Nghiên cứu cải tiến quy trình công nghệ lên men rượu cổ truyền sử dụng các chủng sinh vi sinh vật thuần chủng

Sản xuất rượu ở Việt Nam phần lớn do nhân dân tự nấu thủ công, trình độ công nghệ còn kém, thiết bị sản xuất thô sơ mặt khác sử dụng nguồn nguyên liệu khác nhau dẫn đến chất lượng rượu c

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Hồng Ánh trưởng bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công nghiệp thực phẩm đã trực tiếp hướng dẫn cá nhân tôi thực hiện đề tài này

-Tôi xin chân thành cám ơn Thạc sỹ Phạm Thị Thu, người đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập

Để thực hiện tốt đề tài này còn có sự giúp đỡ nhiệt tình của:

Kỹ sư Nguyễn Thị Minh Hằng - Giảng viên trường Đại học Lâm Nghiệp

đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong thời gian học tập tại trường

Các anh, chị trong bộ môn Công nghệ đồ uống cũng như các cán bộ của Viện Công nghiệp thực phẩm

Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm tới tôi trong suốt quá trình thực tập

Đây là lần đầu tiên cá nhân tôi trực tiếp thực hiện nghiên cứu khoa học

do đó không tránh khỏi thiếu sót, rất mong được sự đóng góp chân thành của các quý thầy cô và bạn đọc

Tôi xin chân thành cảm ơn!

1

MỞ ĐẦU

Rượu dân tộc đã từ lâu là niềm tự hào của rất nhiều quốc gia trên thế giới Khi thưởng thức, người ta không chỉ biết đến hương vị độc đáo đặc trưng của rượu mà qua đó còn góp phần tìm hiểu được bản sắc văn hóa riêng của mỗi dân tộc, mỗi vùng miền Ở Việt Nam rượu cổ truyền do các làng nghề và do người dân tự nấu có số lượng đáng kể Nhiều làng nghề sản xuất rượu truyền thống như rượu làng Vân (Bắc Giang), rượu Sán Lùng (Lào Cai), rượu Bầu Đá (Bình Định)… đã trở nên nổi tiếng không chỉ trong nước mà còn

ở cả nước ngoài

Sản xuất rượu ở Việt Nam phần lớn do nhân dân tự nấu thủ công, trình

độ công nghệ còn kém, thiết bị sản xuất thô sơ mặt khác sử dụng nguồn nguyên liệu khác nhau dẫn đến chất lượng rượu chưa đồng đều, còn chứa nhiều độc tố, tạp chất gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng Mặt khác, hiệu suất thu hồi rượu thấp, hao phí nguyên vật liệu lớn dẫn đến hiệu quả sản xuất chưa cao Vì thế, ngành công nghiệp sản xuất rượu ở nước ta trong những năm gần đây đã được quan tâm và bắt đầu tạo dựng được những thương hiệu như Vodka của Công ty rượu Hà Nội, các sản phẩm rượu Shochu của Công ty thực phẩm Huế… được thị trường ưa chuộng

Các sản phẩm rượu được sản xuất hiện nay trên quy mô công nghiệp chủ yếu bằng phương pháp enzym không sử dụng nấm mốc nên không giữ được hương thơm của nguyên liệu Thêm vào đó, cùng với việc loại bỏ các loại độc tố trong quá trình chưng cất, hương vị đặc trưng của sản phẩm cũng

bị mất gần như hoàn toàn Rượu được sản xuất trên quy mô công nghiệp vẫn dựa vào sự phân giải của hệ vi sinh vật có trong các loại bánh men truyền thống do đó chất lượng rượu bị phụ thuộc chủ yếu ở loại bánh men Các loại bánh men chủ yếu sử dụng như bánh men thuốc bắc, bánh men lá dân tộc… tuy nhiên chúng cho hiệu suất không cao, gây khó khăn cho việc áp dụng vào lên men rượu công nghiệp

2

Rượu cao độ được sản xuất tại hầu hết các nước trên thế giới tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng đủ cho nhu cầu tiêu thụ của thị trường rượu mạnh toàn cầu Theo báo cáo của châu Âu, trong năm 2002 khu vực này có 10 công ty sản xuất rượu cao độ nhưng mới chỉ có 23% thị trường quốc tế Theo nhận định của các chuyên gia, ngành công nghiệp sản xuất rượu mạnh sẽ càng phát triển trong tương lai về cả giá trị kinh tế lẫn chất lượng

Hiện nay, trên thế giới nhiều sản phẩm rượu cổ truyền của Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc đang có xu hướng ngày càng được ưa chuộng bởi chất lượng cao và vẫn giữ được hương vị đặc trưng riêng của nguyên liệu Đó

là những sản phẩm được coi như “quốc túy” - đại diện cho một phần nét văn hóa của những quốc gia này Nét độc đáo trong sản xuất rượu ở những nước này là ở chỗ công nghệ cải tiến cho lên men riêng rẽ nấm mốc, nấm men đã mang lại hương vị cho sản phẩm Bên cạnh đó điều này còn khiến cho việc áp dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp được dễ dàng vì khả năng kiểm soát quá trình lên men tăng dẫn đến tăng hiệu suất thu hồi rượu mặt khác còn kiểm soát được những tác nhân gây độc hại đối với sức khỏe người tiêu dùng

Với mục tiêu của Tổng công ty rượu – bia - nước giải khát là bằng một

số biện pháp phải cân đối giữa sản xuất và tiêu thụ để đến năm 2010 có 75% rượu công nghiệp, thay thế phần lớn rượu do nhân dân tự nấu thì việc áp dụng quy trình công nghệ mới thay thế phương pháp lên men cổ truyền là điều rất

cần thiết Đề tài cấp Nhà nước mã số KC 07 - 14: “Nghiên cứu và hoàn

thiện Công nghệ và thiết bị sản xuất một số sản phẩm truyền thống kiểu

công nghiệp” được thực hiện trong 03 năm từ 2008 đến 2010 của Viện Công

nghiệp thực phẩm là một trong những giải pháp đó

Nhằm tiếp tục hoàn thiện công trình nghiên cứu trên với mong muốn sản xuất các loại rượu truyền thống với sự kết hợp hài hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại thành những loại rượu có chất lượng cao, chúng

tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cải tiến quy trình công nghệ lên men rượu cổ truyền sử dụng các chủng vi sinh vật thuần chủng”

3

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ rượu trên thế giới

Đã từ lâu rượu gắn bó với cuộc sống tinh thần của con người Rượu được coi như tinh hoa của trời đất chưng cất thành dòng chảy làm tâm hồn con người hòa hợp cùng vũ trụ Sự tồn tại và phát triển của rượu là một mắt xích quan trọng trong đời sống con người Việc sản xuất và tiêu thụ rượu ở mỗi vùng địa lý được thể hiện bằng cách riêng biệt, độc đáo Điều đó xuất phát từ các nguồn nguyên liệu khác nhau, phong tục truyền thống riêng của mỗi quốc gia, dân tộc Trên thế giới có rất nhiều loại rượu nổi tiếng khác nhau, và có thể phân thành các loại rượu dựa theo nguyên liệu sản xuất như:

- Nguyên liệu từ trái cây: Nho, Mơ, Táo, Anh Đào… trong đó chủ yếu nguyên liệu Nho được biết đến nhiều nhất dùng để sản xuất chủ yếu các loại rượu vang, Champagne và một số loại rượu Brandy nổi tiếng thế giới [7]

- Nguyên liệu từ tinh bột: Gạo, ngô, sắn, đại mạch, lúa mỳ… chủ yếu để sản xuất các loại rượu cao độ như Vodka, Gin, Whisky, Shochu, rượu trắng Việt Nam và Trung Quốc… ngoài ra còn sản xuất ra các loại rượu vang gạo như rượu cẩm, Sake [7]

- Nguyên liệu rỉ đường hay sản phẩm từ mía dùng để sản xuất cồn dùng cho pha rượu hay làm ra loại rượu Rhum nổi tiếng

- Một số loại nguyên liệu khác: Các loại rễ cây, củ, lá, hoa, tinh dầu… như rượu Greenleaves của Anh cất từ Brandy và hồ tiêu, bạc hà hay rượu mùi, rượu hồi [7]

Rượu Whisky bắt nguồn từ Scotland, Irland, sau được sản xuất thêm ở

Mỹ, Úc, Nhật Bản, Hà Lan, Tây Ban Nha và Canada… Nguyên liệu chính để sản xuất Whisky là malt đại mạch, lúa mỳ, ngô và yến mạch Nhiều nhãn rượu Whisky nổi tiếng thế giới như Johny Walker, Ballantimes… nhờ có hương vị đặc trưng và công nghệ truyền thống của nó mang lại Việc chưng cất để thu rượu được tiến hành bởi quá trình chưng cất, từ một đến hai lần

4

Sau đó, rượu được tàng trữ trong các thùng gỗ sồi dung tích nhỏ hơn 700 lit trong thời gian tối thiểu 3 năm Tiếp đó, rượu được phối trộn với nhiều chủng loại khác nhau (thường 30 - 40 loại) để đa dạng hóa các sản phẩm và tạo thêm nhiều loại rượu chất lượng cao

Brandy là tên chỉ chung các loại rượu mạnh được chưng cất từ rượu vang (nho) hay từ trái cây đã lên men Thường thì Brandy phải qua hai lần chưng cất để đạt được tỉ lệ cồn 70 - 80% rồi mới ủ cho rượu dịu bớt trong các thùng gỗ sồi nhờ quá trình oxy hóa, sau đó rượu được pha thêm nước cất để đạt được độ cồn khoảng 40% Brandy có hai dòng chính là Cognac và Armagnac

Ngoài hai dòng chính trên, Brandy còn vài dòng không thông dụng khác như Marc và Grappa Marc được chưng cất từ nước cốt của vỏ và hạt nho qua lần ép thứ tư hoặc thứ năm Marc thường có màu xanh nhạt, vị gắt hơn Cognac và Armagnac Còn Grappa hoàn toàn không mùi, vị hơi chát

Các loại rượu mạnh trung tính như Vodka, Gin về bản chất là rượu Etylic tinh khiết được lên men và chưng cất để tách các tạp chất, trở thành Etylic chất lượng cao Nguyên liệu để sản xuất chúng thường chủ yếu là nước quả nho, ngũ cốc…

Vodka không màu, không nhất thiết phải qua khâu ủ, nhưng cần xử lý nhằm loại bỏ hương vị và màu sắc để trở thành trong suốt, không mùi

Còn Gin được chưng cất từ các loại hạt trộn với hương liệu thảo mộc như hạnh nhân, quế, hạt coca, gừng, cỏ chanh… Độ cồn trong Gin thường khoảng từ 34 - 37%

Tequila được lên men từ dịch cây Thùa (Avega) và đường mía hoặc siro ngô Độ cồn của rượu thường nằm trong khoảng 38 - 55 (%V), được tàng trữ trong các thùng gỗ sồi từ 2 - 12 tháng

Sản xuất rượu trên thế giới có tốc độ gia tăng mạnh trong vài năm trở lại đây, do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng chủ yếu do mức sống và nhu cầu tiêu dùng của người dân tăng lên, tốc độ tăng dân số, tiến bộ của khoa học

5

công nghệ làm cho chất lượng cũng như sản lượng rượu tăng, giá thành hạ Tổng sản lượng rượu trên thế giới năm 1998 là 32290 triệu lit, năm 2001 là

38050 triệu lit trong đó:

- Rượu vang chỉ tính riêng 28 nước có sản lượng vang lớn năm 1998 khoảng 25 triệu lit, đến năm 2001 đã tăng lên 29 triệu lit

- Rượu mạnh tính riêng cho Mỹ là nước có sản lượng đứng đầu thế giới năm 1998 đạt 1475 triệu lit, các nước Liên Xô cũ năm 1992 đạt 1366 triệu lit, Vương quốc Anh năm 1990 đạt 1287 triệu lit, Nhật Bản năm 1992 đạt 613,5 triệu lit

Số liệu thống kê của Hiệp hội Rượu Quốc tế cho biết sản lượng rượu thế giới năm 2007 dẫn đầu là Vương quốc Anh chiếm 31%; Canada 24%; Nhật Bản 6,2%; Ý 5,7% và Đức 5,4% Dự báo trong những năm tiếp theo Ý

sẽ là nước sản xuất ra khoảng 1/3 lượng rượu vang cho châu Âu và chiếm giữ 17% sản lượng rượu vang của thế giới Theo dự kiến năm 2009 toàn thế giới

sẽ đạt 45000 triệu lit rượu.[1]

Tình hình tiêu thụ rượu mạnh ở các nước cũng rất khác nhau Mỗi nước cũng có tập quán uống riêng Ở châu Âu thì các nước như Pháp, Ý, Bồ Đào Nha… có khả năng tiêu thụ rượu vang nhiều hơn các loại đồ uống có cồn khác Rượu mạnh thường được tiêu thụ nhiều ở Nga, Tây Ban Nha… còn ở châu Mỹ, người Achentina, Chile thích uống rượu vang, người Mỹ, Brazil lại thích rượu mạnh Trong năm 2007 Mỹ là nước nhập khẩu rượu tăng 12,8% Châu Úc mọi người uống nhiều bia và rượu vang Ở châu Á mức tiêu thụ đồ uống có cồn là thấp, trong đó người ta uống nhiều bia, rượu mạnh chủ yếu là rượu trắng làm từ gạo Việt Nam so với các nước trên thế giới có mức tiêu dùng đồ uống có cồn vào loại thấp.[1]

