: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

- Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

™ Hoạt tính kháng oxy hóa

Oxy không thể thiếu đối với vi sinh vật ái khí Oxy tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa học trong cơ thể. Trong các quá trình đó, oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do

Khi nhận một điện tử đầu tiên, oxy tạo ra gốc superoxid Đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào Từ gốc superoxid (O2 •−), nhiều gốc tự do và các phân tử khác

H2O2, 1O2 (oxy đơn bội), LO• (gốc lipoxid), LOO• (gốc lipoperoxid), RO• (gốc alkoxid), LOOH Tên chung của các gốc này là các dạng oxy hoạt động Ngoài ra

trong cơ thể còn có những dạng gốc tự do hoạt động khác có chứa nitơ, clo…

Trong cơ thể luôn tồn tại những hợp chất có khả năng loại bỏ các dạng oxy hoạt động trên, và được gọi là các chất kháng oxy hóa Tiêu biểu là enzym superoxid dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym glutathion peroxydas (GSH – Px), enzym catalas và những phân tử nhỏ như tocopherol, ascobat…

Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng kháng oxy hóa Đó là trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này được gọi là stress oxy hóa Oxy kết hợp với mô, oxy hóa thành phần tế bào và các phân tử sinh học Khi bị stress oxy hóa, các gốc tự do tạo thành có khả năng phản ứng rất cao với các hợp chất sinh học sẽ gây tổn thương mô

Curcuminoid là hợp chất tự nhiên tách từ cây nghệ vàng, có tính chất kháng oxy hóa khá cao, ngăn cản sự tạo thành các gốc tự do như superoxid, hydroxyl…

Cơ chế quá trình kháng oxy hóa của curcuminoid là ngăn cản sự peroxid hóa các lipid trong cơ thể

Phản ứng peroxid hóa lipid là phản ứng dây chuyền và xảy ra theo cơ chế gốc

tự do, gồm các bước sau:

Giai đoạn khơi mào: Dưới tác dụng của các gốc tự do, nguyên tử hydro bị tách

ra khỏi các acid béo chưa bão hòa (lipid)

+

−

→+

−

SOO O

S

RH S

R SH

™ Hoạt tính kháng ung thư

Ung thư là một căn bệnh nan y từ trước đến nay Yêu cầu của thuốc trị ung thư

là ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển

và di căn của ung thư Tuy nhiên nhược điểm chung của đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay là không có sự chọn lọc cao, đều dễ bị lờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng tóc, buồn nôn Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu

Cur là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính[4]. Có tác dụng kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối Kết quả là các tế bào ung thư bị vô hiệu hóa nhưng không gây ảnh hưởng đến tế bào lành tính, đồng thời ngăn ngừa sự hình thành tế bào ung thư mới

Ngoài ra cur còn có tác dụng loại bỏ các men gây ung thư, bắt các gốc tự do gây ung thư Bởi vậy, cur có thể giúp cơ thể vừa phòng ngừa vừa chống ung thư một cách hiệu quả

1.2 Các nghiên cứu về imin và dẫn xuất imin-curcumin

Một trong các hướng nghiên cứu về cur hiện nay là nâng cao khả năng ứng dụng và hoạt tính dựa trên các nguyên tắc sau:

- Tạo phức với các kim loại chuyển tiếp

- Tổng hợp các hợp chất imin

- Encapsule hoá cur

- Tạo các dẫn xuất cur với glucose, glycin, alanin, acid acetic…

Trong các hướng nghiên cứu trên thì các nghiên cứu về các dẫn xuất imin ngày càng thể hiện nhiều tiềm năng cho ngành dược phẩm

J.S.Shim và cộng sự[20] đã tổng hợp được một số dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC) và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC)

Hình 1.15 Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin

Hình1.16: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin

Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BAEC (bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với cur Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào: HT29, NH3T3, Chang

