8: Lượng nguyên bào sợi tăng sinh của các mẫu thử nghiệm khảo sát trong thời gian 24 giờ.... Nanocomposite trên được hòa tan trong nước cất lạnh cho các thử nghiệm như đo kích thước hạt
Trang 1Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ii
DANH MỤC HÌNH iii
DANH MỤC BẢNG iv
CHƯƠNG 1: THỰC NGHIỆM 1
1.1 THỰC NGHIỆM 1
1.1.1 Hóa chất 1
1.1.2 Thiết bị và dụng cụ 1
1.1.3 Thực nghiệm 1
CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ 1
2.1 ĐẶC TÍNH NHẠY NHIỆT CỦA COPOLYMER GHÉP CHITOSAN- PLURONIC F127 1
2.2 KẾT QUẢ MANG, NHẢ NANOCURCUMIN CỦA HYDROGEL NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127 4
2.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA VẬT LIỆU LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI 7
2.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHỮA LÀNH VẾT THƯƠNG 9
CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 11
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 2Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ICP-AES Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy
Trang 3Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2 1: chuyển hóa sol-gel của dung dịch chitosan-pluronic ở 10oC và 37oC 1Hình 2 2: Giản đồ pha thể hiện sự tương quan giữa nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C, 45°C và 50°C) và nồng độ các mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với lượng khác nhau (wt/ wt) của F127 và lượng không đổi của chitosan (CS) 3Hình 2 3: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của G’ và G’’ trong dao động nhiệt với tần số và biên độ không đổi của mẫu F7 nồng độ 15% wt/v 4Hình 2 4: Dạng sol-gel của chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) 5Hình 2 5: Kết quả TEM của hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) 5Hình 2 6: Khả năng giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) trong môi trường PBS 6Hình 2 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu
xử lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127 7Hình 2 8: Lượng nguyên bào sợi tăng sinh của các mẫu thử nghiệm khảo sát trong thời gian 24 giờ 8Hình 2 9: Hình ảnh theo dõi quá trình chữa lành vết bỏng và đồ thị đánh giá
độ co vết thương 9Hình 2 10: Kết quả nhuộm hóa mô Hematoxyline&Eosin của: a) Mô thường, b) mô chữa với Biafine và c) mô chữa với hydrogel composite 10
Trang 4Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2 1 Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển đổi từ gel sang dung dịch và ngƣợc lại 2
Trang 5Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page 1
1.1.2 Thiết bị và dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: lọ nhỏ có nắp kín, becher, bình cầu 2 cổ, becher
50ml
- Nhiệt kế
- Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G (4 số lẻ)
- Máy khuấy từ gia nhiệt
- Máy cô quay chân không
- Túi thẩm tách Por 7 Regenerated Cellulose Membrane, MWCO:
12.000-14.000 D được mua của Aldrich
1.1.3 Thực nghiệm
1.1.3.1 Đánh giá đặc tính nhạy nhiệt của copolymer
Copolymer ghép được hoà tan hoàn toàn trong nước cất (5, 8, 10, 12,
15 và 20% w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của copolymer ghép bằng phương pháp khảo sát sự chảy của chitosan-pluronic F127 hydrogel ở các nhiệt độ: 4, 25, 30, 37 và 40oC Khả năng nhạy nhiệt của chitosan-pluronic F127 hydrogel khi có sự thay đổi của nhiệt độ được xác định thông qua phép đo lưu biến (HAAKE RheoStress 6000) Phương pháp đo biến
Trang 6Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page 2
dạng dao động theo nhiệt độ này được sử dụng có thể cho biết chính xác nhiệt
độ chuyển pha của hydrogel
1.1.3.2 Thực nghiệm mang, nhả nanocurcumin của hydrogel nhạy nhiệt
70 trong 15 phút Sau đó dung dịch phía trên đem đi cô quay để loại bỏ dung môi và được đông khô để thu mẫu nanocomposite Dung dịch curcumin trong cồn tuyệt đối với nồng độ 100mM được nhỏ giọt vào copolymer ( CS:F127 = 1: 15) 15% trong hỗn hợp dung dịch nước và cồn (9:1 v/v) dưới điều kiện siêu
