Đề tài tách collagen từ da cá basa bằng phương pháp hóa sinh

Ở collagen tự nhiên, các chuỗi tropocollagen được định hướng để nhóm NH của liên kết peptid thứ ba của chuỗi này có thể hình thành liên kết hydro với nhóm COOH của liên kết peptid thứ ba

MỤC LỤC

GIỚI THIỆU CHUNG 5

CHƯƠNG I 8

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI 8

1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa 8

1.1/ Tên khoa học của cá basa 8

1.2/ Đặc điểm sinh học 8

1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Việt Nam 8

1.4/ Thành phần hóa học của cá 9

2 Tính chất hoá học của collagen 10

2.1/ Thành phần acid amin của collagen 10

2.2/ Cấu tạo phân tử 12

2.2.1/ Đặc điểm cấu trúc phân tử của collagen (kiểu I) 12

2.2.2/ Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen 13

2.3/ Kiểu liên kết và tính chất của các liên kết ngang trong chuỗi 13

2.3.1/ Liên kết hydro 13

2.3.2/ Các liên kết kỵ nước 16

2.3.3/ Các liên kết ion 16

2.3.4/ Các liên kết cộng hoá trị 16

3/ Các tính chất chức năng của collagen [7], [9] 22

3.1/ Sự liên kết với nước của collagen 22

3.2/ Sự trương nở 24

3.3/ Khả năng tạo nhũ tương 24

3.4/ Sự tạo bọt 24

3.5/ Tính tạo nhớt 25

4/ Ứng dụng của collagen 25

4.1/ Ứng dụng collagen trong thực phẩm 25

4.2/ Ứng dụng collagen trong y dược 26

4.3/ Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm 27

2/ Phương pháp nghiên cứu 30

CHƯƠNG III 32

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

1/ Phân tích nguyên liệu 32

2/ Xử lý da cá bằng NaOH 32

3 Xử lý da cá bằng LasNa 33

4 Xử lý da cá bằng H2O2 33

5 Chiết bằng acid acetic 35

6 Chiết bằng acid acetic và pepsin 38

7/ Xác định đặc tính lý hoá của dịch collagen thu được 41

7.1/ Kết quả phân tích collagen ở dạng tủa 41

7.2/ Xác định phân tử lượng collagen bằng phương pháp điện di 42

7.3/ Phân tích tính chất nhiệt của collagen dạng tủa 42

CHƯƠNG IV 44

KẾT LUẬN 44

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng I.1 Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò 10

Bảng I.2 Thành phần hóa học của cá (%) 10

Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen 10

Bảng I.4: Các loại collagen 11

Bảng III.1: Thành phần da cá Basa nguyên liệu 32

Bảng III.2: Kết quả xử lý da cá bằng NaOH 33

Bảng III.3: Kết quả xử lý da cá bằng LasNa 0.1M (1%) 34

Bảng III.4: Kết quả xử lý da cá bằng H2O2 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình I.1: Sự hình thành tropocollagen và sự kết hợp các tropocollagen thành sợi

collagen 12

Hình I.2: Sự hình thành sợi collagen 13

Hình I.3: Liên kết hydro giữa hai chuỗi gần nhau (A và B) của collagen 14

Hình I.4: Các tương tác liên kết ngang của lysine xảy ra trong môi trường 19

Hình I.5: Các tương tác liên kết ngang của hydroxylysine xảy ra trong môi trường20 Hình I 6 Ảnh hưởng của các anion đơn, đôi và đa hoá trị lên đường cong hydrat hoá theo pH 23

Hình III.1: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất béo theo thời gian xử lý LasNa0.1M (1%) 34

