Nghiên cứu trích ly flavonoid và xác định một số đặc tính sinh hóa của dịch chiết lá đu đủ

Được sự nhất trí của Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học – Trường Đại học Lâm Nghiệp, tôi đã tiến hành khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu trích ly Flavonoid và x

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học 2015-2019 và đánh giá khả năng kết hợp lý thuyết với thực hành, giúp sinh viên củng cố kiến thức đã được trang bị và vận dụng vào thực tế một cách có hiệu quả Được sự nhất trí của Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học – Trường Đại học Lâm

Nghiệp, tôi đã tiến hành khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu trích ly Flavonoid

và xác định một số đặc tính sinh hóa của dịch chiết lá Đu đủ”

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban giám hiệu Trường đại học Lâm Nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những sự giúp đỡ quý báu đó Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS

Hà Văn Huân và ThS Nguyễn Thị Thu Hằng, thầy giáo và cô giáo đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ ở Trung tâm Thông tin – Thư viện Trường Đại học Lâm Nghiệp đã cung cấp cho tôi nhiều tài liệu quý báu và cần thiết có liên quan đến khóa luận

Mặc dù đã rất cố gắng trong khuôn khổ thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên khóa luận chắc chắn không tránh khỏi nhiều thiếu sót Kính mong nhận được những đóng góp quý báu của các thầy giáo, cô giáo, và bạn bè đồng nghiệp

để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Giới thiệu về cây Đu đủ 3

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc 3

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Đặc tính sinh học của lá Đu đủ 4

1.1.4 Công dụng của lá Đu đủ trong y dược 5

1.2 Các hoạt chất có tác dụng sinh học trong lá Đu đủ 6

1.2.1 Flavonoid 6

1.2.2 Các hợp chất thuộc nhóm axit hữu cơ 9

1.2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học khác 10

1.3 Các nghiên cứu về chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá Đu đủ 11

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13

PHẦN 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Vật liệu nghiên cứu 15

2.3.1 Vật liệu thực vật, vi sinh vật 15

2.3.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 16

2.3.3 Hóa chất và thiết bị 16

2.3.4 Địa điểm bố trí thí nghiệm 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp luận 17

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể 17

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả xác định độ ẩm và tạo nguyên liệu bột khô của lá cây Đu đủ 28

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly Flavonoid 29

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến hàm lượng Flavonoid 29

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Flavonoid 31

3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Ethanol đến hàm lượng Flavonoid 31

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết bằng Ethanol đến hàm lượng Flavonoid 32 3.3 Định tính Flavonoid bằng các phản ứng hóa học đặc trưng 34

3.4 Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa trong lá Đu đủ: 35

3.4.1 Xác định hàm lượng axit toàn phần 35

3.4.2 Xác định hàm lượng đường tổng 36

3.4.3 Xác định hàm lượng vitamin C 37

3.5 Kết quả xác định tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá Đu đủ 38

Phần 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và nguồn gốc cây Đu đủ 3

Bảng 2.1 Môi trường LB 16

Bảng 3.1 Định tính Flavonoid bằng các phản ứng hóa học đặc trưng 34

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng đường tổng 36

Bảng 3.3 Hoạt tính kháng của một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá Đu đủ 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lá Đu đủ 5

Hình 1.2 Cấu trúc của các loại Flavonoid 7

Hình 2.1 Các dạng lá của cây Đu đủ 16

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần 19

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn glucose 24

Hình 3.1 Độ ẩm của lá Đu đủ 28

Hình 3.2 Bột khô của lá cây Đu đủ 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đối với hàm lượng Flavonoid 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly Flavonoid 31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Ethanol đến hiệu suất trích ly Flavonoid 32

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết bằng Ethanol đến hiệu suất trích ly Flavonoid 33

Hình 3.7 Định tính Flavonoid chiết xuất từ lá Đu đủ 34

Hình 3.8 Hàm lượng axit toàn phần của lá Đu đủ 35

Hình 3.9 Xác định hàm lượng đường tổng 36

Hình 3.10 Hàm lượng vitamin C trong lá đu đủ 37

Hình 3.11 Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá Đu đủ 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả được trồng ở các

nước vùng nhiệt đới Lá Đu đủ được chứng minh có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, có hoạt tính kháng khuẩn tốt Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau Dịch chiết lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu, điều hòa miễn dịch

Ở Việt Nam, cây Đu đủ trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Các tỉnh trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng đu đủ của cả nước hiện nay khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả

Đu đủ là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao, đa tác dụng: thân,

lá, quả đều được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau Ngoài việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, cây Đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nuôi Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,…Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ đều khẳng định lá Đu đủ có khả năng chống oxy hóa rất mạnh Là hoạt tính chống oxy hóa do tác dụng của các hợp chất thuộc nhóm phenol Bên cạnh đó lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, phổ kháng rộng (kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm) Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau Đặc biệt, người dân Việt Nam thường sử dụng lá Đu đủ để ức chế phát triển của các

tế bào ung thư

Một trong số các hoạt chất có tác dụng chống oxi hoá, kháng viêm trong

lá Đu đủ là Flavonoid Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư

Việt Nam được đánh giá là nước đứng thứ 16 trên thế giới về sự phong phú và đa dạng sinh vật Điều này đã góp phần không nhỏ cho sự phát triển ngành y học cổ truyền của nước ta, bên cạnh đó cũng đóng góp vai trò rất lớn đối với ngành y học hiện đại Hiện nay các nhà khoa học rất quan tâm đến các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật Do đó, tôi đã lựa chọn lá Đu đủ

làm nguyên liệu cho đề tài: “Nghiên cứu trích ly Flavonoid và xác định một số

đặc tính sinh hóa của dịch chiết lá Đu đủ” Bên cạnh đó, để làm rõ sự khác

biệt về hàm lượng chất có hoạt tính sinh học trong ba loại lá Đu đủ (non, bánh

tẻ, già), vật liệu thực vật được sử dụng trong khoá luận là ba loại lá Đu đủ ở các thời kỳ phát triển khác nhau

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu về cây Đu đủ

Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [2] Ở Việt Nam có 1 chi và một loài là chi

Carica, loài Carica papaya Linn Một số giống cây Đu đủ hiện nay đang được

trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mẽico, So Lo, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống Đu đủ Đài Loan được trồng rải rác ở nhiều huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…

Đu đủ thường được biết đến với giá trị thực phẩm và dinh dưỡng trên toàn thế giới Các tính chất của quả Đu đủ và các bộ phận khác của cây cũng nổi tiếng trong hệ thống y học cổ truyền Trong thời gian vài thập kỷ qua đã đạt được tiến bộ đáng kể về hoạt động sinh học và dược liệu áp dụng đu đủ Hiện nay Đu đủ được coi là cây ăn quả dinh dưỡng có giá trị Đu đủ có dược tính điều trị các bệnh khác nhau Các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm lá, hạt,

mủ và quả trưng bày có giá trị dược liệu Thân, lá và quả Đu đủ chứa nhiều mủ

Mủ từ quả đu đủ chưa chín có chứa enzyme papain và chymopapain

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc

Bảng 1.1 Phân loại và nguồn gốc cây Đu đủ

Giới (regnum) Thực vật (Plantae)

Loài (species) C papaya Chi Đu đủ (Carica) có một loài duy nhất là Đu đủ (Carica papaya) thuộc Họ đu đủ (Caricaceae hay Papayaceae) Loài này có nguồn gốc ở vùng

nhiệt đới của Châu Mỹ Đây là cây thân thảo to, không hoặc ít khi có nhánh, cao từ 3–10 m Lá to hình chân vịt, cuống dài, đường kính 50–70 cm, có khoảng 7 khía Hoa trắng hay xanh, đài nhỏ, vành to năm cánh Quả Đu đủ to

tròn, dài, khi chín mềm, hạt màu nâu hoặc đen tùy từng loại giống, có nhiều hạt [38]

1.1.2 Phân bố

Cây Đu đủ được trồng lần đầu tiên ở Mexico khi có sự xuất hiện của các nền văn minh cổ điển Trung Mỹ Hiện nay cây đu đủ là loài cây ăn quả nhiệt đới được trồng rộng rải ở Miền Nam Hoa Kỳ (Floria và US Virgin Islands), Mexico, các nước Trung Mỹ, các nước Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á, Châu Đại Dương và tiểu bang Hawaii của Mỹ

Năm 1526, nhà báo Oviedo người Tây Ban Nha lần đầu tiên mô tả cây Đủ đu

ở bờ biển các nước Panama và Colombia Từ đó người Tây Ban Nha giới thiệu loài cây này đến Châu Phi, Châu Á và Châu Úc Cây đu đủ du nhập vào Việt Nam qua Philiippines [3, 24]

Ở Việt Nam có hai giống Đu đủ nội địa truyền thống là giống Đu đủ thịt

đỏ và giống Đu đủ thịt vàng Hiện nay có nhiều giống mới được lai tạo và nhập nội chủ yếu là các giống Đu đủ lai F1 với năng suất, sản lượng và chất lượng quả cao với nhiều màu sắc của thị quả khác nhau như đỏ, vàng, tím…

Đu đủ là loại cây ăn quả nhiệt đới dễ trồng, có năng suất cao và phẩm chất quả ngon nên được nhiều nước khai thác để cung cấp quả tươi và làm nguyên liệu chế biến các sản phẩm trái cây công nghiệp