âm với tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 trong 15 phút Sau đó dung dịch phía trên đem đi cô quay để loại bỏ dung môi và được đông khô để thu mẫu nanocomposite [1] Nanocomposite trên được hòa tan trong nước cất lạnh cho các thử nghiệm như đo kích thước hạt nanocurcumin, hiệu quả nhả chậm curcumin, khả năng tăng sinh nguyên bào sợi và đánh giá hiệu quả chữa lành vết bỏng (cấp độ 2) Hình thái học của Curcumin đã được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEM-1400 JEOL) ở 25°C Lượng nano curcumin mang trong copolymer được phân tích gián tiếp thông qua phổ UV-visible spectroscopy (Agilent 8453 UV-visible spectrophotometer) tại bước sóng 420 nm Các nano curcumin tinh khiết đã được chuẩn bị trong ethanol tuyệt đối trong khoảng nồng độ 1-10 mg / ml để thiết lập một đường cong chuẩn [2]
chitosan-pluronic F127/ nanocurcumin
Cur được nhả từ hidrogel chitosan-pluronic/nanoCur được xác định bằng máy quang phổ UV Agilent 8453 Hòa tan hidrogel chitosan-pluronic/nano Cur với nồng độ 2mg/ml, rồi cho vào 3 màng thẩm tách MWCO 12.000 D -
Trang 7Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page 3
14.000 D mỗi màng 2 ml Tiến hành thẩm tách trong đệm PBS (10 ml) Lấy mẫu dung dịch thẩm tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 ml trong 0 giờ, 0.25 giờ, 0.5 giờ, 1-6 giờ Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung dịch thẩm tách bên ngoài màng và thêm vào lượng đệm PBS tương ứng ban đầu là 10 ml, cách xác định lượng nCur nhả ra theo báo cáo của Kailas D.Thakker [3]
1.1.3.3 Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vật liệu lên khả năng tăng
sinh nguyên bào sợi
Hydrogel đông khô được ngâm trong 1 ml (15%) Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) và ủ ở 37°C trong 24 h Các nguyên bào sợi được gieo khoảng 3x104 tế bào mỗi giếng trong đĩa 24 giếng và được ủ qua đêm trước khi được xử lý với các hydrogel như đã chuẩn bị trước Sau đó, các tế bào được cố định với dung dịch axit tricloaxetic 50% (w/v) lạnh trong 2 giờ, rửa sạch, và nhuộm với 0,2% (w/v) sulforhodamin B (SRB) trong 20 phút Sau
5 lần rửa với axit axetic 1% Thuốc nhuộm gắn với protein được hòa tan trong
10 mM dung dịch Tris bazơ và được ghi lại trên một đầu đọc microplate ở bước sóng hấp thụ 620 nm Dựa trên những đường cong chuẩn đã được tạo ra bởi số lượng khác nhau của các nguyên bào sợi, tính toán được số lượng nguyên bào sợi trên các mẫu
Thí nghiệm tiến hành với 3 nhóm nghiệm thức: (a) đối chứng; (b) xử lý với CS-F127; (c) xử lý với nCur-CS-F127 Quá trình thực nghiệm được khảo sát tại Bộ môn Công nghệ sinh học Y Sinh, Khoa Công nghệ Sinh học Đại học Quốc Tế, Tp.HCM
1.1.3.4 Thực nghiệm đánh giá hiệu quả chữa lành vết thương
Đánh giá hiệu quả chữa lành vết thương bỏng trên mô hình chuột nhắt trắng được gây bỏng nhân tạo Chuột nhắt trắng (Mus musculus Var albino)
có trọng lượng 28 – 30g, cung cấp từ của Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh, được nuôi ổn định trong 1 tuần Cạo sạch lông chuột ở vùng lưng và gây mê bằng hốn hợp thuốc mê Ketamine và nước (tỷ lệ 1,5:1,5) với liều lượng 0.02ml/g trọng lượng cơ thể chuột, rồi gây bỏng nhiệt ướt (độ 2) bằng thanh kim loại (1cm x 1cm) nung nóng trong nước Sau 48 giờ gây bỏng, cắt
Trang 8Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page 4
lọc hoại tử ở vết thương bỏng (nếu có) Tiến hành thí nghiệm với 4 nhóm nghiệm thức: (i) đối chứng (để lành tự nhiên); (ii) phun dung dịch CS-F127 copolymer; (iii) Phun dung dịch nCur-CS-F127; (iv) bôi kem điều trị bỏng độ
2 thương mại (Biafine, Janssen, France) Quá trình thử nghiệm và theo dõi tiến trình lành hóa, đánh giá mô học vết thương bỏng ở chuột sau 14 ngày khảo sát tại Bộ môn Sinh lý động vật–Khoa sinh ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM
Trang 9Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
Hình 2 1: chuyển hóa sol-gel của dung dịch chitosan-pluronic ở 10oC và 37o