Ở phương Đông rượu được sản xuất từ ngũ cốc như lúa, gạo, ngô đã trở thành nét văn hóa độc đáo và có truyền thống từ mấy nghìn năm với công nghệ và thiết bị khác hẳn so với công nghệ và thiết bị của châu Âu

6

Rượu Trung Quốc đã được định hình hơn 4000 năm Đây là đất nước

có nền văn hóa về rượu đồ sộ Rượu mạnh ở Trung Quốc xuất hiện từ đời Tống và nổi tiếng về độ trong, thuần, thơm dễ chịu với các loại rượu như: rượu Mao Đài, Ngũ Lương, Đổng Tửu, Nữ Nhi Hồng, Mai Quế Lộ, Thiệu Hưng… với mức tiêu thụ bình quân đầu người khá cao 5,2 lit/ năm (theo số liệu báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới năm 2008)

Các loại rượu Sake, Shochu của Nhật Bản đã trở thành đồ uống được

ưa chuộng ở nhiều nơi trên thế giới Hiện nay, Nhật Bản có 2700 cơ sở sản xuất rượu Sake trên khắp đất nước với tổng sản lượng khoảng 1,2 tỷ lit/ năm Sake được coi như là quốc hồn, quốc túy của đất nước này Hiện nay, có khoảng 138 loại rượu Sake ngon đúng tiêu chuẩn Từ sau chiến tranh thế giới lần thứ hai, ngành sản xuất rượu Sake được coi là một trong những trọng tâm của hiện đại hóa, tự động hóa đưa việc sản xuất mặt hàng này trở thành quy

mô công nghiệp Bên cạnh Sake, Shochu là rượu mạnh truyền thống của Nhật Bản được sản xuất ở vùng Tây Nam Năm 2002, Nhật Bản đã sản xuất 1307 triệu lit rượu Sake và 868 triệu lit rượu Shochu phục vụ tiêu dùng trong nước

và xuất khẩu.[16]

1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ rượu ở Việt Nam

Lịch sử nghề nấu rượu của Việt Nam có vào khoảng 100 năm trước Công nguyên Các loại rượu do người dân tự nấu theo tập quán cổ truyền, mang tính chất tự cung tự cấp Ở miền núi, đồng bào dân tộc thường dùng gạo, ngô, sắn nấu chín rồi cho men giống có nguồn gốc từ lá rừng (men lá) để lên men Nếu sau khi ủ men đem chưng cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng còn nếu không sẽ thu được rượu cần - một loại rượu nổi tiếng của người dân miền núi Còn ở đồng bằng, nhân dân làm men từ bột gạo trộn lẫn với các vị thuốc Bắc tạo bánh men thuốc Bắc cũng thu được rượu trắng với chất lượng khác nhau, trong đó có nhiều loại ngon nổi tiếng

Rượu làng Vân có từ thời Triệu Quang Phục (thế kỷ thứ VI) được nấu

từ gạo nếp thơm, men gia truyền với các vị thuốc quý và kỹ thuật riêng của

7

người Kinh Bắc Rượu đã trở thành niềm tự hào của người dân nơi đây với cái tên “Vân hương mỹ tửu” Ngày nay rượu làng Vân vẫn được người dân nơi đây tiếp tục sản xuất với năng suất khá lớn, hàng ngày khoảng 15000 - 20000 lit rượu được ra lò cung cấp cho các vùng lân cận [5]

Bầu Đá là địa danh của một làng ở xã Nhơn Lộc, huyện An Nhơn, tỉnh Bình Định Sở dĩ rượu Bầu Đá có chất lượng tuyệt hảo và hương vị độc đáo phân biệt được với các loại rượu khác là bởi rượu được nấu theo một công thức bí mật gia truyền, và đặc biệt nguồn nước để nấu được lấy ra từ khe nước ngầm ở thôn Bầu Đá - xã Nhơn Lộc Rượu uống vào vị ấm, ngọt, có cảm giác thật êm dịu Theo thống kê, toàn xã Nhơn Lộc hiện có 1600 hộ dân nấu rượu trong tổng số 2149 hộ dân So với năm 2000, đã tăng thêm khoảng 800 hộ Trong đó riêng thôn Cù Lâm có đến 95% hộ dân nấu rượu [5]

Khác hơn Bầu Đá của miền Trung và làng Vân của miền Bắc đều là những làng rượu, thì Gò Đen lại là một vùng rượu Rượu đế Bến Lức - Gò Đen được sản xuất từ gạo nếp với men Cần Giuộc, Mỹ Tho và công nghệ riêng của người dân Long An đã trở thành nét ẩm thực riêng của người Nam

Bộ Theo một điều tra, 173 hộ sản xuất rượu trong xã Mỹ Yên, huyện Bến Lức thì chưa đến 40 hộ mới sản xuất từ 30 năm trở lại đây, còn lại hơn 140 hộ

là nghề truyền lại từ đời này qua đời khác

Rượu men lá Lạng Sơn được sản xuất với công nghệ lâu đời của người Dao sống trên vùng núi Mẫu Sơn - Lạng Sơn Bánh men lá được sản xuất từ các loại bột gạo và các loại lá, củ, quả rừng cùng với điều kiện sản xuất riêng

đã đem đến một loại rượu có chất lượng tốt, hương vị rất đặc trưng Ngày nay rượu men lá Lạng Sơn được nhiều người tiêu dùng biết đến với các thương hiệu như rượu Mẫu Sơn, Công Sơn Tửu… [7]

Từ ngày hòa bình lập lại, năm 1955, Nhà nước ta mới bắt đầu khôi phục lại các ngành công nghiệp trong đó có ngành rượu Đến năm 1956, Nhà máy rượu Hà Nội bắt đầu sản xuất trở lại, sản lượng và chất lượng được dần nâng lên do thay đổi công nghệ sản xuất, nghiên cứu nhiều loại nguyên liệu

8

thay gạo để sản xuất rượu, cồn Năm 1962 - 1963 nước ta bắt đầu xuất khẩu rượu, chủ yếu là sang các nước Đông Âu, nhất là Liên Xô cũ, và sản xuất cũng tăng dần, lượng xuất khẩu mỗi năm cũng nhiều hơn [5]

Vào những năm 1970, một số nhà máy mới được xây dựng với công suất nhỏ và trung bình từ 100 - 500000 nghìn lit cồn/năm, ở hầu hết các tỉnh như Lục Ngạn, Việt Trì, Sông Lam… Năm 1975 khi đất nước thống nhất nhiều nhà máy ở phía Nam cũng đã được xây dựng và phát triển thêm Chất lượng rượu cũng được nâng lên nhờ được trang bị các tháp tinh chế cồn tốt hơn