1.1.3 Đặc tính sinh học của lá Đu đủ

Đu đủ là cây lá đơn, mọc thành chùm ở ngọn thân Lá lớn có cuống dài phiến rộng 30 – 60 cm, mỏng, mềm, chia thành 7 – 11 thùy và đôi khi các thùy này chia ra làm nhiều thùy nhỏ Lá đu đủ dễ bị gãy, rách

Hình 1.1 Lá Đu đủ

1.1.4 Công dụng của lá Đu đủ trong y dược

Lá Đu đủ non có tác dụng tốt cho người bệnh tim: Lá Đu đủ chứa chất Alkaloid gọi là carpaine thay thế được chất digitalin trị bệnh tim

Dịch chiết lá Đu đủ điều trị bệnh sốt xuất huyết có hiệu quả: Từ năm

2002 bệnh sốt xuất huyết thường và bệnh số xuất huyết Dengue hoành hành mạnh ở Malaysia, mỗi năm có trên 20.000 người bị nhiễm bệnh Trong điều trị bệnh sốt xuất huyết của Tây y theo cách truyền thống là truyền nước và truyền máu kết hợp với điều trị hỗ trợ và quản lý nhiễm trùng ở bệnh nhân và điều trị theo cách này thường không có hiệu quả cao Chữa tiêu chảy: Các enzyme của

lá Đu đủ giúp bảo vệ toàn bộ hệ thống tiêu hóa từ miệng đến đại tràng, làm giảm axit hình thành trong ruột Giảm sưng do sốt xuất huyết: Các lá Đu đủ có chứa các enzyme giúp giảm sưng trong cơ thể, cũng như đau và cúm liên quan đến sốt

do virus dengue Giải quyết vấn đề không dung nạp gluten: Lá Đu đủ giúp cơ thể phân hủy protein gluten và tiêu hóa tốt hơn Chống ung thư: Các chất chống oxy hóa trong lá Đu đủ vô cùng hữu ích trong việc giúp cơ thể chống lại các căn bệnh như ung thư mà không gây ra các phản ứng phụ [29] Loại bỏ triệu chứng thèm đường: Thèm đường là một vấn đề nghiêm trọng, gây ra những tác hại nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe Tiêu thụ lá Đu đủ như một loại trà sẽ làm cho bạn đẩy lùi cơn thèm ăn các loại thực phẩm có nhiều carbohydrate và

đường Giúp nhuận tràng: Nhờ có nhiều chất xơ nên lá Đu đủ cũng giúp giảm các vấn đề rắc rối của táo bón Chống lão hóa: Do có rất nhiều Axit Amin nên lá

Đu đủ có tác dụng làm cho làn da của trẻ trung và khỏe mạnh Uống trà từ lá Đu

đủ giúp ngăn ngừa các nếp nhăn Tăng cường hệ thống miễn dịch: Các chất dinh dưỡng từ lá Đu đủ giúp cơ thể có thể tự bảo vệ mình khỏi các căn bệnh về tim mạch, ung thư, lão hóa, dị ứng và nhiễm trùng dạ dày

1.2 Các hoạt chất có tác dụng sinh học trong lá Đu đủ

Theo Adachukwu và cộng sự (2013), trên cơ sở phân tích những chất hóa

học tồn tại trong lá Đu đủ Carica Papaya L cho thấy cây Đu đủ được đặc trưng

bởi nhiều hoạt động dược lý và phổ rộng của các hoạt động trị liệu Phương pháp tiêu chuẩn của phân tích được sử dụng để xác định thực sự rằng lá đu đủ Carica có chứa chất kiềm, Saponin, Tannin, Glycoside và Flavonoid [4]

Trong lá Đu đủ có Alkaloid, Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, … Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,

Theo các nguồn phân tích khác, thành phần hóa học lá Đu đủ chứa khá nhiều hợp chất như: Alkaloid (lá chứa carpinin và carpain, ruột thân có pseudo cẩpin), Flavonoid (chồi non chứa quercetin, myricetin và kaempferol), các khoáng chất và vitamin, Calcium, sắt, Magiê, Phốt pho, Kali, Natri, kẽm, đồng, Mangan, Thiamin (B1), Beta caroten (tiền vitamin A), Riboflavine (B2), Niacin (B3), Axit Pantothenic (B5), Axit Ascorbic (C), vitamin E, riêng chồi còn có Alpha Tocopherol [4] Lá đu đủ chứa Alkaloid carpain, làm chậm nhịp tim, diệt amíp

1.2.1 Flavonoid

1.2.1.1 Khái niệm và cấu trúc

Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật, tạo màu

cho rất nhiều loại rau, hoa và quả

Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen (vòng A và B) nối với nhau qua một

mạch 3 carbon (vòng pyron - vòng C) Phần lớn Flavonoid có màu vàng nhạt, một số có mà đỏ, xanh tía và các dạng không màu [36]

Cấu trúc của Flavonoid và các loại Flavonoid:

Hình 1.2 Cấu trúc của các loại Flavonoid

Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch 3C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết với vòng benzopyrano, flavonoid được phân loại thành các các nhóm như:

Flavonoids (2- phenylbenzopyrans): gồm các nhóm phụ Flavan, Flavan

3-ol (catechin), Flavan 4-3-ol, Flavan 3,4-di3-ol, Anthocyanidin, Flavanone, Flavone, Flavonol, 3-Hydroxy Flavanon, Chalcon, Dihidrochalcon, Aurone

Isoflavonoid (3-benzopyrans) gồm các nhóm phụ: Iso flavan, Iso flavan-4-ol, Isoflavon, Isoflavanon, Rotenoid…Thường gặp nhất là Isoflavon trong cây họ đậu

Neoflavonoid ( benzopyrans) gồm các nhóm phụ Aryl-chroman, Arylcoumarin, Dalbergion [75]

4-1.2.1.2 Giá trị sinh học của Flavonoid

• Tác dụng chống oxi hóa:

Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [7, 30] Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của

một loại đại phân tử sinh học, như các enzyme, Protein, DNA và lipid [6, 30] Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [6, 7]

Gần đây, các hợp chất Flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh

mẽ trong ống nghiệm và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids [7]

Khả năng chống oxi hóa của Flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử:

Trong phân tử Flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do;

Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự do

Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [6, 7]

• Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm:

Theo Đỗ Thị Hoa Viên (năm 2007), dịch chiết Flavonoid từ quả mơ cho

thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển của S Aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans [37] Kết quả tương tự đối với dịch chiết Flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E Coli, P Aeruginosa, B Subtilis và S Aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml [23]

Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [35]

• Tác dụng đối với enzym:

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxi hóa - khử Flavonoid còn ức chế các tác động của hyaluronidase Enzyme này làm tăng tính thấm của mao mạch Khi enzym này thừa thì gây xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Flavonoid từ hoa hòe

(Rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính giòn và tính thấm của mao mạch Tác dụng này được hợp lực với axit Ascorbic Các dẫn chất Anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng làm tăng thị lực vào ban đêm [10, 22]

• Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường:

Tác động bảo vệ của các Flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các Flavonoid có vai trò như chất kích thích Insulin hay chức năng tương tự chức năng của Insulin; bên cạnh đó còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường [12]

• Tác dụng trong phòng chống ung thư:

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất Flavonoid Gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo của Flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau Quercetin

có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u [26] Naringenin và kaempferol- 3-O- (2‖ , 6‖ -di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu nhận từ hoa của cây Melastoma malabathricum L cũng đã được tìm thấy là có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3 µM [28]

1.2.2 Các hợp chất thuộc nhóm axit hữu cơ

Trong lá Đu đủ có chứa các axit hữu cơ như axit Pantothentic, axit Ascorbic, Folate (axit Folic), [1]

Axit Pantothenic: Axit Pantothenic hay còn gọi là vitamin B5, được RJ

Williams phát hiện vào năm 1933 và sau đó đã được tìm thấy ở dạng vitamin Axit Pantothenic cần thiết cho sự hình thành coenzym-A và đóng vai trò quan

trọng trong trao đổi chất và tổng hợp cacbohydrat, protein, và mỡ

Về mặt lâm sàng, axit Pantothenic là cần thiết cho sự tổng hợp của các tế bào máu đỏ, sự trao đổi chất steroid, neuron hoạt động, và kích thích sản xuất kháng thể Nguồn thường gặp của axit Pantothenic là trong pho mát, ngô, trứng, gan, thịt, lạc, đậu Hà Lan, đậu nành, men bia rượu, mầm lúa mì, thạch hoàng gia, sữa chua và lê tàu [21]

Việc thiếu axit Pantothenic là rất hiếm, trừ khi thiết kế đặc biệt cho mục đích điều tra sinh hóa Axit Pantothenic được phát hiện bởi Roger J Williams vào năm 1933 [25]

Axit Ascorbic:Axit Ascorbic hayVitamin C là một chất dinh dưỡng thiết yếu cho các loài linh trưởng bậc cao, và cho một số nhỏ các loài khác Sự hiện diện của Ascorbic là cần thiết trong một loạt các phản ứng trao đổi chất trong tất

cả các động vật và cây cối và được được tạo ra trong cơ thể bởi hầu như tất cả các cơ thể sinh vật, loại trừ loài người, khỉ, cá heo do thiếu enzyme đặc hiệu xúc

tác chuyển hóa Glucose thành Vitamin C

Đây là một chất được mọi người biết đến rộng rãi là một vitamin mà thiếu

nó thì sẽ gây ra bệnh scorbut cho con người [9]

Folate: Folate là các dạng riêng biệt được gọi là axit Folic, Folacin và

vitamin B9 và là một trong những vitamin nhóm B [15] Folate phục vụ cho

nhiều chức năng quan trọng trong cơ thể Ví dụ như đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng tế bào và sự hình thành DNA Hàm lượng Folate thấp có liên quan tới sự gia tăng nguy cơ mắc phải một số căn bệnh nguy hiểm Thiếu Axit Folic con người sẽ bị những rối loạn sau: thiếu máu, giảm sức đề kháng, trầm cảm do rối loạn tâm thần Thai phụ thiếu axit Folic có thể bị bệnh thai

trứng, thai suy dinh dưỡng

1.2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học khác

Alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân

dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc

thử chung của alkaloid

Công dụng của Alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid: Tác dụng lên hệ thần kinh, kích thích thần kinh trung ương (strychnine, caffeine), ức chế thần kinh trung ương (morphin, codeine), kích thích thần kinh giao cảm (ephedrine), liệt giao cảm (yohimbin), kích thích phó giao cảm (pilocarpin), liệt phó giao cảm (atropine), gây tê: cocaine, [16]

Thiamin: Thiamine, còn được gọi là Thiamin hoặc vitamin B1, là một loại

vitamin có trong thực phẩm, và được sản xuất dưới dạng thực phẩm bổ sung và

thuốc Thiamin thuộc họ B phức tạp Nó là một vi chất dinh dưỡng thiết yếu,

không thể tạo ra trong cơ thể Thiamin cần thiết cho quá trình trao đổi chất bao

gồm glucose, Axit amin và lipid

Niacin: Niacin hay Niaxin (còn được gọi là vitamin B3, Axit Nicotinic

hay vitamin PP) là một hợp chất hữu cơ có công thức C6H5NO2 và là một trong

40 đến 80 chất dinh dưỡng thiết yếu của con người, tùy thuộc vào định nghĩa được sử dụng [18]

Niacin là một trong năm vitamin mà nếu thiếu trong chế độ ăn uống của con người sẽ gây ra bệnh điển hình: bệnh thiếu Niacin (pellagra), bệnh thiếu vitamin C (scurvy), bệnh thiếu Thiamin (beriberi), bệnh thiếu vitamin D (bệnh còi xương), bệnh thiếu vitamin A (bệnh mù ban đêm và các triệu chứng khác) Niacin đã được sử dụng trong hơn 50 năm để tăng mức độ HDL trong máu và đã được chứng minh là có thể làm giảm nguy cơ gây bệnh tim mạch trong một số thử nghiệm có kiểm soát trên người

1.3 Các nghiên cứu về chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học từ lá Đu đủ

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ayoola và cộng sự (2002) đã chứng minh chất chiết lá Đu đủ bằng ethanol có hoạt tính chống oxy hóa Nồng độ chất chiết cần có để ức chế 50% gốc tự do DPPH IC50 là 0,58mg/ml, trong khi đó vitamin C có IC50 là 0,054mg/ml [8]

Năm 2008, Morimoto và cộng sự đã công bố dịch chiết trong nước từ các phần khác nhau của lá Đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc ức chế nhiều loại tế bào ung thư như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh

bạch cầu, Các tác giả đã kiểm tra hoạt tính của dịch chiết lá Đu đủ nồng độ 1,25 - 27 mg/ml và sử dụng 3H-thymidine là yếu tố đánh dấu Kết quả, các phần khác nhau của Đu đủ (rễ, thân, quả) đều có hoạt tính chống ung thư [29]

Năm 2010, Otsuki và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của dịch chiết lá Đu đủ (nồng độ 0,625-20 µg/ml) với các dòng tế bào ung thư khác nhau, bao gồm các dòng tế bào khối u rắn và tế bào tạo máu Kết quả không có

sự khác biệt giữa các dòng tế bào ung thư, điều đó có nghĩa là cơ chế diệt tế bào được thông qua việc kích hoạt quá trình tự chết của tế bào ung thư Tác giả chứng minh dịch chiết từ lá Đu đủ làm tăng hàm lượng các cytokine, hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u Sau đó tác giả sử dụng màng lọc

để tách thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau Các chất có hoạt tính chống ung thư và điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 1000 [19]

Bhattacharjee và cộng sự (2011), Suresh và cộng sự (2008) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một số loại lá, trong đó có lá Đu đủ Các tác giả khẳng định, dịch chiết lá Đu đủ bằng nước, Chloroform, n- Hexan, Ethanol đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt [11, 27]

Rahman và cộng sự (2011) nghiên cứu dịch chiết bằng Ethanol 95% của

lá và thân đu đủ được thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dương tại nồng độ 5 và 10 mg/ml Chất chiết từ quả có năng kháng khuẩn tốt hơn chất chiết từ thân Nồng độ ức chế tối thiểu của lá 1250 - 5000 mg/l, của thân 1250 - 10000 mg/l [24]

Năm 2011, Aysun và cộng sự đã chứng minh các giống Đu đủ khác nhau

có tổng hàm lượng Phenol khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa cũng khác nhau Có mối quan hệ tỷ lệ thuận giữa khả năng chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenol trong lá Đu đủ Điều đó chứng tỏ rằng các chất Phenol gây ra hoạt tính chống oxy hoá [6]

Moses Alo và cộng sự (2012) đã chứng minh dịch chiết lá Đu đủ bằng

nước lạnh và Ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi Các

nhà khoa học ở Ấn Độ đã ngâm chiết lá và thân Đu đủ bằng Ethanol, Ethyl Acetate rồi tiến hành thử hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương và gram âm Kết quả, dịch chiết ức chế vi khuẩn gram âm tốt hơn gram dương Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết là 50- 200 mg/ml Phân tích sơ bộ cho thấy dịch chiết chứa alkaloid, tanin, saponin và phenol [17]

Năm 2012, Kalpna và cộng sự công bố khi kết hợp chất chiết từ lá Đu đủ bằng Methanol với kháng sinh thì hoạt tính kháng khuẩn đã tăng lên rất mạnh, mặc dù chất chiết từ lá Đu đủ bằng Methanol một mình không có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm [13]

Okunola và cộng sự (2013) đã dùng nước, Ethanol, Acetone chiết lá Đu

đủ tươi và khô Nồng độ dịch chiết thử nghiệm là 25; 50; 100 μg/ml trên cả vi khuẩn và nấm Các dịch chiết đều có hoạt tính kháng với vi khuẩn gram dương

và gram âm Dịch chiết Ethanol, Acetone có hoạt tính mạnh hơn so với dịch chiết nước Dịch chiết từ lá khô có tác dụng mạnh với vi khuẩn gram dương và gram âm Trong khi đó, dịch chiết từ lá tươi chỉ có tác dụng mạnh với vi khuẩn gram âm Dịch chiết từ lá khô còn có khả năng kháng một số loại vi khuẩn mà thuốc kháng sinh đã không thể ức chế, đồng thời hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn hoạt tính kháng nấm [20]

Năm 2013, một nghiên cứu đã được tiến hành để so sánh hoạt tính chống oxy hóa từ các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β - carotene Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non →quả xanh → quả chín → hạt Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [14]

Trong y học cổ truyền, các bộ phận khác nhau của Đu đủ bao gồm cả lá,

vỏ cây, rễ, mủ, hoa, hạt đều được sử dụng để điều trị một số bệnh Người dân ở Indonesia đã dùng dịch ép lá Đu đủ uống chữa rốt rét và những bệnh sốt khác

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 1999, Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của Flavonoid chiết từ lá Đu đủ Các tác giả thí nghiệm với 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm gây bệnh Nồng độ Flavonoid thí nghiệm là 0,4

mg/ml Kết quả, Flavonoid trong lá Đu đủ thể hiện tính kháng khuẩn tốt đối với

các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [32]

Phạm Kim Mãn (2001) đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [33]

Năm 2006, theo Đỗ Thị Thảo, cặn chiết Methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư

vú MCF- 7, ung thư máu cấp tính HL- 60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết Methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [34]

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ Kết quả cho thấy β-Carotene, Luteine chiếm tỷ

lệ tương ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được Lycopene [37]

Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết Hexan của lá Đu đủ Bao gồm, β- Sitosterol, Daucosterol, Cycloart- 23- ene- 3β,

n-25 diol (Sterculin A) và Cycloart- n-25- ene- 3β,24 (R/S)- diol Trong đó, Sterculin A và Cycloart- 25- ene- 3β,24 (R/S) diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [31]

Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong lá Đu đủ có các hợp chất Alkaloid Carpaine, Carotenoid, Flavonoid và một số Triterpene Đồng thời, cặn chiết lá Đu đủ đã được chứng minh là có tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư

PHẦN 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu tách chiết hợp chất Flavonoid và xác định được hàm lượng một số chất có tính sinh hóa có trong dịch chiết lá Đu đủ, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng lá Đu đủ trong công nghệ chế biến thực phẩm và công nghệ y dược

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly Flavonoid từ lá cây Đu đủ (Ảnh hưởng của nồng độ Ethanol, Ảnh hưởng của nhiệt độ, Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Ethanol, Ảnh hưởng của thời gian chiết bằng Ethanol)

- Xác định một số đặc tính sinh hóa của dịch chiết lá Đu đủ (Xác định hàm lượng axit toàn phần, Xác định hàm lượng đường tổng, Xác định hàm lượng vitamin C)

- Xác định khả năng kháng một số vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá

Đu đủ

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu thực vật, vi sinh vật

- Đối tượng nghiên cứu: Lá của cây Đu đủ Carica papaya Linn

- Vật liệu thực vật: Sử dụng 3 loại lá (Lá non, lá bánh tẻ, lá già) của những cây Đu đủ trưởng thành, không bị sâu bệnh

