Nghiên cứu tách chiết flavonoid và xác định hàm lượng vitamin c của lá cây chùm ngây (guilandina moringa lam)

i LỜI CẢM ƠN Kết thúc bốn năm học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học, trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, được sự cho phép của Viện trưởng cùng sự giúp sức của quý thầy cô tr

i

LỜI CẢM ƠN

Kết thúc bốn năm học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học, trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, được sự cho phép của Viện trưởng cùng

sự giúp sức của quý thầy cô trong ngành, năm học 2017-2018 này, em đã có thể

tiến hành làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid và xác định hàm lượng vitamin C của lá cây Chùm Ngây (Guilandina moringa Lam)”

Để có thể hoàn thành tốt bài luận này không thể không kể đến sự giúp sức của quý thầy cô đang công tác và giảng dạy tại Viện Công nghệ Sinh học trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, gia đình cũng như bạn bè đã ở bên, đồng hành

và ủng hộ em trong suốt quãng thời gian dài

Lời đầu tiên, cho phép em được gửi lời biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến cô giáo trực tiếp hướng dẫn khóa luận - Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng người thầy khoa học đã định hướng và tận tình chỉ bảo, đã truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong cách nghĩ, các tiếp cận và cách giải quyết vấn đề, tác phong làm việc, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng các anh chị và các bạn tại viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã quan tâm và giúp đỡ

em, các thầy cô đã trang bị kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập thực tập tốt nghiệp vừa qua

Em cũng xin phép được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo và chị Nguyễn Thị Hồng Nhung của Bộ môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, điều kiện thực nghiệm một cách tốt nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này

Cuối c ng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ, những người đã vất vả nuôi dưỡng và dạy dỗ con nên người, người đã uôn uôn h ch ệ, động viên, tin tưởng ủng hộ con tới ngày hôm nay!

Tuy được sự chỉ bảo tận tình của ThS Nguyễn Thị Thu Hằng và các thầy

cô trong viện cùng với sợ nỗ lực của bản thân đã cố gắng để hoàn thiện uận văn này, song iến thức, inh nghiệm của em c n hạn chế ,vậy nên bản báo cáo hoa học này hông tránh h i những sai sót, nh mong các thầy cô đóng góp ý iến đánh giá, để bản báo cáo của em được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

2

M

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5

1.1 Giới thiệu về cây Chùm Ngây 5

1.1.1 Phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 5

1.1.3 Thành phần hóa học của lá cây Chùm Ngây 7

1.1.4.Tác sụng sinh học của lá Chùm Ngây 8

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây trên thế giới và trong nước 8

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây ở Việt Nam 11

1.2 Hợp chất chống oxi hóa 12

1.2.1 Khái niệm 12

1.2.2 Phân loại các hợp chất có tác dụng chống oxy hóa 12

1.3 Hợp chất Flavonoid 13

1.3.1 Khái niệm về flavonoid 13

1.3.2 Cấu trúc chung và phân loại 13

1.3.3 Tính chất lý hóa của flavonoid 17

1.3.4 Hoạt tính sinh học của flavonoid 18

PHẦN 2: NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Vật liệu nghiên cứu 19

2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 19

2.5 Phương pháp nghiên cứu 20

2.5.1 Xác định độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây 20

2.5.2 Xác định làm lượng vitamin C trong lá Chùm Ngây 21

2.5.3 Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp của B.C.Talli 23

2.5.4 Tối ưu một số điều kiện trong quá trình tách chiết theo quy trình 23

2.5.5 Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết 25

3

2.5.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoid 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Xác định độ ẩm của lá và bột á cây Ch m Ngây và xác định hàm ượng vitamin C của lá cây Chùm Ngây 28

3.1.1 Xác định độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây 28

3.1.2 Xác định hàm lượng vitamin C của lá cây Chùm Ngây 30

3.2 Tối ưu một số điều kiện trong quá trình tách chiết 30

3.2.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly flavonoid 30

3.2.2 Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả trích ly flavonoid 31

