Nghiên cứu nhân giống in vitro phi điệp tím hòa bình (dendrobium anosmum linld ) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng

Riva và cộng sự 2016 đã nghiên cứu quy trình tái sinh và nhân nhanh in vitro của Dendrobium bensoniae được kết luận như sau: Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP là tốt nhấ

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian được học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm Nghiệp với sự hướng dẫn nhiệt tình, đầy tâm huyết của các thầy, các cô đã giúp cho em có thêm được những kiến thức mới và những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống Được sự đồng ý của ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm Nghiệp và giáo

viên hướng dẫn em xin được thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Linld.) bằng kỹ thuật nuôi cấy lát

mỏng”

Có được kết quả hiện tại trước hết em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới

cô giáo Th.s Nguyễn Thị Thơ và TS Khuất Thị Hải Ninh đã tận tâm hướng dẫn chỉ bảo, động viên em và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong quãng thời gian học tập Em xin cảm ơn cô Th.s Nguyễn Thị Thơ, cô đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho em rất nhiều không chỉ về kiến thức mà còn về những kinh nghiệm trong công việc và trong cuộc sống Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô và toàn bộ cán bộ viên chức tại bộ môn Tài nguyên thực vật rừng đã giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến quý báu

để quá trình thực hiện nghiên cứu của em thuận lợi

Em xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh bên em Trong quá trình thực hiện đề tài còn nhiều hạn chế về kinh nghiệm của bản thân nên không thể tránh được những sai sót nên em rất mong nhân được những lời nhận xét và đóng góp của các thầy, các cô để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2019 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Giới thiệu về Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái: 3

1.1.3 Đặc điểm sinh học của Phi điệp tím 3

1.1.4 Phân bố 4

1.1.5 Một số điều kiện sinh thái 4

1.1.6 Giá trị sử dụng 6

1.1.7 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào: 6

1.1.8 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro chi Dendrobium: 8

1.1.9 Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng 12

1.1.10 Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng chi Dendrobium 15

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Mục tiêu 20

2.2 Nội dung 20

2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro 20

2.2.2 Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi lan Phi điệp tím từ lát mỏng 20

2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Phi điệp tím 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm: 20

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm: 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu: 21

2.4.1 Phương pháp tạo mẫu sạch lan Phi điệp tím Hòa Bình 21

2.4.2 Phương pháp tái sinh chồi từ lát cắt mỏng 21

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi 23

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả tạo mẫu sạch 25

3.2 Kết quả tái sinh chồi từ lát cắt mỏng 26

3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi…… 26

3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi 28 3.3 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Phi điệp tím Hòa Bình 30

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

4.1 Kết luận 33

4.2 Tồn tại 33

4.3 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Giải thích

1 MS Murasighe và Skoog (1962)

2 IBA 3 - Indole butyric acid

3 NAA Α - Naphthaleneacetic acid

4 Kinetin 6 – furfuryl aminopurine

5 BAP 6 – Benzyl aminopurine

6 2,4 - D 2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid

8 CTTN Công thức thí nghiệm

9 PLBs Protocom – like bodies

10 tTCL traverse thin cell layer (lớp cắt mỏng theo chiều ngang)

11 lTCL Longitudinal thin cell layre (lớp mỏng tế bào cắt theo chiều doc)

12 IAA 3 – indole acetic acid

15 2ip N6- (2-isopentyl) adenine

16 WPM Woody Plant Medium

22 VW Vacin and Went, 1949

23 MVW modified Vacin and Went

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm và thống kê kết quả nghiên cứu 21Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm và biểu thu thập số liệu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới khả tái sinh chồi từ lát mỏng lan Phi điệp tím Hòa Bình 22Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi Phi điệp tím 23Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh chồi từ lát mỏng lan Phi Điệp Tím Hòa Bình 23Bảng 3.1 Kết quả tạo mẫu sạch từ chồi Phi điệp tím 25Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tái sinh chồi Phi điệp tím 27Bảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi Phi điệp tím 29Bảng 3.4 Kết quả nhân nhanh chồi Phi điệp tím Hòa Bình 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ảnh lan Phi điệp tím Hòa Bình 2

Hình 3.1 Chồi lan Phi điệp tím Hòa bình tái sinh trên môi trường vào mẫu 26

Hình 3.2 Chồi tái sinh trên môi trường: 28

Hình 3.3 Chồi Phi điệp tím Hòa bình tái sinh trong điều kiện ánh sáng 30

Hình 3.4 Chồi Phi điệp tím Hòa Bình sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh chồi 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phi điệp tím Hòa Bình có tên gọi khác là giã hạc hay giả hạc thuộc chi

hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium anosmum Lindl Phi điệp tím Hòa

Bình là giống lan quý của rừng nhiệt đới được nhiều người chơi lan ưa chuộng không chỉ bởi khuôn bông đẹp, cây sai hoa mà còn đẹp về cả màu sắc lẫn hình dáng Cánh hoa tao nhã, trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím đậm, nhất là bộ phận môi hoa có cấu trúc phức tạp và độc đáo Phi điệp tím Hòa Bình có hương thơm đặc biệt, dễ chịu, thoang thoảng mà hầu như không có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được Phi điệp tím Hòa Bình đặc trưng riêng so với các loại Phi điệp có nơi phân bố khác về hình dạng, màu sắc hoa Hoa Phi điệp tím hòa bình sẽ có cánh hoa to hơn, có màu đậm hơn

và có hương thơm đặc biệt hơn hoa Phi điệp ở khu vực phân bố khác Ngoài giá trị làm cảnh, Phi điệp tím Hòa Bình còn có giá trị làm thuốc để điều trị nhiều bệnh về da, suy nhược thần kinh và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Vì vậy, Phi điệp tím Hòa Bình mang lại hiệu quả kinh tế cao [13], [17]

Lan Phi điệp nói riêng và các loại lan thân thòng nói chung khách rất ưa chuộng nhưng khi mua họ cần rõ mặt hoa như thế nào? Vì thực tế, mặt hoa của lan rất đa dạng Vì vậy, với phương pháp gieo hạt không thể đảm bảo cây giống

có mặt hoa giống như cây mẹ Vì vậy cần thiết phải nhân giống vô tính Tuy nhiên, nhân vô tính bằng cách nhân kei lại có hạn chế về nguồn mẫu ban đầu Phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào có thể giải quyết vấn đề này

Chính vì những lý do trên, tôi lựa chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu

nhân giống in vitro Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Linld.)

bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.)

