Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyt alcohol dehydrogenase biểu hiện đặc hiệu ở xylem từ cây bạch đàn urô

Những nghiên cứu về bộ gen ở cây bạch đàn Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất cao và tin sinh học nhiều nghiên cứu về bộ gen của nhiều loài cây đã đư

1

MỞ ĐẦU

Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau cellulose, và ước tính lignin chiếm 30% lượng carbon hữu cơ trong sinh quyển [27] Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất, ) Nó còn là một loại nhiên liệu hoàn hảo, khi đốt năng lượng tỏa ra

từ lignin cao hơn từ cellulose

Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm lượng lignin cao lại là một trở ngại Ví dụ như trong công nghiệp sản xuất giấy, lignin làm cho giấy chuyển mầu vàng theo thời gian Do đó lignin cần phải được loại bỏ trước khi sử dụng để sản xuất giấy trắng chất lượng cao Vậy làm thế nào để điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy

Đã và đang có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin, quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol

dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis

2

thaliana, Populus trichocarpa) Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của

một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng

tôi tiến hành đề tài: “Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) biểu hiện đặc hiệu ở xylem từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)” Làm vật liệu để thiết kế

các cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện đặc hiệu ở tầng xylem thực vật MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tách dòng và phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ cây bạch

đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) trồng tại Việt Nam

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI và thiết kế cặp mồi để khuếch đại đoạn

promoter này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)

2 Tách dòng đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD từ cây

bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)

3 Phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD phân lập được ở mục 2

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây bạch đàn

Bạch đàn là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim

(Myrtaces), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones)

Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp

Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788 Từ đó đã có tới

600 loài và biến chủng được đặt tên và mô tả, gần đây đã chấp nhận trên 500 loài [3] bạch đàn có xuất xứ từ Australia [3, 4, 23] và chỉ có hai loài bạch đàn

phân bố ngoài Australia là E.deglupta Blume và E urophylla S.T Blake Cho

đến nay, bạch đàn đã được gây trồng ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45oN và 40oB như: Braxin, Trung Quốc, Ấn Độ,… [3]

Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) có nguyên sản ở

Indonesia (tập trung ở một số đảo là Flores, Adona, Pantar, Alor Wetar và Timor), phân bố từ 7o30 - 10o vĩ Nam và 122o - 127o kinh Đông trên các dốc núi và trong các thung lũng, trên các loại đất bazan, diệp thạch và phiến thạch, đôi khi mọc ở vùng núi đá vôi Bạch đàn urô phân bố ở độ cao 300 – 2960 m

so với mặt nước biển Bạch đàn urô có thể cao 25 – 45 m, cá biệt có thể cao

55 m, đường kính đạt từ 1 – 2 m [2]

Lần đầu tiên bạch đàn urô có mặt tại Việt Nam trong chương trình khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyện liệu giấy Trung tâm Bắc Bộ [5] Các vườn giống cây trồng bằng hạt của loài hiện đã được xây dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Tây

Bạch đàn urô được đánh giá là loài có dáng rất đẹp, chất lượng gỗ tốt

Gỗ bạch đàn được sử dụng với rất nhiều mục đích như: gỗ xây dựng, làm đồ

4

dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ,… Bạch đàn urô được xem là nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên thế giới và Việt Nam

1.2 Những nghiên cứu về bộ gen ở cây bạch đàn

Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất cao và tin sinh học nhiều nghiên cứu về bộ gen của nhiều loài cây đã được

giải mã thành công ví dụ cây Arabidopsis thaliana, và đặc biệt trong số này bao gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp như lúa (Oryza sativa) và trong lâm nghiệp như cây dương (Populus trichocarpa) Thông tin

về bộ gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị trong các nghiên cứu về chức năng và sự tương tác giữa các gen, những nghiên cứu về tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật Thực vật hạt kín được cho là có nhiều điểm tương đồng về bộ gen, các quá trình trao đổi chất với các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên các loài cây này là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây

thuộc họ khác ví dụ chi Eucalyptus [6]

Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen Đặc điểm của bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng

và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính trạng mong muốn

1.3 Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.3.1 Lignin

5

Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu trúc gỗ Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm được tổng hợp từ ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol Ba loại đơn phân này phân biệt với nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl

M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [18, 21] (Hình 1.1)

Hình 1 1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin

Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G)và syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại

để tạo ra phân tử lingin

Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong các nhà khoa học Tương tự như vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được nghiên cứu và thảo luận

7

Thành phần và hàm lượng lignin khác nhau giữa các loài, loại tế bào và các phân lớp của vách tế bào thực vật, và chúng thay đổi dưới các tác động của môi trường và các giai đoạn phát triển của cây Thông thường, lignin từ các loài thực vật hạt kín hai lá mầm (cây gỗ cứng) bao gồm ba thành phần (G), (S) và (H), trong khi đó các loài thực vật hạt trần (gỗ mềm) chỉ bao gồm (G) và (H) Lignin từ các loài cây một lá mầm thường bao gồm hai thành phần (G) và (S) với tỉ lệ thích hợp Thành phần (H) thường tồn tại nhiều hơn

ở các loài cây hai lá mầm, thành phần này được hình thành do sự kết hợp của monolignol p-coumaryl alcohol M1H vào trong phân tử lignin và thường hay

bị nhầm với p-coumarate Y3 ở các loại lignin đang bị acyl hóa tách chiết từ

mã hóa cho enzyme CAD đã được nghiên cứu ở nhiều loài thực vật như:

Arabidopsis thaliana, Oryza sativa và cây Bạch dương (Populus) Năm 2009

Barakat và cộng sự [6] đã tiến hành những nghiên cứu rất đầy đủ về họ gen CAD ở cây Bạch dương Kết quả thấy rằng họ gen CAD ở cây bạch đàn được phân ra làm ba lớp chính mà một trong số đó là đại diện của các trình tự gen CAD được phân lập từ các thực vật hạt trần và thực vật hạt kín Hai phân lớp khác là đại diện của các trình tự gen CAD được phân lập chỉ từ các thực vật hạt kín Gen CAD, ngoại trừ gen PoptrCAD 4 thì hầu hết tồn tại trong hai phân lớp II và III Nghiên cứu cũng chỉ ra các tiểu phần gen CAD tham gia vào quá trình phát triển của hệ mạch gỗ trong thân cây như PoptrCAD 4 và

8

PoptrCAD 10 thuộc lớp I và lớp II Hầu hết các gen CAD đều phân bố ngẫu nhiên trên các khối mô và thường có các vị trí tương đồng ở các khối mô lặp lại trong thực vật Đây được xem là sự nghiên cứu toàn diện đầu tiên về dòng Gen mã hóa cho enzyme CAD trong thực vật thân gỗ bao gồm các nghiên cứu về hệ gen, cấu trúc gen, hệ thống phát triển của thực vật theo chiều ngang

và quá trình hình thành cấu trúc bên trong cây Dương (Populus) [6] Kim và

cộng sự vào năm 2003 đã tiến hành nghiên cứu trên đối tượng cây

Arabidopsis và cho thấy gen CAD trong Arabidopsis gồm có 17 tiểu phân, Từ

đó nhóm tác giả đã có những phân tích sự tương đồng của các tiểu phần của gen CAD và sự ảnh hưởng của chúng trong các giai đoạn phát triển của cây tới quá trình tổng hợp lignin Kết quả cho thấy các tiểu phần AtCAD6 và AtCAD9 không ảnh hưởng nhiều tới sự hình thành các tiểu phần của lignin ngược lại AtCAD5 lại là tiểu phần quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp lignin trong thực vật [15]

Sự biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme CAD ảnh hưởng trực tiếp tới hàm lượng và chất lượng lignin trong tầng xylem thực vật Năm 1999, Baucher và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm làm giảm hàm lượng enzyme

CAD trong cây Linh Lăng (alfalfa) bằng kỹ thuật antisense, kết quả nghiên

cứu cho thấy hàm lượng enzyme CAD thay đổi theo từng công thức thí nghiệm tuy nhiên hàm lượng lignin trong cây lại hầu như không thay đổi, sự thay đổi là hàm lượng các tiểu phần cấu thành nên phân tử lignin Nghiên cứu cho thấy việc làm giảm lượng enzyme CAD dẫn tới tỷ số syringyl/guaiacyl (S/G) giảm, trong nghiên cứu này tác giả cũng chỉ ra rằng

hệ số S/G giảm ảnh hưởng trực tiếp tới sự tạo thành liên kết giữa các sợi cellulose trong cây Như vậy hàm lượng enzyme CAD ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng lignin trong thực vật [7, 8]

9

Do đó với mục đích tăng hàm lượng và chất lượng lignin trong thực vật,

từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã tiến hành phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD có hoạt tính mạnh trong xylem thực vật

1.4 Tổng quan về promoter

1.4.1 Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn

Điều hoà ở mức độ phiên mã của sinh vật nhân chuẩn cơ bản giống với điều hoà ở sinh vật nhân sơ cũng dựa trên sự tương tác giữa các protein điều hoà với các trình tự DNA chuyên biệt, nhưng phức tạp hơn rất nhiều Các

trình tự DNA chuyên biệt ở đây được gọi là trình tự cis (cis elements ) và các protein điều hoà tương tác với chúng được gọi là các nhân tố trans (trans

factors) [1]

1.4.1.1 Các yếu tố tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen

Trình tự cis : là các trình tự DNA tham gia vào quá trình điều hòa sự biểu hiện của các gen trong tế bào Trình tự cis thường nằm cách xa điểm khởi đầu

phiên mã hàng ngàn nucleotide Chính các trình tự này quyết định sự biểu hiện đặc trưng của gen, nghĩa là gen được biểu hiện trong loại tế bào nào, vào thời điểm nào, dưới tác động của nhân tố điều hoà nào ? Một đặc điểm chung cho các trình tự này là chúng thường có cấu trúc hai phần đối xứng nhau Sở

dĩ như vậy là vì các trình tự này thường tiếp nhận các protein điều hoà (nhân

tố trans) dưới dạng dimer (cấu tạo từ hai tiểu đơn vị) (Hình 1.4)

Bên cạnh đó còn một nhóm trình tự khác cũng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện của gen, đó là nhóm các trình tự tăng cường (enhanncer) Các enhanncer này có tách dụng làm tăng biểu hiện của gen tương ứng Khác

biệt cơ bản của nhóm này so với các trình tự cis là hoạt tính tăng cường biểu

hiện của chúng không phụ thuộc vào :

1 Vị trí, chúng không nhất thiết phải nằm ở đầu 5’, đầu 3’ hay ngay trong intron của gen

10

2 Hướng, sự đảo ngược hướng của chúng (từ đầu 5’ – 3’ sang 3’ – 5’) không làm mất hoạt tính khuếch đại Với cùng các đặc tính đó nhưng có tác dụng ngược lại là nhóm các trình tự kìm hãm (silencer) Cơ chế hoạt động của hai nhóm này chưa được biết rõ [1] (Hình 1.3)

Hình 1 3: Các trình tự cis và trình tự tăng cường (enhancer)

1.4.1.2 Các nhân tố tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen - các

nhân tố trans

Nhân tố trans là những protein điều khiển sự phiên mã nhờ sự gắn kết

với một đoạn trình tự nằm trong vùng điều hòa của gen

Đặc điểm chung của nhân tố này là chúng bao gồm ít nhất hai vùng cấu trúc - chức năng chính :

1 Vùng chịu trách nhiệm gắn nhân tố trans vào DNA

2 Vùng tác động lên sự phiên mã

Các vùng cấu trúc - chức năng này độc lập đối với nhau

11

Ngoài hai vùng nêu trên nhân tố trans còn mang một số vùng phụ khác

như : vùng gắn các hormone, các ion,…(Hình 1.4)

Hình 1 4: Cấu trúc của một nhân tố trans

Đây là một thụ thể hormone tuyến giáp (THR – Thyroid Hormone Receptor) bao gồm nhiều vùng cấu trúc và chức năng, trong đó hai vùng được biết rõ nhất là

C – vùng gắn lên DNA – và E – vùng tiếp nhận hormone tuyến giáp khi gắn lên vùng E của thụ thể sẽ làm biến đổi cấu hình thụ thể Lúc đó, vùng C của thụ thể có thể gắn lên vùng DNA điều hoà của các gen đích và gây ra sự phiên mã của gen này

Tương tác đặc hiệu giữa các trình tự cis và nhân tố trans là kết quả những liên kết yếu hình thành giữa các nucleotide của nhân tố trans với các base của trình tự cis Do cấu trúc xoắn kép cố định trong không gian của phân

tử DNA nên để đạt được tương tác tương đối bền vững, các nhân tố trans

cũng phải có cấu trúc không gian cố định tương ứng Các kết quả nghiên cứu

cho thấy các nhân tố trans có thể phân ra 4 nhóm cấu trúc:

 zinc-finger

 helix-turn-helix

 helix-loop-helix

 leucine-zipper

Đặc tính chung của các cấu trúc vừa kể là chúng luôn luôn gắn lên các

trình tự cis dưới dạng dimer (gồm hai monomer)