Riêng HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAEC mạnh hơn cur nhưng kém hơn HC HBC có hoạt tính ức chế mạnh lên tế bào HCT15, ở nồng độ 40µM HBC thì hầu như toàn bộ lượng tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48 giờ Tuy nhiên, cũng như HC, HBC không thể hiện hoạt tính ức chế đối với APN (amino peptidase N)

Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy HBC có khả năng cản trở quá trình phát triển của tế bào ung thư ruột kết (ruột già – HCT15 colon cancer cells) bằng cách kết hợp với nhóm chức năng trung gian khác là Ca2+/CaM Ca2+/CaM là một protein

đa chức năng, bản thân nó không có hoạt tính nào đặc biệt nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy nó có liên quan và thường có những biểu hiện bất thường đối với một vài loại tế bào ung thư Vì vậy, nó được xem như một chất mang lý tưởng cho các chất khác trong đó Ca2+ đóng vai trò là cầu nối gắn kết những chất có hoạt tính sinh học với CaM Kết quả nghiên cứu cho thấy HBC có thể gắn trực tiếp lên protein Ca2+/CaM với độ tương thích cao

C Selvam và cộng sự [18] đã tổng hợp một số dẫn xuất imin–curcumin và qua khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này cho thấy dẫn xuất HC và isoxazolcurcumin kháng viêm cao hơn cur tương ứng

Hình 1.17 Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imin từ curcuminoid[18]

Hydrazinocurcumin và 3-Nitrophenylpyprazolcurcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum cao hơn so với cur

Hình 1.18 3-nitrophenylpyrazolcurcumin

Hình 1.19 Hydrazinocurcumin

Curcuminsemicarbazone (CSC) được tổng hợp từ phản ứng thế một nguyên tử oxy của nhóm diceton trong cur bằng nhóm semicarbazone[18] Kết quả nghiên cứu

cho thấy hợp chất này thể hiện hoạt tính chống peroxy hóa lipid của microsome gây

ra bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS tương tự như cur Cả hai chất đều thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa này ở mọi liều sử dụng, điều này chứng

tỏ rằng cấu trúc diceton khi liên kết với các nhóm chức khác vẫn không mất đi hoạt tính sinh học của cur

Hình 1.20 Công thức cấu tạo của curcuminsemicarbazone [13]

Cur thể hiện hoạt tính bắt gốc DPPH nhanh hơn nhiều so với CSC Điều này được lý giải là do có nhóm thế hút điện tử semicarbazone nên làm giá trị thế oxy hóa của nhóm phenolic trong CSC hơn trong cur

Nhóm tác giả Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (Đại học Đà Nẵng) [1] đã tổng hợp thành công dẫn xuất pyrazole giữa phenylhydrazin và cur, dẫn xuất isoxazol giữa hydroxylamin và cur Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế gốc tự

do DPPH của chúng, kết quả cho thấy hai dẫn xuất này đều có khả năng kháng oxy hóa và kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa, B.subtillis, S.aureus Tuy nhiên các hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất này đều kém hơn so với cur

công isoxazolcurcumin (IOZ) và hydrazinocurcumin (HC) từ cur Qua khảo sát các hoạt tính sinh học của 2 dẫn xuất này cho thấy IOZ và HC có tính kháng oxy hóa tương tự như cur Trong đó IOZ và HC có khả năng gây độc cho dòng tế bào ung thư Hep-G2 cao hơn cur riêng HC cho hoạt tính cao gấp 2 lần so với cur

hợp thành công 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC), 2,4- hydrazinocurcumin (DFPHC) từ cur, qua khảo sát hoạt tính sinh học của 2 dẫn xuất

Difuorophenyl-này cho thấy chúng có tính kháng oxy hóa tương đương cur, DFPHC và cur có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào Hep-G2, không gây độc tế bào RD, LU và không làm tăng hoạt tính gây độc đối với 3 dòng tế bào đã khảo sát

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ 2.1: Quy trình thực nghiệm

Từ nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid thương phẩm của Viện Dược Liệu

