Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu Trường Đại học Lâm Nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và giáo viên hướng dẫn tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập và t

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu Trường Đại học Lâm Nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và giáo viên hướng dẫn tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật

có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng’’

Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc và tích cực đến nay đề tài về cơ bản đã hoàn thành Để có được kết quả này trước hết chúng tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng thuộc bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam người đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình chúng tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, ban lãnh đạo và cán bộ nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này

Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài song do hạn chế về mặt thời gian, kinh nghiệm bản thân và điều kiện nghiên cứu nên không thể tránh khỏi những thiếu sót và tồn tại nhất định Tôi kính mong nhận được những lời nhận xét, đóng góp ý kiến của các thầy cô

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Ngọc

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng 3

1.1.1 Vai trò của vi sinh vật đối kháng 3

1.1.2 Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng đến các vi sinh vật gây bệnh 3

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật 5

1.1.4 Các vi sinh vật đối kháng được ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây hại 6

1.2 Vi sinh vật gây bệnh cây trồng thường gặp 12

1.2.1 Nấm Fusarium 12

1.2.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae 13

1.2.3 Vi khuẩn Ewinia 15

1.3.Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng 16

1.3.1 Trên thế giới 16

1.3.2 Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Vật liệu nghiên cứu 19

2.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 22

2.5.1 Thu thập và chuẩn bị mẫu 22

2.5.2 Phương pháp pha loãng mẫu 22

2.5.3 Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật thuần khiết 22

2.5.4 Phương pháp bảo quản giống 23

2.5.5 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 24

2.5.6 Xác định đặc điểm hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật đối kháng đã tuyển chọn 25

2.5.7 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào 26

2.5.8 Xác định hoạt tính catalase 29

2.5.9 Phương pháp xử lí phân tích số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng 30

3.2 Xác định hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật đối kháng đã tuyển chọn 35

3.3 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật đối kháng đã tuyển chọn 35

3.4 Xác định hoạt tính catalase 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) IPM Integrated Pest Management (Quản lý dịch hại tổng hợp)

ISR Induced systemic resistance (Hiện tượng kích kháng hệ thống)

LB Luria – Bertani

PGA Potato - Glucose Agar

PGPB Plant growth promoting bacteria (Vi khuẩn kích thích sinh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu đất 19 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật 30 Bảng 3.2 Kết quả xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn đã phân lập với 3 chủng vi sinh vật kiểm định 32 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng tuyển chọn 35 Bảng 3.4 Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của 3 chủng B1, B5, B6 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng tế bào vi sinh vật gây bệnh 20 Hình 3.1 Khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập đƣợc 33 Hình 3.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 3 chủng vi khuẩn đối kháng

đã tuyển chọn 36 Hình 3.3 Xác định hoạt tính catalase 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nằm trên vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các cây nông nghiệp, dựa vào ưu thế đó, Việt Nam đã từng bước trở thành một trong số các nước sản xuất và xuất khẩu lương thực lớn trên thế giới Tuy nhiên, song song với sự thuận lợi cho cây trồng là bệnh hại phát triển Hằng năm, các loại nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh thực vật như đạo

ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương, héo xanh,… chiếm đến trên 83% trong số các bệnh ở cây trồng, làm thiệt hại hằng trăm tỉ đồng Bệnh hại do vi sinh vật (VSV) là vấn đề mà người nông dân còn gặp nhiều khó khăn trong việc quản

lí và phòng trừ Để khắc phục những thiệt hại đó, người ta sử dụng nhiều biện pháp kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học… trong đó thuốc hóa học được sử dụng phổ biến vì thuận tiện và hiệu quả

Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), ở các nước châu Á trồng nhiều lúa,

10 năm qua (2000 - 2010) sử dụng phân bón tăng 100%, sử dụng thuốc BVTV tăng 200 - 300% Thuốc BVTV được bắt đầu được sử dụng ở miền Bắc Việt Nam vào những năm 1955 từ đó đến nay tỏ ra là phương tiện quyết định nhanh chóng dập tắt các dịch sâu bệnh trên diện rộng Mặt khác, việc sử dụng thuốc hóa học, thuốc bảo vệ thực vật lâu dài và không kiểm soát để lại những hậu quả đáng tiếc về môi trường đất, nước… gây ô nhiễm nghiêm trọng, làm mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe con người vật nuôi do lượng thuốc tồn dư để lại Theo thống kê cả nước hiện còn tồn đọng trên 706 tấn thuốc cần tiêu hủy và 19.600 tấn rác bao bì thuốc bảo vệ thực vật chưa được thu gom và xử lý, hàng năm phát sinh mới khoảng 9.000 tấn

Vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái Bình dương của FAO năm

1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của quần thể ký sinh Một trong hướng nghiên cứu theo

xu hướng này là sử dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng để ức chế các

vạ t ga y bẹ nh là chủng vi sinh vạ t có thể tiết ra chất kháng sinh, cạnh tranh về dinh du ng hoạ c tấn co ng trực tiếp le n to nấm ga y bẹ nh, hay tiết ra những chất kích thích sinh tru ởng gi p cho ca y trồng ta ng khả na ng kháng bẹ nh Do

đó, việc phân lập tuyển chọn thường xuyên các chủng vi sinh vật đối kháng mới có tính độc cao là rất cần thiết Chúng sẽ là đối tượng cho việc tuyển chọn các chủng VSV vừa có khả năng đối kháng cao vừa cạnh tranh tốt với các VSV gây bệnh cây trồng để sản xuất chế phẩm sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế cũng như bảo vệ môi trường, cân bằng hệ sinh thái

Từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một

số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng

Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác và ch ng thường được gọi là vi sinh vật đối kháng Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Biện pháp này được cho là một phương pháp quản lý bệnh cây trồng trực tiếp, bằng cách sử dụng các thành phần trong hệ sinh thái để giúp cây trồng chống lại những tác nhân gây

bệnh, nó là chìa khóa để tạo một nền nông nghiệp bền vững [3, 9, 13]

1.1.1 Vai trò của vi sinh vật đối kháng

Các loài vi khuẩn đối kháng luôn tồn tại trong tự nhiên, đa số trong

ch ng đều có lợi cho con người Đối với nông nghiệp những vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh trong đất Trong quá trình sinh trưởng chúng tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều h a sinh trưởng, acid v.v Những chất này rất có lợi cho sự phát triển của cây trồng như: kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dư ng của cây trồng, kích thích sinh trưởng cây,

h a tan dinh dư ng trong đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để cây trồng hấp thụ được v.v [3, 9, 13]

1.1.2 Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng đến các vi sinh vật gây

bệnh

VSV đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với các vi sinh vật khác trong hệ sinh thái về dinh dư ng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh,

tạo siderophore vv… để sinh trưởng

 Cơ chế tiết kháng sinh ức chế VSV gây bệnh

Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất có tính chống lại các VSV hại, ch ng có hoạt tính sinh lý cao có tác động chọn lọc và được các VSV tiết

ra đưa vào môi trường sống trong mối quan hệ đối kháng với các sinh vật

khác, trong đó vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn là những VSV sinh ra nhiều chất kháng sinh nhất (Lương Đức Phẩm, 2011) CKS có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số VSV khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng

độ thấp, có thể can thiệp vào hoạt động sinh lý của một chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác

Nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu tr c hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, c n có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor [9, 18]

 Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng)

Tác dụng của VSV kích thích sinh trưởng thực vật: vi khuẩn (VK) kích thích sinh trưởng thực vật (Plant growth - promoting bacteria – PGPB) là VSV vùng rễ khi tương tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại VK, nấm và virus gây bệnh Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng

hệ thống – ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng có hệ thống có điều kiện – SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu,

C M và cs, 2004)

PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) là các VK sống xung quanh vùng rễ cây, dễ hình thành khuẩn lạc, nhân lên với số lượng lớn và ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp gi p ngăn cản những tác nhân gây bệnh thực

dư ng, cạnh tranh sắt thong qua thể mang sắt (siderophores), tạo ra kháng sinh hoặc tiết enzyme thủy phân tạo hệ thống đề kháng cho cây (Bhattacharyya P., 2012)

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

Trong tự nhiên, sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, ánh sáng, tính đặc hiệu, mật độ…

 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của VSV Mỗi loại VSV phát triển trong một giới hạn nhiệt độ nhất định, dựa vào khoảng nhiệt

độ phát triển tối ưu, VSV có thể được chia làm 3 nhóm: nhóm ưa ấm có nhiệt

độ tối ưu giữa 20 - 45oC, nhóm ưa lạnh có nhiệt độ tối ưu dưới 20o

C và nhóm

ưa nóng có nhiệt độ tối ưu trên 45o

C Ở nhiệt độ qua thấp VSV không phát triển được nhưng có thể sống; còn ở nhiệt độ cao hoặc rất cao thì VSV bị tiêu diệt do protein bị đông đặc, enzyme bị phá hủy, tổn thương màng nguyên tương làm thay đổi tính thẩm thấu, phá hủy cân bằng lý hóa trong tế bào do tăng tốc độ phản ứng sinh vật hóa học, giải phóng acid nucleic…

 Ánh sáng

Ánh sáng thường có tác động đến sự hình thành bào tử sinh sản, tổng hợp sắc tố, chuyển động hướng sáng… Bức xạ ánh sáng có thể tiêu diệt hoặc

ức chế vi sinh vật

 pH

Độ pH của môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động sống của VSV do làm thay đổi sự cân bằng về trao đổi chất giữa môi trường và VSV, có thể giết chết VSV Mỗi loại VSV chỉ thích hợp với một giới hạn pH nhất định (từ 5,5 đến 8,5),

đa số là pH trung tính (pH = 7), bởi vì pH nội bào của tế bào sống là trung tính

 Áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu của môi trường xung quanh có tác động mạnh đến tế bào VSV do tính thẩm thấu của màng nguyên tương Đa số các VSV phát triển thích hợp khi môi trường có áp suất thẩm thấu bằng 7 atm (dung dịch

NaCl 0,9%) Trong dung dịch nhược trương, áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn môi trường nên nước bị hút vào tế bào làm tế bào phình to và v Trong dung dịch ưu trương, áp suất thẩm thấu ở môi trường cao nên nước bị

h t ra môi trường làm tế bào bị teo lại

 Độ ẩm

Hàm lượng nước trong môi trường quyết định độ ẩm mà nước là dung môi của các chất khoáng dinh dư ng là yếu tố hóa học tham gia vào các quá trình thủy phân các chất Nhìn chung vi khuẩn đ i hỏi độ ẩm cao, nấm men

đ i hỏi ít nước hơn, c n nấm sợi có thể sống trong điều kiện độ ẩm thấp Do

đó, nước có thể được dùng để khống chế sự sinh trưởng của từng nhóm vi sinh vật Mỗi loại vi sinh vật sinh trưởng trong một giới hạn độ ẩm nhất định

 Yếu tố sinh vật

Trong quá trình tồn tại của VSV nếu ch ng phải sống trong điều kiện

có VSV khác thì ch ng có thể bị cạnh tranh sinh tồn, bị tiêu diệt hoặc song song tồn tại

1.1.4 Các vi sinh vật đối kháng được ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây hại

1.1.4.1.Vi khuẩn Burkholderia cepacia

Năm 1950, William Burkholder, một nhà sinh học thuộc trường Đại

học Cornell Mỹ đã phát hiện và mô tả Burkholderia cepacia như một tác nhân gây ức chế bệnh thối củ hành Đến năm 1992, Pseudomonas cepacia và 6 loài khác thuộc nhóm II rRNA của chi Pseudomonas đã được chuyển sang một chi mới và mang tên của người đã phát hiện ra Burkholderia cepacia Trái với chi Pseudomonas, Burkholderia cepacia bao gồm ít nhất 17 loài có liên quan chặt chẽ đến các phân khu β - proteobacteria Tất cả các loài Burkholderia có bộ

gen rất lớn về kích thước từ 6 - 9 Mb, và tương đối khác nhau, là cơ sở cho khả năng di truyền là rất lớn và được xem là nền tảng cơ sở cho sự linh hoạt của chủng trong sự tồn tại và thích ứng của chủng trong tự nhiên [22]

Burkholderia cepacia là nhóm vi sinh vật được phân bố khắp mọi nơi

và tìm thấy phổ biến trên rễ cây, vùng rễ trong đất, các môi trường ẩm ướt và

có khả năng sống sót trong môi trường nghèo dinh dư ng

Burkholderia cepacia đã được chứng minh là vi khuẩn hữu ích như là

thuốc đối kháng của sâu hại cây trồng và gia tăng năng suất của một số cây trồng, như l a trồng ở các nơi có mức pH thấp có tính axit, đất kém phì nhiêu [20, 21]