Hiện nay, ở nước ta có hai doanh nghiệp quốc doanh Trung ương có công suất sản xuất cồn, rượu lớn nhất nước, đó là Công ty rượu Hà Nội có công suất thiết kế 10 triệu lit/năm và nhà máy rượu Bình Tây – Tp Hồ Chí Minh công suất thiết kế 20 triệu lit/năm Nhưng năm 1997 cả hai nhà máy chỉ sản xuất được 3,28 triệu lit rượu Năm 1998 Công ty rượu Hà Nội nâng sản lượng lên 4,2 triệu lit rượu và 1,7 triệu lit cồn Sản xuất bắt đầu có lợi nhuận, nộp ngân sách Nhà nước cũng tăng, kết quả này có được là do việc cải tiến công nghệ sản xuất, đặc biệt là công nghệ sản xuất cồn tinh chế có sử dụng các chế phẩm enzym vào đường hóa tinh bột thay nấm mốc Các sản phẩm của nhà máy có chất lượng cao, uy tín trên thị trường trong nước vào đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Nhà máy rượu Bình Tây cũng khôi phục lại sản xuất được khoảng 1 triệu lit/năm [5]

Ngoài ra cả nước còn 26 doanh nghiệp quốc doanh địa phương với công suất thiết kế khoảng 25,8 triệu lit/năm Tuy nhiên năm 1997 chỉ sản xuất được 13,53 triệu lit Trong số 26 doanh nghiệp này chỉ có 3 doanh nghiệp có công suất 1,8 triệu lit/năm trở lên đó là Công ty rượu nước giải khát Thăng Long, Công ty rượu Đồng Xuân, Công ty đường rượu Việt Trì

Các cơ sở sản xuất tư nhân và cổ phần có tổng công suất thiết kế khoảng 4,55triệu lit/năm Vốn đầu tư khoảng 6,9 tỷ đồng Sản lượng rượu thực tế sản xuất năm 1995 khoảng 1,63 triệu lit; năm 1997 là 1,84 triệu lit;

9

năm 2002 khoảng 2,53 triệu lit Các cơ sở này chủ yếu thành lập từ đầu năm

1990, thiết bị phần lớn chế tạo trong nước, thường có vốn đầu tư thấp, công suất nhỏ nên thiết bị thường chắp vá, không đồng bộ, lao động hoàn toàn thủ công, công nghệ sản xuất trong nước; sản phẩm chủ yếu tập trung vào sản xuất các loại rượu pha chế Một số cơ sở sản xuất rượu vang và Champage, tùy theo nhu cầu của thị trường Số khác có đầu tư thường xuyên công nghệ

và thiết bị nên sản phẩm tương đối tốt và ổn định, tuy nhiên phần lớn các cơ

sở sản xuất theo thời vụ, đối tượng bán hàng chủ yếu tập trung ở các vùng nông thôn, miền núi, chất lượng sản phẩm kém, không ổn định [5]

Đối với các doanh nghiệp có vốn đầu tư nước ngoài có sản lượng rượu trắng và rượu mùi tăng nhanh trong những năm từ 1995 -2000, riêng năm

2000 sản lượng đạt 1,6 triệu lit

Các sản phẩm sản xuất hiện nay ở quy mô công nghiệp chủ yếu là rượu pha chế từ cồn tinh luyện, đa số hương vị của sản phẩm phụ thuộc chủ yếu vào hương liệu và chất phụ gia bổ sung vào, chưa có sản phẩm nào đặc trưng cho Việt Nam

Từ năm 1990 trở lại đây cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế thị trường, rượu do nhân dân tự nấu có chất lượng tốt cũng được phát triển sản xuất như một ngành nghề, tạo nên những làng nghề về rượu Một số làng nghề có truyền thống nấu rượu với công nghệ độc đáo, lâu đời và những lợi thế về điều kiện khí hậu, nguồn nước, bánh men… đã sản xuất ra các sản phẩm rượu đặc sản có chất lượng cao, hương vị riêng rất đặc trưng cho sản phẩm của địa phương như rượu Mẫu Sơn (Lạng Sơn), rượu Sán Lùng (Lào Cai), rượu Ngô (Tuyên Quang)…

Tổng sản lượng rượu do nhân dân tự nấu rất lớn, theo báo cáo của các tỉnh và số liệu thống kê đạt khoảng 242,412 triệu lit/năm Trong đó loại rượu nấu ở các địa phương có truyền thống khoảng 82,412 triệu lit/năm Ngoài ra hàng năm nước ta còn nhập một lượng lớn các loại rượu nước ngoài để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng Theo số liệu thống kê năm 1997 cho biết sản lượng

10

rượu nhập khẩu vào Việt Nam khoảng 1890434 lit, chủ yếu là rượu nhập khẩu

từ Pháp chiếm 1012889 lit Mục tiêu của Tổng công ty rượu – bia - nước giải khát là bằng một số biện pháp phải cân đối giữa sản xuất và tiêu thụ để đến năm 2010 có 75% rượu công nghiệp, thay thế phần lớn rượu do nhân dân tự nấu Cụ thể các mục tiêu sản xuất rượu, cồn công nghiệp năm 2010 là 70 triệu lit, trong đó cơ cấu gồm ba nhóm chính: Rượu cao độ chiếm 65%, rượu nhẹ chiếm 30%, còn lại 5% rượu đặc sản dân tộc.[ 5]

Ngoài các rượu làng nghề có chất lượng cao thì phần lớn là rượu dân tự nấu, do trình độ công nghệ còn kém và thiết bị sản xuất thô sơ nên còn rất nhiều độc tố, tạp chất có tác động xấu tới hệ tiêu hóa, hệ thần kinh, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của người tiêu dùng Mặt khác hiệu suất thu hồi rượu thấp, hao phí nguyên vật liệu lớn dẫn đến hiệu quả sản xuất chưa cao Theo số liệu của Bộ Y tế, từ đầu năm tới nay có tới 42% số ca tử vong do ngộ độc thực phẩm là có nguyên nhân từ rượu, rượu kém chất lượng Kết quả kiểm tra của

Bộ Y tế cho thấy, cả nước có hơn 20000 cơ sở sản xuất rượu nhưng chỉ khoảng 10% công bố tiêu chuẩn chất lượng Do đó, các loại rượu không được công bố chất lượng, nhất là những loại rượu thường được gọi là rượu quê, rượu dân tộc, rượu gạo đều có hàm lượng độc tố như aldehyde, methanol và các chất độc hại khác rất cao

Ở nước ta tuy có nhiều làng nghề nấu rượu, với các loại rượu đặc sản

có nét riêng nhưng nhìn chung chất lượng chưa cao, chưa có loại nào vượt tầm ra khỏi địa phương mình để hòa nhập vào thị trường cùng cạnh tranh mạnh mẽ với các dòng rượu ngoại Vấn đề nghiên cứu ứng dụng các tiến bộ khoa học nhằm cải tiến công nghệ sản xuất, nâng cao và ổn định chất lượng các loại rượu đặc sản làng nghề truyền thống và có thể đưa vào sản xuất ở quy

mô công nghiệp là việc làm cần thiết và có ý nghĩa quan trọng trong chiến lược phát triển ngành rượu Việt Nam