Hình III.2: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/50 35

Hình III.3: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/100 35

Hình III.4: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/50 36

Hình III.5: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/100 36

Hình III.6: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/50 37

Hình III.7: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/100 37

Hình III.8: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/20 39

Hình III.9: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/80 39

Hình III.10: Kết quả chiết collagen ở 17oC, tỷ lệ R/L = 1/20 40

Hình III.11: Kết quả chiết collagen ở 17oC, tỷ lệ R/L = 1/80 40

Hình III.12: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/50 41

Hình III.13:Hình chụp điện di collagen trên SDS-PAGE 42

Hình III.14: đồ thị nhiệt của collagen dạng tủa chụp bằng máy DSC1 43

GIỚI THIỆU CHUNG

Thủy sản là một trong những ngành kinh tế quan trọng nhất của Việt Nam, một nước có đường bờ biển dài trên 3.200 km và một Vùng Đặc quyền Kinh tế (EEZ) có diện tích trên 1 triệu km2 và 1,4 triệu héc-ta diện tích đánh bắt nội đồng gồm sông ngòi, hồ đầm và ruộng cá có thể sử dụng để nuôi trồng thủy sản 600.000 héc-ta tập trung ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long 800.000 héc-ta còn lại nằm ở vùng Đồng bằng sông Hồng phía Bắc và vùng duyên hải Theo số liệu của ngành thủy sản, trên hải phận Việt Nam có khoảng 2.000 loài cá biển trong đó xấp xỉ 130 loài có giá trị thương mại Lượng cá biển ước tính khoảng 4,2 triệu tấn và tổng nguồn tài nguyên có thể phục hồi ước tính khoảng 1,73 triệu tấn Ngành chế biến thủy sản nói chung và ngành sản xuất cá, đặc biệt là sản xuất philê cá thải ra một lượng phế phụ phẩm rất lớn (Ở Việt Nam, chỉ tính riêng phế phụ phẩm từ sản xuất philê cá basa năm 2008 đã lên tới 700.000 tấn) Lượng phế phụ phẩm này ở nước ta

từ trước đến nay chưa được quan tâm sử dụng đúng mức, thậm chí còn bị xem là chất thải Tuy nhiên, ngày nay cùng với sự gia tăng dân số toàn cầu đã kéo theo nguy cơ về cạn kiệt các nguồn tài nguyên, cạn kiệt nguồn nguyên liệu, nhiên liệu cho sản xuất; chính vì vậy cả thế giới đang quan tâm đến vấn đề phát triển bền vững, sử dụng chất thải của ngành sản xuất này làm nguyên liệu cho ngành sản xuất khác Theo hướng này, chất thải thủy sản có thể dùng để làm phân bón, chế biến thức ăn gia súc, làm bao bì sinh học, làm môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp các chế phẩm sinh học, là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất cần thiết cho ngành công

nghệ thực phẩm, dược phẩm,…

Colagen được xem như một loại dược liệu quý giúp kéo dài tuổi thanh xuân cho con người Việc sản xuất colagen có nhiều ý nghĩa lớn đối với ngành thực phẩm, y học và ngành sản xuất mỹ phẩm

+ Trong sản xuất thực phẩm : collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, kẹo,

, là nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng

+ Trong y học: collagen được ứng dụng rộng rãi trong việc chế tạo da nhân tạo

để điều trị những vết bỏng sâu, ứng dụng trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình, làm

liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội,các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm,…

Trên thế giới, việc nghiên cứu về collagen đã tiến hành từ năm 1930 bởi người Đức; thời kỳ đó người ta tách chiết colagen chủ yếu từ da và xương của trâu, bò, lợn Tuy nhiên đến năm 1990 đã bắt đầu một hướng chuyển biến mới: bắt đầu “tách chiết collagen từ da cá” phát minh này của các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk (Ba Lan) đã gây tiếng vang mạnh mẽ trên toàn cầu Trong những năm gần đây nhiều quốc gia như: Mỹ, Đức, Pháp, Ba Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc đã đầu tư hàng triệu đôla vào nghiên cứu thu nhận collagen để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, da nhân tạo, chỉ tự tiêu, thuốc mỡ điều trị bỏng và các sản phẩm làm đẹp như mặt nạ, kem dưỡng da, dầu dưỡng tóc,…

Nhận thấy nhu cầu rất lớn về collagen trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong những năm gần đây, đồng thời việc nghiên cứu tách chiết, sản xuất collagen ở Việt Nam hầu như chưa có, trong khi nguồn nguyên liệu da và xương cá để sản xuất collagen ở nước ta khá dồi dào, ổn định, giá rẻ và có tiềm năng phát triển nên chúng

tôi chọn đề tài “Tách collagen từ da cá basa bằng phương pháp hoá sinh” với

mong muốn tạo ra nguồn nguyên liệu collagen có giá cả phù hợp cung cấp cho các nhà sản xuất trong nước; nâng cao hiệu quả kinh tế cho các ngư dân và nhà sản xuất thủy sản; đồng thời cũng góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu công nghệ tách collagen từ da cá basa

- Thu được collagen thô ở dạng dịch chiết

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập tài liệu, tìm hiểu về cấu tạo, cấu trúc, tính chất, chức năng của collagen cá; các phương pháp tách chiết collagen Các phương pháp xác định đặc tính hoá lý của collagen

- Phân tích nguyên liệu (da cá basa): xác định độ ẩm, độ tro, lipid, hàm lượng

+ Chiết collagen bằng acid acetic

+ Chiết collagen bằng phương pháp kết hợp enzym pepsin và acid acetic

- Xác định một số đặc tính hoá lý của dịch chiết collagen: xác định phân tử lượng bằng SDS-PAGE, xác định nhiệt độ biến tính, hàm lượng tro, hàm lương béo, hàm lượng collagen

CHƯƠNG I

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI

1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa

1.1/ Tên khoa học của cá basa

Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts, cá ba sa thuộc họ Pangasiidae, giống Pangasius, loài P bocourti Trước đây cá Basa được định danh là Pangasius pangasius (Hamilton) (Mai Đình Yên et al., 1992; Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương, 1993), Pangasius nasutus (Blecker) (Kawamoto và cộng sự., 1972)

1.2/ Đặc điểm sinh học

- Về ngoại hình, cá basa rất dễ phân biệt đối với các loài khác trong họ Cá tra Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân Đầu cá basa ngắn hơi tròn, dẹp đứng Miệng hẹp, chiều rộng của miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn, miệng nằm hơi lệch dưới mõm Dải răng hàm trên to rộng và có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại,

có 2 đôi râu, râu hàm tren bằng ½ chiều dài đầu; râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu Răng trên xương khẩu cái là một đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên Có 40-46 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31-36 tia vây Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa

và răng trên xương lá mía ở 2 bên Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng có màu trắng

- Phân bố: Cá Basa phân bố rộng ở Miến Điện, Java, Thái Lan, Campuchia,

Việt Nam

1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Việt Nam

Ở Việt Nam 2 họ chính trong bộ cá trơn được nghiên cứu là họ Pangasiidae và

Clariidae

Họ Pangasiidae có 21 loài thuộc 2 giống: giống Pangasius có 19 loài và giống Helicophagus có 2 loài Có một loài sống trong nước lợ, 2 loài sống ở biển Tính ăn của các loài trong họ Pangasiidae thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của

Hiện nay cá tra và cá ba sa đã được nơi ở hầu hết các tỉnh trong vùng Những năm gần đây , Việc nuôi các loài cá này phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu Đặc biệt từ khi chúng ta hoàn toàn chủ động về giống nhân tạo thì nghề nuôi càng ổn, định và có những bước phát triển vượt bậc Thế nhưng do phát triển một cách tự phát nên khủng hoảng thừa cá nguyên liệu, cả người nuôi lẫn doanh nghiệp chế biến xuất khẩu đều gặp khó khăn Đến 6 tháng đầu năm 2008 nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL đều tăng cả về diện tích, sản

lượng và năng suất bình quân/ha (Nguồn VOH, 29/06/2008)

1.4/ Thành phần hóa học của cá [5]

Thành phần hóa học gồm: nước, protein lipid, muối vô cơ, vitamin Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống, Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là ở cá nuôi Các yếu tố này có thể kiểm soát được trong chừng mực nào đó Các thành phần cơ bản của cá và động vật có vú có thể chia thành những nhóm có cùng tính chất

