Nghiên cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem của cây bạch đàn uro (eucalyptus urophylla s t blake) trồng tại việt nam

Bằng việc sử dụng phương pháp này, nhiều tính trạng đã được phân tích ở các loài cây rừng như sự hình thành gỗ, khả năng chịu lạnh… Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở việ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA LÂM HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÂY DỰNG THƯ VIỆN cDNA

TỪ XYLEM CỦA CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS

UROPHYLLA S.T BLAKE) TRỒNG TẠI VIỆT NAM

Khoá học: 2005 – 2009

Hà Nội, 2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, ThS Bùi Văn Thắng, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam- những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cám ơn đến CN Hoàng Hà đã tận tình giúp đỡ truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Lâm học và các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn luôn động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Nguyễn Thị Hiền

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

E coli Escherichia coli

Taq Thermus aquaticus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BsrGI

222 Bảng 3.2: Kích thước đoạn cDNA được chèn vào vector

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ vận chuyển chất của mạch xylem

Hình 1.2 Các bước chính trong việc xây dựng thư viện cDNA

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng BP trong kỹ thuật Gateway

Hình 3.1 Kết quả tách chiết RNA từ mẫu gỗ Bạch đàn

Hình 3.2 Kết quả tách RNA khi loại DNA bằng DNAse

Hình 3.3 Mô hình tạo cDNA

Hình 3.4 Kết quả phép thử đánh dấu trên đĩa thạch

222

222 Hình 3.6 Kết quả chọn lọc các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp trên môi trường chứa kháng sinh Kanamycin

Hình 3.7 Kết quả tách plasmid

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt

Hình 3.9 Trình tự phân đoạn cDNA số 6

Hình 3.10 So sánh trình tự cDNA số 6 với các trình tự trên Genbank (bằng BLAST)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

2BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T Blake) và những nghiên cứu bộ gen đối với loại cây này 3

1.2 Cấu trúc và vai trò của xylem ở thực vật 4

1.3 Giới thiệu về thư viện cDNA 5

1.4 Một số kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu tạo thư viện cDNA 7

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu và hóa chất 12

2.1.1 Vật liệu 12

2.1.2 Hóa chất 12

2.1.3 Máy móc, thiết bị 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Tách chiết RNA 14

2.2.2 Điện di trên gel agarose 1% 14

2.2.3 Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất 15

2.2.4 Tổng hợp sợi cDNA thứ 2 và gắn attB1 16

2.2.5 Phân đoạn kích thước cDNA bằng cột sắc kí ái lực 17

2.2.6 Biến nạp vào các dòng tế bào kháng phage ElectroMAX TM DH10B TM T1 trong môi trường kháng sinh Kanamycin 19

2.2.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu gỗ của Bạch đàn urô 22

3.2 Thu các phân đoạn cDNA và kiểm tra chất lượng các phân đoạn 27

3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kháng phage ElectroMAX TM DH10B TM T1 30

3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp và cắt plasmid bằng Enzyme BrsG I 32

3.5 Đánh giá chất lượng cDNA 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

1 KẾT LUẬN 37

2 KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

quả cao (Brauetigam et al., 2005) [10] Bằng việc sử dụng phương pháp này,

nhiều tính trạng đã được phân tích ở các loài cây rừng như sự hình thành gỗ, khả năng chịu lạnh… Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở việc phân tích sự biểu hiện gen có liên quan đến tính trạng nghiên cứu cụ thể

mà chưa mở rộng tìm hiểu những tác động lên các chu trình trao đổi chất khác trong cây

Chi Bạch đàn (Eucalyptus) gồm các loài cây công nghiệp có giá trị kinh

tế cao Gỗ Bạch đàn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực từ việc trang trí, đóng các đồ gỗ gia dụng, cho đến xây cất nhà cửa cũng như các công trình xây dựng khác Những công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh thái,

quá trình sinh trưởng, phát triển của cây Bạch đàn đã được quan tâm chú ý

Sự sinh trưởng, phát triển của thực vật nói chung và của cây Bạch đàn nói riêng có liên quan chặt chẽ với nhau và với môi trường sống Cây Bạch đàn phát triển nhanh sẽ cho năng suất gỗ lớn, ngược lại cây sinh trưởng chậm, ra hoa sớm thì năng suất gỗ thấp [15] Sự khác nhau về khả năng sinh trưởng của các dòng Bạch đàn có thể là hệ quả của sự khác nhau về biểu hiện của các gen đặc trưng Thư viện cDNA từ các dòng cây với khả năng sinh trưởng khác nhau sẽ là một công cụ cần thiết cho những nghiên cứu sâu hơn về sự biểu hiện các gen ở mô hay tế bào nghiên cứu Phương pháp này có nhiều ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của gen [6]

Chính vì lý do này mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem của cây Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) trồng tại Việt Nam"

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T Blake) và

những nghiên cứu bộ gen đối với loại cây này

Chi Bạch đàn (Eucalyptus) thuộc họ Mytarceae gồm hơn 700 loài Theo cách phân loại mới nhất thì hai dưới chi của Bạch đàn là Corymbia và

Angophora, tuy nhiên một vài nhà phân loại thực vật lại cho rằng chúng là

những chi độc lập Cây Bạch đàn có nguồn gốc từ Australia và chúng có thể sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng [14] Ngày nay Bạch đàn là một trong những cây gỗ lâm nghiệp rất quan trọng được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới với diện tích canh tác khoảng 17 triệu hecta Trong số

đó thì Eucalyptus grandis, E globus, E camandulensis được trồng phổ biến nhất, chiếm khoảng 80% diện tích canh tác Ngoài ra, các loài E nitens, E

saligna, E deglupta, E urophylla, E tereticornis và E pilularis cũng được

trồng khá phổ biến Gỗ từ cây Bạch đàn có thể sử dụng trong xây dựng, công nghiệp giấy Cây Bạch đàn là loài cây gỗ sinh trưởng nhanh, chiều cao cây có thể đạt tới 15 - 20 m, đường kính có thể đạt tới 40 cm Thân cây thẳng, vỏ mịn, bao phủ bên ngoài là một loại chất dạng bột [21]

Những nghiên cứu về gen trên cây Bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen Đặc điểm của bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng [15] Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng

và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính trạng mong muốn [22]

1.2 Cấu trúc và vai trò của xylem ở thực vật

Mạch gỗ thuật ngữ khoa học là xylem (chữ "xylem" bắt nguồn từ 1 từ cổ điển Hy Lạp (xylon), có nghĩa là "gỗ"), là tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên (khoáng và nước) trong thân cây, chỉ có ở cây gỗ lá rộng Mạch gỗ chiếm 20-30% thể tích thân cây Cấu tạo mạch gỗ là tập hợp của các tế bào mạch gỗ nối tiếp nhau thành ống dài theo chiều dọc của thân cây Quan sát dưới kính hiển

vi, tế bào mạch gỗ có hình dạng: hình trụ, hình trống hoặc viên trụ Mạch gỗ

là thành phần lớn nhất trong cấu tạo của gỗ nên dễ quan sát nhất, trên mặt cắt ngang nó có hình tròn hoặc elip nên gọi là lỗ mạch, trên mặt cắt xuyên tâm và tiếp tuyến nó có dạng ống nên gọi là ống mạch Mạch gỗ là yếu tố đầu tiên giúp phân biệt các loại gỗ, là yếu tố làm tăng độ xốp rỗng của gỗ Số lượng và kích thước của mạch gỗ ảnh hưởng quyết định đến bề mặt gỗ (lỗ mạch nhiều

và lớn thì thớ gỗ thô) Các chất dinh dưỡng và nước từ đất cùng các chất hữu

cơ sinh ra trong lá cây được phân phối vào các khu vực cụ thể trong cây thông qua xylem và phloem [7] Xylem đưa nước và các chất dinh dưỡng từ rễ lên các phần phía trên của thân cây, còn phloem vận chuyển các chất khác, chẳng hạn glucose sinh ra từ quá trình quang hợp, là chất hữu cơ tạo ra cho cây nguồn năng lượng để phát triển và kết hạt Xylem bao gồm các quản bào, là các tế bào chết có vách cứng được sắp xếp để tạo ra các ống nhỏ có chức năng vận chuyển nước Vách quản bào thông thường chứa lignin Phloem lại bao gồm các tế bào sống gọi là các thành viên ống sàng Giữa các thành viên ống sàng là các tấm sàng, có các lỗ để cho phép các phân tử đi qua Các thành viên ống sàng thiếu các bộ phận như nhân hay ribosom, nhưng các tế bào cạnh nó (tế bào đồng hành) thì có chức năng duy trì hoạt động của các thành viên ống sàng Chuyển động của nước, chất dinh dưỡng, đường và chất thải được thực hiện nhờ sự truyền dẫn, hấp thụ và thoát hơi nước

Hình 1.1 Sơ đồ vận chuyển chất của mạch xylem

Các tế bào xylem vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước từ rễ và các lông rễ mịn lên phía trên tới các bộ phận khác của cây Các

tế bào rễ còn sống hấp thụ nước chủ động khi thiếu sức hút thoát hơi nước thông qua thẩm thấu tạo ra áp lực rễ Có những khoảng thời gian khi thực vật không có sức hút thoát hơi nước, thông thường là do thiếu sáng hay do các yếu tố môi trường khác gây ra Nước trong các mô thực vật có thể di chuyển tới rễ để hỗ trợ khi hấp thụ thụ động

1.3 Giới thiệu về thƣ viện cDNA

Bộ gen của sinh vật có số lượng gen rất lớn, tuy nhiên số lượng gen mã hóa protein chiếm một phần nhỏ Trong số các gen mã hóa protein, ở mỗi loại

tế bào, mỗi loại mô chỉ có một số gen nhất định hoạt động và biểu hiện Thời gian hoạt động và biểu hiện của gen trong mỗi loại tế bào, mô khác nhau tùy thuộc giai đoạn sinh trưởng phát triển của cơ thể [6, 20]

Tách chiết và tinh sạch RNA thông tin (mRNA) của tế bào, mô ở từng thời điểm nhất định thu được số loại mRNA tương ứng với số gen đang hoạt động trong tế bào Sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược từ mRNA tạo nên các cDNA tương ứng, mỗi cDNA được gắn vào một vector tách dòng, tạo nên các dòng cDNA khác nhau [6]

Tập hợp gồm nhiều phân đoạn cDNA đã được tách dòng và lưu giữ trong một tập hợp các dòng tế bào chủ gọi là thư viện cDNA, thư viện cDNA

từ một cơ quan hay bộ phận của cơ thể sẽ là một tập hợp bao gồm các gen biểu hiện ở mô, cơ quan tại thời điểm đó [4] Trong trường hợp này là thư

viện các gen biểu hiện ở xylem của cây Bạch đàn nâu (Eucalyptus urophylla)

cDNA được tạo ra từ phân tử mRNA và do đó nó là sản phẩm biểu hiện của một gen Ở các tế bào sinh vật nhân chuẩn, do phân tử mRNA phải trải qua quá trình splicing nên cDNA không chứa các đoạn không phiên mã (intron) [9] Trong các nghiên cứu sinh học phân tử thì thư viện cDNA là một công cụ hữu ích vì sản phