Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang phổ

So với các phương pháp trên thì phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, phân tích nhanh, không sử dụng dung môi độc hại, có thể t

i

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về nhóm thuốc glycoside tim 2

1.1.1 Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nhiên nhóm glycoside tim 2

1.1.2 Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim 2

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim 3

1.1.4 Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim 4

1.1.5 Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim 5

1.1.6 Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim 6

1.1.7 Tá dược trong thuốc glycoside tim 8

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim 9

1.2.1 Phương pháp sắc ký 9

1.2.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại 12

1.3 Thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp 16

1.3.1 Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến 16

1.3.2 Một số ứng dụng thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất 21

1.3.3 Giới thiệu phần mềm Matlab 22

1.4 Phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng 23

CHƯƠNG 2.THỰC NGHIỆM 25

ii

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Thiết bị 27

2.3 Phương pháp phân tích 27

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 27

2.3.2 Phương pháp phân tích 28

2.4 Câu lệnh thực hiện hồi quy đa biến trong Matlab 29

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ hồng ngoại tới quá trình xác định đồng thời digoxin và digitoxin trong hỗn hợp 32

3.1.1 Khảo sát lựa chọn số sóng thích hợp 32

3.1.2 Khảo sát tỷ lệ trộn mẫu với bột KBr 38

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng quá trình ép viên mẫu 39

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 39

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu chuẩn 40

3.1.6 Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên 41

3.2 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng digoxin trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến 42

3.2.1 Chuẩn bị số liệu đầu vào của mô hình hồi quy đa biến 42

3.2.2 Lựa chọn số cấu tử chính 44

iii

3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 46

3.2.4 Phân tích mẫu thực tế 47

3.3 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định đồng thời các hoạt chất50 3.3.1 Chuẩn bị số liệu đầu vào 50

3.3.2 Lựa chọn số cấu tử chính 52

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) 55

3.3.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 56

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 63

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim 2

Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose 9

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn 28

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 4000-400 cm-1 33

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 4000-400 cm-1 34

Hình 3.3 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 3600-2800 cm-1 35

Hình 3.4 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 3600-2800cm-1 35

Hình 3.5 Phổ tổng cộng của digoxin và digitoxin 35

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại truyền qua của lactose trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm-1 36

Hình 3.7 Phổ hồng ngoại truyền qua magie stearat trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm-1 37

Hình 3.8 Phổ hồng ngoại truyền qua talc trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm-1 37

Hình 3.9 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định digoxin 49

Hình 3.10: Sắc đồ của mẫu thực (D1 và D2) 49

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim 3

Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim 5

Bảng 1.3 Thành phần các glycoside trợ tim chính 6

Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng với bột KBr đến độ hấp thụ quang tại một số đỉnh pic đặc trưng 38

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát quá trình ép viên 39

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 40

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu 40

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên tại một số đỉnh pic đặc trưng 41

Bảng 3.6 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng 43

Bảng 3.7 Hàm lượng digoxin và tá dược trong ma trận kiểm tra 44

Bảng 3.8 Độ lệch chuẩn của mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng digoxin với các PC từ 1-4 46

Bảng 3.9 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định riêng digoxin 47

Bảng 3.10 Mẫu dược phẩm chứa hoạt chất digoxin đang lưu thông trên thị trường 47 Bảng 3.11 Khối lượng trung bình của một viên thuốc và khối lượng digoxin trong một viên thuốc 48

Bảng 3.12 Hàm lượng digoxin trong mẫu thực tính theo HPLC 50

Bảng 3.13 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng các chất chuẩn trong ma trận chuẩn xác định đồng thời digoxin và digitoxin 51

Bảng 3.14 Khối lượng các hoạt chất và tá dược trong ma trận kiểm tra 52

vi

Bảng 3.15 Độ lệch chuẩn tương đối của mô hình hồi quy tuyến tính đa biến xác định đồng thời digoxin và digitoxin với số cấu tử từ 1-4 54Bảng 3.16 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng thời digoxin và digitoxin 56Bảng 3.17: Hàm lượng digoxin và digitoxin trong mẫu thêm chuẩn xác định theo

mô hình hồi quy đa biến tuyến tính 57

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Bình phương tối thiểu thông thường

Bình phương tối thiểu nghịch đảo

Bình phương tối thiểu từng phần

Hồi qui cấu tử chính (principal

1

MỞ ĐẦU

Glycoside tim đại diện cho một trong những nhóm dược liệu quan trọng của các tác nhân điều trị bệnh tim Tuy nhiên các hoạt chất thuộc nhóm này có cơ chế tác dụng đặc biệt lên tim, đặc tính động học cao, thời gian tích lũy trong cơ thể rất lâu vì thế khi ngộ độc thì bị kéo dài, dễ gây tử vong cho người bệnh Chính vì thế cần xác định chính xác hàm lượng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đưa vào điều trị đạt hiệu quả cao Yêu cầu đặt ra là phải có phương pháp phù hợp định lượng các glycoside tim trong dược liệu, dược phẩm một cách nhanh chóng và chính xác Để định lượng chính xác glycoside có rất nhiều phương pháp như HPLC, HPLC kết hợp với detecto UV…, tuy nhiên nhược điểm của các phương pháp này

là là phải thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại, tốn dung môi và yêu cầu xử lý mẫu, tách chất nên khá mất thời gian … không thể dùng để phân tích nhanh, đại trà [11,13]

So với các phương pháp trên thì phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, phân tích nhanh, không sử dụng dung môi độc hại, có thể tiến hành đo trực tiếp mẫu rắn rất phù hợp cho việc phân tích nhanh Nhưng do vùng phổ hồng ngoại gần và trung bình gồm các bước sóng của các liên kết cơ bản (C-C, C-H, N-H…) do vậy xảy ra sự chồng phổ, khó tách phổ và quá trình phân tích mẫu rắn gặp rất nhiều khó khăn nên việc định lượng hoạt chất trong dược phẩm rất khó khăn

Trước thực trạng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến” Với việc kết hợp phương

pháp phổ hồng ngoại với kỹ thuật thống kê đa biến ta có thể định lượng đồng thời nhiều hoạt chất trong dược phẩm mà không cần tách chiết chất

Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa Việt Nam

và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình, kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh trong thực

tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng tính thời sự

của công tác giám định chất lượng

2

1.1 Giới thiệu chung về nhóm thuốc glycoside tim

1.1.1 Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nhiên nhóm glycoside tim

Glycoside tim bắt đầu được sử dụng trong y học bởi Withering vào năm 1985, đây là những glycoside steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, được dùng để điều trị suy tim Trong số hơn 300 loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin và digitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị hiện nay

Glycoside tim có trong hơn 45 loài thực vật chủ yếu thuộc các họ:

Apocynaceae, Asclepiadaceae, Celastraceae (Dây gối), Cruciferae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Liliaceae, Meliaceae, Moraceae, Ranulculaceae, Scrophulariaceae, Sterculiaceae, Tiliaceae (Đay) và trong một số côn trùng Ở trong cây glycoside tim có ở các bộ phận: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ, nhựa mủ [8,11,13,23]

1.1.2 Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim

Glycoside tim cũng như các glycoside khác cấu trúc hoá học gồm hai phần: phần đường và phần không đường (aglycon hoặc genin) được nối với nhau bằng dây nối glycoside Công thức cấu tạo chung của glycoside tim được trình bày ở hình 1.1 và bảng 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim

3

Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim

- Phần không đường (aglycon hoặc genin) có thể chia thành hai phần nhỏ:

+ Phần hydrocacbon: là dẫn xuất của 10,13 – dimetylxyclopentanopehydro phenantren

+ Phần mạch nhánh là vòng lacton, có tác dụng chống suy tim, được nối vào vị trí C-17 của khung

Đính vào nhân này còn có các nhóm chức có oxy

- Phần đường không có tác dụng dược lý, được nối vào -OH ở C-3 của aglycon Phần không đường có thể chia thành hai phần nhỏ:

+ Phần hydrocacbon

+ Mạch nhánh là vòng lacton

- Các loại dây nối:

+ Dây nối axetal gồm: O- glycoside, C- glycoside, S- glycoside, N- glycoside + Dây nối este: Pseudoglycoside [11,13,23]

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim

4

* Tính chất hóa học

Các glycoside tim rất nhạy cảm với thay đổi pH môi trường, những glycoside tim có đường 2-desoxy rất dễ thuỷ phân khi đun với axít vô cơ 0,05 N trong metanol 30 phút trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó không thuỷ phân được

Trong môi trường kiềm các cacdenolid chuyển thành các dẫn chất iso và các dây nối este bị cắt (nếu có) không hoạt tính Glycoside dễ bị thuỷ phân bởi các enzim Thường thì các enzim này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt phần glucose để chuyển thành các glycoside thứ cấp Ví dụ: digilanidaza trong lá digitan lông, digipuapidaza trong lá digitan tía, strophantobiaza trong hạt Strophanthus courmonti, xilarenaza trong Scilla maritima [11,13,23]

1.1.4 Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim

Phần quyết định tác dụng lên tim là phần aglycol bao gồm nhân steroid và vòng lacton chưa bão hoà Nếu giữ vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzen hoặc naphtalen thì mất tác dụng Nếu giữ nhân steroid mà thay đổi vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất nhiều Phần đường có ảnh hưởng đến tác dụng nhưng ít, chủ yếu là ảnh hưởng đến độ hoà tan.Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH của phần aglycon

Digitoxin dễ hấp thu qua đường tiêu hoá và tái hấp thu qua thận và gan thì chỉ

có một nhóm -OH tự do trong phần aglycon Digitoxin tích luỹ trong cơ thể

Các hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim tác dụng lên tim theo cùng một cơ chế Glycoside tim làm tâm thu ngắn và mạnh, tâm trương dài ra, nhịp tim chậm lại

Do đó bệnh nhân đỡ khó thở và nhịp hô hấp trở lại bình thường Glycoside tim còn làm giảm dẫn truyền nội tại và tăng tính trợ của cơ tim nên nếu tim bị loạn nhịp, thuốc có thể làm đều nhịp trở lại

Khi dùng với liều lượng cao, sẽ có hiện tượng nhiễm độc dẫn tới các dấu hiệu tâm thần mê sảng, lú lẫn, giảm thị giác, nôn, chán ăn, tim đập chậm lại, loạn

5

nhịp ngoại tâm thu nhĩ, cuối cùng là ngừng đập Điều trị ngộ độc bằng cách dùng thuốc ức chế gắn tiếp tục glycoside tim vào tim (kali) và thải trừ calci là chất hiệp đồng tác dụng với digitalis trên cơ tim (EDTA) và các thuốc chữa triệu chứng loạn nhịp tim Điều trị chủ yếu dựa vào mức độ nhiễm độc nặng hay nhẹ với các triệu chứng loạn nhịp ra sao [8]

1.1.5 Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim

Glycoside tim được khuếch tán thụ động qua ống tiêu hóa (dạ dày, tá tràng, ruột non): thuốc càng tan tốt trong lipid, càng dễ khuếch tán Các nhóm -OH của genin là những cực ưa nước, làm hạn chế độ tan trong lipid của thuốc Digitoxin có một nhóm -OH tự do ở C14, nên dễ tan trong lipid, được hấp thu hoàn toàn khi uống Digoxin có 2 nhóm -OH tự do, hấp thu qua đường tiêu hóa tốt hơn uabaigenin, nhưng không hoàn toàn như digitoxin

Glycoside tim gắn nhiều vào mô, đặc biệt là tim, gan phổi, thận vì những cơ quan này được tưới máu nhiều [8]

Đặc tính dược động lực học của một số glycoside tim được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim

Glycoside

Số nhóm

OH

Tính hòa tan

Hấp thu qua đường tiêu hóa

Gắn vào protein huyết tương

Chuyển hóa

Đường thải trừ chính

nhanh) Lanatozid C 2 Nước >

Digoxin 2 Nước >

Thận và gan (nhanh)

Chuyển hóa hoàn toàn ở gan

Thận,gan

và phân (rất nhanh)

6

1.1.6 Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim

Trong số hơn 300 glycoside tim có trong tự nhiên thì chỉ có digoxin và digitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim

và được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay Vì vậy chúng tôi chỉ đi sâu nghiên cứu vào hai hoạt chất digoxin và digitoxin trong luận văn này