Hơn nữa, các nhà khoa học cũng đang khai thác các tính chất chuyển

hóa đa dạng của Burkholderia cepacia để phát triển nó như một tác nhân để

sử dụng trong việc xử lý sinh học góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do các hợp chất bảo vệ thực vật được sử dụng trong nông nghiệp, hiện nay ch ng đang được đề suất để sử dụng thay thế cho thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học có hại với môi trường, một số các hợp chất đã được xác định là pyrolnitrin có tác dụng ức chế tác động lên chuỗi vận chuyền điện tử và việc sản xuất ammoniac dễ bay hơi cũng đã được phát hiện để kiểm soát mầm bệnh trong đất

1.1.4.2 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là nhóm VSV đơn bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, ao hồ, một phần trong bùn và các chất hữu cơ khác Xạ khuẩn giống nấm ở chỗ tạo thành hệ sợi, nhưng lại có cơ thể đơn bào, không có nhân thực giống vi khuẩn Những loại xạ khuẩn tham gia vào quá trình phân giải sơ cấp và mùn hóa chất hữu cơ trong đất trung tính, hơi kiềm hoặc rác ủ đều có khả năng xâm nhập vào cơ chất không tan như lignocelluloza [4]

Xạ khuẩn là loại vi khuẩn Gram dương có tỉ lệ G + C cao (>55%) trong DNA [2], toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Đa số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong tự nhiên

và xác thực vật, thường sống ở nhiệt độ 25 - 37o

C và pH trung tính, tham gia

vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như cellulose, tinh bột v.v góp phần khép kín v ng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Đặc tính này c n được ứng dụng trong quá trình chế biến phân hủy rác v.v Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh dùng trong y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm

Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn

có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật Theo Kamada (1974), khi điều tra VSV đối kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn thì

ở đó các loài Fusarium biến mất nhanh Thông thường một loài xạ khuẩn đối

kháng có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học Tuy nhiên khi sử dụng các chủng có hoạt phổ rộng phải ch ý tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có lợi trong vùng rễ Không phải tất cả xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4% – 5%) nhưng ch ng có vai tr quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh Xạ khuẩn ngoài việc chống nấm bằng cách tiết chất đối kháng c n sinh enzyme tác động lên hệ VSV như enzym chitinase tác động lên thành tế bào nấm mốc, các enzyme phân giải hợp chất hữu cơ khó tan như cellulase gi p phân giải cellulose tạo thành phân bón hữu cơ cho cây trồng Dùng để sản xuất nhiều enzym như protease, amylase, cellulase, chitinase… một số axit amin và axit hữu cơ Ngoài ra, nhiều loài xạ khuẩn c n sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật cũng như các loài VSV có lợi cho đất Một số chủng xạ khuẩn vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến trùng hại cây trồng và tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước (Lương Đức Phẩm, 2011)

1.1.4.3.Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có 4 loài khác nhau, phần lớn là vô hại,

một số gây bệnh là làm hỏng thức ăn, thường được sử dụng rộng rãi trong đấu tranh sinh học và ph ng trừ các loại sâu bệnh hại cây trồng [2]

Bacillus là trực khuẩn, thường xếp thành chuỗi, kích thước từ 0,5 – 2,5

x 1,2 - 10μm, hầu hết có khả năng di động

Các VK thuộc chi Bacillus phần lớn sống hoại sinh và có khả năng

sống ở những điều kiện khắc nghiệt như sa mạc, suối nước nóng, vùng cực hay trong cả những nơi có giá trị nhiệt độ, pH và nống độ muối mà ít loài có khả năng sống sót được [15]

Bacillus là nhóm vi khuẩn phân bố rộng từ trong đất, côn trùng cũng

như là sống trên cơ thể con người Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có nhiều đặc tính sinh học như khả năng sinh kháng sinh, enzyme, vitamin cũng như nhiều sản phẩm trao đổi khác Ngoài ra, khả năng chống chịu lớn đối với nhiệt độ cao và các chất tẩy rửa, các bào tử của Bacillus được dùng để kiểm tra các kĩ thuật khử trùng hơi nóng và trong các chất tẩy rửa hóa học [1, 25]

Các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng sinh chất kháng sinh, là sản

phẩm chuyển hóa thứ cấp trong pha sinh trưởng muộn hay pha cân bằng sớm của quá trình phát triển khi nuôi cấy Có hơn 169 chất trao đổi thứ cấp đã