3.2.3 Tỷ lệ mẫu/dung môi 32

3.2.4 Thời gian ngâm chiết 33

3.3 Xác định sự có mặt của flavonoid tròn dịch chiết bằng các phương pháp 34

3.3.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng màu đặc trưng 34

3.3.2 Định tính flavonoid bằng phương pháp chạy sắc ký lớp mỏng 35

3.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của flavonoid 35

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Kiến nghị 38

4

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, xã hội càng phát triển nhu cầu về chất dinh dưỡng càng cao, màu sắc trong thực phẩm càng được cải thiện nhằm tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm Chất màu là một trong các yếu tố quan trọng nhằm mục đ ch đó Một trong các chất tạo màu tiêu biểu là flavonoid, flavonoid là một trong các nhóm hợp chất po ypheno thường gặp trong thực vật

Các flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng vào bậc nhất trong thiên nhiên, có mặt không những chỉ trong những thực vật bậc cao mà còn trong một số thực vật bậc thấp, thậm chí còn có cả trong các loài tảo Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid và chúng cũng à các thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật Cho đến nay, flavonoid vẫn là lớp chất được các nhà hoá học các hợp chất thiên nhiên quan tâm nghiên cứu Có khoảng trên

11000 hợp chất f avonoid được biết về cấu trúc

Flavonoid không những có giá trị về mặt cảm quan mà được khai thác, sử dụng trong nhiều ĩnh vực: thực phẩm, mỹ phẩm và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong y dược học Flavonoid có ứng dụng trong y học để điều trị một số bệnh như: viêm nhiễm, dị ứng, loét dạ dày và hành tá tràng, giúp cơ thể điều hoà các quá trình chuyển hoá, chống lão hoá, làm bền thành mạch máu, và giảm ương cho estero trong máu…Với các nhà hoá sinh thì flavonoid là một chất chống oxi hoá mạnh Hiện nay, nhiều f avonoid được phân lập từ thực vật trong

đó á cây Ch m ngây được xem là một trong những loài thực vật chứa các hợp chất thiên nhiên có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá và đột biến của các tế bào trong cơ thể

Việt Nam à nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Là điều kiện tốt cho sinh trưởng phát triển của rất nhiều oài động thực vật, đặc biệt với các loại cây chịu hạn như: Phi lao, Hương thảo, Chùm ngây, Keo,…Chùm ngây được trồng

ở khắp thế giới chủ yếu ở Ấn Độ, Hy Lạp, Châu Phi,Châu Á( trong đó có Việt Nam) Việt Nam, Ch m ngây được trồng nhiều ở các tỉnh miền Nam sau đó được nhân rộng ra các tỉnh miền Bắc Với nguồn nguyên liệu dồi dào lá chùm ngây và phong phú cùng với việc nhận thấy ý nghĩa, tầm quan trọng của hoạt chất chống lão hóa trong đời sống cũng như ĩnh vực nghiên cứu khoa học, em

tiến hành tách chiết flavonoid với đề tài khóa luận tốt nghiệp à: “Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid và vitamin C của lá cây Chùm Ngây Guilandina moringa Lam”

5

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu về cây Chùm Ngây

1.1.1 Phân loại

Cây Chùm ngây hay còn gọi là cây Chùm Ngây Cải Ngựa, tên khoa học

là Moringa oleifera Lam, thuộc hệ thống phân loại như sau[1]:

và tất cả các loài đều là các cây thân gỗ thích hợp với khí hậu khu vực nhiệt đới

và cận nhiệt đới Loài phổ biết nhất trong Chi Moringa là Chùm ngây (Moriga oleifera Lam) được trồng nhiều nơi trong khu vực nhiệt đới, và là loài duy nhất của chi Moringa được trồng tại Việt Nam [2]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây Chùm Ngây nh hay cây nhỡ cao khoảng 5-10m V cây dày, có khía rãnh.Thân non có long, lá kép, mọc so le, dài 30-60cm, có 6-9 đôi lá chét hình trứng, mọc đối Hoa thơm, màu trắng hơi giống hoa họ Đậu Cây ra hoa vào tháng 1-2 Quả Chùm Ngây dạng nang treo, có thiết diện tam giác, dài 25-30 cm hay hơn, mở làm 3 mảnh, hạt có 3 cạnh và có màu trắng, dạng màng [2]

Chùm Ngây là loài cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khô

và có khả năng chịu hạn hán Theo một số báo cáo thì cây Chùm Ngây sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ từ 18,7-28,5o

C và pH khoảng 4,5-8 [21]

Cây Chùm Ngây có nguồn gốc ở Tây Bắc Ấn Độ, sau được đưa vào trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Ma aysia, Cuba ,… Ngoài ra, Chùm Ngây c n được phát hiện có phân bố ở Châu Phi, Madagascar

6

Ở Việt Nam, cây Chùm Ngây mọc hoang hoặc đƣợc trồng ở nhiều tỉnh phía Nam từ Đà Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang và các đảo Phú Quốc [2]

A B

C D

Hình 1.1: Một số hình ảnh về hình thái cây Chùm Ngây

(Guilandina moringa Lam)[2]

A Thân cây Chùm Ngây C Lá cây Chùm Ngây

B Hoa cây Chùm Ngây D Quả cây Chùm Ngây

7

1.1.3 Thành phần hóa học của lá cây Chùm Ngây

Các bộ phận của Chùm Ngây chứa nhiều chất khoáng quan trọng, và là nguồn cung cấp đạm chính là amino acid, vitamin, beta-carotene, và nhiều hợp chất phenolic Chùm Ngây cung cấp một hỗn hợp nhiều hợp chất như zeatin, quercetin và kaempferol

Kết quả phân t ch hàm ượng dinh dưỡng của quả, á tươi và bột khô của lá Chùm Ngây có thể được tóm tắt như Bảng 1.1 [11]:

Bảng 1.1: Một số thành phần hóa học của cây Chùm Ngây

8

Hình 1.2: So sánh hàm lượng dinh dưỡng của lá Chùm Ngây và một số

thực phẩm giàu dinh dưỡng thông dụng [3]

Nhìn chung, lá Chùm Ngây có hàm ượng vitamin C nhiều gấp 7 lần trái cam và có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch trong cơ thể, chống oxi hóa

và chữa trị các bệnh ây an như cảm cúm Hàm ượng canxi trong Chùm Ngây khá cao, và có thể cao hơn sữa 4 lần giúp bổ sung canxi cho xương, ngăn ngừa oãng xương Hàm ượng Kali nhiều hơn chuối 3 lần và kali là chất cần thiết cho

óc và hệ thần kinh.Vitamin A trong lá Chùm Ngây nhiều hơn cà rốt 4 lần giúp chống lại những chứng bệnh về mắt, da và tim, đồng thời ngăn ngừa tiêu chảy

và chứng bệnh thông thường hác…Protein nhiều hơn sữa 2 lần, có vai trò quan trọng đối với cơ thể người và động vật có vai trò tạo nên cấu trúc cơ thể

1.1.4.Tác sụng sinh học của lá Chùm Ngây

Lá cây Chùm Ngây phòng bệnh ung thư, thoái hóa, xơ nang Lá của cây Chùm Ngây có chứa 46 loại chất chống oxy hóa, đặc biệt là vitamin C và vitamin A Đây à những chất chống oxy hóa vô cùng quan trọng đối với sức

kh e con người Các chất chống oxy hóa này giúp trung h a các tác động tàn phá của các gốc tự do, từ đó bảo vệ chúng ta kh i bệnh ung thư và các bệnh thoái hóa như thoái hóa điểm vàng và bệnh xơ nang Tốt cho cơ bắp, xương, da

và máu Lá của cây Chùm Ngây rất giàu các amin acid và có chứa 18 amin acid, trong đó có 8 amin acid thiết yếu (isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalaine, threonine, tryptohyan, valine) nên loài cây này chứa protein “hoàn

9

hảo’ và à một loại cây rất hiếm trong thế giới thực vật Hỗ trợ điều trị tăng cho estero , tăng ipid máu, tăng trig ycerit, àm giảm uric acid, ngăn ngừa s i oxalate Giúp ổn định huyết áp và đường huyết, bảo vệ gan, trị suy nhược Điều trị u xơ tiền liệt tuyến và phòng ngừa oãng xương, với hàm ượng canxi và magie phong phú, cây Chùm Ngây trở thành một trong những loại thực vật có tác dụng tốt cho xương của bạn nếu bạn bổ sung chúng qua ăn uống hoặc dùng

để pha trà Canxi à dưỡng chất cần thiết để xây dựng xương và răng, c n magiê lại giúp cơ thể hấp thụ canxi tốt hơn Vì cây Ch m Ngây chứa nhiều cả hai dưỡng chất này này nên nó đặc biệt tốt cho bạn trong việc phòng ngừa bệnh oãng xương và các bệnh về xương hác Chùm Ngây chứa cytokinin – một loại kích thích tố thực vật tạo ra phân chia tế bào, tăng trưởng, và làm chậm quá trình lão hóa của các tế bào Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy Chùm Ngây sản xuất

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây trên thế giới và trong nước

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây trên thế giới

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong Chùm Ngây Theo công trình nghiên cứu của Suphachai Charoensin trên tạp chí Medicinal Plant Research (2012), 15(g) bột lá Chùm Ngây trích ly với 350 m methano , hàm ượng phenolic và flavonoid tổng số lần ượt là 261,45 và 65,38 (mg đương ượng gallic acid/g chiết xuất) [19]

Boonyadist Vongsak và CS (2013) trong nghiên cứu của mình đã tr ch

ly lá Chùm Ngây để hàm ượng phenolic và flavonoid tổng số lớn nhất trong điều kiện sử dụng dung môi cồn ethanol 70% thu được hàm ượng phenolic và flavonoid tổng số lần ượt là 13,23 và 6,20g/100g chiết xuất [10]

Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) về hoạt tính trên các thông số lipid của quả Chùm Ngây, thử trên th , ghi nhận: th cho ăn Chùm Ngây (200mg/kg mỗi ngày) hay uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trộn trong một hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120 ngày Kết quả cho thấy th ăn á Chùm Ngây hay uống lovastatin đều có tác dụng làm hạ cholesterol, phospholipid, triglycerid, hạ tỷ số

10

cholesterol/phospholipid trong máu so với th trong nhóm đối chứng [18] Dịch chiết thô lá Chùm Ngây có hoạt tính làm giảm đáng ể cholesterol trong huyết thanh của chuột thí nghiệm có chế độ ăn giàu chất béo Được cho là do sự có mặt của thành phần hóa học β-sitosterol

Nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm gây bệnh, nghiên cứu tại Institute of Bioagricu tura Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt Chùm Ngây bằng ethanol có các hoạt tính diệt được nấm gây

bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophyte, Epidermophyton floccosum và Microsporum canis [15]

Dịch chiết bằng nước nóng của hoa, lá, rễ, hạt, v thân Ch m Ngây đã được nghiên cứu tại Trung tâm nghiên cứu kỹ thuật (CEMAT) tại Guatamala City về các hoạt t nh dược học, thử trên chuột Hoạt tính chống co giật được chứng minh bằng thử nghiệm trên chuột đã cô ập, hoạt tính chống sưng thử trên chân chuột bị gây phù bằng carrageenan và tác dụng lợi tiểu bằng ượng nước tiểu thu được khi chuột được nuôi nhốt trong lồng Nước trích từ hạt cho thấy tác động ức chế khá rõ sự co giật gây ra bởi acetylcholin ở liều ED50= 65,6 mg/m môi trường; tác động ức chế phụ gây ra do carrageenan được định ở 1000mg/kg và hoạt tính lợi tiểu cũng ở 1000 mg/kg

Những nghiên cứu về t nh dược lý của lá Chùm Ngây đã được tiến hành rộng rãi, cho thấy những thành phần trong dịch chiết cồn có hoạt tính chống co thắt, thong qua việc phong t a kênh calci Hoạt tính chống co thắt của dịch chiết cồn lá Chùm Ngây là do sự có mặt của hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]-o-metyl thiocarbamat Đây à cơ sở để lý giải vì sao lá Chùm Ngây được dùng

để chữa bệnh tiêu chảy trong y học dân gian Ngoài ra, hoạt tính chống co thắt từ những thành phần hác nhau c n à cơ sở dược ý để oài cây này được sử dụng trong điều trị rối loạn nhu động ruột Dịch chiết methanol lá Chùm Ngây thể hiện hoạt tính chống viêm loét và bảo vệ gan trên chuột Dịch chiết nước của lá cũng có hoạt tính chống viêm loét cho thấy rằng những phức hợp chống viêm loét là phổ biến trong oài cây này Cũng có những nghiên cứu công bố rễ Chùm Ngây có hoạt tính bảo vệ gan Dịch chiết nước và dịch chiết cồn hoa Chùm ngây

mô hình phân tích in vitro Kết quả cho thấy chúng có hiệu quả ức chế đáng ể

virus Epstein - Bar Niazimicin đã được đề nghị là chất có hiệu lực ngăn ngừa

những tác nhân hóa học gây ung thư

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu có những nghiên cứu tập trung vào đối tượng Chùm Ngây Các nghiên cứu chủ yếu xác định về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý, nhằm có những biện pháp chế biến và sử dụng hiệu quả đối tượng này Trong số đó, một số công trình nghiên cứu nổi bật đã được công bố

Nghiên cứu của Sa ihah (2011) đã phân ập được 2 hợp chất chống oxy hóa trong Chùm Ngây à vitexin và isoquercitrin trong điều kiện tối ưu cồn 96% với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1/6), phương pháp chiết là sử dụng phương pháp ngâm chiết [3]

Đại học Y dược Tp HCM (2011), cũng đã có công trình nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây Chùm Ngây Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lá Chùm Ngây trồng tại Việt Nam có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan Khả năng này thể hiện rõ nhất là dịch chiết lá Chùm Ngây bằng cồn 60% ở liều 0,2g/kg

Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Ch Minh (2010) đã hảo sát được trong lá Chùm Ngây có những nhóm hợp chất là: chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin, acid hữu cơ Đồng thời, tác giả cũng

đã khảo sát và ghi nhận được những đặc điểm về hình thái và vi học, cũng như đặc điểm của bột dược liệu lá Chùm Ngây Ngoài ra, công trình này cũng đã định ượng được flavonoid toàn phần có trong lá cây Chùm Ngây mọc tại Tp

12

Hồ Ch Minh và Đồng Nai, giữa lá non và lá già Từ đó, rút ra được mối tương quan giữa hàm ượng flavonoid trong lá với nơi cây mọc, cụ thể à hàm ượng flavonoid sẽ gia tăng khi cường độ chiếu sáng vào cây (cường độ tia UV) tăng

và hàm ượng flavonoid trong cây non sẽ cao hơn trong cây già [7]

Một nghiên cứu khác của Trung tâm phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Tp HCM ( 2010), cũng đánh giá được thành phần hóa học của Chùm Ngây

sẽ khác nhau tùy theo từng bộ phận trên cây và t y theo nơi mọc của cây

Trước đó, những công trình nghiên cứu về Chùm Ngây trong nước chủ yếu hướng vào khảo sát đặc điểm hình thái học thực vật, hệ thống phân loại thực vật và thống kê các công dụng dân gian của Chùm Ngây Trong số đó, tiêu biểu

là những tài liệu về thực vật và cây thuốc của Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ Những nghiên cứu khác mang tính nh lẻ và hầu như chưa được quan tâm

1.2 Hợp chất chống oxi hóa

1.2.1 Khái niệm

Chất chống oxi hóa là những chất có khả năng nhường điện tử cho những

gốc tự do hay đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, làm mất đi t nh thiếu ổn định và dễ gây phản ứng hóa học với những phân tử khác

Với khả năng đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, chất chống oxy hóa giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại tác hại của gốc tự

do Hệ thống bảo vệ, chống oxy hóa này bao gồm nhiều thành phần Sự thiếu hụt bất kỳ thành phần nào đều có thể gây giảm trạng thái chống oxy hóa toàn phần