3 digitoxose

3 digitoxose+

phần acetic

Digitalin Acilanid

Digoxin

Lanataglycoside C

Digoxigenin Digoxigenin

3 digitoxose

3 digitoxose + 1 glucose+ phần acetic

Digoxin Xedilanid

Scilaren A Scilarenin Ramnose + 1

glucose

Xilaren

1.1.6.1 Digoxin

Công thức: C41H64O14 (780,95)

Tên quốc tế: Digoxin

Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp tim Digoxin làm tăng sức bóp cơ tim và

giảm tính dẫn truyền xung điện qua nút nhĩ thất, do đó thường dùng trong điều trị suy tim, kiểm soát nhịp tim trong rung nhĩ,cuồng động nhĩ, nhịp nhanh kịch phát

trên tâm thất

7

Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin

Tính chất vật lý: digoxin là chất kết tinh không màu Tan trong cồn, pyridin,

hay hỗn hợp clorofom – ancol, tan nhiều trong cồn nóng 80% Độ tan trong nước 64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C Không tan trong ete, axeton…

Digoxin có thể dùng bằng cách uống hoặc tiêm tĩnh mạch Thể tích phân phối trung bình khoảng 7,3 l/kg Thải trừ qua thận gần như hoàn toàn Sự thải trừ không phụ thuộc pH của nước tiểu [3]

1.1.6.2 Digitoxin

Công thức: C41H64O13 (764,95)

Tên quốc tế: Digitoxin

Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp Là chất độc bảng A Có cấu trúc và hiệu

ứng tương tự như digoxin, mặc dù các hiệu ứng lâu dài không giống như digoxin (được loại bỏ ra khỏi cơ thể qua thận), nó được thải trừ qua gan, do đó có thể được

sử dụng ở những bệnh nhân có chức năng thận kém hoặc thất thường

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin

8

Tính chất vật lý: Digitoxin là chất kết tinh không màu Tan tốt trong cồn,

clorofom, tan ít trong nước (1gam/100 lít ở 20oC) Không tan trong dung môi hữu

cơ benzen, ete….[3]

1.1.7 Tá dược trong thuốc glycoside tim

Dạng thuốc là sản phẩm cuối cùng của quá trình bào chế; có bao gồm dược chất, tá dược, và bao bì Dược chất hay hoạt chất chính là thành phần chính của dược phẩm có tác dụng dược lý Dược chất dùng để trị bệnh, phòng bệnh hoặc chuẩn đoán bệnh

Tá dược hay tá chất là các loại chất phụ thêm vào dược phẩm nhằm làm thuận lợi cho quá trình sản xuất thuốc, tạo cho dược phẩm có thể chất, khối lượng, màu sắc, mùi vị thích hợp hoặc tiện dụng, dễ bảo quản, tăng độ ổn định của thuốc, giải phóng được chất tại nơi mong muốn, phát huy được tối đa tác dụng của dược chất, hạn chế tác dụng phụ và độc tính Như vậy, tá dược có vai trò là chất độn, chất mang, dung môi hòa tan, và chất bảo quản

Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc glycoside tim đều thay đổi theo mỗi nhà sản xuất Tuy nhiên trong quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy lactose, magie stearat, talc… là 3 loại tá dược được sử dụng nhiều nhất và chiếm khối lượng phần trăm lớn (gần 98%)

1.1.7.1 Talc

Bột talc là magie silicat tự nhiên đã được lựa chọn và làm thành bột mịn

Công thức hóa học Mg3Si4O10(OH)2 Cấu trúc của talc bao gồm lớp bát diện magie liên kết kẹp giữa hai lớp tứ diện silic

Tính chất: bột talc rất mịn, nó cho cảm giác trơn bóng như xà phòng Talc có

tính chất cách điện, cách nhiệt, nhiệt độ nóng chảy cao, độ giãn nhiệt thấp, bền hóa học, hấp thụ dầu, kị nước, ưu hợp chất hữu cơ và diện tích bề mặt lớn [2]

9

1.1.7.2 Magie stearat

Magie stearat là stearat là hỗn hợp các muối của magie và các axit béo

Công thức: C36H70MgO4

Tính chất: magie stearat có dạng bột trắng mịn, là thành phần tá dược có tác

dụng chủ yếu để bôi trơn, chống dính, làm chất độn, không tan trong nước, etanol hoặc ete, chủ yếu được sử dụng như một chất bôi trơn

1.1.7.3 Lactose

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose Tính chất

Lactose có dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng Dễ tan nhưng tan chậm trong nước, kém tan trong etanol 96%

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim

1.2.1 Phương pháp sắc ký

Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hóa dược, sinh hóa, hóa thực phẩm, nông hóa, hóa dầu, hóa học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

10

1.2.1.1 Phân tích định lượng bằng HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học lại vừa có tính chất lý hóa Trong cột sắc ký xảy ra những cân bằng động giữa pha tĩnh và pha động Chất tan luôn được vận chuyển và phân

bố lại giữa hai pha Pha động chảy liên tục qua cột tách với tốc độ và thành phần nhất định Do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất là khác nhau, thời gian bị giữ lại trong cột sắc

ký khác nhau, dẫn đến quá trình tách của các chất trong cột sắc ký

Đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách, dựa vào thời gian lưu này để định tính chất đó thông qua mẫu chuẩn Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) đề định lượng các chất

H = k1.Cb

S = k2.Cb Trong đó: H chiều cao pic sắc ký của chất

S diện tích pic sắc ký của chất

k hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

11

Youichi Fujii và các cộng sự đã đưa ra quy trình tách và định lượng các glycoside tim trong thuốc bằng phương pháp micro – HPLC với điều kiện: Cột Jasco SC-01 (165x0,5mm I.D), pha động là hỗn hợp acetonitrin –metanol – nước với tỉ lệ thể tích bằng 1:1:1, tốc độ dòng 4 l/phút, detector UV đặt tại bước sóng ở

220 nm, thể tích bơm mẫu là 0,1l Thứ tự các chất ra khỏi cột là: digoxin, lanatoside B, gitoxin, lanatoside A, digitoxin, thời gian tách thay đổi trong khoảng

30 đến 45 phút.[26]