được thông báo, điển hình như B.subtillis có 68 chất kháng sinh được biết đến

và B.brevis có 23 chất kháng sinh như Bacilysocin, TasA, Sublancin, Subtilin, Chất kháng sinh do vi khuẩn Bacillus sinh ra hầu hết có khả năng

hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (+) Các chủng vi khuẩn

B.thuringiensis, B.subtilis, B.larvae, B.lentimorbus được sử dụng rộng rãi

trong việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học cũng như phân bón hữu cơ vi sinh,

ph ng trừ VSV gây hại như nấm Fusarium, Rhizotonia solani, , ngoài ra còn

được ứng dụng nhiều trong công tác bảo quản nông sản sau thu hoạch Việc

sử dụng các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus để ph ng trừ sâu bệnh hại là

một hướng triển vọng và hiệu quả, thân thiện với môi trường trong đấu tranh sinh học

1.1.4.4.Vi khuẩn Pseudomonas

Đặc điểm hình thái chung cho Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế

bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lý

dị dư ng, không lên men, linh hoạt về dinh dư ng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen Về đặc điểm sinh hóa, một số d ng VK này có đặc điểm như: khuẩn lạc có màu trắng, tr n, viền nhẵn, có khả năng di động Một số

Pseudomonas có thể chuyển hóa các chất ô nhiễm hóa học môi trường, như Pseudomonas resinovorans có thể làm suy giảm cacbazol [27]

Vi khuẩn Pseudomonas là VK có sự biến dư ng dễ thay đổi và linh

động, có thể xuất hiện ở mọi môi trường khác nhau như đất, nước, trên đất và

trong l ng đất Trong số những loài Pseudomonas, có những loài tiêu biểu có

thể sử dụng trong các nghiên cứu khoa học, đặc biệt là công nghệ sinh học [8, 27]

Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh

trưởng và phát triển thực vật, tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng

hấp thu chất dinh dư ng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae Pseudomonas kích thích

sinh trưởng của cây trồng bởi vì ch ng x c tiến cây trồng sinh ra các chất kích thích sinh trưởng như auxin, xitokinyl, gibberellin và tính 23 kháng tập thể của cây, gi p cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh Cơ chế tác

động của vi khuẩn đối kháng Pseudomonas như sau:

+ Có khả năng sản sinh ra cyanide, tăng tính chống chịu của cây, sản sinh ra chất kích thích sinh trưởng và có khả năng phân giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh tiết ra

+ Có khả năng hấp thụ các ion Fe3+ trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vsv, làm cho môi

trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe3+ cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó ch ng sẽ không sinh trưởng được Cạnh tranh dinh dư ng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe

Có khả năng ph ng chống lại nhiều loại vi sinh vật gây bệnh hại cây, nghĩa là có khả năng chống lại những loại vi sinh vật gây bệnh mà những vi sinh vật đó thường làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [27]

1.1.4.5.Nấm Trichoderma

Trichoderma sp phân bố phổ biến trong đất, nơi có nhiều dinh dư ng, là

nấm hoại sinh có khả năng ký sinh và đối kháng với nhiều loại nấm hại gây

bệnh cây trồng Trichoderma sp sinh trưởng và phát triển mạnh ở vùng rễ, thuộc nhóm nấm Deuteromycetes (Nhóm nấm bất toàn - Fungi imperfecti),

không có giai đoạn sinh sản hữu tính, sinh sản vô tính bằng những đính bào tử Conidia (bào tử nguyên phân)

Trichoderma có khả năng khống chế, cạnh tranh và tiêu diệt nhiều loại nấm gây bệnh thối rễ, chết rạp cây con, xì mủ… trên cây trồng như Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Sclerotium…bằng cách tiết ra một

enzym làm tan vách tế bào các loài nấm hại, sau đó xâm nhập và hấp thu các chất dinh dư ng làm nấm hại bị chết Ngoài tác dụng diệt nấm, nhiều nghiên

cứu cho thấy một số chủng Trichoderma c n gi p th c đẩy “cơ chế tự ph ng

vệ” của cây chống lại các tác nhân gây bệnh khác

Một số giống Trichoderma giúp cây phát triển hệ rễ, rễ mọc nhiều và sâu

hơn (sâu 1 m dưới mặt đất) nhờ đó gi p cây tăng cường tính chịu hạn và chống đổ ngã… Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy trên rễ cây bắp

có nấm Trichoderma giống T.22 cần ít hơn tới 40% đạm so với cây không có nấm Trichoderma

Trichoderma sp thể hiện tính kháng “bẩm sinh” với phần lớn hoá chất

nông nghiệp bao gồm cả thuốc trừ bệnh, dù rằng một số giống thể hiện tính kháng có khác nhau

1.2 Vi sinh vật gây bệnh cây trồng thường gặp

1.2.1 Nấm Fusarium

Fusarium là một chi lớn của nấm nito, một phần của nhóm thường

được gọi là hyphomycetes, phân bố rộng rãi trên toàn thế giới Ch ng phân bố trên tất cả các vùng địa lý từ sa mạc đến các vùng nhiệt đới, từ các vùng đồng

cỏ đến các vùng đất trống, do có khả năng thay đổi hình thái, sinh lý trong quá trình phát triển để thích nghi với môi trường sống nhờ đó dẫn đến sự gia

tăng số loài để thích ứng với các vùng sinh thái khác nhau Nấm Fusarium

chủ yếu tồn tại trong đất dưới dạng hoại sinh hoặc ký sinh vật chủ, phổ ký chủ của ch ng khá rộng bao gồm cả động vật và thực vật

Các độc tố chính được sản xuất bởi các loài Fusarium là fumonisins và

trichothecenes thường nhiễm vào l a mạch nếu có mưa vào cuối mùa, đó là tác động kinh tế đối với ngành chế tạo bia Tổng thiệt hại ở Hoa Kỳ đối với

l a mạch và l a mì trong giai đoạn 1991 - 1996 ước tính khoảng 3 tỉ USD [5]

Một số chủng nấm Fusarium gây bệnh thối thân, rễ, gây rụng lá trên thực vật Bệnh do nấm Fusarium gây ra thường ít xuất hiện sớm mà gây hại

mạnh nhất ở cuối giai đoạn sinh trưởng của cây Biểu hiện rõ ràng là những lá gốc chuyển từ màu xanh sang màu vàng sau đó đến các lá phía trên Mặc dù

lá bị vàng nhưng các lá gốc chưa rụng ngay mà về sau khi phần thân sát mặt đất khô tóp lại và có màu vàng nhạt, ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe là không rõ ràng, phần gốc tiếp giáp với rễ có màu nâu xám nham nhở khác với vết thương do trầy xước Cây bị bệnh lá héo từ dưới lên trên, phần thân dưới cùng và rễ bị thối dần nên có thể nhổ cây một cách dễ dàng Nguyên nhân là

do sợi nấm mọc lấn át, thít chặt các bó mạch dẫn làm cho ban đầu cây bị héo sau đó phần thân và rễ bị thối dần

Nấm Fusarium moniliorme gây nên bệnh l a von với các triệu chứng

như: cây phát triển cao vọt, cong queo, lá bệnh chuyển màu xanh nhạt sau đó chuyển màu vàng gạch cưa, cứng gi n rồi chết nhanh chóng, dóng thân cây

phát triển cao vọt và mọc ra nhiều rễ phụ ở đốt và có lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh, hạt bị bệnh thường lửng, lép, màu xám [11]

Nấm Fusarium verticillioides là nguyên nhân gây bệnh mốc hồng trên

ngô biểu hiện một số triệu chứng: gây vết đốm nhỏ màu nâu trên thân cây, sau

đó phát triển rộng tạo ra thành vết thối xung quanh thân làm phần này bị thối mục Khi có gió lớn phần này dễ bị gãy, ngoài ra có thể gây thối đen trên rễ

và gây hiện tượng cây bị héo vàng [11]

Nấm Fusarium oxysprorum là nguyên nhân gây bệnh héo, thối nõn,

thân, rễ và mầm cây trên nhiều lý chủ khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai

lang, khoai tây, cây hoa huệ (Hình 1.1A) Nấm Fusarium oxysprorum có

dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào tử hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào hình cầu hoặc

hình bầu dục.Một số loài Fusarium oxysprorum có bào tử nhỏ, bào tử hậu và

quả thể hoặc không có bào tử hậu Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là

25 - 30oC, phát triển trong 4 - 5 ngày ở độ ẩm 90 - 95% Nhiệt độ tối ưu cho gây bệnh là 30oC hoặc cao hơn Tuy nhiên nhiễm trùng qua hạt giống có thể xảy ra ở nhiệt độ thấp tới 14o

Vi khuẩn này sau đó được Tagami, Mizukami (1962), Wakimoto (1969) đặt

tên là Pseudomonas oryzae, về sau Dowson đặt tên là Xanthomonas oryzae

Bệnh bạc lá ở cây l a trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng l a khác nhau trên thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng l a ở châu Á như: Ấn Độ (1990), Philipin (1957), Indonexia

(1950), Trung Quốc (1957) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ sau hoà bình lập lại (1945) trên các giống l a địa phương cao cây Sau đó, do phong trào thâm canh l a lên cao đã làm cho bệnh bạc lá l a phát triển mạnh trên diện rộng, phức tạp và khó ph ng trừ, thường xuyên gây hại nặng ở vụ mùa Bệnh đã phát triển nhiều thành dịch lớn ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng trong v ng từ năm

1968 – 1975 [10] Trong những năm gần đây, ở miền Bắc, thiệt hại do bệnh bạc

lá l a có xu hướng tăng trở lại và gây hại ở cả vụ xuân

 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có dạng hình gậy ngắn, hai đầu hơi tr n,

có một lông roi ở một đầu, kích thước 1 - 2 x 0,8 - 1μm Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tr n, có màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt ướt, háo khí, nhuộm gram âm

Vi khuẩn này không có khả năng phân giải nitrat, không có dịch hóa gelatin, không tạo NH3, idol nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo acid trong môi trường có đường

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5oC, tối đa 40o

C Nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 53 oC

Xanthomonas oryzae có khả năng sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 –

8,5 thích hợp nhất là ở pH khoảng 6,8 – 7,2; tồn tại không lâu trong đất và chỉ có thể tồn tại 15 - 38 ngày trong môi trường nước; tuy nhiên c n tùy thuộc vào loại đất, tồn tại 7 - 8 tháng trong hạt giống nhưng chỉ 3 - 4 tháng trong rơm [12]

Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động, có thể xâm nhiễm qua thủy khổng, lỗ khí ở trên n t mép lá Khi đã tiếp x c với bề mặt có màng nước, vi khuẩn dễ dàng di động và xâm nhập vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương

mà sinh sản nhân lên ở mặt số lượng, theo các bó mạch dẫn mà lan rộng đi [10] Trong điều kiện mưa ẩm thích hợp thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt vi khuẩn Thông qua sự va chạm giữa các lá l a, nhờ gió lan truyền bệnh sang các lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lân trong thời ký sinh trưởng của cây

1.2.3 Vi khuẩn Ewinia

Bệnh thối nhũn thân, rễ, lá (Hình 1.1C) xuất hiện phổ biến trên cây

ngô, cây lúa, phong lan, khoai tây… do vi khuẩn Erwinia gây ra Hiện nay

chưa có cách ph ng trị bệnh hiệu quả Chính vì vậy, thiệt hại do vi khuẩn

Erwinia sp trên cây trồng là rất lớn đặc biệt vào mùa xuân

Trên thế giới, bệnh do Erwinia gây ra rất lớn, hiện diện khá phổ biến ở

Brazil, Mỹ, Ấn Độ, Ai Cập, Úc, Israel… Đây là bệnh hại trên cây ngô trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt gây hại nghiêm trọng trong điều kiện

nhiệt độ và độ ẩm cao Ở Việt Nam, hằng năm, Erwinia gây thiệt hại lớn trên

các vườn lan tại thành phố Đà Lạt và các ruộng ngô, thanh long của đồng bằng song Cửu Long

Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua những vết thương tạo nên vết thối ướt với mùi hôi khó chịu Ban đầu vết thối nhỏ có màu vàng nâu, bệnh nặng vết thối lan nhanh trong lá và gây rụng lá Thời tiết khí hậu nóng ẩm gi p bệnh phát triển mạnh mẽ hơn [12]

Bệnh thường xảy ra vào những ngày mưa dầm Vi khuẩn Erwinia phát

triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ từ 27 - 32o

C, tuy nhiên có thể chết trong điều kiện khô và dưới ánh nắng trực tiếp

1.3.Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng

1.3.1 Trên thế giới

Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin…) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng

Theo Elad và cs (1982) [16], dùng chế phẩm Trichoderma sp Có tác

dụng ph ng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế

phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma sp Có thể gi p cây khỏe hơn, tăng

sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây Theo Dutta và Das (1999), đã thử nghiệm khả năng ph ng trừ sinh học

của nấm Trichoderma harzianum bằng cách cho một số lượng lớn bào tử nấm này nuôi trồng trong môi trường rắn vào đất để kiểm soát nấm Rhizoctonia solani trên cây đậu tương Trichoderma harzianum khi bón vào đất với tỷ lệ 1:10 theo thể tích đã ngăn chặn được bệnh ở thân và rễ do nấm Rhizoctonia solani gây hại đồng ruộng

Kết quả nghiên cứu của Ganesan và Gnanamanickam (1987) [17], sử

dụng các chủng vi khuẩn bản địa Pseudomonas fluorescens đánh giá khả năng của ch ng trong hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng lạc do Sclerotium rolfsii cho thấy vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng ức chế sinh trưởng của sợi nấm Sclerotium rolfsii ở điều kiện in vitro, giảm khả năng nảy mầm

của hạch nấm và giảm tỷ lệ bệnh ở trong điều kiện nhà kính

Theo kết quả công bố của Kishore và cs (1995) [19], 393 chủng vi

khuẩn nội sinh (endophyte) Pseudomonas được sử dụng xử lý hạt giống lạc

và tưới vào đất để đánh giá khả năng ph ng trừ bệnh thối trắng hại lạc

Sclerotium rolfsii Trong đó, 12 chủng có khả năng giảm tỉ lệ bệnh cây chết

Và sử dụng 12 chủng này nghiên cứu ở điều kiện in vitro cho thấy ch ng có

khả năng làm giảm sự sinh trưởng của sợi nấm Sclerotium rolfsii và hoạt chất

của ch ng tiết ra có khả năng ức chế enzyme phân huỷ vách tế bào của nấm

Sclerotium rolfsii

Kết quả nghiên cứu của Anand và Kulothungan (2010) [14], cho thấy

các chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được phân lập từ rễ cây lạc

khỏe và đánh giá khả năng đối kháng của ch ng với nấm gây bệnh héo rũ gốc

mốc đen Aspergillus niger Kết quả ở điều kiện in vitro cho thấy 5 trong số 60 chủng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng và có khả năng tạo ra

các enzyme thuỷ phân như protease, lipase và các hợp chất thứ cấp như

xianhydric acid, salicylic acid Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng làm giảm tỷ lệ bệnh c n 8,27% trong khi đó đối

chứng là 18,77% và năng suất quả khô đạt 1800,48 kg ha và đối chứng đạt 1557,14 kg/ha [26]

1.3.2 Việt Nam

Viện Bảo vệ Thực vật đã tiến hành phân lập các chủng Trichoderma từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của Trichoderma đối với

một số nấm gây bệnh, tìm phương pháp nuôi cấy để tạo chế phẩm Các chủng

nấm Trichoderma thu thập được có hiệu quả ức chế từ 67,7 – 85,5% đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium sp, Aspergillus sp

Dương Minh và cs (2006) [7], đã tuyển chọn được các chủng nấm đối

kháng Trichoderma spp Có hiệu quả ph ng, trị tốt các bệnh do Phytophthora palmivora gây hại trên cây sầu riêng tại đồng bằng sông Cửu Long Khả năng tiết enzyme thủy phân của các chủng Trichoderma được phân lập tại Việt

Nam cũng đã được nghiên cứu

Nguyễn Lân Dũng và cs (1998) đã tiến hành tối ưu điều kiện nuôi

cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis ứng dụng trong diệt trừ sâu bệnh hại

Đinh Minh Hiệp và cs (2007) [6], đã tiến hành khảo sát hoạt tính các enzyme chitinase, β - glucanase, cellulose, pectinase, amylase và protease của

92 chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam Kết quả cho thấy, ngoại trừ

enzyme protease, có sự chênh lệch khác biệt về hoạt tính các enzyme này giữa

các chủng Trichoderma khảo sát Ngoài ra, kết quả nghiên cứu c n chọn ra đƣợc 26 92 chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp các enzyme

chitinase, β- glucanase, cellulose, pectinase và amylase cao