Phân lập vi khuẩn bacillus megaterium có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học

Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được .... Hiện nay, hầu hết các sản phẩm vi sinh vật đều được sản xuất từ một loại v

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập tại Viện Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học do thời gian và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo tận tình của quý thầy, cô để đề tài khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Ths Nguyễn Thị Thu Hằng Hoàng Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I MỤC LỤC II DANH MỤC VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI HUẨN BACILLUS 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS MEGATERIUM 3

1.2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS MEGATERIUM 3

1.2.2 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI 3

1.2.3 ĐẶC ĐIỂM 4

1.2.4 LỊCH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM 5

1.2.5 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG 5

1.2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACILLUS MEGATERIUM 7

CHƯƠNG 2MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU 9

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 9

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 9

2.3 NGUYÊN LIỆU 9

2.3.1 NGUỒN VI SINH VẬT 9

2.3.2 HÓA CHẤT 10

2.3.3 THIẾT BỊ SỬ DỤNG 10

2.3.4 MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU 10

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.4.1 PHÂN LẬP, GIỮ CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CHẾ PHẨM 13

2.4.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS 13

2.4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO 16

2.4.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG 17

2.4.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 17

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC CHỦNG BACILLUS MEGATERIUM 19

3.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA NGUỒN CARBON 21

3.3 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS 22

3.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO 23

3.4.1 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 24

3.4.2 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CELLULASE 25

3.4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 26

3.5 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG 27

3.5.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT 27

3.5.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NACL 28

3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 30

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

4.1 KẾT LUẬN 32

4.2 KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

DANH MỤC VIẾT TẮT

B cereus : Bacillus cereus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Công thức Môi trường Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi khuẩn

Bacillus megaterium 10

Bảng 2.2: Công thức môi trường LB 11

Bảng 2.3: Môi trường xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon 11

Bảng 2.4: Công thức môi trường thử hoạt tính enzyme 11

Bảng 3.1 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được 19

Bảng 3.2 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của các chủng vi khuẩn 21

Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của Bacillus 22

Bảng 3.4 Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 24

Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 25

Bảng 3.6 Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 26 Bảng 3.7 Khả năng chịu nhiệt của chủng L3 trên môi trường LB-lỏng và agar 27

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Bacillus Megaterium 4

Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu 5

Hình 3.1 A, Ba dạng khuẩn lạc đặc trưng được làm 20

thuần trên môi trường Ashby agar 20

B, Hình ảnh nhuộm gram của ba khuẩn lạc 20

Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khuẩn B2 và B3 trên môi trường cố định Nitơ 23

B, Hình ảnh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh catalase 23

Hình 3.3 Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của các chủng Bacillus megaterium đã phân lập 24

Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 25

Hình 3.4 Hoạt tính phân giải cellulase của các chủng Bacillus phân lập 25

Hình 3.5 Hoạt tính phân giải protease của các chủng Bacillus phân lập 26

Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau ở môi trường LB-lỏng 28

Hình 3.7 a, Hình ảnh biểu đồ khả năng chịu muối của vi khuẩn 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ vi sinh đã đóng góp cho nền nông nghiệp thế giới những thành tựu to lớn, trở thành một trong những ngành mũi nhọn tham gia giải quyết các mục tiêu bảo vệ tài nguyên đất đai và nâng cao độ phì nhiêu, tăng năng suất cây trồng và chất lượng nông sản

Nông nghiệp Việt Nam mỗi năm tiêu thụ trên 9 triệu tấn phân hóa học để bảo đảm sản lượng, nhưng hiệu quả sử dụng phân bón thấp, nhiều vùng đất đang có

xu hướng suy thoái độ phì, sâu bệnh phát triển mạnh, chất lượng nông sản chưa cao Vì vậy việc nghiên cứu ứng dụng các nguồn gen vi sinh vật tốt để sản xuất các chế phẩm vi sinh, phân vi sinh vất, phân hữu cơ vi sinh và hữu cơ sinh học đang là

xu hướng tích cực trong chiến lược phát triển một nền nông nghiệp theo hướng hữu

cơ hiệu quả và bền vững Tuy nhiên, ngành công nghệ vi sinh nói chung ở Việt Nam còn rất non trẻ so với các nước có nền nông nghiệp tiên tiến, do đó nghiên cứu tuyển chọn làm giàu nguồn gen vi sinh vật hữu ích có chất lượng cao phục vụ cho sản xuất nông nghiệp đang là vấn đề cấp thiết

Hiện nay, hầu hết các sản phẩm vi sinh vật đều được sản xuất từ một loại

vi sinh vật, hay phối hợp nhiều chủng có tác dụng hỗ trợ cho nhau cùng phát huy tác dụng chuyên biệt của chúng như: (Cố định đạm cộng sinh – Nitragin, Rhizoda; Cố định đạm hội sinh, tự do – Azogin, Rhizolu; Phân giải hợp chất photpho khó tan – Phosphobacterein, phân hữu cơ vi sinh cố định đạm, phân giải lân, phân hữu cơ vi sinh đa chức năng gồm vi sinh vật cố định đạm, phân giải lân, kích thích sinh trưởng hoặc kết hợp với chủng vi sinh có khả năng hạn chế bệnh trong đất hại cây trồng) và hiệu quả sử dụng của các chế phẩm này ở các địa phương thì khác nhau Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phong phú,

đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại nhiều chiều cùa các vi sinh vật với nhau, của vi sinh khác nhau với cây trồng và điều kiện môi trường Vì vậy,

chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn Bacillus Megaterium có tiềm

năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học”

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1 1 Giới thiệu chung về vi hu n Bacillus

 Phân loại khoa học:

Tế bào Bacillus hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -

7 µm Tế bào Bacillus thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông Bacillus VK là gram dương, hầu hết dương tính với catalase có khả năng

di động nhờ lông roi Mỗi tế bào Bacillus chỉ có thể hình thành một nội bào tử

có hình oval hoặc hình trụ Bào tử V có khả năng chịu nhiệt, acid Sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí Các loài thuộc chi

Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử vẫn giữ nguyên hình que khi

mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút Tùy theo

loài chi Bacillus, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [15,20]

- Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau Bacillus rất phổ biến trong

tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, Chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ carbon và nito

- Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu

nhận năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino acid, acid hữu cơ, [8]

- Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là V hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện,

nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30-45°C, một số chịu nhiệt với nhiệt độ sinh

trưởng tối ưu lên tới 6°C, hoặc ưa lạnh (5°C-25°C) Các loài V thuộc chi

Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2-11 Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện

bất lợi trong thời gian dài [15]

1.2 Tổng quan về Bacillus Megaterium

1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus Megaterium

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương , hiếu khí chủ yếu là bào tử

được tìm thấy phổ biến trong môi trường Với chiều dài tế bào lên tới 4 Pha và

đường kính 1,5 Thaym, B megaterium là một trong những vi khuẩn lớn nhất

được biết đến Các tế bào thường xuất hiện theo cặp và chuỗi, trong đó các tế bào được nối với nhau bằng các polysaccharide trên thành tế bào

Vào những năm 1960, B megaterium là sinh vật mẫu chính trong số các

vi khuẩn gram dương cho các nghiên cứu chuyên sâu về sinh hóa, bào tử và vi khuẩn Hiện nay, Bacillus megaterium được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học cho khả năng sản xuất protein tái tổ hợp, làm phân bón

1.2.2 Đặc điểm phân loại

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Loài: B megaterium

Hình 1.1: Bacillus Megaterium 1.2.3 Đặc điểm

B megaterium phát triển ở nhiệt độ từ 3°C đến 45°C, với mức tối ưu

khoảng 37°C Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên tới 63°C

B megaterium đã được công nhận là một endophyte và là một tác nhân

tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật Sự cố định đạm đã

được chứng minh ở một số chủng B megaterium

B megaterium là một sinh vật công nghiệp quan trọng trong nhiều thập

kỷ Nó sản xuất penicillin amidase được sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp, các loại amylase khác nhau được sử dụng trong ngành làm bánh và glucose dehydrogenase được sử dụng trong xét nghiệm glucose máu Hơn nữa, nó được

sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, các loại thuốc có đặc tính diệt nấm và kháng vi-rút, Nó tạo ra các enzyme để điều chỉnh corticosteroid, cũng như một số axit amin dehydrogenase

B megaterium được biết là sản xuất axit poly-glutamic Sự tích lũy của

polymer được tăng lên rất nhiều trong môi trường nước muối (2 xăng10% NaCl ), trong đó polymer bao gồm phần lớn L-glutamate (hàm lượng

đồng phân L lên tới 95%) Ít nhất một chủng B megaterium có thể được coi

là halophile , vì sự tăng trưởng của NaCl lên đến 15% đã được quan sát thấy [27]

Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu

Về mặt phát sinh, dựa trên 16S rRNA , B megaterium được liên kết mạnh

mẽ với B flexus, sau này được phân biệt với B megaterium một thế kỷ trước, nhưng chỉ mới được xác nhận là một loài khác B megaterium có một số điểm tương đồng về kiểu hình và phát sinh gen với mầm bệnh B anthracis và B cereus, mặc dù bản thân nó tương đối vô hại [28]

1.2.4 Lịch nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus megaterium

Loài này được mô tả bởi de Bary vào năm 1884, với Bacillus megaterium, nhưng không đưa ra từ nguyên Tuy nhiên, một số tác giả sau đó gọi nó là B megatherium giả sử tên này được viết sai chính tả Xu hướng này tiếp tục khi nhiều nhà khoa học (chủ yếu từ các nước đang phát triển ) vẫn sử dụng tên B megatherium, gieo rắc sự nhầm lẫn

Tên B megaterium là bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp mega, (ας, μεγάλη, μέγα)

có nghĩa là "lớn", tức chi vi khuẩn có kích thước lớn hơn so với các vi khuẩn

khác trong chi Bacillus

 Lỗi chính tả không chủ ý (không cho thực tế rằng de Bary và học sinh của mình, liên tục sử dụng biệt danh "megaterium"), trong khi nó cần phải có

được megatherium, từ therion ( θηρίον , có nghĩa là "con quái vật"), có nghĩa là

"con thú lớn "

1.2.5 Tiềm năng ứng dụng

B megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thường có trong đất Chu

trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy, giáng hóa chất

hữu cơ để trở thành các hợp chất đơn giản hơn được thực hiện bởi các loại vi

sinh bao gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm khác nhau, mà B megaterium là một

trong số đó Các loài vi sinh này sử dụng các chất dinh dưỡng từ các vật liệu hữu

cơ chết hay hoại sinh để duy trì nguồn năng lượng cho sự phát triển của chúng Trong môi trường đất vi khuẩn ở dạng sinh dưỡng khi có sẵn cơ chất cho chúng phát triển và chuyển thành dạng bào tử khi chất dinh dưỡng trở nên cạn kiệt Điều này là một chiến lược sinh tồn được sử dụng bởi nhiều loại vi sinh chiếm

ưu thế trong môi trường sống hiếu khí của đất ngoài vi khuẩn còn có các loại nấm sợi và các loài xạ khuẩn (actinomyces) Các nhóm vi sinh sống trong đất và tạo ra kháng sinh quần hợp với qui trình tạo thành bào tử của chúng Vì có rất nhiều loài vi sinh tạo bào tử có thể có hiệu quả làm giáng hóa nhiều hợp chất polymer sinh học như protein, tinh bột, pectin…, chúng được cho là có vai trò đáng kể trong chu trình sinh học của carbon và nitrogen Chính nhờ đặc tính này

hiện nay B megaterium là một trong những loại vi khuẩn được dùng khá phổ

biến trong lĩnh vực xử lý môi trường [30]

B megaterium được coi là vi khuẩn không gây bệnh nhưng V đóng vai

trò lớn trong việc tạp nhiễm các môi trường vô khẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các hạt bụi, và chúng có thể là tác nhân gây nên hiện tượng phân hủy và thối rữa [30]

Trong công nghệ sinh học nhờ kích thước lớn của vi khuẩn B megaterium

đã cho phép sử dụng B megaterium trong các nghiên cứu về protein cũng như các

nghiên cứu về màng tế bào thành công Chủng đơn được sử dụng cho nhiều nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực của sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào Một số của các ứng dụng đó được áp dụng trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất các enzyme glucose dehydrogenase, penicillin aminidase và đặc biệt là b-amylase, ứng dụng trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin, P450 cytocrome…

và rất nhiều các ứng dụng khác trong công nghệ gen và tái tổ hợp [19]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về Bacillus megaterium

B megaterium thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm và được sử

dụng như một sinh vật công nghiệp có khả năng sản xuất nhiều loại protein và

nguồn sinh học Bacillus megaterium là một nguồn protein công nghiệp tốt vì nó

vừa là vật chủ nhân bản vừa mong muốn và tạo ra một biến thể lớn của các enzyme Loài này là vật chủ nhân bản tốt vì có thể chứa nhiều vectơ plasmid, sử

dụng Bacillus megaterium nhà khoa học đã phát triển nhiều loại protein thường

được sử dụng trong lĩnh vực y tế và nông nghiệp Ví dụ, nhiều penicillin tổng hợp đã được tạo ra bằng cách sử dụng penicillin amidase trong vi khuẩn; glucose dehydrogenase thu hoạch được sử dụng trong xét nghiệm glucose máu; ß-Amylase thường được sử dụng trong ngành công nghiệp bánh mì; và protease trung tính được sử dụng bởi ngành công nghiệp da Một số chủng đã được chứng minh là vật chủ tốt cho biểu hiện gen Một chủng, QM B1551, vẫn được sử dụng để tạo kháng nguyên cho Bộ chẩn đoán HIV Nghiên

cứu công nghệ sinh học của Bacillus megaterium cung cấp rất nhiều protein

khác nhau mà họ có thể sử dụng trong các tiến bộ y tế, khoa học và công nghiệp quan trọng [19]

Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 18 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin Trong đó có dòng vi khuẩn

Bacillus megaterium cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng

còn lại với tỷ lệ phân hủy lông lên đến 40,48% [21]

Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất rộng

rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam Phân

hữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có

tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là

bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii…

Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học hiện có trên thị trường phía Nam với chất lượng tốt và có uy tín như nhóm sản phẩm phân hữu cơ Cugasa của Công

Ty Anh Việt, phân VK của Công ty Viễn Khang, phân hữu cơ Phaga, Trimix của Công ty Phaga……

Nhóm phân hữu cơ sinh học có bổ sung vi sinh vật trợ giúp và làm giàu dinh dưỡng (phân hữu cơ vi sinh) thường được chế biến bằng cách đưa thêm một số vi sinh vật có ích khác vào sau khi nhiệt độ đống ủ đã ổn định (30°C )

Như nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do (Azotobacter), vi khuẩn hoặc nấm sợi

phân giải photphát khó tan (Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas striata; Aspergillus awamori…), xạ khuẩn Streptomyces Rất nhiều lọai phân hữu cơ vi sinh, phân lân vi sinh đang lưu thông trong sản xuất tại Việt nam

- Phân gà (hoặc phân heo, phân bò) thải ra từ các trại chăn nuôi là dạng cơ chất rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng đạm chiếm đến hơn 2%, độ ẩm phân gà (hoặc phân heo, phân bò) khá cao, trung bình khoảng 70-80% Do độ ẩm cao, phân gà (hoặc phân heo, phân bò) rất dễ phát sinh mùi, quá trình ủ phân cần phải phơi hoặc trộn với các giá thể khác để làm giảm ẩm

- Hàm lượng hữu cơ trong phân gà (hoặc phân heo, phân bò) cao, rất dễ gây ngộ độc hữu cơ cho cây trồng nếu chưa qua quá trình ủ hoai

- Phân gà (hoặc phân heo, phân bò) có chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Salmonella (vi khuẩn gây bệnh thương hàn) và E coli gây bệnh đường ruột ở người, cần phải ủ hoai trước khi sử dụng làm phân bón trong canh tác nông nghiệp [13]

Chương 2 MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus megaterium có khả năng cố định Nitơ,

sản sinh một số enzyme ngoại bào và xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn đã phân lập được

2 2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus megaterium có khả năng cố

định Nitơ từ ba mẫu đất ruộng

- Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạnh tế bào của Bacillus megaterium

các chủng vi khuẩn đã phân lập

- Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập

+ hả năng cố định Nitơ

+ hả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau

+ hả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí

+ hả năng sinh catalase

- Xác định hoạt tính loại enzyme (amylase, protease, cellulase) ngoại bào

của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã phân lập

- Xác định khả năng chống chịu một số yếu tố bất lợi với môi trường của các chủng vi khuẩn (khả năng chịu nhiệt độ cao và nồng độ NaCl cao) của

- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus megaterium từ một số mẫu

đất thu thập ở ruộng lúa của tỉnh Cao Bằng

2.3.2 Hóa chất

Các hóa chất như: Peptone, yeast extract, NaCl, K2HPO4 , MgSO4.7H2SO4, (NH4)2SO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, Mannitol, Glucose, Lactose, Glyxerol, Maltose, Sucrose và Fructose,… do Trung Quốc, Việt Nam, Mỹ, Đức, … sản xuất

2.3.3 Thiết bị sử dụng

Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp bao gồm:

- Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter – Ý, Nồi khử trùng HVE

50 - Nhật Bản, Máy ly tâm lạnh - Mỹ, Máy lắc ổn nhiệt - Thụy Sĩ, Tủ ấm (Memmert) - ức, Cân phân tích OHAUS PA 213 - Mỹ, Tủ lạnh 4ºC; -20ºC; -80ºC - Nhật Bản, Kính hiển vi quang học, Tủ cấy (Box laminar PII) - ức, Micropipet - ức, Máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels - Nhật Bản, Lò vi sóng 20 lít, 30 lít – Liên Doanh