Digoxin và digitoxin cũng đã được nhóm nghiên cứu của Federica Pellati phân tích xác định và tách trong lá cây mao địa hoàng với phương pháp HPLC trên cột LiChrospher RP-18 (125 mm × 4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6

mm I.D.); SB-Aq (150 mm × 4.6 mm I.D); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D., trong điều kiện dung môi pha động là hỗn hợp của acetonitrin và nước, chạy gradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 với tỉ lệ H2O/ACN là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 được giữ trong 3 phút, nhiệt độ cột đặt ở 20oC, thể tích bơm là 10l, tốc độ dòng là 1ml/phút, detector đặt tại bước sóng 220nm Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút Thứ tự các chất ra khỏi cột: digoxigenin; 2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin;

5, digoxin; 6, lanatoside C; 7, digitoxigenin; 8, -acetyldigoxin; 9, -acetyldigoxin;

10, lanatoside B; 11, gitoxin; 12, lanatoside A; 13, digitoxin.[19]

Sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để xác định digoxin trong thuốc cũng đã được công bố bởi A Jedlicka và các cộng sự Digoxin sau khi được chiết pha rắn được đưa vào phân tích với điều kiện: cột C18 (RP-18e, 5m, 125x4,0mm), pha động là hỗn hợp của nước và acetonitrin với tỉ lệ H2O/ACN = 72:28, phát hiện chất ở bước sóng 118nm, thể tích bơm mẫu là 100l, nhiệt độ cột 50oC, tốc độ dòng 1,1ml/phút.[13]

12

1.2.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại

1.2.2.1 Đại cương về phổ hồng ngoại

Vùng phổ hồng ngoại gần được phát hiện vào năm 1800 bởi William Herschel Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành tổng hợp hữu cơ, các máy đo quang phổ hồng ngoại càng trở nên thông dụng ở các phòng thí nghiệm cho mục đích định dạng các vật liệu tinh khiết và cấu trúc của chúng, đã đóng góp rất nhiều cho các công trình nghiên cứu về nông nghiệp, thực phẩm, dệt, polymer, xăng dầu, dược phẩm…

Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích khá hiệu quả Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác đó là nó có thể cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các tính toán hay công đoạn chuẩn bị mẫu quá phức tạp

1.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới tín hiệu đo phổ hồng ngoại

* Các yếu tố ảnh hưởng làm dịch chuyển tần số đặc trưng

Tần số dao động của các nguyên tử phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử của chất nghiên cứu và tương tác giữa các phân tử này Ngoài ra còn có ảnh hưởng của dung môi, nồng độ, nhiệt độ và trạng thái tập hợp tới vị trí của cực đại hấp thụ:

- Dung môi: có ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của các cực đại hấp thụ tùy theo độ phân cực của chúng

- Nồng độ dung dịch: cũng gây ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của đỉnh hấp thụ, đặc biết đối với các chất có khả năng tạo cầu liên kết hidro như ancol, phenol, amin…

- Ảnh hưởng của nhóm thế: Các nhóm thế trong phân tử cũng gây ra ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí đỉnh hấp thụ tùy theo nhóm thế gây hiệu ứng cảm ứng hay liên hợp

13

- Phức chất: khi tạo phức, tần số hấp thụ đặc trưng của nhóm chức thay đổi theo kim loại trung tâm và số phối trí [9, 12, 13]

Ngoài ra H2O cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn tới phổ hấp thụ hồng ngoại,

do H2O hấp thụ mạnh trong vùng này nên các mẫu đem đo phổ phải đảm bảo không chứa nước (mẫu phải bảo quản trong bình hút ẩm)

1.2.2.3 Máy quang phổ hồng ngoại

Máy quang phổ hồng ngoại dùng để ghi phổ trong vùng từ 10000 cm-1 đến

670 cm-1 hoặc trong một vài trường hợp tới 200 cm-1 Máy quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) sử dụng bức xạ đa sắc và tính toán phổ theo dải tần số từ các dữ liệu gốc bằng chuyển đổi Fourier

Thông thường phổ được xem là hàm số của độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới

Độ hấp thụ ánh sáng (A) là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền qua [2]

1.2.2.4 Kỹ thuật đo phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại (IR) là một trong các kỹ thuật phân tích quan trọng Một trong các lợi thế vượt trội của nó là có thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất: chất lỏng, dung dịch, bột nhão, bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…

Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toàn phần trong đó phổ truyền qua hay được sử dụng nhiều nhất

Phổ IR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha rắn

Chuẩn bị mẫu

1 Pha hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ dài 10

cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua

2 Dạng màng chất lỏng: Giọt mẫu chất lỏng được nhỏ lên bề mặt một tấm cửa

số NaCl, lấy tấm cửa sổ NaCl còn lại xoa nhẹ để tạo lớp màng chất lỏng mỏng giữa

4 Ở trạng thái rắn: Đo mẫu dạng rắn có hai phương pháp đo:

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi một lớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy

Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu với bột KBr, nghiền kỹ bằng cối mã

não, sau đó cho vào cối ép thành màng mỏng, đặt vào giá đỡ cuvet để đo trên máy Một vài yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chuẩn bị mẫu đo theo phương pháp trộn KBr: nghiền không kỹ, trộn không đều, độ ẩm, các tạp chất trong môi trường phân tích [2, 9, 12, 13]

Log = Đối với trường hợp đo trong dung dịch: theo phương trình trên, ở một bước sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với nồng độ C và chiều dày cuvet d và bản chất của mẫu đo Như vậy, khi phân tích một chất, đo ở một bước sóng xác định với một cuvet có chiều dày d đã biết thì độ hấp thụ quang A chỉ còn tỉ lệ với nồng độ C của mẫu chất

15

Phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại cũng thực hiện theo cách lập đường chuẩn Pha một loạt mẫu với nồng độ khác nhau của chất cần xác định ở dạng tinh khiết rồi đo giá trị A của chúng, sau đó vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A vào nồng độ C Sau khi thiết lập được đồ thị đường chuẩn, cần chú ý là đường chuẩn này chỉ sử dụng được trong phạm vi giới hạn nồng độ ứng với đoạn đường thẳng của đường biểu diễn, bởi vì trong giới hạn này mới có sự tuyến tính giữa độ hấp thụ quang A và nồng độ dung dịch [9]