1.2.2 Phân loại các hợp chất có tác dụng chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme và không phải enzyme:

Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzyme: trong tế bào sinh vật luôn

có cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại tác động của gốc tự do bằng enzyme Enzyme kháng oxy hóa có khả năng trung h a gốc tự do và mỗi phân tử enzyme có thể

vô hiệu hóa hàng ngàn gốc tự do Các enzyme đó thường xuyên hiện diện trong

cơ thể từ trước khi có phản ứng tạo ra gốc tự do Tiêu biểu là enzyme superoxyd dismutase , glutathion , enzyme glutathione peroxydase, enzyme cata ase… Mỗi enzyme liên hệ vào từng phản ứng riêng biệt Tuy nhiên, sự gia tăng quá mức do

cơ thể không bị cạn kiệt

1.3 Hợp chất Flavonoid

Hợp chất phenolic trong Chùm Ngây có chứa nhiều các flavonoid, các flavonoid có hoạt tính sinh học cao vì vậy chất ượng của dịch tách chiết cao

1.3.1 Khái niệm về flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng Về cấu trúc hóa học, f avonoid có hung cơ bản kiểu C6

C3 C6 (2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau và hầu hết flavonoid là các chất phenolic [7]

F avonoid được phát hiện bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỷ XX: Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986) Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid

1.3.2 Cấu trúc chung và phân loại

Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm 15 nguyên tử carbon và hai vòng benzene liên kết bởi một đường thẳng có 3 carbon [7]

Hình 1.3 Cấu trúc chung của các chất thuộc nhóm flavonoid

14

Phân loại:

Flavonoid có cấu trúc mạch C6 C3 C6 với 2 v ng thơm, tùy thuộc vào cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6 C3 C6, flavonoid đƣợc phân thành 3 phân nhóm chính sau [7]:

+ Flavonoids: gồm các chất flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon, anthocyanin, anthocyanidin

+ Isoflavonoid: gồm các nhóm phụ isolavon, isoflavanon, rotenoid

OH và hoặc OCH3 đã có tới hơn 300 chất Chất f avon đơn giản nhất không có nhóm thế đã đƣợc phân lập từ cây Anh thảo ( Primula) Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin.Flavon rất phổ biến trong thực vật nhƣ Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), cây Anh thảo…

Flavonol: khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở C3 Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng Những dẫn chất flavonol rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là Hành, Hoa hòe, Lúa mạch, Diếp cá

15

dạng hỗn hợp của các dẫn suất, với tỷ lệ khác nhau, tuỳ thuộc nguồn gốc thực vât

Chalcon

Chalcon có chủ yếu ở một số cây họ cúc (Asteraceac) tập trung nhiều nhất

ở v cây, gỗ lõi ( Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tương, Trinh nữ hoàng cung, Dương

16

với dung dịch acid vô cơ thì có màu đ , dễ bị oxi hoá và trùng hợp hoá nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó hăn Anthocyanidin thường tồn tại dưới dạng glycozit, gọi là anthocyanin

1.3.2.2 Các chất thuộc nhóm isoflaconoid

Thuộc nhóm này có isoflavon, isoflavanon, rotenoid Isoflaconoid tất cả không có màu sắc Nó được tạo thành từ axetat theo cơ chế đóng v ng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập vào vòng B và C - 2,3, và - 4 của dạng vòng

17

1.3.2.3 Các chất thuộc nhóm neoflavonoid

Phân tử của các hợp chất ở các phân nhóm trên đều có 2 v ng thơm, mang nhóm hydroxyl với số ượng và vị trí khác nhau, tùy thuộc từng chất Các hợp chất này có cấu trúc mạch C6C3C6 nhưng hung cầu nối C3 giữ 2 nhân thì khác nhau tùy thuộc từng loại hợp chất Mạch cầu nối có thể là mạch hở (chalcon), một v ng đơn (flavanon), hoặc òng có nối đôi (f avon, f avono )