Một sự khác biệt nữa giữa sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đó là

ở sinh vật nhân chuẩn còn có các cơ chế điều hoà ở các giai đoạn sau phiên

mã, dịch mã và sau dịch mã [1]

12

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của promoter

 Phần lõi (Core) promoter

o Vị trí khởi đầu phiên mã (TSS)

 Vị trí khoảng -35

o Vị trí bám của RNA polymerase

 RNA-polymerase I: phiên mã gen mã hóa cho RNA ribosome

 RNA-polymerase II: phiên mã gen mã hóa cho mRNA và

một số RNA nhân nhỏ (small nuclear RNA)

 RNA-polymerase III: phiên mã gen mã hóa cho RNA vận chuyển và những RNA nhỏ khác

o Ví trí bảm của các nhân tố phiên mã

 Phần cận biên (Proximal) promoter

o Vị trí khoảng -250

o Điểm bám của một số nhân tố phiên mã đặc biệt

 Phần ngoại biên (Distal) promoter

o Vị trí xa hơn ở phía thượng nguồn (upstream) (ngoại trừ

enhancer hoặc các vùng điều hòa không phụ thuộc vị trí và chiều)

o Điểm bám của một số nhân tố phiên mã đặc biệt

Promoter là những nhân tố quan trọng phối hợp với enhancer, silencer, nhân tố liên kết trong việc quyết định mức độ biểu hiện của một gen nhất định [22]

1.4.3 Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học

Promoter của sinh vật nhân chuẩn thường rất đa hình và khó xác định Chúng nằm cách điểm khởi đầu phiên mã vài kilobase Người ta thường tìm thấy hộp TATA trong nhiều promoter của sinh vật nhân chuẩn Các liên kết

13

giữa protein với hộp TATA có tác dụng hỗ trợ việc hình thành phức hệ phiên

mã của RNA polymerase Hộp TATA thường nằm khá gần vị trí khởi đầu phiên mã (trong khoảng 50 base) [1]

Trình tự điều hòa promoter của sinh vật nhân chuẩn thường liên kết với các protein gọi là nhân tố phiên mã

Những nghiên cứu về promoter đã giúp các nhà khoa học tìm ra các hướng mới nhằm điều khiển sự hoạt động của gen Việc đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc, chức năng và các yếu tố liên quan của promoter đã cho thấy khả năng thay đổi sự biểu hiện gen trong sinh vật cũng như các gen quan tâm bằng việc sử dụng cấu trúc (Promoter + Gen) Do đó promoter được coi như

là một nhân tố rất quan trọng trong việc kiểm soát quá trình biểu hiện của gen [12, 13, 15]

Phân loại các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học phụ thuộc vào từng loại gen cụ thể Các loại promoter này bao gồm:

 Nhóm các promoter biểu hiện toàn phần: Những promoter này

điều khiển hoạt động của gen quan tâm ở tất cả các mô và tế bào Sự biểu hiện của các gen quan tâm này hoàn toàn không phụ thuộc vào các yếu tố tác động

từ bên ngoài như môi trường… Chính vì những ưu điểm này nên các loại promoter thuộc nhóm này thường được dùng với phổ rất rộng ở các loài và các giới thực vật khác nhau

 Nhóm các promoter biểu hiện đặc hiệu mô hoặc ở các giai đoạn phát triển: Khác với nhóm trên, các loại promoter thuộc nhóm này sẽ điều

khiển sự biểu hiện các gen quan tâm ở các mô nhất định trong cơ thể thực vật hoặc ở các giai đoạn phát triển nhất định của cây Ở thực vật, hoạt động của promoter ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen ở các loại mô quan tâm bao gồm hệ thống bó mạch, các mô liên quan đến quá trình quang hợp, ở các cơ quan dự trữ như củ hay hạt và ở các cơ quan sinh sản như hoa đối với những

14

trường hợp khác loài (thông thường được áp dụng cho các loài có quan hệ họ hàng xa)… Tuy nhiên sự biểu hiện đặc hiệu chỉ thường đạt được đối với các promoter được phân lập từ các đối tượng nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần như cùng loài, chi hoặc họ Điều này có thể là do tương tác của các yếu tố phiên mã đến sự điều hòa hoạt động của các promoter

 Nhóm các promoter cảm ứng: Điểm khác biệt của các promoter

thuộc nhóm này là hoạt động của chúng không phục thuộc vào các nhân tố nội sinh nhưng lại phụ thuộc vào các yếu tố từ môi trường bên ngoài hay các yếu tố kích thích nhân tạo Trong nhóm này, hoạt động nhiều promoter được kích hoạt bởi các nhân tố sinh học như ánh sáng, nồng độ oxy, nhiệt độ và các yếu tố gây tổn thương Bên cạnh đó các loại promoter được kích hoạt bởi các hợp chất hóa học cũng được quan tâm đặc biệt, thường không có ở các cơ thể nghiên cứu Trong số này các promoter phản ứng với các nhân tố phi sinh học, kim loại đồng, cồn, các nhóm chất steroid hay các loại thuốc trừ sâu đã được đưa vào sử dụng để điều khiển hoạt động của các gen quan tâm trong các điều kiện chủ động

 Nhóm các promoter tổng hợp: Các loại promoter này được tạo ra

bằng cách ghép nối các vùng cơ bản của một promoter có các nguồn gốc khác nhau [20]

Ngoài các nhóm promoter kể trên, có thể kể đến các hệ thống biểu hiện

khác dựa trên các loại protein hoạt hóa dạng trans (trans-activating) Các hệ

thống này điều hoàn sự biểu hiện của các gen quan tâm mà không phụ thuộc vào vị trí vật của gen đích Trong thực tế, nhiều loại promoter cảm ứng hóa

học liên kết với các protein hoạt hóa dạng trans và các promoter biểu hiện

toàn phần [20]

15

1.4.4 Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem

Mạch gỗ (xylem) là tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên (khoáng và nước) trong thân cây, chỉ có ở cây gỗ lá rộng Mạch gỗ chiếm 20-30% thể tích thân cây Cấu tạo mạch gỗ là tập hợp của các tế bào mạch gỗ nối tiếp nhau thành ống dài theo chiều dọc của thân cây Mạch gỗ là thành phần lớn nhất trong cấu tạo thô đại của gỗ nên dễ quan sát nhất [24], ở thực vật tầng xylem là nơi quá trình sinh tổng hợp lignin diễn ra mạnh nhất [9], do vậy để điều khiển hoạt động của các gen trong tầng xylem với mục đích làm tăng hàm lượng và chất lượng lignin đòi hỏi phải sử dụng promoter mạnh có khả năng biểu hiện đặc hiệu các gen thuộc tầng xylem

Năm 1995, Feuillet và cộng sự lần đầu tiên phân lập thành công

promoter của gen CAD từ cây bạch đàn Eucalyptus gunii (EuCAD promoter)

Theo tác giả thì chiều dài của promoter này là khoảng 2,5 kb Để nghiên cứu hoạt động của promoter này, tác giả đã thiết kế cấu trúc chuyển gen vào cây bạch dương trong đó gen GUS chịu sự điều khiển của promoter này Sau khi phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc này tác giả nhận thấy rằng gen GUS biểu hiện chủ yếu ở phần xylem và các tế bào bó mạch Đây là nơi mà sự lignin hóa diễn ra mạnh nhất [9] Các kết quả của nghiên cứu này là nguyên liệu rất tốt cho đề tài của chúng tôi

Cinnamyl alcohol dehydrogenase là enzyme xúc tác cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp lignin Năm 2002, tác giả Lauvergeat cho rằng sự biểu hiện của promoter EuCAD trong các tế bào bó mạch là sự bảo tồn và phát

triển hệ mạch của những thực vật hạt kín (Vitis vinifera L.), cũng như trong một số loài cây thảo mộc (Nicotiana tabacum L.) Hơn nữa, việc loại bỏ một

vài đoạn trình tự promoter để phân tích sự biểu hiện của promoter này đã giúp xác định các vị trí cần thiết ảnh hưởng tới tầng phát sinh gỗ [16]

17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu sử dụng để phân lập promoter:

Vật liệu sử dụng để phân lập promoter là các mẫu gỗ bạch đàn nâu do Viện khoa học Lâm nghiệp cung cấp

2.1.2 Hoá chất:

Thang DNA 1 kb (Fermentas); Kit tinh sạch DNA (QIAqick Gel Extraction Kit), và tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) (QIAGEN); TA cloning Kit (Invitrogen); Sequencing Kit (Applied Biosystems); Các hoá chất thông dụng khác (Amplicillin, IPTG, X-gal, agarose,…) của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech

Dung dịch tách chiết plasmid: dung dịch 1:Tris HCL, 25mM, pH 8; EDTA, 10mM, pH8; Glucose 50 mM; dung dịch 2: NaOH 0.2 M, SDS 1%; dung dịch 3: đệm Axetat kali 3 M, pH 5,5; dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1), dung dịch TE (10 mM Tris-HCL pH 8,0; 1mM EDTA); vector pBT (Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học)

Dung dịch điện di DNA :dung dịch đệm TAE 50X: Tris base:121 g, Axit acetic glacia: 28,6ml, 0,5 M EDTA pH 8,0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ: 500

ml, Agarose 1%; Ethidium bromide (EtBr) Đệm kiểm tra mẫu DNA (Loading buffer) 5X: Tris-HCL 1 M pH 8,0:1ml; EDTA 0,5 M pH 8,0: 0,2 ml; Glycerol: 2ml; Bromphenol Blue 1 %: 2 ml;

Môi trường LB, Dịch chiết nấm men: Trypton: 10 g; NaCl:10 g; pH = 7,4 (chỉnh bằng NaOH 1N)

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac

300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ),

18

máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD trên ngân hàng gen quốc tế

Thông tin về gen mã hóa cho enzyme CAD được khai thác trên ngân hàng gen quốc tế thông qua trang web NCBI [26]

2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter

Dựa trên trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CAD của cây

bạch đàn E gunnii (Genbank) có mã số X75480, sử dụng phần mềm DNAstar

để thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn trình tự promoter EuCAD Trên

cơ sở đó promoter được nhân bản sử dụng hai cặp mồi như sau:

1 Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD1 kích thước khoảng 987 bp

Trình tự mồi Kích thước

Mồi xuôi (Foward) 5’-ctgcagtgaacggttcgatctcaaca-3’ 26 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 20 nucleotide

2 Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD2 kích thước khoảng 1149 bp

Trình tự mồi Kích thước Mồi xuôi (Foward) 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 20 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-ctcatctctgctcctacccg-3’ 20 nucleotide

19

2.2.3 Tách chiết và tinh sạch DNA từ mô gỗ

Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn:

 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn

 Cân 200 mg mẫu và nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn

 Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ

 Ủ ở nhiệt độ 65o

C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần)

 Thêm 600 µl dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1) và đảo đều,

để 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 4o

C, Trong 5 phút Dùng pipette hút lấy 500 µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá

 Thêm 500 µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 4oC, trong 10 phút

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần) Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống Eppendorf

 Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA

Việc xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bước sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo quang phổ Khi đó DNA có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm Từ giá trị OD260 ta sẽ tính được hàm lượng của DNA thu được (giá trị OD = 1,0 tương ứng với hàm lượng DNA là 50 µg/l mẫu) Độ tinh sạch của DNA có thể được xác định bằng tỷ số OD260/280 và OD260/OD230 Các tỷ số này lần lượt chỉ

ra sự có mặt của tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và carbonhydrate Một mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/280 và

OD260/OD230 đạt 1,8 – 2,0

 Các bước đo được tiến hành như sau:

 Chỉnh cân bằng máy: dùng nước cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn

 Kiểm tra máy: đo một mẫu DNA có nồng độ chuẩn đã biết trước (DNA của thực khuẩn thể λ)

 Đo mẫu ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm

 DNA được pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995 µl nước cất + 5

µl DNA mẫu, lắc đều, cho vào cuvette, đặt vào máy đo

 Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvette bằng nước cất

2.2.4 Khuếch đại đoạn promoter EuCAD bằng PCR

Sử dụng thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ sau để tiến hành khuếch đại promoter

 Tra mẫu: trộn mẫu theo tỷ lệ (2 µl DNA/1 µl đệm tra mẫu 10X: 7 µl

H20) và tra vào giếng

 Điện di: điện thế dùng để điện di từ 60 – 80 V DNA chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát sự di chuyển bằng màu của bromophenol blue để kiểm soát quá trình điện di

 Nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và đưa vào dung dịch EtBr 0.5 µg/ml trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ

 Soi DNA: soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen-Doc

2.2.5 Tách dòng promoter

 Tinh sạch và gắn đoạn promoter vào vector tách dòng pBT

 Tinh sạch promoter:

 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8% và cắt lấy băng quan tâm

 Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 ( 1 µl tương ứng với 1 mg mẫu)

23

 Bổ sung thêm 500 µl QG, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

 Thêm 750 µl đệm rửa PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE

 Hòa tan DNA rong 30 – 50 µl H20 khử ion đã đƣợc làm ấm đến 50oC

để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút

 Gắn đoạn promoter vào vector tách dòng pBT:

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn promoter vào vector tách dòng

24

2.2.6 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào khả biến E.coli DH5α

 Tạo tế bào khả biến

 Chủng vi khuẩn E coli được cấy trên môi trường LB đặc sau đó nuôi

 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi trên sang 50ml môi trường LB lỏng, lắc trong

3 giờ, đo OD600nm đạt 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm 50

ml được giữ trong đá

 Ly tâm dịch khuẩn ở 4000 v/p, 0oC trong 10 phút, sau đó thu cặn

 Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 20-30ml 0,1 M CaCl2, giữ trong đá 45 phút, ly tâm 4000 v/p, OoC, trong 10 phút thu cặn và hòa tan cạn trong 1,5 ml 0,1 M CaCl2 và 0,5 ml glycerol

 Chia 50 µl khuẩn vào mỗi ống Eppendorf 1,5 ml, làm đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở tủ lạnh -83oC

 Cấy trải khuẩn ở trên môi trường có và không có kháng sinh để kiểm tra

 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α:

Tế bào khả biến lấy từ tủ - 83oC được giải đông trên đá trong thời gian 15-30 phút Sau đó, bổ sung 20 µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ Hỗn hợp được giữ trên đá trong 5 phút, rồi sốc nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút 30 giây, sau đó đặt trên đá 5 phút Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 37o

C, lắc 200 v/p trong 1 giờ Sử dụng que cấy trải 150-200 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa 100 mg/l ampicillin, Xgal 0,004 %, IPTG 100 µM Ủ ở 37oC trong 16 giờ

25

2.2.7 Chọn lọc dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp

 Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR):

Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc

trên môi trường thạch có chứa 100 mg/l ampicillin, Xgal 0,004 %, IPTG 100

µM, ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ sẽ thu được các khuẩn lạc xanh trắng Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18F1 và pUC18R1 thành phần phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ khác mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc

Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 0.8% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid

Sol III 60 ml acetat potasssium 5M; 11,5 ml acid acetic; 28,5 ml H20

Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 4oC [17]

SDS (Sodium dodecyl sulfate) pha mới trước khi dùng

 Các bước tiến hành:

 Lấy 1 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 37o

C trong 3ml môi trường LB (có chứa kháng sinh thích hợp)

 Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Effendorf 2 ml, ly tâm 10000

vòng / phút trong 7 phút

 Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200 µl Sol I, vortex tới khi phần

cặn tế bào tan hoàn toàn

 Bổ sung 200 µl Sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Effendorf;

 Bổ sung 200 µl Sol III, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Effendorf,

sau đó ly tâm 13 000 vòng/ phút trong 10 phút

 Thu nổi sau bổ sung hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (1 : 1), lắc mạnh

 Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút

 Thu phần dịch nổi sau đó bổ sung isopropanol lạnh tỉ lệ (1 : 1)

 Ly tâm 13000 vòng /phút trong 10 phút sau đó thu tủa

 Bổ sung 500 µl cồn 70 %, lắc nhẹ sau đó ly tâm 7000 vòng/ phút trong

5 phút

 Lặp lại bước 10 Thu tủa sau đó làm khô

 Bổ sung 40 ul H2O khử RNAse

2.2.9 Xác định trình tự nucleotide của promoter

Trình tự promoter đƣợc xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Trình tự promoter đƣợc xác định trên cả hai sợi khuôn và đối nghĩa với việc sử dụng hai mồi xuôi và ngƣợc Tuy nhiên, chỉ có một mồi tham gia phản ứng, mồi đơn này bám vào vùng bổ sung đã đƣợc thiết kế trong vector

Thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR xác định trình tự nhƣ sau:

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng

Hình 2.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng cách bổ sung 5 µl EDTA 125mM,

60 µl cồn 100% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Tiếp đó, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút để tủa các đoạn DNA, sau đó loại bỏ cồn Bổ sung 60 µl