Ứng dụng phổ hồng ngoại trong phân tích dược phẩm

Phổ hồng ngoại gần chứa thông tin về cả các tính chất chất hóa học và các tính chất vật lý của mẫu đo Do đó, các thông số dược phẩm khác nhau có thể được phân tích bằng NIRS như độ cứng, kích thước hạt, lực nén, độ ẩm Theo tài liệu tham khảo, việc phân tích định lượng bằng NIR đầu tiên là việc xác định độ ẩm của mẫu nhờ vào dải phổ đặc trưng cho các liên kết trong phân tử của nước hấp thụ tại bước sóng 1450 và 1940 nm

- Kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan sát thấy dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài Năm 1985, tác giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ tại bất kì bước sóng nào với kích thước hạt

- Độ ẩm: Do nước gây ra hệ số suy giảm lớn nhất trong phổ NIR của các vật liệu dược phẩm nên nó cũng là một trong những chất được đo đạc nhiều nhất bằng NIR Derksen và đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định nước thông qua độ ẩm của mẫu với nhiều loại hoạt chất

- Độ cứng: Một trong các ứng dụng về quản lý chất lượng của phổ NIR đó là xác định độ cứng của viên thuốc mà không cần phá mẫu Sự thay đổi về độ cứng của thuốc có thể được quan sát dưới dạng đường phổ nền dốc dịch chuyển khi độ cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên Điều này rõ rệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng

16

- Xác định thành phần của hoạt chất trong các viên nén và viên con nhộng, Xác định liều lượng nguyên vẹn trong thuốc… [9, 12, 13, 27]

L.K Hearn và các cộng sự cũng đã sử dụng phổ hồng ngoại gần để xác định hàm lượng glycoside có trong lá cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) Đã làm thí nghiệm 33 mẫu lá được thu hoạch ở nhiều thời điểm khác nhau trong năm, sau đó cắt nhỏ, sấy khô trong 48h ở nhiệt độ 800C và đem đi đo phổ hồng ngoại gần Kết quả thu được hàm lượng glycoside chiếm từ 4,3 đến 11,1 % hàm lượng lá khô [21]

1.3 Thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp

1.3.1 Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến

Phương pháp hồi quy đa biến là một mảng quan trọng trong Chemometric, hiện nay được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hóa học, phương pháp này giúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời nhiều cấu tử có mặt trong hỗn hợp

mà không cần tách loại ra trước khi phân tích

Thuật toán này đã được ứng dụng rộng rãi để giải quyết nhiều bài toán định dạng phức tạp Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy dung dịch chuẩn có mặt tất cả các cấu tử cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x),

đo tín hiệu phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y và thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến độc lập x (nồng độ các chất trong hỗn hợp) Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ của các cấu tử trong cùng dung dịch định phân khi có tín hiệu phân tích của dung dịch đó

Nếu các cấu tử có mặt trong hỗn hợp cho tín hiệu đo có tính chất cộng tính thì

có thể sử dụng phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính thông thường (multiple linear regression- MLR) như phương pháp bình phương tối thiểu thông thường

hoặc hiệu quả hơn như bình phương tối thiểu từng phần, phương pháp hồi qui cấu

tử chính, … Nhưng nếu trong hỗn hợp, các cấu tử có sự tương tác lẫn nhau làm mất tính chất cộng tính ở tín hiệu đo thì phải sử dụng mô hình hồi qui đa biến phi tuyến tính mà phổ biến là các phương pháp kết hợp với mạng nơron nhân tạo

17

Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, và phương pháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS

Trong phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính nếu giả thiết rằng trong dung dịch cần phân tích có n cấu tử (x1, x2, xn), tín hiệu phân tích của hỗn hợp này là

y, thì phương trình hồi quy đa biến mô tả quan hệ giữa y và các biến xi (i = 1,2, n)

có dạng:

y = k1x1 + k2x2+ + knxn + e (1) với e là tín hiệu nền gây ra sai số khi phân tích

Để tìm nồng độ của n cấu tử thì cần có ít nhất n phương trình hồi quy Vì vậy, khi xây dựng đường chuẩn cần tiến hành số thí nghiệm m n, khi đó sẽ lập được m phương trình hồi quy đa biến Phương trình trên có thể biểu diễn dưới dạng tổng quát như sau:

Trong đó: K là véc tơ chứa các hệ số của phương trình hồi quy

Y là véc tơ cột chứa m giá trị y1, y2 ym

X là ma trận có m hàng (ứng với m thí nghiệm) và n cột (ứng với n cấu tử trong hỗn hợp)

E là véc tơ cột chứa tín hiệu nền của m thí nghiệm

)

Để giải bài toán theo phương pháp hồi đa biến tuyến tính thì tín hiệu phân tích của những cấu tử trong hỗn hợp phải thỏa mãn tính chất cộng tính Phương trình hồi quy này sẽ cho biết:

- Tính được nồng độ các cấu tử trong dung dịch cần phân tích từ việc đo tín hiệu phân tích của mẫu chưa biết

Các thuật toán hồi quy đa biến thường được sử dụng để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp mà không phải tách là:

- Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS)

- Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS)

- Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

- Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

* Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS)

Từ dạng tổng quát Y= XK + e

Với y là vecto (mx1); X là ma trận (mxk), và e là vecto số dư (mx1)

K là vecto hệ số của phương trình hồi qui dạng hàng (kx1) nếu y là véc tơ cột biểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn; K là ma trận (kxp) nếu y là số liệu dạng ma trận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví dụ đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng)

Nếu có giá trị nhập vào là biến độc lập X và biến phụ thuộc y sẽ tính được giá trị hệ số b Theo phương pháp bình phương tối thiểu, ma trận hệ số K sẽ được tính như sau:

K= (XTX)-1 XTy Với XT là ma trận chuyển vị của X (transpose to matrix)

19

Với mẫu chưa biết cần tìm giá trị X0 từ giá trị y0 ta sẽ có:

X0 = y0 KT (KKT)-1

Ưu điểm của CLS : Trong phương pháp hồng ngoại, phương pháp CLS ghi

tín hiệu phân tích dạng ma trận được xem là phương pháp định lượng phổ toàn phần, do vậy đạt được độ chính xác cao so với các phương pháp chỉ sử dụng một số bước sóng và cho phép tính toán đúng với tất cả các phổ trong hỗn hợp