1.3.3 Tính chất lý hóa của flavonoid

Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng liên kết với đường (glycoside) Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzymee sẽ giải phóng ra đường và ag ycon Các đường thường gặp nhất là D-glucose, Dgalactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [17] Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (n-hexan, benzen, ether dầu h a), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid Glycoside tan trong ethanol, methanol Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 c n tan được trong dung dịch NaOH,

Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid Các flavonoid dạng ag ycon thường dễ kết tinh, trong hi các g ycoside thường khó kết tinh hơn

Các f avonoid thường có màu Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam;

f avono có màu vàng đến vàng nhạt; cha con có màu vàng đến cam đ Các

18

isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycoside: pelargonidin, cyanidin,

de phinidin…tạo màu xanh dương, đ , tím cho hoa và trái

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với pH, nhiệt độ và ánh sáng Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu đặc trưng

Hệ thống nối đôi iên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm

1.3.4 Hoạt tính sinh học của flavonoid

Flavonoid có hoạt tính kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ung thư, chống oxy hóa mạnh, tác dụng đến nhiều hệ enzymee và t độc đối với cơ thể sống Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzymee hay hệ thống thần kinh, nội tiết…[20]

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch….nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giống như các chất chống oxy hóa hác như vitamin C,E…) [4]

Nhiều loại f avonoid có chưa vitamin P, tăng cường tác dụng của acid

ascorbic, giúp củng cố các thành mạch máu đang bị suy yếu và có tác dụng làm dịu các cơn đau Chúng c n được xem là một loại thuốc tiêu độc Ngoài ra, nếu ượng flavonoid cung cấp giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng ên rõ rệt Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin

C, E, selenium và kẽm Mỗi một loại f avonoid đều mang lại những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ cho nhau

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xác định được độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây và xác định hàm ượng vitamin C trong lá Chùm Ngây

- Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid trong bột lá Chùm Ngây theo phương pháp của B.C.Talli và xác định một số điều kiện tách chiết thích hợp

- Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết bằng các phản ứng màu đặc trưng và chạy sắc ký lớp m ng

- Xác định hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm định của flavonoid

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Lá cây Chùm Ngây được lấy tại thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ - Hà Nội

Hình 2.1: Hình ảnh lá và bột lá của cây Chùm Ngây

- Vi khuẩn E.coli Gram (-) , vi khuẩn Salmonella

- Nấm mốc Aspergillus niger

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Do phòng vi sinh – hoá sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm Nghiệp cung cấp

2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

a.Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:

20

- Máy siêu âm

- Máy gia nhiệt

- Máy đo quang phổ

- Các dụng cụ tủy tinh như bình trụ, đũa thủy tinh, đĩa peptri, bình tam giác nh

- Kẹp gỗ, pipetman, đầu côn các loại, ống cuvet, ống eppenandorf, ống fancol, ống nghiệm, giấy lọc

- Giấy sắc ký silica gel 60G

c Hóa chất

Các loại hóa chất cần thiết: n-hexan, etyl acetat, ethanol 96°, methanol, dung dịnh NaOH 10%, KOH 10%, hệ dung môi chạy TLC(ethyaxetat :to uen:axit fomic:nước = 7:3:1,5:1)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Xác định độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây

- Độ ẩm à ượng nước tự do có trong mẫu, có thể được xác định bằng phương pháp sấy khô

- Nguyên lý: dùng nhiệt làm bay hết hơi nước trong mẫu Cân trọng ượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó t nh được phần trăm nước trong mẫu

- Tiến hành: cân khối ượng lá Chùm Ngây đã được ngắt b cành vào các hay đĩa đã được sấy hô đến khối ượng hông đổi và biết khối ượng chính xác Cho khay đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 80oC trong 3 giờ.Sau đó ấy khay ra, đợi khay đạt nhiệt độ phòng thì tiến hành cân tính khối ượng trên cân phân tích Cho lại mẫu vào tủ sấy và tiến hành lặp lại quá trình trên lần thứ hai và những lần tiếp theo nữa cho đến khi khối ượng giữa ba lần cân liên tiếp là hông đổi, hoặc có sai số không cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu ban đầu thì dừng quá trình sấy

Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

x 100