Bảng I.1 Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò

Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh

hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, việc bảo quản tươi nguyên

liệu và qui trình chế biến Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự

khác nhau

Bảng I.2 Thành phần hóa học của cá (%)

Thành phầnChỉ tiêu Nước Protein Lipid Muối vô cơ

Thịt cá 48 – 85,1 10,3 – 24,4 0,1 – 5,4 0,5 – 5,6

2/ Tính chất hoá học của collagen

2.1/ Thành phần acid amin của collagen

Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen [7]

Thành phần

Cá (phi lê) Tối thiểu thường Thông Tối đa Thịt nạc bò

• Phân loại collagen

Bảng I.4: Các loại collagen [8]

Loại collagen Cấu tạo của chuỗi Phân bố

I (α1(I))2α2(I), trimer (α1(I))3 Da, gân, xương, giác mạc, men răng, sụn,

Giác mạc, xương, mạch máu, sụn, nướu răng

VI α1(VI) α2(VI) α3(VI) Da, cơ tim

VIII Chưa biết Tạo ra từ tế bào màng trong

X (α1(X))3 Sụn

XI α1(XI) α2(XI) α3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh

2.2/ Cấu tạo phân tử [6]

2.2.1/ Đặc điểm cấu trúc phân tử của collagen (kiểu I)

Hình I.1: Sự hình thành tropocollagen và sự kết hợp các tropocollagen thành sợi collagen

- Collagen có cấu trúc bậc 4, M = 300.000 Da, l = 300nm, d = 1.5 nm

2.2.2/ Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen

- Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định Khoảng trống-gap: 40nm; khoảng sole: 67nm

Hình I.2: Sự hình thành sợi collagen

2.3/ Kiểu liên kết và tính chất của các liên kết ngang trong chuỗi [1],[2],[3],[4],[7] 2.3.1/ Liên kết hydro

Được biết hydro liên kết cộng hoá trị với một chất cho điện tử (ví dụ N, O)

có thể hình thành liên kết yếu thứ hai với nguyên tử tích điện âm khác (chất nhận) Sau đó được gọi là liên kết hydro Những kiểu thông thường của liên kết hydro trong protein là giữa các nguyên tử NH…N, NH…O; và OH…O của acid amin, chúng chứa một lượng năng lượng khoảng 3-5kcal/mole (Ramachandran, 1968)

Hình I.3: Liên kết hydro giữa hai chuỗi gần nhau (A và B) của collagen

Các liên kết này rất cần cho sự ổn định cấu trúc bậc hai và gắn kết các phân

tử collagen (Harrington, 1964); vì thế chúng giữ ổn định hình dạng phân tử protein

ở một dạng đặc biệt Ở collagen tự nhiên, các chuỗi tropocollagen được định hướng

để nhóm NH của liên kết peptid thứ ba của chuỗi này có thể hình thành liên kết hydro với nhóm COOH của liên kết peptid thứ ba của chuỗi bên cạnh Điều đáng chú ý là các liên kết peptid imino (xoay quanh pyrrolidine) khuyết một nguyên tử hydro, không thể hình thành liên kết hydro nội phân tử làm bền cấu trúc xoắn α (Veis, 1964), mặc dù một liên kết hydrogen nội phân tử có thể được tạo thành giữa nhóm OH của một hydroxyproline còn lại trên chuỗi peptid và nhóm COOH của chuỗi bên cạnh (Gustavson, 1956) Tuy nhiên, những quan điểm khác nhau về số liên kết hydro trong collagen Rich và Crik (1961) bàn luận theo hướng “cấu trúc liên kết đơn”, nghĩa là chỉ có một liên kết hydro cho mỗi đoạn ba liên kết peptid (Traub, 1969), Trong khi đó Ramachandran và cộng sự (1962) cho rằng “ cấu trúc hai liên kết”, nghĩa là có hai liên kết hydro cho mỗi đoạn ba liên kết peptid Hình I.12 mô tả cấu trúc “một liên kết” và “hai liên kết”