Kiểm tra độ tinh khiết,

cấu trúc Phân lập curcumin

phần chính Cur, DMC, BDMC Tiến hành phân lập cur bằng 2 bước: Kết tinh bột curcuminoid thương phẩm và sắc ký cột phân lập cur tinh

- Kiểm tra độ tinh khiết của cur tinh bằng TLC

- Tạo các dẫn xuất 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin (3,5-DFPHC) và Fluorophenylhydrazinocurcumin (4-FPHC) Phân lập dẫn xuất bằng sắc ký cột và xác định độ tinh khiết, cấu trúc bằng TLC, NMR, MS

4 Khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất phân lập được

2.2 Phương pháp thực hiện

2.2.1 Phân lập cur

2.2.1.1 Quy trình phân lập cur

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập cur 2.2.1.2 Kết tinh bột curcuminoid thương phẩm

™ Mục đích: loại bỏ nhựa và giảm hàm lượng DMC, BDMC và làm giàu hàm lượng cur

Bột curcuminoid

Sắc ký cột Tinh thể Kết tinh lại

Curcumin tinh

Thời gian 24 giờ, 5oC

- Silica gel 60G, 0.063-0.200mm

- Dm: Diclometan:eter dầu (90:10)

™ Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ:

- Hóa chất: MeOH, nước cất

- Nguyên liệu: Bột curcuminoid thương phẩm

- Dụng cụ: Erlen, lọc hút chân không, bếp điện, nồi, nhiệt kế 100oC, tủ đá

™ Phương pháp:

- Kết tinh lần 1:

cho đến khi hỗn hợp trong, cho nước cất vào hỗn hợp trên (500C) đến khi chuyển sang đục, lắc liên tục khi hỗn hợp trong trở lại thì dừng Để dung dịch nguội ở nhiệt

độ phòng, để kết tinh ở 5oC trong tủ đá khoảng 24 giờ Sau đó lấy ra, tiến hành lọc hút chân không Thu phần trên giấy lọc và tiếp tục kết tinh

- Kết tinh lần 2 và 3: Tiến hành tương tự như lần kết tinh 1

2.2.1.3 Sắc ký bản mỏng (TLC)

™ Mục đích

- Xác định các thành phần có trong bột curcuminoid thương phẩm

- Xác định hệ dung môi chạy cột để phân lập cur tinh

™ Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau

™ Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất

- Nguyên liệu: bột curcuminoid thương phẩm sau khi kết tinh 3 lần

- Dụng cụ: cột sắc ký, hủ bi, vi quản, bản mỏng silica gel 60G, Merck 20x20cm, đèn cồn, bình sắc ký, kẹp, giấy lọc, máy sấy, giá đỡ

- Hóa chất: MeOH, aceton, diclometan, nước, H2SO4 10%

™ Phương pháp:

- Chuẩn bị

ƒ Hoạt hóa bản mỏng silica gel bằng cách sấy 1giờ ở 110oC sau đó để cân bằng trong bình hút ẩm 30 phút

ƒ Kéo ống vi quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa vi quản 3 lần bằng aceton

- Chấm mẫu lên bản mỏng

ƒ Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng metanol

ƒ Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng

ƒ Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 0,7cm hai bờ hai bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 0,6 cm Kích thước của vết chấm vừa phải Vì vậy nên việc lựa chọn dung môi để hòa tan mẫu rất quan trọng

- Triển khai bản mỏng

ƒ Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô

ƒ Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định

ƒ Đặt một tấm giấy lọc vào bình triển khai

ƒ Bão hòa dung môi trong bình triển khai từ 15-20 phút

ƒ Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại

ƒ Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 0,2cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai

ƒ Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi

- Phát hiện vết

ƒ Qua màu sắc tự nhiên

ƒ Phun thuốc thử H2SO4 10% trong H2O rồi hơ nhẹ trên bếp điện

ƒ Qua hơi Iod

Nhận xét và đánh giá các vết trên các bản mỏng để chọn dung môi chạy cột