Nhược điểm của CLS : là cần phải biết tất cả các phổ của những chất gây ảnh

hưởng đến vùng phổ được đo vì chúng đều đóng góp vào đường chuẩn Điều này có thể được loại trừ đáng kể bằng cách phân tích dải phổ tại một thời điểm sau khi gộp kết quả vào phép phân tích thống kê Nó cho phép loại bỏ dải phổ không tuân theo định luật Lambe-Bia hoặc những phổ có chứa tín hiệu của ion cản Vì vậy cần thiết phải xác định xem trong hỗn hợp có những chất nào đóng góp vào tín hiệu phổ

* Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS)

Phương pháp này giả thiết rằng nồng độ chất phân tích là hàm của tín hiệu phân tích theo phương trình:

X = y.P+e Trong phương pháp này, hệ số P trong phương trình hồi qui là thành phần của

ma trận (mxk) được tính theo phương pháp bình phương tối thiểu suy rộng

(generalized):

P= (yTy)-1 yTX Việc phân tích nồng độ chất chưa biết (X0) được thực hiện bằng cách nhân trực tiếp gía trị tín hiệu đo y0 của dung dịch cần phân tích với P

X0= y0.P

Nhược điểm của phương pháp ILS: tín hiệu mẫu phân tích phải được ghi ở

số ít nhất thời điểm chính xác nhất (ví dụ trong trắc quang phải chọn được số ít nhất các bước sóng phản ánh đấy đủ tín hiệu của tất cả các chất trong hốn hợp) Vì ma

20

trận hệ số P tính theo phương trình trên là ma trận nghịch đảo, do đó kích thước của

ma trận này phải bằng số bước sóng sử dụng và phải nhỏ hơn số dung dịch chuẩn đem dùng Một vấn đề khác là tính cộng tính của tín hiệu đo và đường chuẩn khi có nhiều bước sóng được sử dụng sẽ xảy ra làm cho độ chính xác giảm

* Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độc lập X và biến phụ thuộc Y PLS mô hình hoá cả 2 biến X và Y đồng thời để tìm ra

biến ẩn (latent variables- LVs) trong X mà từ đó sẽ đoán được biến ẩn trong Y

PLS1 dùng để chỉ những trường hợp có 1 tín hiệu phân tích ở một thời điểm và được nhập dưới dạng véc tơ cột, trong khi PLS2 có thể cho ta một số kết quả Y đồng thời Nói cách khác số liệu của liệu Y trong phương pháp PLS2 được mô tả dưới dạng ma trận Trong mô hình PLS, số liệu được chia thành 2 nhóm biến: biến X (descriptor: biến mô tả hay biến độc lập, thường là nồng độ chất phân tích) và biến Y (respone: kết quả hay tín hiệu phân tích)

Mục đích của PLS là mô hình hoá X sao cho có thể đoán được thông tin trong

Y PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance) giữa ma trận X và Y Hai

ma trận X và Y được phân tích thành hai ma trận trị số (score matrices) T, U và ma trận trọng số (loading matrices) P và Q

Trái ngược với PCA, có hai dạng khác nhau của giá trị trọng số trong PLS,

tương đương với PCA loading là PLS weights (trọng số PLS) (W) Loading weight

(W) được dùng là trực giao để tối ưu hoá đồng phương sai giữa hai biến X và Y Số

tối ưu các biến ẩn có thể được ước đoán bằng dùng thuật toán đánh giá chéo validation) hoặc tập số liệu kiểm tra riêng biệt

(cross-Nói cách khác phương pháp PLS khác với các phương pháp hồi qui khác ở chỗ

nó thích hợp cho những tập số liệu có số thí nghiệm ít hơn số biến và sự tương quan giữa các biến độc lập và có tính chất cộng tính cao

21

Mục đích của PLS cũng là giảm số biến và tạo ra các cấu tử không liên quan sau đó biểu diễn phương trình bình phương tối thiểu với những cấu tử này

* Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

PCR gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tử chính chuyển sang tập dữ liệu mới, chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết Sau đó sử dụng phương pháp bình

phương tối thiểu nghịch đảo (ILS) để phân tích tập dữ liệu mới này

Trước tiên, chiếu tập số liệu đó lên không gian có ít chiều hơn theo PCA mà không làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tích hồi qui đa biến trên không gian mới này Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập số liệu có thể được gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập số liệu và sử

dụng gía trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồi qui đa biến

tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu

Ưu điểm PCR: Giá trị nhiễu nền được chuyển vào trong sai số dư và loại ra

khỏi mô hình hồi qui vì trong phương pháp này các vector riêng có trị riêng thấp chỉ

chiếm phần phương sai thấp Từ hỗn hợp có rất nhiều cấu tử, bằng phương pháp

PCA có thể giảm số chiều trong tập hợp và do vậy chỉ làm việc với số ít biến

Nhược điểm PCR: Việc giảm kích thước của tập số liệu đôi khi có thể loại bỏ

nhầm tín hiệu và giữ lại sai số trong các PC

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhóm nghiên cứu đã thu được từ nhiều năm qua, hiện thuật toán hồi qui đa biến về xác định đồng thời các cấu tử dựa trên

dữ liệu phổ toàn phần bằng phần mềm MATLAB đã được hoàn chỉnh Vì vậy chúng tôi sẽ kế thừa những nghiên cứu này đối với tập số liệu phổ hồng ngoại [10]

1.3.2 Một số ứng dụng thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất

Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thời

glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [24]

thí nghiệm [14, 15, 16, 18, 24]

Tại Việt Nam, việc áp dụng thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thời các chất cũng đã thu hút nhiểu sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Tác giả Kiều Thu Hà đã đã kết hợp thuật toán này với phương pháp động học–trắc quang để xác định đồng thời sunfit và sunfua của mẫu nước ngầm ở khu vực xã Dân

Hạ - Kỳ Sơn – Hòa Bình, kết quả đạt được có độ tin cậy cao [2]

1.3.3 Giới thiệu phần mềm Matlab

Matlab (Matrix laboratory) là một công cụ phần mềm của Math Work, ban đầu được phát triển nhằm phục vụ chủ yếu cho việc mô tả các nghiên cứu kỹ thuật bằng toán học với phần mềm cơ bản là ma trận Trên cơ sở ban đầu đó, các nhà lập trình đã phát triển phần mềm này để sử dụng cho các ngành khoa học như cơ học, vật lý, hóa học … đối với cả dữ liệu rời rạc và liên tục

Trong Matlab các câu lệnh viết sát với các mô tả kỹ thuật nên lập trình ngôn ngữ này thực hiện nhanh, đơn giản hơn so với nhiều ngôn ngữ thông dụng khác như Pascal, Fortran … Đặc biệt Matlab cho phép đọc, xử lý và đưa tín hiệu đầu ra, đầu vào ngay trên các file Exel – rất tiện lợi cho quá trình xử lý tập số liệu phức tạp Ngoài ra với ưu điểm cài đặt đơn giản, có thể liên kết được với các thư viện hỗ trợ như Simulink, Fuzzy, Toolbox…., Matlab đã thực sự trở thành công cụ phổ biến đắc lực trong các môi trường khác nhau [5, 7]

Với ưu thế là bộ chương trình phần mềm lớn trong lĩnh vực toán số và mô phỏng, chúng tôi lựa chọn phần mềm Matlab để nghiên cứu lập phương trình hồi quy đa biến định lượng các hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim

Tác giả Đoàn Thị Hưng đã áp dụng kỹ thuật đa bước sóng và thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính như phương pháp bình phương tối thiểu cổ điển (CLS), phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS), phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) sử dụng phần mềm Matlab để xác định đồng thời sắt và titan trong xi măng và vật liệu chịu lửa bằng thuốc thử điantipyrin metan mà không phải tách và làm giàu cho kết quả tốt [3]

1.4 Phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng

Kết hợp phổ hồng ngoại gần NIR với Chemometric đã trở thành một công cụ mạnh mẽ cho ngành công nghiệp dược phẩm, phù hợp cho việc phân tích các hình thức dược phẩm cả dạng rắn và lỏng, cũng như trong ngành công nghệ sinh học Đồng thời, quang phổ hồng ngoại gần còn có thể sử dụng trong quá trình kiểm soát chất lượng dược phẩm

Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguça và các cộng sự đã nghiên cứu xác định nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại gần mà không cần sử dụng các phản ứng dẫn xuất hoặc xử lý mẫu Phương pháp này đã được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và ba tá dược là lactose, bột talc và magie stearat Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate Mẫu được tiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần phù hợp với hàm lượng

24

neomycin sulphate Để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các mẫu thương mại, người ta đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định thành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6% [22]

Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký S.T.H Sherazi đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích thống kê đa biến Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu [25]

Payal Roychoudhury và các cộng sự cũng đã ứng dụng thành công phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến để phân tích

đồng thời glycerol và clavulanic axit trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [24]

25

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu tập trung vào phân tích hai hoạt chất được sử dụng nhiều nhất trong nhóm glycoside tim là digoxin và digitoxin Nhằm mục đích xây dựng quy trình phân tích hai hoạt chất này trong nguyên liệu dược và dược phẩm

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng qui trình phân tích xác định các hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp hồng ngoại gần kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau:

1 Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại của hai hoạt chất digoxin và digitoxin

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần tá dược đến tín hiệu đo độ hấp thụ quang của chất phân tích trong vùng hồng ngoại

3 Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính: PLS, ILS, CLS, PCR, lựa chọn các thông số tối ưu của các mô hình sử dụng mẫu chuẩn, xây dựng

cơ sở dữ liệu về phổ hồng ngoại, xây dựng các mô hình đường chuẩn của phương pháp thống kê đa biến

4 Đánh giá các thông số chính của phương pháp phân tích như giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn trên nền dược phẩm

5 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao)

6 Ứng dụng phương pháp nghiên cứu để định lượng nhanh thành phần hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường

26

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

Nguyên tắc xác định hàm lượng hai hoạt chất digoxin và digitoxin trong dược phẩm như sau:

Chuẩn bị ma trận hàm lượng chất chuẩn của 30 mẫu chuẩn đo độ hấp thụ quang của các mẫu trên bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần, ghi ma trận phổ của các mẫu trên ta được ma trận tín hiệu đo, đưa các ma trận này vào phần mềm Matlab, sử dụng các thuật toán hồi quy đa biến để thu được ma trận chuẩn và ma trận kiểm tra Ta xây dựng được mô hình hồi quy đa biến

Kiểm tra lại tính đúng của mô hình hồi quy bằng 10 mẫu kiểm tra, các bước tiến hành giống như đối với 30 mẫu chuẩn

27

- Talc (99,2% khan, Nơi sản xuất Hungary)

- Magie stearat (99,3% khan, nơi sản xuất Hungary)

- Lactose (99,2% khan, Nơi sản xuất Mỹ)

- Axeton (Merck)

- Thuốc viên Digoxin – Richter (hãng sản xuất GedeonRichter – Hungary)

- Thuốc viên Digoxine – Nativelle (hãng sản xuất Teofarma – Pháp)

2.2.2 Thiết bị

- Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g

- Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải bước sóng đo 7500-2800 cm-1

- Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no: Pike- 162- 1000)

- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD – M10Avp

- Phần mềm Matlab 7.0: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS, ILS và PCR để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp

- Phần mềm Minitab 15

2.3 Phương pháp phân tích

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu

Quy trình chuẩn bị các mẫu chuẩn

Chuẩn bị 40 mẫu chứa hỗn hợp dược phẩm có tổng khối lượng là 3g với thành phần: 0% – 0,3 % digoxin, 0% – 0,3 % digitoxin, 60 – 70 % lactose, 23 – 30 % talc,

7 – 9 % magie stearat, sau đó tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2.1

28

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn

Mẫu phải được xử lý trong phòng có máy hút ẩm và mẫu sau khi trộn phải bảo quản trong bình hút ẩm để tránh sự hấp thụ nước Yêu cầu đối với viên nén phải trong suốt

Quy trình chuẩn bị các mẫu thực

Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình của một viên thuốc, sau đó nghiền nhỏ trong vòng 5 phút, sau đó thực hiện quy trình như Hình 2.1

29

Sau khi có được ma trận hàm lượng chất chuẩn và ma trận tín hiệu của 30 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra Nhập các dữ liệu này vào phần mềm Matlab, dùng thuật toán hồi quy đa biến trong Matlab để định lượng hai hoạt chất digoxin và digitoxin Phép phân tích các glycoside tim cũng được thực hiện trên hệ sắc kí lỏng hiệu năng cao của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh: bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode – array (PDA) đặt ở bước sóng 225 nm Các điều kiện chạy máy được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột 30oC

- Van bơm mẫu 20l

- Hệ pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O, kênh C là ACN

- Chế độ chạy đẳng dòng, với tốc độ pha động là 0,7ml/phút Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 15 phút

2.4 Câu lệnh thực hiện hồi quy đa biến trong Matlab

Trong các phương pháp CLS, ILS, PLS, PCR chỉ có PCR phù hợp với quy trình phân tích:

- CLS gặp sai số do mô hình này tính toán trên cơ sở tập số liệu thô ban đầu, kết quả tính toán cuối cùng là kết quả tính toán trung bình nên toàn phổ phụ thuộc vào giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ quang A mà giá trị này lại thay đổi theo từng phép đo và bị ảnh hưởng rất lớn của nền mẫu và của KBr

- Phương pháp ILS , sai số lớn do chỉ sử dụng một số giá trị hấp thụ tại một số bước sóng đặc trưng do đó nếu số bước sóng lựa chọn không phù hợp sẽ gây ra nguồn sai số

- Mô hình PLS không phụ thuộc vào tập số liệu thô đưa vào mà phụ thuộc vào các mô hình trung gian lựa chọn Tuy nhiên, khi áp dụng mô hình này lại có sai số rất lớn, nguyên nhân do mô hình này giống với mô hình ILS chỉ sử dụng một số giá

30

trị số sóng đặc trưng nên mô hình trung gian tìm được chưa phù hợp với hệ 3 cấu

tử Do vậy, chúng tôi chỉ sử dụng thuật toán PCR để phân tích tập số liệu

Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

* Các bước tính toán PCR trong phần mềm Matlab:

- Khởi động phần mềm MATLAB

- Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE

+ Nhập ma trận hàm lượng chất chuẩn X0 (mxk) của m dung dịch chuẩn chứa

k cấu tử (m hàng, k cột)

+ Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0 (mxn) (n là số tín hiệu đo)

+ Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân

- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : PCR.mat [6]

% Tu gia tri phan tram phuong sai cua cac PC, can cu vao yeu cau cu the cua

% bai toan de quyet dinh so PC lam co so cho khong gian moi cua tap so lieu

% (n):

f = V(:,1:n);

% Nhap ma tran bien phu thuoc cua k mau can dinh phan va tinh nong do mau

% theo cong thuc:X=Y*Fj

% NEU MUON KIEM TRA DO CHINH XAC CUA PHUONG PHAP

% Nhap ma tran do hap thu quang cua mau kiem tra:Yktra

%Tinh nong do mau kiem tra theo PCR:

Xktra=Yktra*Fj;

%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu PCR:

Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra ;

% TINH LOD, LOQ CUA PHUONG PHAP

%Nhap ma tran do lech chuan cua tin hieu do lap lai mau trang: Z

%Tinh toan cac gia tri LOD, LOQ theo PCR:

LOD=(3*Z)*Fj;

LOQ=(10*Z)*Fj;

% TINH NONG DO CUA CHAT TRONG MAU BAT KI

%Nhap ma tran do hap thu quang cua mau thuc: Y

X=Y*Fj;

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được: PCR.m

- Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW :

>> PCR

- Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE thu được các dữ liệu mong muốn

32

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ hồng ngoại tới quá trình xác định đồng thời digoxin và digitoxin trong hỗn hợp

Như đã đề cập ở phần 1.2.2, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại đối với mẫu rắn như: mức độ phân tán đồng đều của chất trong mẫu đo,

độ dày mẫu, kích thước hạt, cũng như hàm lượng chất trong mẫu Để đạt được kết quả có độ chính xác và độ lặp lại cao khi ứng dụng phổ hồng ngoại để phân tích định lượng, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khảo sát tìm điều kiện chuẩn bị mẫu đo phổ NIR tối ưu qua việc khảo sát các yếu tố: lựa chọn vùng số sóng thích hợp; hàm lượng chất trong mẫu đo, nhiệt độ, lực ép, thành phần các chất trong mẫu đo

3.1.1 Khảo sát lựa chọn số sóng thích hợp

Công thức cấu tạo của hai hoạt chất digoxin và digitoxin:

Phân tử hai hoạt chất trên đều chứa:

- Liên kết CH2, CH3 trong xycloankan hấp thụ hồng ngoại ở 3100-2990 cm-1

- Liên kết OH hấp thụ hồng ngoại ở 3400-3000 cm-1

- Liên kết OH hấp thụ hồng ngoại ở 1800-1660 cm-1

- Dao động hóa trị đặc trưng của nhóm C-O hấp thụ hồng ngoại ở 1300-1000 cm-1

- Dao động hóa trị nhóm C-H hấp thụ hồng ngoại ở 3000 cm-1

33

Có thể nhận thấy các liên kết trong phân tử hai hoạt chất digoxin và digitoxin dao động chủ yếu trong vùng 4000-400 cm-1, do vậy chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại của hai hoạt chất trên trong vùng số sóng 4000-400 cm-1

Để phương pháp nghiên cứu có độ chính xác với mẫu rắn cần chọn được vùng số sóng có tín hiệu cao đối với hoạt chất và đồng thời ảnh hưởng của các tá dược trong vùng đó là tối thiểu

Mẫu đo phổ hồng ngoại truyền qua của các hoạt chất được chuẩn bị bằng cách: trộn 1mg hoạt chất với 99 mg bột KBr nghiền kỹ bằng cối mã não 10 phút, sau đó lấy 15mg cho vào cối ép thành viên mỏng, đặt vào giá đỡ cuvet để đo trên máy hồng ngoại gần trong vùng số sóng 4000-400 cm-1 Kết quả thu được trình bày

ở Hình 3.1, 3.2

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 4000-400 cm -1