Ramachandran và Chandrasekaran (1968) đưa ra lựa chọn cấu trúc “hai liên kết” trung hoà hai quan điểm bằng cách chỉ ra rằng một liên kết hydrogen liên kết trực tiếp với chuỗi polypeptid bên cạnh còn một liên kết hydrogen khác tạo thành qua một phân tử nước Ngược với cấu trúc “ hai liên kết”, nhóm OH của hydroxyproline được xem như thể hiện hai chức năng: một là hình thành liên kết hydro với phân tử nước để gia tăng tính bền của sợi protofibril ba chuỗi, liên kết hydro còn lại (liên kết ngang) giữa một chuỗi xoắn bộ ba với một chuỗi xoắn bộ ba

kế bên (Hình I.12c) Cấu trúc hai liên kết xem ra thích hợp nhất so với minh chứng thực nghiệm (Harrington, 1964; Berendsen, 1972; Yee và cộng sự, 1974; Suzuki và cộng sự, 1980) Nó cũng cho thấy thêm nhóm 4-OH của hydroxyproline ở vị trí Y của (Gly-X-Y)n là cấu hình đối xứng với nhóm COOH của hydroxyproline để thể hiện những chức năng này (Schubert và Hamerman, 1968; Ramachandran và Ramakrishnan, 1976)

Salem và Traub (1975) cũng đề nghị gộp cả glutamine vào sự hình thành cầu nối hydrogen trong vùng xoắn ốc của các chuỗi α Theo họ, glutamine ở vị trí Y

2.3.2/ Các liên kết kỵ nước

Mặc dù các acid amin không phân cực glycine và alanine chiếm gần 44% phân tử collagen, tuy nhiên chúng góp phầm rất nhỏ vào tương tác van der Waals (liên kết kỵ nước) phụ thuộc vào các nhóm bên rất nhỏ (Veis, 1964) Ngược lại, một

số nghiên cứu đã chỉ ra tương tác kỵ nước thích hợp giữa các acid amin propyl cạnh nhau trên các chuỗi khác nhau (Segal,1969; Yonath và Traub, 1969) Tuy nhiên, các nhóm bên của các acid amin không cực khác có thể hình thành liên kết kỵ nước bên trong và giữa các phân tử (Schnell, 1968; Heidemann và Hill, 1969) trong đoạn không phân cực (vùng giữa các chuỗi) của chuỗi α (Schubert và Hamerman, 1968) Người ta cho rằng chuỗi α2 chứa nhiều acid amin kỵ nước hơn chuỗi α1 Thật vậy,

sự hình thành chuỗi góp phần đáng kể vào tính chất kỵ nước của collagen kiểu I (Fietzek và Kuhn, 1976) Hơn nữa, phản ứng tối đa ở vùng có cực và không có cực của các phân tử liền kề thì thích hợp với kiểu xếp xen kẽ xung quanh trục (D=233 acid amin) bên trong sợi cơ Vì thế, cả lực tĩnh điện và tương tác kỵ nước đều quan trọng trong sự kết hợp các phân tử collagen vào các sợi cơ

2.3.3/ Các liên kết ion

Các liên kết muối (dạng ion) được xem như không quan trọng về việc ổn định cấu trúc collagen so với liên kết hydro (Weir và Carter, 1950), nhưng Weinstock và cộng sự (1967) cho rằng hầu hết các vị trí ion hình thành các liên kết muối bên trong và giữa các phân tử Chẳng hạn như, Salem và Traub (1975) cho rằng arginine ở vị trí Y có liên quan đến tương tác tĩnh điện với acid glutamic ở vị trí X của chuỗi bên cạnh

2.3.4/ Các liên kết cộng hoá trị

a/ Các liên kết disulfide

Các liên kết disulfide (-S-S-) giữa các chuỗi được tìm thấy ở đầu C tận cùng của vùng peptid dạng khối cầu (được gọi là chuỗi Pc- α) của chuỗi α procollagen của tất cả các dạng Nhưng, chuỗi Pc bị phân tách bởi enzym trước khi phân tử procollagen bị giấu vào trong vùng ngoại bào (Martin và cộng sự, 1975; Bornstein

và Traub, 1979) Do đó, các liên kết disulfide không hiện diện trong kiểu collagen I

và II do không có cystein trong chuỗi tropocollagen Tuy nhiên, các liên kết disulfide giữa các chuỗi đã được tìm thấy ở vùng xoắn của collagen kiểu III (Harwood, 1979) và trong vùng không xoắn glycoprotein ( vùng tận cùng) của

collagen kiểu IV (Kefalides, 1973) Cả hai kiểu collagen này chứa một lượng đáng

kể cystein)

b/ Các liên kết ngang giữa lysine và hydrolysine

Hiện nay có rất nhiều tài liệu về liên kết ngang cộng hoá trị giữa các chuỗi (giữa các phân tử) ở các kiểu collagen khác nhau bắt nguồn từ phản ứng aldehyde,

từ phản ứng oxy hoá deamin của nhóm ∈- NH2 của lysine và hydroxylysine (Tanzer, 1973, 1976; Bailey, 1969, 1974; Gallop và Paz, 1975) Các acid amin lysine và hydroxylysine ở cả hai vùng tận cùng của chuỗi α1(I) và vùng đầu N tận cùng của chuỗi α2 có thể bị oxi hoá thành α-aminoadipic acid δ-semialdehyde (Traub và Piez, 1971; Stark và cộng sự, 1971ª; Gallop và cộng sự, 1972) Điều này xảy ra bằng cách oxi hoá khử nhóm amin của nhóm ∈- NH2 của lysine và hydroxylysine bằng một ion Cu phụ thuộc enzym oxi hoá lysine (Siegel, 1974, 1979) Kết quả hợp chất carbonyl sau khi phản ứng với nhóm ∈- NH2 của lysine hay hydroxy hoặc glycosylate của hydroxylysine có ở phân tử bên cạnh Các liên kết ngang nội phân tử được hình thành bởi một chuỗi aldimine hay ketoimine ( dạng Schiff) và phản ứng ngưng tụ aldol, dẫn tới hình thành tính bền cao của hợp chất pyridinium chẳng hạn như desmosine và isodesmosine (Gallop và cộng sự, 1972; Robins và cộng sự, 1973; Bailey và cộng sự, 1974; Tanzer, 1976); số lượng của chúng tăng theo tuổi của động vật

Các liên kết ngang này được xác định bằng một phản ứng giảm nhẹ sợi cơ collagen bằng borohydride, chất này làm bền các liên kết và làm tách riêng các liên kết acid amin thích hợp Tuy nhiên, Bailey và cộng sự (1974) cho rằng việc xác định các hợp chất này bằng cách xử lý collagen bằng borohydride có thể không đưa ra những minh chứng cần thiết về các dạng không bị cắt giảm của chúng hoạt động như các liên kết nội phân tử trong cơ thể sống, bởi vì phản ứng ngưng tụ ban đầu dễ xảy ra trong điều kiện ít kiềm

Dựa vào trình tự các acid amin trên chuỗi α1 (I), người ta cho rằng đầu C tận cùng của lysine có thể phản ứng với hydroxylysine ở vị trí 87 và với lysine ở vị trí 327, trong khi đó nhóm amin đầu N tận cùng chỉ hình thành một liên kết với hydroxylysine ở vị trí 927 Một liện kết side –to-side chỉ là kết quả của phản ứng

acid δ-semialdehyde) với các nhóm chức năng khác của acid amin qua một loạt các

cơ chế phức tạp (Hình I.13 và I.14)

Nhóm 1 Hydroxylysinonorleucine: Những liên kết ngang này có thể phát triển qua hai phản ứng: phản ứng thứ nhất, do sự ngưng tụ hydroxylysine và α-aminoadipic acid δ-semialdehyde; phản ứng thứ hai, do sự ngưng tụ của lysine và δ-hydroxy α-aminoadipic acid δ-semialdehyde Các liên kết được phát hiện đầu tiên bởi Bailey và Peach (1968) ở collagen nguồn gốc từ gân bê và chuột Sau này nhiều nghiên cứu chứng minh các liên kết này được tìm thấy ở da (Franzblau và cộng sự, 1970; Tanzer và cộng sự, 1970; Bensusan, 1972; Bailey và Lapiere, 1973) Trong trường hợp da bê, hydroxylysine và α-aminoadipic acid δ-semialdehyde chủ yếu xoay quanh liên kết ngang (Tanzer và Mechanic, 1970; Nicholls và Bailey, 1980)

Nhóm 2 Lysinonorleucine: Các liên kết lysinonorleucine đã được biết trong collagen của da một số loài khác (Bailey, 1970; Kang và cộng sự, 1970; Mechanic

và Tanzer, 1970; Bensusan, 1972), gân (Shimokomaki và cộng sự, 1972; Cannon và Davison, 1973) và màng sừng (Tanzer và Kefalides, 1973)

Nhóm 3 Dihydroxylysinonorleucine: sự xuất hiện của các liên kết ngang trong collagen tạo thành từ xương và ngà được Bailey và cộng sự đưa ra năm 1969; David và Bailey (1971) xác định cấu trúc thực của nó Các nghiên cứu sau này công

bố sự hiện diện của các liên kết ngang trong collagen của da và gân (Mechanic và cộng sự, 1971; Bensusan, 1972; Eyre và Glimcher, 1972; Forrest và cộng sự , 1972; Bailey và Lapiere, 1973)

Nhóm 4 Aldol histidine: Sự có mặt của các liên kết ngang aldol histidine đã được thừa nhận trong da bò và màng sừng mà không có ở các loại collagen khác (Fairweather và cộng sự, 1972; Tanzer và cộng sự, 1973b) Kiểu này của liên kết không bị làm yếu thì rất dễ bị phá huỷ trong acid (Kang và cộng sự, 1970; Davison

và cộng sự, 1972; Robins và Bailey, 1973b, 1975)

Nhóm 5 Hydroxyaldol histidine: Housley và cộng sự (1975) đã công bố sự

có mặt của các liên kết hydroxyaldol histidine trong collagen, chúng không bị làm yếu và rất bền vững Chúng liên quan đến sự ngưng tụ của allysine, hydroxylysine

và histidine (Tanzer và cộng sự, 1973b)

Nhóm 6 Hydroxypyridinium: gần đây, Eyre và Oguchi (1980) đã xác định các liên kết ngang hydroxypyridinium trong khung collagen Sự hình thành các liên kết ngang xoay quanh hai aldehyde ở giữa, tạo thành từ acid amin hydroxylysine

Hình I.5: Các tương tác liên kết ngang của hydroxylysine xảy ra trong môi

trường

Trong số những hợp chất chỉ có hydroxylysinonorleucine và dihydroxylysinonorleucine được tách ra từ collagen với lượng đáng kể Hàm lượng của chúng trong collagen dường như liên quan đến mức độ lysine hydroxylation trong vùng đầu N và C của các chuỗi α (Balazs, 1977) Thực ra, các liên kết ngang, bắt nguồn từ lysine và hydroxylysine, được phân phối với lượng lớn trong collagen

ở các mô và các loài khác nhau (Hall, 1976) Một số mô bào chỉ chứa một kiểu liên kết ngang, một số chứa hai liên kết ngang, một số khác chứa nhiều hơn tuỳ thuộc vào thành phần của chuỗi α (Bailey và Robins, 1976) Một ví dụ của sự quan sát có thể là mức độ hydroxy hoá của acid amin lysine và sự gần nhau của các nhóm phản ứng ở chuỗi peptid xa đầu tận cùng của các chuỗi α khác nhau có thể xác định bản chất của các liên kết ngang