- Lá Đu dạng lá non, lá bánh tẻ, lá già được phân biệt qua hình thái và màu sắc lá Lá non xanh cốm, bản lá mỏng Lá bánh tẻ xanh đậm hơn lá non, bản lá dày Lá già xanh đậm, bản lá dày và cứng (Hình 2.1)

Lá non Lá bánh tẻ Lá già

Hình 2.1 Các dạng lá của cây Đu đủ

- Vật liệu vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn kiểm định do Phòng Công nghệ

Vi sinh-Hóa sinh, Viện CNSH Lâm nghiệp cung cấp, gồm:

chiết nấm men, C7H4N2O7, KNaC4H4O6.4H2O, C6H5OH, Na2S2O5, Etyl Axetat (CH3COOC2H5), Chlorofom, n-Hexan, Axit- 3,5- dinitrosalicylic (C7H4N2O7), Muối Seignett (KNaC4H4O6.4H2O), Phenol (C6H5OH) nóng chảy ở 50o

C, Natri metabisunfut (Na2S2O5) Các hóa chất sử dụng trong đề tài do Việt Nam, Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ sản xuất

- Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu là các loại máy móc gồm:

+ Tủ cấy (Box laminer PII)- Đức + Cân điện tử

+ Nồi hấp khử trùng (lequenx) – Pháp + Bếp điện/bếp từ

+ Máy đo pH (Accument) – Mỹ + Máy gia nhiệt

+ Các dụng cụ, thiết bị khác: ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, que trang, pipet thường, pipetman, cốc đong, ống đong, bình tam giác với

đủ các dung tích khác nhau, đĩa pipet, đèn cồn, giấy thấm, giấy lọc, giấy cân, giấy bạc …

2.3.4 Địa điểm bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh- Hoá sinh thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp

2.4 Phương pháp nghiên cứu

- Phải tuân thủ nguyên tắc lặp lại với số lần lặp ≥ 3

- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.4.2.1 Xác định độ ẩm trong nguyên liệu lá cây Đu đủ

Độ ẩm là lượng nước tự do có trong lá Đu đủ ở các giai đoạn khác nhau (lá bánh tẻ, lá non và lá già), được xác định bằng phương pháp sấy khô

Nguyên lý: Dùng nhiệt làm bay hết hơi nước trong mẫu Cân trọng lượng

mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được lượng nước trong mẫu

Tiến hành:

- Cân 10g lá mỗi loại đã được rửa sạch để khô ráo, cho vào đĩa đã được sấy khô đến khối lượng không đổi

- Cho đĩa chứa mẫu (lá) vào tủ sấy ở nhiệt độ 80oC đến khi lá khô (khoảng 24h)

- Lấy đĩa chứa mẫu ra tiến hành cân tính khối lượng trên cân phân tích

- Cho lại mẫu vào tủ sấy và tiến hành lặp lại quá trình trên lần thứ hai và những lần tiếp theo nữa cho đến khi khối lượng giữa ba lần cân liên tiếp là không đổi, hoặc có sai số không cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam ban đầu thì dừng quá trình sấy Ghi lại giá trị khối lượng đó

Cách tính độ ẩm:

Độ ẩm mỗi mẫu là H =

100%

Trong đó H là độ ẩm (%)

mo: khối lượng mẫu trước khi sấy

m1 : khối lượng mẫu sau khi sấy

2.4.2.2 Tách chiết Flavonoid từ lá cây Đu đủ

Tách chiết Flavonoid gồm các bước được mô tả trong Hình 2.2

xử lý mẫu sấy khô, xay thành bột

Chiết bằng nước cất và Ethanol

Đun cách thủy

Chiết bằng nước cất nóng

Chiết bằng Chlorofom (loại tạp)

Chiết bằng Ethyl Acetate

Cô cạn ở nhiệt độ thấp

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần

Dịch hòa tan cao lá

Đu đủ Cao lá Đu đủ

Flavonoid tổng số

Dịch chiết lá Đu đủ

Dịch chiết 5g mẫu

Dịch chiết

Lá Đu đủ

2.4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly Flavonoid

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến khả năng trích ly:

Tiến hành:

- Cân 5g lá, cho vào bình nón

- Chiết ở nhiệt độ phòng bằng Ethanol với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:15 ở các nồng độ Ethanol 60%, 80%, 90% trong vòng 24h, ở nhiệt độ 60oC

- Lọc bỏ bã, lấy dịch chiết

- Cô cạn dịch chiết bằng cách đun cách thủy

- Thêm 30ml nước cất để hòa tan phần cặn bám xung quanh bình, được dung dịch chứa cao lá Đu đủ

- Dùng pipet thêm vào mỗi mẫu 20 ml Chlorofom, lắc đều 15 phút để loại protein và tạp, thực hiện 3 lần Mỗi lần loại bỏ phần màu xanh lắng xuống dưới