C Mẫu F7 và F8 có gel hình thành tốt ở nhiệt độ của cơ thể con người (37oC), tuy nhiên mẫu F8 với tỷ lệ chitosan/ pluronic là 1:20 cho thấy gel có thể hình thành ở nhiệt độ 25oC Như vậy, nhiệt độ tạo gel càng thấp khi tăng hàm lượng pluronic F127 Bên cạnh đó, khi giảm nhiệt độ, mẫu gel này cho thấy sự thoái biến bởi nhiệt Đặc tính đảo ngược trạng thái sol-gel theo nhiệt độ môi trường của gel này cho thấy tiềm năng trong định hướng trong việc nghiên cứu lớp màng polyme sinh học Kết quả khảo sát chuyển trạng thái sol-gel theo nồng
độ và nhiệt độ (hình 2 6) cho thấy mẫu F7 có thể tạo gel ở nồng độ copolymer khá thấp (trên 10% wt/v) tại khoảng nhiệt độ 32-37oC
Trang 10Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
Bảng 2 1 Khảo sát nhiệt độ tạo gel của copolymer ghép và khả năng chuyển
đổi từ gel sang dung dịch và ngƣợc lại
NPC-4oC 25oC 33oC 37oC 40oC 50oC
Khả năng chuyển pha sol-gel
( -: không có khả năng tạo gel; +: tạo gel yếu; ++: tạo gel khá tuy nhiên gel chƣa đặc lại hoàn toàn; +++: tạo gel tốt,
gel đông đặc không chảy khi đặt nghiêng)
Trang 11Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
Hình 2 2: Giản đồ pha thể hiện sự tương quan giữa nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C, 45°C và 50°C) và nồng độ các mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với lượng khác nhau (wt/ wt) của F127 và lượng không đổi của chitosan (CS)
Để có kết luận chính xác về quá trình chuyển pha của chitosan-pluronic F127 hydrogel, phương pháp đo lưu biến học bằng cách đo sự thay đổi của modul tích G’ và modul thoát G’’ theo nhiệt độ dao động từ 4oC đến 45oC với tần số và biên độ cố định Như số liệu thể hiện ở hình 3 8, ở tần số không đổi
là 1Hz, giá trị G’ tăng dần, điều này có nghĩa là khi nhiệt độ tăng lên, các liên kết hydro trong mạch chitosan-pluronic F127 bị phá vỡ và hệ bị hỗn loạn cấu trúc mạch ngang hệ quả là giá trị G’ tăng dần Mặt khác giá trị G’ tăng dần còn cho thấy độ cứng của vật liệu cũng tăng dần hay có thể nói hệ chitosan-pluronic F127 cho phép truyền ứng xuất hiệu quả trong trạng thái nghỉ Mặt khác giá trị G’’ trong khoảng nhiệt độ từ 4oC đến dưới 30oC có xu hướng giảm dần biểu thị cho sự chảy nhớt và độ linh động của phân tử giảm dần Nguyên nhân có thể do mạch sườn chitosan làm giảm lớp hydrat hóa bao quanh các phân tử pluronic trong dung dịch nước, làm phân tán chúng và kết quả là độ tan của copolymer giảm dần [6] Thêm vào đó, ở gần nhiệt độ tạo gel, giá trị G’’ tăng lên nhanh chóng, năng lượng của hệ thoát ra càng nhiều, sự chảy nhớt
Trang 12Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
và độ linh động càng tăng nên các chuỗi kỵ nước trên pluronic F127 có xu hướng quy tụ lại tạo thành các mắt xích trong mạng lưới liên kết, tạo thành hệ hỗn loạn Tại nhiệt độ gel được hình thành, năng lượng của hệ mất đi cao nhất tức là giá trị G’’ đã chạm ngưỡng tối đa Ở nhiệt độ thấp giá trị G’’ >> G dẫn đến góc 45o < δ < 90o hay giá trị tan δ >> 1, điều này có nghĩa vật liệu đang ở trạng thái dung dịch đàn hồi nhớt hay ở trạng thái lỏng Bắt đầu từ 30oC, cả hai giá trị cùng đồng thời tăng và tại điểm 35oC hai giá trị này gần như bằng nhau (G’= 501.992 Pa và G’’= 502.125) Như vậy điểm gel của chitosan-pluronic F127 (nồng độ 15%) được ghép ở tỷ lệ 1:15 được xác định tại 35oC, điểm này rất thích hợp cho các ứng dụng y sinh sau này vì nhiệt độ cơ thể con người bình thường dao động khoảng 37oC Hệ hydrogel trên có thể phù hợp cho việc phát triển một hệ chất mang thuốc trong chữa lành vết thương ngoại-nội mô
Hình 2 3: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của G’ và G’’ trong dao động nhiệt với tần số và biên độ không đổi của mẫu F7 nồng độ 15% wt/v
HYDROGEL NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127
nCur đã được chuẩn bị theo phương pháp ướt trong ethanol tuyệt đối thay vì sử dụng dichloromethane thông thường Dung dịch Cur trong ethanol được thêm từng giọt vào dung dịch copolymer Chitosan-g-Pluronic (CS: F127 với tỷ lệ 1:15 về khối lượng) Quá trình thí nghiệm sử dụng siêu âm (tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 trong 15 phút) nhằm mục đích nâng cao hiệu
Trang 13Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
quả phân bố Cur vào copolymer Chitosan-g-Pluronic [1] Với mục đích điều trị bỏng, trong báo cáo này chúng tôi khảo sát và điều chỉnh hàm lượng Cur được mang khoảng 0.5% trọng lượng hidrogel, với hàm lượng Cur cao hơn 0.75% (wt/wt), Cur sẽ ức chế nguyên bào sợi phát tiển, theo báo cáo của Kang
JY [7]
Hình 2 4: Dạng sol-gel của chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) Cur sau khi được phân bố vào copolymer CP là một màu vàng trong suốt, đồng nhất (Hình 2.9) Bên cạnh đó, kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình 3.10) phân tích cho thấy các hạt nCur phân bố trong dung dịch hidrogel chitosan-pluronic với kích thước khoảng 8-23 nm cho thấy Cur phân bố đều
và tan tốt trong dung dịch nước Điều đặc biệt ở đây là không có sự khác biệt
về nhiệt độ gel thể hiện qua sự chuyển pha Sol-Gel của copolymer CP và copolymer CP/nCur ở nhiệt độ 25°C và 35°C (Hình 2.9)
Hình 2 5: Kết quả TEM của hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1)
Trang 14Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
Khảo sát khả năng nhả Cur in vitro từ hidrogel
chitosan-Fluronic/nanoCur trong môi trường phosphate-buffered saline (PBS) (pH = 7,4) được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp khuếch tán với màng thẩm tách sinh học MWCO 12.000 D - 14.000 D Lượng Cur được nhả từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur được xác định bằng máy quang phổ UV Agilent
8453
Hình 2 6: Khả năng giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel
chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) trong môi trường PBS
Kết quả thử nghiệm in vitro chứng minh khả năng nhả chậm Cur từ
hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (Hình 2.11) Sau 2 giờ, 56.98 ± 0.001% nCur đã được nhả từ hidrogel này Từ 2-6 h, nCur đã được nhả ra với một tốc
độ không đổi Theo một số báo cáo, hidrogel chitosan-Fluronic sẽ trương phồng trong môi trường sinh lý cơ thể Do đó, cho phép sự khuếch tán của thuốc thông qua mạng lưới hydrogel [8, 9] Vì vậy, quá trình nhả chậm Cur từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur cho thấy tiềm năng ứng dụng để điều trị các tổn thương về da như chữa lành vết thương
Trang 15Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
KHẢ NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI
Kết quả thực nghiệm cho thấy sự phát triển của tế bào trong những điều kiện nuôi cấy khác nhau có sự khác biệt rõ rệt Quan sát mẫu xử lý với nCur-CS-F127 có sự tăng sinh mạnh nguyên bào sợi khi so sánh với mẫu xử lý với CS-F127 và mẫu đối chứng (hình 2 12)
Hình 2 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu xử
lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127 Dựa trên những đường cong chuẩn đã được tạo ra bởi số lượng khác nhau của các nguyên bào sợi tạo ra trong thời gian 24 giờ, tính toán được số lượng
Trang 16Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm
nguyên bào sợi tăng sinh trên các mẫu đối chứng; mẫu xử lý với CS-F127 và mẫu
xử lý với nCur-CS-F127 (hình 2 13)
Hình 2 8: Lượng nguyên bào sợi tăng sinh của các mẫu thử nghiệm khảo sát
trong thời gian 24 giờ Qua kết quả thử nghiệm có thể kết luận rằng mẫu hydrogel CS-F127 có chứa nanocurcumin hỗ trợ nguyên bào sợi phát triển Theo một số báo cáo, khi những nguyên bào sợi này tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thương Chúng sản sinh ra collagen có vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa vết thương, phục hồi cấu trúc và chức năng của mô Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trưởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thương như TGF-
β, PDGF, KGF, … Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh hơn Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thương đã liền [10-13] Thử nghiệm này cho thấy tìm năng ứng dụng vật liệu hydrogel nCur-CS-F127 trong lĩnh vực làm lành vết thương