1.1.2 Đặc điểm hình thái:

Thân: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc dạng thân thòng, thân có thể dài tới 2

m buông rũ xuống Phi đệp tím Hòa Bình mọc thành từng cụm, thuộc nhóm đa thân và thân có giả hành Gỉa hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới và duy trì sự sống Thân chia thành nhiều đốt, mỗi đốt chứa một mắt ngủ Độ dài đốt phụ thuộc vào độ tuổi của cây, môi trường… Màu sắc thân Phi điệp tím Hòa Bình rất đa dạng từ màu xanh, chấm tím và tím tùy từng giai đoạn, đường kính thân có thể tới 1,5 cm khi vào mùa nghỉ Thân già các đời trước thì thường khô teo, màu nâu tím hoặc vàng như rơm, bóng [13], [17]

Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nước, dài 10 -15 cm, rộng từ 3 -4

cm Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhon [17]

Rễ: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đường kính nhỏ khoảng 1,5 – 2 mm, có hình trụ Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [17]

Hoa: Hoa Phi đệp tím không những mọc trên những giả hành mới mà còn

mọc trên các giả hành cũ Hoa Phi điệp tím Hòa Bình thưởng nở vào cuối xuân –

đầu hè (tháng 4 – 6 dương lịch), hoa to tới 10 cm, mọc từ 1 – 3 chiếc ở các đốt

đã rụng lá Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím đậm Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (2 – 3 tuần lễ) Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [13], [17]

Quả: Quả của Hoàng thảo Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại quả nang, nở

ra theo 3 – 6 đường nứt dọc Khi chín quả nở ra, các mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, chứa đầy không khí Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [17]

1.1.3 Đặc điểm sinh học của Phi điệp tím

Thân: Là cây đa thân, có thân giả hay giả hành chứa diệp lục, là cơ quan

dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để duy trì sự sống lâu hơn loài đơn thân

Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng Củ giả hành có màu xanh bóng, cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [17]

Lá: Là cơ quan cung cấp dinh dưỡng bằng quang hợp Lá thường rụng vào mùa thu, đông khi cây đã thắt ngon và bước vào mùa nghỉ [17]

Rễ: Rễ Phi Điệp Tím Hòa Bình thuộc rễ bì sinh, xung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp [13]

Hoa: Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực

ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc phấn Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc phấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng [13]

1.1.4 Phân bố

Phi điệp tím có xuất xứ ở nhiều nơi đặc biệt là Đông Nam Á như: Lào,

Campuchia, Thái Lan [17]

Tại Việt Nam có ở các tỉnh như Cao Bằng, Hòa Bình, Phú Thọ, Thanh Hóa, Tây Ninh…Tuy nhiên, tùy vào xuất xứ mà Phi điệp tím mang đặc trưng riêng Đặc biệt, Phi điệp tím Hòa Bình có hình dạng, màu sắc, hương thơm và vẻ đẹp độc đáo riêng biệt so với phi điệp khác bởi cánh hoa to hơn, màu sắc và hương thơm đặc biệt [17]

1.1.5 Một số điều kiện sinh thái

1.1.5.1 Ánh sáng

Phi điệp tím là cây ưa sáng nên có thể trồng nơi có nhiều ánh sáng nhưng không nên phơi dưới thời tiết nắng nóng cả ngày, dễ có thể bị cháy lá non Tốt nhất nên có thêm một lớp lưới che bảo vệ cây, giúp cây hấp thụ đủ lượng ánh sáng cần thiết mỗi ngày Cây trồng không nên ở chỗ râm quá, cây sẽ quặt quẹo,

lá xanh sẫm, thân lá còi nhỏ Nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó lòng

ra hoa

1.1.5.2 Nhiệt độ

Lan Phi điệp tím chịu nóng và chịu lạnh rất tốt vào mùa nóng cây có thẻ chịu được nhiệt độ lên đến 38 độ C, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu được nhiệt độ xuống thấp đến mức 3,3 độ C Tuy nhiên, vào mùa đông nếu nhiệt độ không lạnh dưới 15-16 độ C kéo dài trong khoảng 4-6 tuần lễ thì giả hạc khó lòng ra nụ

1.1.5.3 Độ ẩm và độ thông thoáng

Phi điệp tím cũng cần nhiều độ ẩm vào thời điểm các thân non phát triển

Độ ẩm thông thường khoảng 60 – 70% Loài này cũng thích sống trong điều kiện thoáng gió vậy nên ghép vào dớn bảng, ghép gỗ rất thích hợp, dáng cây thòng xuống, buông hoa rất đẹp và lại an toàn, thoáng, đỡ sợ úng, nấm

1.1.5.4 Lượng nước

Nước là điều kiện cần thiết cho sự phát triển của lan, việc tưới nước đúng cách sẽ giúp cây sinh trưởng ổn định và ra hoa đều Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh cần tưới 2-3 lần một tuần Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng, nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi

bị teo lại Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngừng hẳn việc tưới nước Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1-2 lần

1.1.6 Giá trị sử dụng

1.1.6.1 Giá trị thẩm mỹ

Lan Phi điệp tím Hòa Bình được mệnh danh là món trang sức đẹp nhất mà thiên nhiên ưu đãi ban tặng cho loài người Màu sắc hoa quyến rũ, trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mặt tím đậm với hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (2 – 3 tuần lễ) Thân cao khỏe và rất siêng hoa, một giả hành một lúc có thể cho rất nhiều phát hoa Chính vì lẽ đó, Phi điệp tím Hòa Bình thường được con người dùng để thưởng lãm vẻ đẹp hay làm cảnh, trang trí, làm đẹp không gian sống [13], [17]

1.1.6.2 Giá trị kinh tế

Khác với các dòng lan phi điệp khác, Phi điệp tím Hòa Bình mang lại giá trị kinh tế khá cao bởi sự đẹp lạ và độc đáo của nó Phi điệp tím Hòa Bình đã chiếm một vị trí quan trọng điểm tô trong các trong các hội nghị, đám cưới, bàn tiệc hay trang trí cô dâu … [2]

Phi điệp tím Hòa Bình được khai thác và bán với giá khá cao Năm 2017, giá lan phi điệp tím phổ biến trong khoảng từ 1,2 triệu cho đến 1,5 triệu thậm chí bán với giá 1,8 triệu/kg phi điệp tím Năm 2019 giá lan Phi điệp tím tính theo kg vào khoảng 6-7 triệu/kg

Ngoài ra, lan Phi điệp tím Hòa Bình còn được dùng để chiết suất tinh dầu thơm dùng trong công nghiệp hóa mỹ phẩm (nước hoa) mang lại giá trị kinh tế cho con người [2]

1.1.6.3 Giá trị y học

Ngoài giá trị làm cảnh, lan Phi điệp tím Hòa Bình còn có giá trị làm thuốc

mà ít ai biết được trong điều trị nhiều bệnh về da, suy nhược cơ thể, suy nhược thần kinh, đau họng, thiểu năng sinh dục nam giới, và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể…

1.1.7 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào:

1.1.7.1 Giới thiệu về kĩ thuật lớp mỏng tế bào:

Phương pháp cấy lát mỏng tế bào (TCL) (Jaime, 2003), có nguồn gốc cách đây gần 30 năm với việc khảo sát sự sinh trưởng phát triển ở hoa, rễ, cành

và phôi soma trên cây thuốc lá [7]

Lớp mỏng tế bào là những mẫu cấy có kích thước nhỏ, được cắt ra từ các

cơ quan thực vật như thân, lá, rễ, hoa, các bộ phận của hoa…Có hai loại lớp mỏng tế bào:

- Nếu cắt theo chiều dọc (lTCL: longitudinal thin cell layer) ta được mẫu

cấy chỉ bao gồm 1 loại tế bào như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp của tế bào vỏ

- Nếu cắt theo chiều ngang (tTCL: transverse thin cell layer) ta được mẫu

cấy bao gồm nhiều loại tế bào như biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch cũng như nhu mô…

Sự phát triển và biệt hóa của các tế bào thực vật đều bị chi phối bởi chương trình điều khiển sự biệt hóa và phát sinh hình thái của cơ thể thực vật Nếu cắt mô thành những lớp mỏng chừng vài lớp tế bào và đặt vào môi trường nuôi cấy thích hợp thì chúng có thể thoát khỏi sự ức chế và có khả năng phát sinh hình thái một cách độc lập thông qua sự tái lập trình các thông tin di truyền trong tế bào [7]

1.1.7.2 Ưu điểm của kĩ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào:

Mẫu cấy tiếp xúc trực tiếp với môi trường và diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường [11]

Dễ định vị cho vùng phản ứng do chỉ có 1 loại lớp mỏng tế bào

Lượng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác động lên mẫu

Hệ thống TCL có sự hình thành nhiều loại cấu trúc, có những cấu trúc mới

Mẫu nuôi cấy đồng nhất và nhanh chóng đáp ứng các phản ứng Từ đó, rút ngắn thời gian nghiên cứu và chương trình biệt hóa riêng biệt tùy vào mục tiêu và mục đích nghiên cứu

Phôi và các cơ quan sơ khởi được hình thành ở tần số cao (là do số lượng

tế bào được cảm ứng phát sinh hình thái cao)

Nâng cao năng suất chuyển gen thực vật, tiềm năng tái sinh cao và mở rộng ra cho các loài khó tái sinh góp phần cải thiện giống thực vật

Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến đổi

Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan và giữa cơ quan với toàn bộ

cơ thể thực vật [11]

1.1.8 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro chi Dendrobium:

1.1.8.1 Trên thế giới:

Urvashi Sharma và cộng sự (2006) đã xây dựng quy trình nhân giống vô

tính Dendrobium microbulbon A Rich được kết luận như sau: Môi trường cơ

bản Murashige và Skoog (MS) được bổ sung với các nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin có thể sử dụng một mình hoặc kết hợp để tạo cảm ứng, nhân,

kéo dài và tạo rễ của chồi in vitro Môi trường MS được tăng cường với 3%

sucrose, 7,5 mg/l (IAA) và 20 mg/l (BAP) bắt đầu xuất hiện chồi nách Môi trường MS với 2,0 mg/l BAP tạo ra số lượng chồi tối đa (39 chồi),và sự phát

triển của chồi Chồi in vitro được bắt nguồn từ Knop với vitamin và muối sắt

Trong quá trình thích nghi, 60% số cây con đã sống sót sau khi được đưa ra khỏi

điều kiện in vitro

M Maridass và cộng sự (2010) đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro Dendrobium nanum Hook F từ chồi thân rễ thu được kết quả sau: Tỷ lệ cảm

ứng mô sẹo tối đa thu được trên môi trường MS với 2,0 µM/l NAA và 1,2 µM/lkinetin Hiệu quả tối đa của cảm ứng chồi (15,78 ± 0,37mm) được quan sát thấy trên môi trường cơ bản được bổ sung 0,5 µM/l BAP Khi đưa ra môi trường sống tự nhiên của chúng có 85% tỷ lệ sống sau 3 tháng

Sana Asghar và cộng sự (2011) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Dendrobium nobile var Emma white đưa ra kết luận như sau: Môi trường MS

được bổ sung 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 và 3,0 mg/l của BAP và Kinetin, nước dừa (CW) ở mức 50 , 100, 150, 200, 250 và 300 ml Ở mức 2 mg/l BAP số lượng chồi tối đa (4,33), trọng lượng tươi và khô (752,5 và 52,99 mg), tại 1,5 mg/l Kin

có chiều dài chồi cao nhất (4,18 cm) Nồng độ BAP, Kin (3.0 mg/l) và nước dừa (300 ml) cao hơn dẫn đến vàng, chồi hoại tử và tăng trưởng kém Hai chất auxin được sử dụng là IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5, 1,0, 1,5, 2.0, 2.5 và 3.0 mg/l) trên môi trường MS Ta thấy, IBA ở mức 2 mg/l tăng tỷ lệ ra rễ (97,5%) số rễ (4,70) và chiều dài rễ (3,47 cm) hiệu quả hơn NAA Nồng độ IBA

và NAA cao hơn 3.0 mg/l cho thấy kết quả ra rễ kém

A N Pyati và cộng sự (2002) đã nghiêm cứu thành công quy trình nhân

giống in vitro của Dendrobium macrostachyum Lindl được kết luận như sau:

Môi trường nuôi cấy cơ bản MS được bổ sung thêm BAP (2,22, 4,44 và 8,88 µM), Kinetin (2,32, 4,65 và 9,29 µM), và nước dừa (5,10 và 15%) riêng lẻ hoặc kết hợp với 2,69 µM NAA Mô sẹo được tạo ra trực tiếp từ môi trường có bổ sung BAP, Kinetin, nước dừa Số chồi tối ưu 6 chồi/mẫu và mô sẹo được tạo ra trên môi trường bổ sung 15% nước dừa Chồi rễ phát triển trung bình 5 rễ/chồi

S S Riva và cộng sự (2016) đã nghiên cứu quy trình tái sinh và nhân

nhanh in vitro của Dendrobium bensoniae được kết luận như sau: Tái sinh trên

môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP là tốt nhất, tốt hơn nồng độ khác của BAP và BAP + IBA trong nghiên cứu Số lượng chồi và lá cao nhất tại 1,0 mg /l BAP + 1,5 mg /l IBA được bổ sung vào môi trường MS Đối với rễ, 0,5 mg /l BAP + 1,0 mg /l IBA được tìm thấy là hiệu quả nhất Các cây con có rễ tốt đã được thích nghi thành công dưới độ ẩm 70-80% Sau khoảng thời gian trồng, có 85% cây con sống sót

1.1.7.2 Tai Việt Nam

Nguyễn Văn Việt (2017) đã nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro thành công trong vi nhân giống lan Hoàng Thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley)

thu được kết quả: Sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch Hgcl2 0,1% trong 12 phút và nuôi cấy trên môi trường Knops, cho tỷ lện mẫu sạch là 86,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi (protocom) là 76,7%, với thời gian phát sinh chồi 5 tuần Cảm úng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,8 mg/ml, Kinetin 0,3 mg/ml, MAA 0,1mg/ml, dịch chiết khoai tây 100ml/l, nước dừa 100ml/l, sucrose 30g/l, agar 5g/l cho hệ số nhân chồi cao nhất 10,3 sau 5 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ 100% với số rễ trung bình 4,8 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 3,6 cm khi nuôi trên môi trường Knops bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA o,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100ml/l, sucrose 20g/l sau 5 tuần nuôi cấy Cây con hoàn chỉnh được huấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể dớn

trắng, xử lý giá thể 2 ngày trong nước, cho tỷ lệ sống 89%

Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự (2013) đã xây dụng thành công quy trình

tạo cây con bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro lan Phi Điệp Tím (Dendrobium anosmum) từ nguồn vật liệu ban đầu là quả Lan Phi điệp tím được kết quả như

sau: Quả lan được khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút và khử trùng bằng NaOCl 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt và lỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất Môi trường Knuds có bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAP cho hệ số nhân nhanh thể chồi đạt 5,8 lần/3 tuần, chất lượng thể chồi tốt Sau 4 tuần, công thức bổ sung 30g/l sucrose + 0,5 mg/l GA3 + 0,1 mg/l Kinetin chồi tăng trưởng tốt nhất (2,45 cm), chất lượng chồi tốt Công thức bổ sung 0,5 mg/l IBA và công thức 0,3 mg/l IBA +0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt trên 3 rễ/chồi, chất lượng rễ tốt Khi cây có chiều cao > 4 cm, có 3 – 4 rễ ta đem bình cây ra huấn luyện ở điều kiện tự nhiên 1 tuần, rửa sạch thạch, đưa cây ra trồng trên giá thể

Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile lindl (Thạch Hộc) và đưa ra kết luận:

Nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là

MS + (100ml nước dừa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít môi trường Trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC+ (100ml nước

dùa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100ml

nước dừa + 10g sucrose + 6,0g agar)/lít Trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy

lỏng lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt

1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển Nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm

25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm 1/2 thời gian nhân giống

Nguyễn Thị Lý Sơn và cộng sự (2014) đã xây dựng môi trường nhân

giống in vitro Lan Dendrobium officinle Kimura et Migo (Thạch hộc Thiết Bì)

kết quả chỉ ra như sau: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường (VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường (MS + 100ml nước dừa + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín)/lít môi trường Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân

mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi

trường (MS + 20g sucrose + 10% nước dừa + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l NAA + 6g agar)/lít môi trường

Vũ Kim Dung và cộng sự (2016) đã xây dựng thành công quy trình nhân

giống lan Hoàng Thảo Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimun Reichenb.f) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro kết quả nghiên cứu cho thấy: Sát khuẩn bề mặt

quả lan bằng ethanol 70% trong 2 phút, khử trùng bằng dung dịch Hgcl20,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l cho tỷ lệ mẫu sạch là 96,67% tỷ lệ mẫu phát sinh protocom 90% với thời gian phát sinh chồi 20 ngày Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3 mg/l, Kinetin 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100mg/l, nước dừa 100mg/l, sucrose 30g/l, cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (9,53 và 96,67%) sau 4 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ 93,33% và chiều dài rễ trung bình 3,22 cm khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, sucrose 20g/l sau 5 tuần nuôi cấy

Vũ Thanh Sắc và cộng sự đã xây dựng quy trình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo Trám Trắng (Dendrobium anosmum var alba) được kết

luận như sau: Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy là protocom và cây con sau

gieo hạt Các thí nghiệm được tiến hành trên môi trường rắn Cây con in vitro

được cấy trên môi trường khoáng thích hợp có bổ sung 20 g/l sucrose, 10g/l agar, chất kích thích sinh trưởng và các chất hữu cơ Môi trường thích hợp cho nhân nhanh và sinh trưởng là ½ MS + 20 g/l sucrose + 10g/l agar + 1,5 mg/l kinetin + 120 g/l chối xanh nghiền + 10% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính Cụm

cây nuôi cấy gồm 5 cây sẽ thích hợp cho sự sinh trưởng của cây con in vitro

1.1.9 Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng

1.1.9.1 Trên thế giới

Nararatn Wattanapan và cộng sự (2018) đã đã xây dựng quy trình nhân

giống Lan Paphiopedilum callosum var sublaeve (họ phong lan) bằng lát mỏng

ngang (tTCL) được rút ra kết luận sau: Nuôi cấy hạt giống 2 tuần trong nước cất trước khi chuyển sang môi trường MS là điều kiện tối ưu để thúc đẩy hạt nảy mầm trong ống nghiệm Các lớp tế bào mỏng ngang (tTCL) được nuôi cấy trên môi trường rắn MVW chứa 1,0 mg/l TDZ trong 8 tuần cung cấp tỷ lệ protocorm – like bodies (PLBs) được tái sinh cao nhất (46,67 ± 6,67), sự hình thành chồi (40,00 ± 5,16), sự hình thành rễ (30,00 ± 12,38) và tỷ lệ sống (70,00 ± 4,47) Các cây trồng thích nghi trong nhà kính tăng trưởng tốt với tỷ lệ sống 80%

Ravindra B Malabadi và cộng sự (2008) đã xây dựng quy trình vi nhân

giống của Eria dalzelli (Dalz.) Lindl bằng lát mỏng tế bào được kết luận sau:

Protocom – like bodies (PLBs) quan sát thấy khi cắt lát mỏng ngang chóp chồi

và được nôi cấy trên môi trường Mitra et al (1976) môi trường cơ bản có bổ

sung 9,08 µM TDZ cho tỷ lệ sống cao nhất của protocom – like bodies là 96%, tạo ra chồi khỏe với 2 -3 lá Rễ được tạo ra trên môi trường cơ bản bổ sung với 11,42 µM IAA.Cây con sinh trưởng bình thường với tỷ lệ sống 96%

Shivani Vyas và cộng sự (2010) đã nghiên cứu quy trình ảnh hưởng của

nước (CW) dừa đến vi nhân giống Cymbidium Sleeping Nymph thông qua

protocom – like bodies (PLBs) bằng lớp mỏng tế bào được kết quả: Cắt lớp

mỏng ngang tế bào (tTCL) của Cymbidium Sleeping Nymph trong 2 giai đoạn

PLBs (30 ngày và 60 ngày tuổi) và được bổ sung nước dừa Với 5% nước dừa

được bổ sung vào môi trường KC tạo ra 5 protocom – like bodies (PLBs) trên mỗi tTCL của 30 ngày tuổi PLBs đạt tỷ lệ là 83% Một tỷ lệ thấp các tTCL được quan sát thấy trong 60 ngày của PLBs Tỷ lệ tái sinh chồi cao đáng kể thu được

từ các PLBs được hình thành trên 1 - 10% CW từ các tTCL của PLBs trong 30 ngày tuổi so với PLBs trên môi trường KC (không có CW) Các PLBs cảm ứng được tái sinh thành cây con có rễ mềm và những cây con này đã được chuyển

đến điều kiện nhà kính có tỷ lệ sống gần 100%

1.1.9.2 Tại Việt Nam

Nguyễn Văn Việt (2017) đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng trong

nhân giống in vitro của Chirysanthemum indicum và đưa ra kết luận: Khử trùng

bằng dung dịch HgCl2 trong 6 phút và cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 30g/l đường, 7 g/l agar Mẫu nuôi cấy có tỷ lệ sống đạt 81%, chồi được tạo ra sau 4 tuần nuôi cấy Mô sẹo được cảm ứng và tái sinh chồi trên môi trường MS với 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin, 0,2 mg/l NAA đã thu được với 82,2% và 80% tương úng Trung bình sau 20 ngày chồi được tạo

ra Trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin , 0,1 mg/l NAA tạo đa chồi đạt 4,31 và chiều dài dài chồi 4,91 cm Chồi tạo ra xanh và khỏe mạnh Tỷ lệ ra rễ cao nhất là 97,78% thu được trên môi trường MS với 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA và chiều dài chồi là 6,97 cm sau 4 tuần nuôi cấy

Nguyễn Thị Thúy Diễm (2015) đã xây dựng quy trình nhân giống cây Đại

Hồng Môn (Anthurium andreanum L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào được đưa ra như sau: Các mẫu cấy của cây Đại hồng môn in vitro bao gồm

lá non, cuống lá và đoạn thân được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 15

% nước dừa, 30 g/l đường, 7 g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng như BA, TDZ, 2,4 – D, NAA ở các nồng độ khác nhau Môi trường thích hợp tạo mô sẹo

từ lá là MS bổ sung 0,5 mg/l BA với 0,1 mg/l 2,4- D, cuống lá là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D với 0,5 mg/l TDZ, đoạn thân là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D với 1,0 mg/l TDZ Môi trường để tạo chồi là MS bổ sung 0,5 mg/l NAA với 1,0 mg/l TDZ, môi trường nhân chồi là MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D với 0,2 mg/l

TDZ đạt 17,4 chồi Môi trường tạo rễ là MS bổ sung 15 mg/l Putrescine Thuần

dưỡng cây Đại hồng môn in vitro với giá thể tro trấu + mụn dừa (1:1) cho tỷ lệ

sống cao

Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái của cây Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro được đưa ra như sau:

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (NAA, 2,4-D, BAP và TDZ riêng lẻ hoặc kết hợp) Sau 10 tuần nuôi cấy, mẫu lá tTCL_L, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự phát sinh phôi, mô sẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh

mô sẹo và rễ Trong đó, tỷ lệ phát sinh phôi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao nhất (91 - 98,8%), tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã được ghi nhận tương ứng khi mẫu lá tTCL_L được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,0 mg/l NAA và được đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, lá tTCL_L, cuống lá tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BAP dưới điều kiện chiếu sáng giờ/ngày, điều kiện tối hoàn toàn, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l NAA đặt trong điều kiện tối hoàn toàn Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy Việc sử dụng đèn huỳnh quang chiếu sáng 16 giờ/ngày phù hợp cho khả năng phát sinh phôi của mẫu cấy, những phôi thu được có dạng hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và cả dạng lá mầm Ngược lại, điều kiện tối lại kích thích

sự hình thành rễ và mô sẹo tốt hơn Rễ thu được có màu trắng đục, có phân nhánh, trong khi mô sẹo lại xốp và có màu vàng nhạt

Bùi Văn Lệ và Trần Nguyên Vũ (2003) đã úng dụng thành công kỹ thuật

nuôi cấy lát mỏng tế bào trên cây điều (Anacardium cccidentale L.) kết luận như

sau: Môi trường nuôi cấy là MS có bổ sung vitamin, 30g/l sucrose, 7 g/l agar, 2 mg/l glycine, 100 mg/l m – Inositol Khử trùng bằng dung dịch Tween 20 nồng

độ 3% trong 3 phút, sau đó khử trùng bằng Hgcl2 trong 20 phút, tráng nước cất 3

- 4 lần.Tỷ lệ nảy mầm là 96% Cắt lát mỏng vùng đốt thân cho sự tạo chồi tốt và không dùng than hoạt tính hay chất chống oxy hóa Nồng độ BAP thích hợp tạo

chồi là 5mg/l đạt 16 – 17,3 chồi/lát cắt ngang vùng đốt thân và 16,1 chồi/lát cắt mỏng dọc vùng tử diệp nhưng ở cùng nồng độ BAP 5 mg/l và 2 mg/l acid ascorbic lát mỏng tế bao thấp hơn chỉ đạt 5 chồi/lát Cây con ra rễ tốt ở nồng độ 0,5 mg/l NAA và 1 mg/l IBA , tỷ lệ sống 100%

Trần Nguyên Chất và cộng sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4 – D và kiểu cắt lớp mỏng tế bào đến sự hình thành và phát triển mô sẹo

ở cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) được kết quả như sau:

Thân cây Gấc được cắt lát mỏng ngang và cắt lát mỏng dọc dài 3 – 5 mm và dày 0,5 – 1 mm Cấy trên môi trường MS có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 2,4 – D với nồng độ lần lượt là: 0,5, 1,0, 1,5, 2 mg/l Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả các kiểu cắt

lát mỏng đều hình thành mô sẹo chiếm 100% Tuy nhiên ở kiểu cắt ngang kết

hợp với nồng độ 2,4 - D ở mức 1,5 mg/l có khả năng hình thành, phát triển và cho chất lượng mô sẹo tốt nhất

1.1.10 Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp cắt lát mỏng chi Dendrobium

1.1.9.1 Trên thế giới :

S.Parthibhan (2018) đã nghiên cứu tạo phôi soma từ lớp tế bào mỏng của

Dendrobium aqueum đưa ra kết quả sau: Các tTCL (dày 0,5 mm) có bổ sung

cytokinin và auxin để tạo mô sẹo với 0,5 mg/dm3

zeatin tạo mô sẹo chiếm 41,42% tTCLs 42,66 phôi soma được hình thành từ 1,5 mg/dm3 N6- (2-isopentyl) adenine (2iP) nhưng chỉ chiếm 10,33% tế bào Sự kết hợp của 2iP (1,5 mg/dm3) và 0,5 mg/dm3 6-benzyladenine tạo 34 phôi soma chiếm14,7% tTCLs trong khi kết hợp của 2iP và 1,0 mg/dm3 indole-3-butyric acid (IBA) tạo 7,4 phôi soma chiếm 2,33% tTCLs Bổ sung than hoạt tính, axit amin và chất chống oxy hóa làm giảm bớt màu nâu ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm nhưng phản ứng tạo phôi soma giảm Việc bổ sung 0,5 mg/dm3polyvinylpyrrolidone vào 1,5 mg/dm3 2iP và 1,0 mg/dm3 IBA tạo ra 24 phôi soma trên 19,89% tTCLs cho thấy rằng mô sẹo và phôi soma có thể được tạo ra một cách hiệu quả bởi các cytokinin Các cây con thu được qua phôi soma

không cho thấy có biến đổi hình thái và cấu hình cũng xác nhận tính trung thực

di truyền của in vitro có nguồn gốc con cháu có tính đơn hình cao (97,78%)

Peng Zhao và cộng sự (2007) đã tái sinh thành công Dendrobium candidum Wall Ex Lindl bằng nuôi cấy lát mỏng ngang tế bào được kết luận

sau: Hệ số tái sinh chồi và số lượng chồi phụ thuộc đáng kể vào nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Môi trường nuôi cấy MS với các chất dinh dưỡng đa lượng và 2% sucrose, bổ sung 1,2 mg/l NAA và 1,2 mg/l BAP là tối ưu để tạo chồi với tỷ lệ tái sinh chồi chiếm 92% và số lượng chồi trung bình là 24,5 Sự ra

rễ của chồi thành công trên môi trường MS, các chất dinh dưỡng đa lượng và 2% sucrose, 1mg/l NAA và 1 mg/l IAA với tỷ lệ sống của cây chiếm 95%

Lucas Roberto Pereia Gomes và cộng sự (2015) đã nghiên cứu phương

pháp nhân giống in vitro cho Brasilidium forbesii (Hook.) bằng lớp mỏng ngang

và dọc (tTCL và lTCL) được kết quả sau: Lát cắt mỏng protocom 1mm (từ hạt nảy mầm), được cấy trên môi trường Woody Plant Medium (WPM) được bổ sung với BAP (0,5 – 4 µM) Sự hình thành protocom - like bodies (PLBs) bị ảnh hưởng bởi nồng độ BAP và lát cắt dọc (lTCL) trên môi trường chứa 2 µM BAP tạo ra tỷ lệ cao nhất protocom chiếm (77%) với 22,7 PLBs Sự phát triển của cây con là tối ưu trên môi trường WPM chứa 3,0 g/l than hoạt tính, và axit indole-3-butyric không cần thiết cho sự ra rễ Cây tái sinh đã được thích nghi thành công trong nhà kính sau 16 tuần tỷ lệ sống 100%

Nitramol Rangsatorn (2009) đã nghiên cứu quy trình nhân giống lan

Dendrobium draconis Rchb.f bằng cắt mỏng ngang được kết luận như sau: Môi

truường nuôi cấy MS được bổ sung 20 g/l sucrose, nồng độ khác nhau của BAP

và Kinetin, NAA riêng lẻ hoặc kết hợp Protocom – like bodies (PLBs) từ lát cắt

đã nuôi cấy và phát triển thành chồi trong vòng 6 -7 tuần Sự kết hợp tối ưu của điều hòa sinh trưởng phát triển tối đa PLBs là 2 mg/l BAp và 1,0 mg/l NAA, làm tăng 68% cấy đáp ứng với mức trung bình của 11 PLBs mỗi mẫu cấy Môi trường MS có chứa sucrose và nước dừa được phát triển tốt nhất Cây con, 6-8

cm được cấy vào than bùn, dừa trấu với tỷ lệ sống 92% trong một vườn ươm

1.1.9.2 Tại Việt Nam

Phạm Văn Lộc, Lê Thị Hoài Thương (2016) đã xây dựng thành công quy

trình nhân giống in vitro Lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobiumm lituiflorun Lindl)

bao gồm phát sinh PLBs từ chồi, tái sinh chồi, tạo rễ Chồi in vitro được nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung TDZ ở các nồng độ khác nhau để phát sinh protocorm like bodies (PLBs) Ở nồng độ TDZ 2,0 mg/l cho tỷ lệ phát sinh PLBs cao nhất Chồi phát sinh tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung TDZ

1,5mg/l Môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l thích hợp để tạo rễ in vitro

Đặng Thị Thắm và cộng sự (2017) đã nghiên cứu thành công vi nhân

giống Lan Nhất điểm hoàng (Dendrobium heterocarpum Lindl.) Kết quả nghiên

cứu cho thấy, môi trường thích hợp cho sự hình thành PLBs là MS bổ sung 2

mg/l BAP và 1,0 mgl/l NAA (7,11 PLBs/mẫu, 68,9% mẫu tạo PLBs) hoặc môi

trường MS bổ sung 1 mg/l TDZ với 0,5 mg/l NAA (7,29 PLBs/mẫu, 75,53% mẫu tạo PLBs) Trên môi trường nuôi cấy MS bổ sung 1,5 mg/l BA (20,47 chồi/mẫu, chiều cao chồi 1,96 cm) và môi trường nuôi cấy MS bổ sung 60 g chuối chín/lít (22,40 chồi/mẫu, chiều cao chồi 2 cm) đều phù hợp cho sự sinh

trưởng và phát triển của chồi nuôi cấy Môi trường thích hợp cho sự tạo rễ in vitro là: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l NAA (4,4 rễ/chồi, chiều dài rễ 3,12 cm, 95,56% chồi ra rễ) Sau 60 ngày chuyển cây con in vitro ra ngoài vườn ươm, kết

quả thí nghiệm cho thấy giá thể thích hợp nhất là giá thể dớn (5 rễ/mẫu, chiều dài rễ 3,4 cm, tỉ lệ sống 97,78%)

Nguyễn Thị Lài và cộng sự (2018) đã nghiên cứu nhân giống thành công

Lan Hoàng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) được kết quả như

sau: Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng theo chiều ngang (tTCL - traverse thin

cell layer) của chồi in vitro Kết quả cho thấy, môi trường gây hiệu ứng tối ưu để sản sinh protocorm - like bodies là môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước

dừa + 7 g/l agar + 1,5 mg/l BAP (tạo ra 30,1 protocorm - like bodies/lát mỏng

sau 6 tuần nuôi cấy) Cụm protocorm - like bodies được cấy lên môi trường VW

+ 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 2 g/l

peptone + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngô + 1 g/l tảo

Spirulina cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt 16,82 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường cấy chồi in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh VW + 20 g/l

sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 1,0 mg/l IBA là thích hợp nhất với số rễ được hình thành là 7,3 rễ/cây sau 6 tuần nuôi cấy

Nguyễn Thành Tùng (2010) đã áp dụng thành công phương pháp nuôi cấy

lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Lan Hoàng Thảo Thân Gãy (Dendrobium aduncum) được kết quả: Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang (tTCL – traverse thin cell layer) của chồi in vitro Các

tTCL được cảm ứng tạo protocom – like bodies (PLBs) trên môi trường cơ bản

½ MS có bổ sung riêng lẻ BAP hay bổ sung kết hợp BAP Và NAA Môi trường tối ưu cảm ứng protocom – like bodies là môi trường ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP cho 29,85 protocom – like bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôi cấy Cụm protocom – like bodies được cấy lên môi trường MS có bổ sung TDZ, Kinetin, MAA riêng lẻ hay kết hợp để tái sinh chồi Môi trường MS bổ sung 3 mg/l Kinetin kết hợp với 0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67

chồi/mẫu Chồi in vitro được cấy lên môi trường MS có bổ sung NAA để cảm ứng tạo rễ Nồng độ MAA 2,0 mg/l là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với kết quả 9,18 rễ/chồi Cây con in vitro tái sinh đầy đủ được huấn luyện và trồng

lên gia thể, sau 6 tuần lỷ lệ sống đạt 90%

Huỳnh Hữu Đức và cộng sự (2017) đã xây dựng thành công quy trình

nhân nhanh giống lan Dendrobium Caesar White bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp

mỏng tế bào và đưa ra kết quả: Môi trường nuôi cấy bổ sung BAP kết hợp 2,4-D hay bổ sung riêng lẻ TDZ kích thích tái sinh chồi trong nuôi cấy lớp mỏng chồi lan Môi trường nuôi cấy bổ sung TDZ 0,1 mg/l thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ lớp mỏng chồi lan với 2,8 chồi/mẫu và tỉ lệ mẫu tạo chồi là 79,36% Môi trường nuôi cấy bổ sung BA 3,0 mg/l tốt hơn so với môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/l đối với sự nhân chồi của cụm chồi từ lát mỏng Kết quả tổng hợp quá trình tái sinh chồi từ lớp mỏng và nhân chồi cho

thấy mẫu lát mỏng khi nuôi cấy trên môi trường có TDZ 2,0 mg/l và tiếp tục nhân chồi trên môi trường có BA 3,0 mg/l kết hợp với NAA 0,5 mg/l tạo được

số chồi/mẫu cao nhất là 21,13

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu

- Xác định được công thức khử trùng thích hợp đối với chồi lan

- Xác định được môi trường và ánh sáng thích hợp cho tái sinh chồi từ lát cắt mỏng

- Xác định được môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi

2.2 Nội dung

2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả

năng tạo mẫu sạch in vitro

2.2.2 Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi lan Phi điệp tím từ lát mỏng

- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng

- Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng

2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Phi điệp tím

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Phi điệp tím Hòa Bình

2.3 Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các đoạn chồi lan Phi điệp tím mới tái sinh có kích thước từ 0,5-0,7 cm được thu thập tại vườn lan Xung Hà - Hòa Sơn - Lương Sơn - Hòa Bình

2.3.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng TN bảo tồn nguồn gen thực vật, Viện công nghệ sinh học Lâm Nghiệp

- Điều kiện bố trí thí nghiệm:

+ Độ ẩm trung bình: 60 - 70%

+ pH môi trường: 5,7

+ Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000 lux

Thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Phương pháp tạo mẫu sạch lan Phi điệp tím Hòa Bình

Những đoạn chồi lan Phi điệp tím khỏe mạnh, không bị sâu bệnh được khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 Tiếp theo chúng được chuyển vào tủ cấy vô trùng

và được rửa bằng nước cất vô trùng 1-2 lần trước khi được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 2, 4 hoặc 6 phút Cuối cùng mẫu vật được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần để loại bỏ HgCl2 Mẫu vật đã được khử trùng bằng hóa chất được cắt thành đoạn có chứa 1 mắt ngủ và được cấy vào môi trường vào mẫu

Môi trường vào mẫu là môi trường cơ bản MS có bổ sung 6g/l agar, 20g/l sucrose và 0,5 mg/l BAP Mẫu vật được theo dõi và đánh giá sau 8 tuần vào mẫu

và được đánh giá thông qua các tiêu chí: tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi Kết quả được thống kê và ghi chép vào mẫu bảng 2.1

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm và thống kê kết quả nghiên cứu

CTTN Thời gian khử

trùng (phút) Số mẫu NC Số mẫu sạch

Số mẫu tái sinh chồi

2.4.2 Phương pháp tái sinh chồi từ lát cắt mỏng

a Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng

Chồi mới tái sinh từ môi trường vào mẫu dài 1,5-2,0 cm, khỏe mạnh được

sử dụng để cắt thành những lát mỏng Sử dụng thân lan Phi điệp tím Hòa Bình cắt thành lát mỏng ngang có kích thước 0,5-0,7mm và loại bỏ phần lá và phần đỉnh, loại bỏ lớp màng bao quanh thân sau đó đặt vào môi trường tái sinh: MS

có bổ sung 20 g/l sucrose, 5,5 g/l agar và các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng: BAP (0,5-1 mg/l) với NAA (0,2-0,5 mg/l) Sau 8 tuần nuôi cấy đánh giá khả

năng tái sinh chồi hoặc thể chồi của lát cắt, số chồi trung bình/lát cắt Kết quả được thể hiện trên mẫu bảng số 2.2

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm và biểu thu thập số liệu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới khả tái sinh chồi từ lát mỏng lan Phi điệp tím

Tỷ lệ tạo thể chồi (%)

Đặc điểm thể chồi

có thời gian chiếu sáng 12g/ngày (3) Che sáng hoàn toàn Quan sát trong vòng 8 tuần và ghi nhận kết quả theo mẫu bảng 2.3

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả

năng tái sinh chồi Phi điệp tím

CTNC Số mẫu

NC

Số mẫu tái sinh chồi Số chồi TB/mẫu

và 5,5 g/l agar Thí nghiệm được theo dõi sau 8 tuần nuôi cấy và được thống kê kết quả theo mẫu bảng 2.4 sau:

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh chồi từ lát mỏng lan Phi Điệp Tím Hòa Bình

nhân chồi (lần)

Chiều cao chồi (cm) BAP Kinetin NAA