- Thêm vào mỗi mẫu 20 ml Etyl Acetat để loại bỏ keo và nhựa có trong dung dịch cao lá Đu đủ, lắc đều dung dịch Dồn dịch chiết Ethyl Acetate lại và

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ trong khi trích ly Flavonoid:

Cân xác định trọng lượng Flavonoid được chiết ở các nồng độ khác nhau

để xác định công thức với nồng độ Ethanol thích hợp để chiết suất Flavonoid cho hiệu quả cao nhất Chiết bằng Ethanol với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:15 Thực hiện trích ly Flavonoid ở nhiệt độ lạnh (3oC), nhiệt độ phòng (30oC)

và nhiệt độ nóng (60oC)

- Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi đến khả năng trích ly:

Sử dụng nồng độ Ethanol và nhiệt độ cho hiệu suất trích ly Flavonoid cao nhất ở thí nghiệm trên để thực hiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi

Khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu bột lá Đu đủ: dung môi Ethanol là 1/10, 1/15, 1/20

Hàm lượng Flavonoid trích ly được tương ứng với mỗi công thức thí nghiệm được sử dụng xác định tỷ lệ nguyên liệu / dung môi tối ưu nhất

- Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết bằng Ethanol đến khả năng trích ly:

Sử dụng nồng độ Ethanol, nhiệt độ và tỷ lệ nguyên liệu: dung môi cho hiệu suất trích ly Flavonoid cao nhất ở trên để khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết bằng Ethanol đến khả năng trích ly Flavonoid Khảo sát ở 12h, 24h, 36h

Hàm lượng Flavonoid chiết suất được là cơ sở cho lựa chọn thời gian trích

• Phản ứng với dung dịch kiềm

Tiến hành: Pha mẫu thử trong Ethanol với một lượng sao cho nhận được dung dịch màu vàng nhạt Chia dung dịch nhận được vào 2 ống:

Ống 1: dùng làm ống đối chứng

Ống 2: nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH

Nếu trong dịch mẫu có Flavonoid thì ống 2 tạo sản phẩm màu vàng nâu

do các nhóm OH của Flavonoid tạo muối kiềm với NaOH

 Phản ứng với FeCl 3

Tiến hành: Nhỏ dung dịch FeCl3 5% trong nước vào ống nghiệm có đựng mẫu thử đã được pha loãng bằng Ethanol 96% Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen

2.4.2.5 Xác định nồng độ axit toàn phần

Độ axit toàn phần (độ chua) được tạo thành do sự có mặt của tất cả các loại axit có trong lá và có thể định lượng được bằng một dung dịch kiềm chuẩn Các axit có trong lá Đu đủ chủ yếu là axit Malic, axit Ascorbic (vitamin C), axit Pantothenic (vitamin B5), axit Lactic,

Nguyên lý của phương pháp: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH) để

trung hoà hết các axit trong mẫu, với phenolphtalein làm chỉ thị màu

Hóa chất:

- Dung dịch NaOH 0,1N

- Thuốc thử phenolphthalein 1% trong cồn

Tiến hành:

- Cắt mẫu, bỏ những phần gân lá lớn, cân thật chính xác 10g lá Đu đủ

- Dùng dao cát nhỏ mẫu rồi cho vào cối xứ nghiền nát, cho 25 ml nước cất vào mẫu đã nghiền nát rồi lắc đều trong khoảng 10-20 phút

- Dẫn nước trung tính đến vừa đủ 50ml, để lắng thu 25ml nước ở trên để định lượng Khi định lượng, cho vào dịch mẫu 5 giọt thuốc thử phenolphthalein 1% trong cồn

- Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững

- Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: X1=

(%)

Nguyên tắc của phương pháp DNS:

Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử Dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Thủy phân mẫu:

Tiến hành thủy phân lá Đu đủ tươi bằng dung dịch HCl 3%, đun trong 1h Dịch mẫu sau đó được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và trung hòa bằng NaOH trước khi cho phản ứng với thuốc thử DNS để xác định hàm lượng đường khử

Xác định hàm lượng đường khử bằng phản ứng với thuốc thử DNS:

Lấy 1ml dịch mẫu đã thủy phân, cho vào ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS Đun sôi 5 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 21ml nước cất vô trùng để pha loãng mẫu Đo cường độ màu ở bước sóng 540nm Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường khử

Mẫu đối chứng: 3ml nước cất + 1ml thuốc thử DNS

Phương pháp xây dựng đường chuẩn glucose: Pha loãng glucose theo các

nồng độ từ thấp đế cao (từ 0,1-1mg/ml), lấy 1ml dung dịch glucose chuẩn vào ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS, đun sôi 5 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 21ml nước cất vô trùng để pha loãng mẫu Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm Đối chứng là 1ml nước cất