Dường như các aldehyde, được tạo thành bởi sự oxy hoá lysyl, có liên quan đến hai kiểu liên kết ngang chủ yếu Kiểu thứ nhất, liên kết nội phân tử có thể tạo thành các chuỗi α bằng sự ngưng tụ aldol Kiểu thứ hai, các liên kết ngang nội phân

tử được tạo thành chủ yếu bàng tương tác Schiff base giữa aldehyde bắt nguồn từ lysine, hydroxylysine hoặc glycosylated hydroxylysine và nhóm ∈- NH2 của lysine, hydroxylysine hoặc glycosylated hydroxylysine khác (Bailey và cộng sự, 1974) Nhìn chung các dạng Schiff đều không bền, nhưng các liên kết bền hơn phát triển (dựa trên sự thay đổi các liên kết đôi) trong sự hình thành các chất dẫn xuất keto Hơn nữa các phản úng dehydration và oxidative và sự hình thành dạng phức với imidazole của histidine ở dạng cấu trúc rất bền Nó cũng cho thấy các liên kết ngang bắt nguồn từ hydroxylysine thì bền hơn các liên kết hình thành từ lysine (Bailey và cộng sự 1977; Miller và Robertson, 1973) Tuy nhiên, nhiều thông tin về bản chất hoá học của các liên kết ngang được bắt nguồn từ các nghiên cứu trên mô khác với

cơ Vẫn còn rất ít thông tin về tính chất hoá học của các liên kết ngang trong cơ

Tóm lại, sự gia tăng độ bền cơ học và sự giảm dần độ hoà tan của các mô collagen trong dung môi nào đó với sự gia tăng từ từ ở các liên kết ngang nội phân

tử Cơ chế của sự thay đổi này rất phức tạp, liên quan đến nhiều biến số như các tương tác không hoá trị, dehydration, quy mô của glycosylation, khối phân tử và vị trí, số lượng và cấu trúc hoá học của các liên kết ngang (Tanzer, 1976) Sự hỗn loạn

tác của homocystein với nhóm aldehyde của các chuỗi polypeptide (Kang và Trelstad, 1973)

3/ Các tính chất chức năng của collagen [7], [12]

3.1/ Sự liên kết với nước của collagen

- Về mặt sinh lý học, phân tử collagen giữ nước ở hai dạng: dạng liên kết (dạng bảo vệ) và dạng tự do hay dạng có hoạt tính sinh học (Hamm, 1975; Fennema, 1976)

- Sự hydrate hóa collagen xảy ra là do các nhóm chức ưa nước (NH2, COOH,…) ở mạch bên của chuỗi polypeptid liên kết với nước

- Khả năng liên kết với nước của các acid amin khác nhau được Kuntz xác định năm

1975 bằng máy cộng hưởng từ hạt nhân Kultz đã đưa ra phương trình sau để ước tính lượng nước liên kết dựa vào sự tồn tại của các acid amin trong phân tử protein:

A = fc + 0.4 fp + 0.2fn

- Với A là số gam nước liên kết trên 1 gam protein

- fc, fp, fn là tỷ lệ các acid amin tích điện, phân cực và không phân cực

a Ảnh hưởng của pH

Nhiều loại liên kết hoá học và lực khác nhau quyết định cấu hình không gian

và cấu tạo của protein Sự thay đổi hình thể protein là do sự mở rộng cấu trúc xoắn,

có thể xem như bắt nguồn từ năng lượng tự do của các lực theo phương trình sau:

UFounf = Fob + Fox + FoH + FoHO+ Focomb + Foelect

Với UFounf là năng lượng tự do chuẩn cho sự mở rộng cấu trúc protein Fob, Fox , FoH , FoHO, Focomb và Foelect lần lượt là năng lượng tự do của

sự gia tăng trục xoắn, của các liên kết ngang cộng hoá trị, của liên kết hidro, của liên kết kỵ nước, của sự kết hợp của chuỗi xoắn ngẫu nhiên với dung môi và của liên kết tĩnh điện

Trong phương trình trên, ngoại trừ Fob, Fox không phụ thuộc pH vì không chứa các nhóm có khả năng ion hoá Các thông số còn lại trong phương trình đều phụ thuộc rất nhiều vào pH Do đó có thể điều khiển các tác động thông qua sự thay đổi nồng

độ ion H+ và OH- trong pha phân tán của protein