11

1.3 Giới thiệu phương pháp cổ truyền sản xuất rượu ở Việt Nam

1.3.1 Quy trình sản xuất rượu cổ truyền [3], [4],[6]

Tàng trữ Bánh men

Nước

b Hấp chín

Mục đích là làm trương nở các hạt tinh bột thông qua bẻ gãy các liên kết cao phân tử trong hạt gạo và đồng thời giữ lại một lượng nước thích hợp trong cơm nhằm tạo môi trường thuận lợi cho hệ sinh vật trong bánh men phát triển, ngoài ra khi nấu còn có tác dụng diệt các vi sinh vật nhiễm tạp trên gạo [1], [7]

c Lên men ẩm

Cơm đã được nấu chín, tãi đều ra để làm nguội Theo kinh nghiệm, nhiệt độ của khối cơm khi vào men phụ thuộc vào từng mùa, mùa đông khoảng 400C, mùa hè khoảng 300C Khi cơm được làm nguội đến nhiệt độ vào men, men và cơm sẽ được trộn đều với tỷ lệ men khoảng 8 - 9 g/kg gạo Bánh men được sử dụng phổ biến cho lên men rượu là bánh men thuốc bắc, thành phần chủ yếu gồm tinh bột, chủng nấm mốc, nấm men, một số vi sinh vật khác và vị thuốc bắc Tuy nhiên loại bánh men này thường được sản xuất thủ công nên chất lượng không đồng đều, dễ lẫn tạp chất gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men cũng như mùi vị sản phẩm Sau khi ủ chuyển toàn bộ khối gạo vào dụng cụ chứa để ủ ẩm Thời gian lên men ẩm khoảng 24 - 28 giờ Khi quan sát thấy cơm đã ướt, mềm, nếm thấy vị ngọt, mùi thơm đặc trưng là kết thúc quá trình lên men ẩm [1], [7]

d Lên men dịch thể

13

Khi lên men dịch thể đã đạt yêu cầu, chuyển toàn bộ khối cơm vào thùng, bình… để tiến hành lên men dịch thể Đối với công nghệ sản xuất rượu làng nghề sử dụng men thuốc bắc, trong giai đoạn này phải bổ sung thêm nước để pha loãng đường trong khối cơm ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men lên men rượu

Thông thường thời điểm và lượng nước bổ sung là hai ngày sau khi lên men dịch thể với tỷ lệ 1,5 - 2 lit nước/kg gạo Thời gian lên men tiếp theo khoảng 4 - 5 ngày thì tiến hành chưng cất thu rượu Đối với công nghệ sản xuất rượu dùng bánh men lá thì giai đoạn này không cần bổ sung nước Quá trình lên men diễn ra từ từ, thời gian lên men khoảng 10 - 20 ngày mới chưng cất [1], [7]

e Chưng cất

Sử dụng thiết bị loại “ống ruột gà” hoặc “thủy tượng” để chưng cất rượu Với thiết bị thủ công, mẻ cất nhiều nhất chỉ có thể đạt được 40 - 60 lit dịch dấm chín, thời gian mỗi mẻ khoảng 5 - 6 giờ

f Tàng trữ

Rượu sau khi chưng cất cần có thời gian tàng trữ để ổn định hương vị

và nâng cao chất lượng Dụng cụ tàng trữ thường là chum, vại hoặc thùng gỗ Sau quá trình này rượu đạt độ chín cả về chất lẫn lượng, hương vị đặc trưng

1.4 Giới thiệu công nghệ cải tiến lên men rượu sử dụng chủng vi sinh vật thuần chủng

1.4.1 Công nghệ sản xuất rượu Shochu - Nhật Bản

Shochu là một loại rượu cao độ truyền thống của Nhật Bản, độ rượu đạt

25 - 43% hoặc cao hơn Thị trường của Shochu tăng mạnh theo từng năm, riêng năm 2002 Nhật Bản đã sản xuất 868 triệu lit phục vụ tiêu dùng trong nước và xuất khẩu

Nguyên liệu làm Shochu rất phong phú bao gồm khoai lang, gạo, kiều mạch, lúa mạch, hạt kê… Tuy nhiên điều đặc trưng nhất khi nhắc đến loại rượu này đó là công nghệ lên men nuôi cấy riêng rẽ nấm mốc và nấm men tạo

14

điều kiện cho quá trình lên men xảy ra nhanh hơn, tăng hiệu suất thu hồi rượu, sản phẩm có khả năng kiểm soát được các nguồn vi sinh vật mà vẫn giữ được hương vị của nguyên liệu [16], [18]

1.4.2 Chế phẩm nấm mốc Koji [17], [18]

Koji là hệ chế phẩm enzym đường hóa được tạo thành khi nuôi nấm mốc trên môi trường nguyên liệu đã hấp chín Tùy vào nguồn nguyên liệu nuôi mốc mà Koji sẽ có tên gọi khác nhau: Koji - đại mạch, Koji - gạo, Koji - khoai lang… [18]

Cũng giống như khi nuôi bất cứ một loài sinh vật nào khác, để đạt được mục tiêu mong muốn cần phải chú ý rất nhiều yếu tố Khi nuôi cấy Koji cũng vậy cần chú ý đến: Chủng giống, chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy (nhiệt

độ nuôi, thời gian nuôi…) Tùy thuộc vào loại nguyên liệu và mục đích công nghệ mà cách xử lý nguyên liệu và các thông số trong quá trình nuôi cấy tạo Koji là khác nhau

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ nuôi cấy nấm mốc tạo Koji

Ở đây Koji là hỗn hợp gạo hấp với nấm mốc Loại nấm mốc này sinh ra nhiều loại enzym, có tới 50 loại enzym mà một số rất quan trọng là amylaza

Gạo

Ngâm Hấp chín

15

và proteaza Những enzym này là các protein có vai trò chuyển gạo thành đường, glucoza và các loại khác Loại nấm này sau đó chết đi trong quá trình lên men do thiếu Oxy

Nấm mốc thuộc về nhiều họ trong nhóm nấm (Fungi) được xếp chung là

vi nấm Chúng là các giống nấm hiển vi, tế bào có hoặc không có vách ngăn, phát triển thành hệ sợi (mixen) Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút chất dinh dưỡng, một phần hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt cơ chất Khi phát triển trên

bề mặt cơ chất sẽ tiết ra một lượng lớn enzym thủy phân nhằm phân cắt các polysaccharide của cơ chất thành các chất nuôi nấm mốc phát triển Chính vì thế nấm mốc đã được dùng nhiều trong ngành sản xuất các chế phẩm enzym (amylaza, proteaza, pectinaza) Vì đặc tính nguồn nguyên liệu sản xuất rượu

là giàu tinh bột nên các chủng nấm mốc được sử dụng phải có khả năng sinh tổng hợp hệ enzym thủy phân tinh bột là α - amylaza và glucoamylaza cao và ngoài ra còn có hệ thủy phân protein.[1], [7]

Những chủng nấm mốc thường được sử dụng trong sản xuất là:

Aspergillus oryzae, A niger, A usami, A awamorii, A kawachii… Đặc điểm của giống Aspergillus nói chung là khuẩn ty không mùi, không màu hoặc màu vàng nhạt Khi Aspergillus hình thành đính bào tử rất dễ phân biệt với các

nấm mốc khác, cuống đính bào tử và bào tử có màu sắc phát triển mạnh nên

màu của chúng sẽ có màu của khuẩn lạc như A oryzae màu vàng hoặc nâu sẫm, A awamorii và A niger có màu đen, A kawachii màu trắng [6]

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này tôi sử dụng chủng nấm mốc

Aspergillus awamorii Đây là chủng nấm mốc đã được nghiên cứu và lựa

chọn trong giai đoạn một của đề tài cấp nhà nước mã số KC 07 – 14 của Viện Công nghiệp thực phẩm

1.4.3 Nấm men

Nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu chủ yếu là các chủng thuần

khiết thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, phát triển tốt ở nhiệt độ 15 – 300

C

- Là loài dị dưỡng Cacbon, hô hấp tùy tiện, trong môi trường hiếu khí thì tổng hợp tạo sinh khối, trong điều kiện yếm khí thì thực hiện quá trình lên men Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi [9], [11]

Một chủng nấm men tốt cho sản xuất rượu cần phải đáp ứng được các yêu cầu sau: [14]

- Hoạt lực lên men cao, chịu được độ rượu cao, có khả năng phát triển và hoạt động trong môi trường axit, phải ổn định và chịu được những biến đổi của môi trường

- Khả năng lên men nhanh và nhiều các loại đường khác nhau, càng triệt để càng tốt, tạo ra ít sản phẩm trung gian và sản phẩm phụ

- Tạo cho rượu những hương vị thơm ngon đặc trưng, không bị nhiễm mùi lạ

và tạo váng trên bề mặt rượu

1.4.4 Cơ chế của quá trình lên men

Lên men là quá trình oxy hóa đường (glucoza) do hệ enzym của vi sinh vật tiến hành trong điều kiện kị khí qua đó Hydro được tách ra khỏi cơ chất và chuyển đến cho chất nhận cuối cùng là các hợp chất hữu cơ để tạo thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường như etanol, Glyxerin, các axit hữu cơ…

Các phản ứng xảy ra khi lên men: [10], [11], [14]

 Đầu tiên dưới tác dụng của Hexokinaza, glucoza sẽ kết hợp với gốc photphat của ATP trong tế bào nấm men để tạo Gluco - 6 photphat và ADP:

C6H12O6 + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP

 Gluco - 6 photphat do tác dụng của Photphogluco - izomeraza sẽ chuyển thành Fructozo - 6 photphat

CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH

17

 Dưới tác dụng của Photphofructokinaza, phân tử ATP thứ hai sẽ đính thêm một gốc photphat nữa vào Fructozo - 6 photphat tạo Fructo - 1- 6 diphotphat và ADP thứ hai

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2O(H2PO3) + ADP Đến đây đánh dấu kết thúc giai đoạn chuẩn bị lên men rượu

 Enzym aldoza sẽ phân cắt Fructo–1-6diphotphat thành aldehitphotphoglyxeric và photphodioxyaceton

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2O(H2PO3)

CH2O(H2PO3)COCH2OH + CH2O(H2PO3)CHOHCHO

 Dưới tác dụng của triphotphatizomeraza sẽ có sự chuyển đổi:

CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3) CHOHCHO

 Tiếp theo 2 phân tử aldehitphotphoglyxeric sẽ bị oxy hóa nhờ Triphotphatdehydrogenaza:

2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 + 2NAD+

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~ H2PO3 + 2NADH2

 Quy trình chuyển hóa tiếp theo là tạo ra 3 - photphoglyxeric và thu được năng lượng

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~H2PO3+2ADP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP

 3-photphoglyxeric dưới tác dụng của Photphoglyxeromutaza sẽ được chuyển thành axit 2 - photphoglyxeric

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH

 Dưới tác dụng của enolaza, 2 - photphoglyxeric chuyển thành axit photphopyruvic

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH + 2ATP

 Axit photphopyruvic không bền nên dễ mất gốc axit photphoric do enzym pyruvatkinaza và tạo thành axit pyruvic

2CH3CO(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3COCOOH + 2ATP

18

 Axit pyruvic tạo ra dưới tác dụng của enzym pyruvat decacboxylaza sẽ chuyển hóa thành axetaldehyt

2CH3COCOOH 2CH3CHO + 2CO2

 Giai đoạn cuối cùng là quá trình khử axetaldehyt tạo rượu etylic

2CH3CHO + 2NADH2 2CH3CH2OH + 2NAD+

Phương trình lên men tổng quát là:

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + Q

Toàn bộ các quá trình chuyển hóa này được thực hiện bên trong tế bào nấm men, sau đó rượu được đưa ra ngoài và tích tụ trong môi trường nhờ chênh lệch về áp suất thẩm thấu Ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2 còn thu được nhiều sản phẩm phụ như aldehyt, este, rượu bậc cao…

1.4.5 Công nghệ lên men rượu cải tiến

a Quy trình sản xuất

Như đã đề cập ở trên, việc tạo ra sản phẩm rượu cổ truyền ở nước ta không thể thiếu được sự có mặt của bánh men Trong bánh men có chứa các loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn… giúp cho quá trình sinh tổng hợp hệ

enzym có lợi cho quá trình chuyển hóa cơ chất sau này

Bánh men thường sử dụng ở các làng nghề sản xuất rượu nước ta là loại bánh men thuốc bắc Bản chất của bánh men là nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trên môi trường tinh bột ở trạng thái khô Tuy nhiên bánh men cổ truyền

có chất lượng men không ổn định do sản xuất thủ công, dễ bị nhiễm tạp dẫn đến hiệu suất lên men không cao, ảnh hưởng đến hương vị và độ rượu.[6]

Rượu Shochu của Nhật Bản sở dĩ được coi như “quốc tửu” bởi sản phẩm làm ra luôn có chất lượng đồng đều, rượu vẫn giữ được mùi thơm đặc trưng của nguyên liệu Sở dĩ như vậy là vì họ đã áp dụng quá trình lên men sử dụng nấm mốc và nấm men riêng rẽ

Dưới đây là quy trình công nghệ sản xuất rượu cao độ theo phương pháp

cải tiến theo sơ đồ 1.3:

19

Sơ đồ 1.3: Quy trình công nghệ sản xuất rượu cao độ theo phương pháp

cải tiến

b Thuyết minh quy trình: [14]

Quá trình nuôi cấy nấm mốc tạo Koji mục đích nhằm thu đƣợc chế phẩm có hoạt độ enzym glucoamylaza, α - amylaza và hàm lƣợng axit xitric ở mức cực đại

20

Gạo được đem ngâm sao cho nước ngập hết gạo Sau khi hấp, gạo được tãi đều ra mục đích nhằm tản nhiệt cho khối gạo hấp, mặt khác tạo độ ẩm đồng đều cho khối cơm Khi nhiệt độ khối cơm còn khoảng 35 - 400

C thì tiến hành trộn bào tử nấm mốc Giống được dùng với tỷ lệ ban đầu nhất định, được trộn đều vào khối cơm Quá trình nuôi cấy được diễn ra trong khay gỗ hoặc kệ ủ với độ dày xác định và được nuôi ở điều kiện nhiệt độ 400

độ trong khoảng 42 - 48 giờ cho đến khi xuất hiện bào tử thì dừng nuôi Đây là lúc khối Koji có hoạt lực enzym mạnh nhất

Về bản chất quá trình này gần giống như lên men ẩm bổ sung bánh men thuốc bắc của rượu cổ truyền Việt Nam

1.5 Sự khác biệt cơ bản giữa hai quy trình sản xuất

1.5.1 Tác nhân vi sinh vật sử dụng trong quá trình sản xuất rượu

a Đối với phương pháp cổ truyền

Hệ vi sinh vật có trong bánh men thuốc bắc có chứa rất nhiều loại khác nhau: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…

Từ một gam bánh men thuốc bắc người ta đã đếm được 666,1×106

tế bào vi khuẩn; 243,3×106

tế bào nấm men, và 320,9×106 tế bào nấm mốc Trong số này cũng chỉ có vài loại điển hình là sử dụng trong quá trình sản

xuất như S.cerevisiae và Endomycopsis, các loài nấm mốc như Aspergillus, Murco, Rhizopus… lượng vi khuẩn chủ yếu là Lactic, Axetic, ban đầu chúng

có tác dụng rất tốt là tạo ra pH thích hợp cho nấm men hoạt động nhưng về sau lại làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men, làm tổn hao hàm lượng cồn

và tạo thành nhiều sản phẩm phụ hơn.[2]

b Đối với phương pháp cải tiến

Hệ vi sinh vật rất thuần khiết, nấm mốc là A awamorii và nấm men S.cerevisiae, chúng đều đã được phân lập và tuyển chọn từ các chủng có khả

năng cho hiệu quả tốt nhất Chính vì thế phương pháp này có thể được áp dụng trên quy mô công nghiệp.Vì độ thuần khiết cao nên không những hạn chế sự tổn hao lượng chất khô mà chất lượng rượu có thể điều khiển được

b Phương pháp cải tiến

- Không những giữ được những tính chất tự nhiên của nguyên liệu như màu sắc, hương vị như của phương pháp cổ truyền mà còn làm cho chất lượng sản phẩm tăng lên nhờ giảm đáng kể thành phần các sản phẩm phụ trong quá trình lên men: anđêhit, este, rượu bậc cao…

- Quá trình lên men diễn ra từ từ làm tăng khả năng hoạt động của nấm men,

độ rượu thu được sẽ cao hơn hẳn so với phương pháp truyền thống Khi độ rượu cao sẽ làm tăng hiệu quả khi chưng cất vì cứ tăng thêm 10

rượu thì sẽ làm lượng hơi nước tiêu tốn giảm đi 10% và năng suất tăng lên 20%

- Quá trình lên men có thể kiểm soát được

Chính vì những ưu điểm đó mà việc nghiên cứu cải tiến công nghệ lên men rượu cổ truyền sử dụng các chủng vi sinh vật thuần chủng hứa hẹn mang lại nhiều triển vọng cho ngành sản xuất rượu nước ta

22

Chương 2 MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Nuôi cấy được chế phẩm nấm mốc (Koji) có hoạt lực enzym α – Amylaza, Glucoamylaza và hàm lượng axit xitric cao nhất

- Xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu cải tiến:

Tỷ lệ giống nấm men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ nước bổ sung

- So sánh được chất lượng rượu sản xuất theo phương pháp cổ truyền (sử dụng bánh men thuốc bắc) với phương pháp cải tiến (sử dụng các chủng vi sinh vật thuần chủng)

- Xác định được bài thuốc bắc bổ sung thích hợp

- Xây dựng được quy trình lên men rượu cổ truyền bằng phương pháp cải tiến

có sử dụng chủng vi sinh vật thuần chủng (quy mô 100 kg gạo/mẻ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nuôi cấy tạo chế phẩm nấm mốc Koji

- Xác định hoạt độ enzym của khối Koji

- Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu cải tiến: Tỷ lệ giống nấm men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ nước bổ sung

- So sánh chất lượng rượu sản xuất theo phương pháp cổ truyền (sử dụng bánh men thuốc bắc) với phương pháp cải tiến (sử dụng các chủng vi sinh vật thuần chủng)

- Nghiên cứu lựa chọn bài thuốc bắc bổ sung

- Xây dựng quy trình lên men rượu trong phạm vi phòng thí nghiệm và phạm

23

- Các vị thuốc bắc

2.3.2 Chủng giống vi sinh vật

- Chủng nấm mốc: Aspergillus awamorii

- Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae kí hiệu SLS thuộc bộ sưu tập

giống của Viện Công nghiệp thực phẩm

- Chiết quang kế: Trung Quốc

- Thiết bị chưng cất chân không: Nhật Bản

- Bình tam giác, ống nghiệm, đèn cồn, pipet…

Hóa chất: NaOH 0,1N; Phenol phtalein, KH2PO4, MgSO4, pepton, đường Glucoza…

24

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp hóa lý

a Xác định độ rượu: Sử dụng bộ cất cồn Dujardin Salleron

 Nguyên lý: Cồn tinh khiết có nhiệt độ sôi dưới áp suất khí quyển là 76,5O nhưng khi tồn tại cùng với nước thì nhiệt độ sôi sẽ tăng theo sự giảm của nồng độ cồn trong hỗn hợp Phương pháp xác định là đưa dịch lên men vào trong thiết bị và bắt đầu đốt đến khi nhiệt độ sôi không thay đổi thì đọc kết quả và tra bảng thực nghiệm để biết được độ cồn trong dịch lên men theo

% thể tích

 Cách tiến hành: Đổ 100 ml nước cất vào 2 ống thiết bị, đun nóng và chờ đếm khi nhiệt độ sôi không tăng nữa Xoay kim trong bảng tra độ cồn theo nhiệt độ sôi của nước Mở khóa để lấy hết nước trong ống ra Lấy 30 ml dịch lên men, đun sôi và tra % độ cồn theo bảng [8], [14]

b Xác định nồng độ chất hòa tan (Bx)

Sử dụng chiết quang kế có thang chia độ ứng với hàm lượng chất khô Nhỏ một giọt dịch vào giữa mặt phẳng của hai lăng kính, ép hai lăng kính lại Quan sát qua thị kính tìm được đường phân chia rõ nhất giữa hai nửa tối và sáng của trường quan sát Đọc kết quả trên thang đo Đó chính là hàm lượng chất khô tính theo % của mẫu đem phân tích [14]

c.Xác định hàm lượng axít: Phương pháp trung hòa

 Nguyên tắc: Dùng dung dịch kiềm chuẩn (NaOH 0,1N) để trung hòa axit có trong dịch lên men, từ thể tích NaOH tiêu hao suy ra hàm lượng axit

có trong dịch lên men [8], [14]

 Tiến hành: Lấy 10 ml dịch lên men cho vào bình tam giác, bổ sung 20

ml nước cất, lắc đều trong 5 phút để đuổi hết khí CO2 trong dịch Cho 2 - 3 giọt phenolphtalein, dùng NaOH 0,1N chuẩn đến khi màu của chỉ thị chuyển sang màu hồng bền trong khoảng 30 giây thì dừng lại Kết quả được tính theo công thức:

Caxit = k× VNaOH×NNaOH×1000/ Vmẫu.

25

Trong đó: k là hệ số axit, quy về axit Citric là 0,064

VNaOH là số ml NaOH 0,1 N cần dùng để chuẩn

NNaOH là nồng độ dung dịch NaOH

Vmẫu là số ml dịch mẫu đem phân tích

Hoạt độ enzym α - Amylaza là số gam tinh bột tan được chuyển hóa thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau khi sử dụng 1g chế phẩm enzym ở 300C và trong thời gian 1 giờ tại pH = 4,7

 Tiến hành: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 10 ml tinh bột 1%, đặt vào máy ổn nhiệt 300C trong 10 phút Bổ sung vào ống nghiệm 2 (ống đựng mẫu thí nghiệm) 5ml dịch chiết enzym Lắc đều 2 ống và để ổn nhiệt ở 300

C trong

10 phút

Lấy từ 2 ống, mỗi ống 0,5 ml hỗn hợp và cho vào ống nghiệm đã có sẵn

50 ml dung dịch Iod phân tích, đem lắc đều và đi đo Cường độ màu được đo

ở bước sóng 656 nm so với mẫu nước cất Kết quả được tính theo công thức: Lượng tinh bột (C) được thủy phân:

C = (D1- D2) × 0,1/ D1 (g) Trong đó: D1 mật độ đo quang của dung dịch kiểm chứng

D2 mật độ đo quang của dung dịch thí nghiệm

0,1 là lượng tinh bột đem phân tích

Hoạt độ enzym α - Amylaza từ nguồn nấm mốc:

HĐA = ( 7,264C – 0,03766) ×1000/m (UI/g) Trong đó: C lượng tinh bột được thủy phân (g)

26

m lượng chế phẩm nghiên cứu (mg)

7,264; 0,03766 là các hệ số thu được từ thực nghiệm

đã tính ra 1 giờ tác dụng

1000 là hệ số quy đổi từ mg sang g

* Xác định hoạt độ enzym Glucoamylaza theo phương pháp DNS:

 Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzym Glucoamylaza có trong chế phẩm nghiên cứu, sản phẩm tạo thành là đường glucoza và xác định cường độ màu tạo thành giữa glucoza và dung dịch DNS Hoạt độ Glucoamylaza là số micromol glucoza tạo thành khi dùng 1 g chế phẩm enzym tác dụng lên tinh bột tan ở điều kiện pH= 4,7; nhiệt độ tại

550C trong 30 phút

 Tiến hành: Dựng đường chuẩn: Cân 0,15 g đường glucoza tinh khiết 99% hòa tan trong 1000 ml Tiến hành làm thí nghiệm với 7 mẫu có số ml của dịch đường khác nhau là 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; và 1,2 ml và thêm tương ứng số ml nước cất là 2; 1,8; 1,6; 1,4; 1,2; 1,0 và 0,8 ml nước cất Thêm vào mỗi ống 2 ml dung dịch DNS, đậy nút và đun sôi ở 1000

C trong 5 phút, làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm Sau đó dựng đường chuẩn từ

số liệu đã thu được, trục tung là giá trị OD, trục hoành là nồng độ đường chuẩn

Mẫu đối chứng: Lấy 1 ml dịch enzym và đem đun sôi ở 1000

C trong 15 phút

Mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng cùng tiến hành như sau: hút 1 ml dịch enzym chưa vô hoạt và 1 ml dịch enzym đã vô hoạt vào các ống nghiệm riêng biệt có nút đậy, bổ sung 1 ml tinh bột 0,05% và đem thủy phân ở 550

C trong 30 phút, rồi sau đó làm nguội Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch DNS

và đun sôi ở 1000C trong 5 phút, làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm so với nước cất

 Kết quả:

27

Cường độ màu được tạo ra do lượng glucoza tạo do enzym có trong dịch phân tích là:

∆A = A1- A2

A1 là cường độ màu của mẫu thí nghiệm

A2 là cường độ màu của mẫu đối chứng

Dựa vào ∆A và đường chuẩn xác định được lượng đường glucoza do enzym tạo ra là a (mg)

Hoạt độ Glucoamylaza (UI/g) tính theo công thức:

a là lượng đường glucoza tạo thành (mg)

b là lượng chế phẩm có trong 1 ml dịch enzym phân tích (g)

180 là phân tử lượng của đường glucoza (g)

V1 số ml dịch enzym sử dụng (ml)

V2 tổng số ml dịch đem đo

1000 là hệ số chuyển đổi từ mg sang µg

2.5.2 Phương pháp vi sinh:

a Hoạt hóa – nhân giống nấm men

Giống nấm men đã được tuyển chọn, bảo quản trong ống thạch nghiêng Trước khi sử dụng để lên men cần hoạt hóa tế bào nấm men Nấm men được cấy truyền vào bình nhân giống cấp 1 Nuôi ở điều kiện 28 - 300

C trong 24 giờ sau đó tiếp tục cấy truyền sang bình giống cấp 2 [8]

b Xác định mật độ của tế bào nấm men [13]

Sử dụng buồng đếm Thomas là một phiến kính dày, giữa có kẻ lưới đếm gồm nhiều ô vuông, có chiều sâu 1/100 mm và diện tích 1/400 mm2

 Tiến hành: Dùng bông thấm nước vô trùng, phết nhẹ lên khoảng bên của lưới đếm Đặt lá kính lên, dùng hai ngón tay ấn nhẹ sao cho lá kính dính chặt vào phiến kính Khoảng không gian giữa lá kính và phiến kính sẽ tạo thành buồng đếm Dùng pipet lấy canh trường vi sinh vật đã được pha

V1

V2

a×1000 b×180