2.3.4 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường Ashby

Bảng 2.1: Công thức Môi trường Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi

khu n Bacillus megaterium

- Môi trường LB nuôi cấy các chủng Bacillus

- Môi trường ISP4 xác định khả năng đồng hóa nguồn cacbon

Bảng 2.3: Môi trường xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon

- Môi trường xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn

Bảng 2.4: Công thức môi trường thử hoạt tính enzyme

Môi trường định tính

enzyme

Thành phần, hàm lượng Thuốc thử

Protease 2% Agar + 1% Casein Thuốc thử Comassi

Quá trình nghiên cứu của đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:

Gia nhiệt 80ºC trong 20 phút

Ủ đĩa cấy trong tủ ấm 37ºC trong 48 giờ

Sơ đồ quy trình phân lập và xác định một đặc điểm sinh lý sinh hóa của

Bacillus

Mẫu đất

Pha loãng 1g đất với nước vô trùng

theo tỉ lệ 1:10

Pha loãng mẫu đất (10-3 )

Cấy trải trên môi trường agar (không có Nitơ)

Ashby-Phân lập, tinh sạch các chủng vi khuẩn

có khả năng là Bacillus megaterium

Xác định hình dạng tế bào, hình thái, đường kính vi

khuẩn, nhuộm Gram

Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon

Xác định khả năng enzyme ngoại bào

Xác định khả năng chống chịu một số yếu

tố bắt lợi của môi trường

Xác định khả năng kháng vi sinh vật

2.4.1 Phân lập, giữ chủng vi sinh vật từ chế phẩm

- Pha loãng mẫu: Tiến hành cân 1g đất cho vào 9ml nước cất vô trùng vào ống falcon được mẫu pha loãng có nồng độ 10-1

và lắc đều, gia nhiệt ở 80ºC trong 20 phút Hút 1ml dịch từ mẫu pha loãng có nồng độ 10-1 cho vào ống falcon chứa 9ml nước cất vô trùng mới thì được mẫu pha loãng có nồng độ 10-2 Tương tự pha loãng mẫu đến nồng độ 10-3

và vi khuẩn còn được hoạt hoá trước khi nhân giống [2]

2.4.2 Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus

Chủng được quan sát trên môi trường Ashby-agar bằng mắt thường và kính hiển vi quang học Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và màu sắc khuẩn lạc

2.4.2.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường LB-agar: khả năng phát triển của khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc

2.4.2.2 Phương pháp nhuộm Gram

 Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân loại vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được

xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot

và làm cho vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này ( vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram

dương cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào

 Cách tiến hành: Làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên 1 lá kính sạch Để khô

tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn Nhỏ vài giọt Crystal Violet (tím kết tinh) cho phủ lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng

1 phút Rửa nhanh bằng nước Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên trên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút Rửa nhanh bằng nước Tẩy màu bằng cách nghiêng lamen và nhỏ từ từ ancol (cồn) lên vết nhuộm, khi giọt ancol rời khỏi lamen không có màu tím thì ngừng ngay Rửa nhanh bằng nước Nhỏ vài giọt safranine cho phủ đều trên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút Rửa nhanh bằng nước Thấm khô vết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100

 Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, V Gram dương sẽ bắt màu tím Quan sát hình dạng vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn, ) và cách sắp xếp (chuỗi, chùm, rời rạc, )

2.4.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh nội bào tử của vi khuẩn

- Nguyên tắc: Bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để chúng có thể tồn Tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng thành sẽ bị giết chết Điểm quyết định để tạo bào tử phụ thuộc rất nhiều vào sự suy giảm dinh dưỡng hoặc/và điều kiện khắc nghiệt trong môi trường nuôi vi khuẩn Dựa vào đặc điểm đó, tiến hành tạo ra điều kiện khắc nghiệt bằng cách sốc nhiệt để xác định khả năng sinh bào tử

 Cách tiến hành theo phương pháp gia nhiệt: Lấy 1 khuẩn lạc đơn từ đĩa petri cấy vào môi trường LB- Lỏng (pH=7), nuôi ở 37ºC, lắc 150 vòng/phút, trong 24 giờ thu huyền phù vi khuẩn

Tiến hành pha loãng dịch huyền phù vào các ống eppendorf đã được khử trùng Đem các ống này đun cách thủy ở 80ºC trong 10 phút Sau đó, dùng mycropipet hút 100µl dịch cấy trải trên môi trường LB-agar, đặt vào tủ ấm 30ºC Sau 24 giờ, nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc kết luận chủng có khả năng hình thành bào tử và ngược lại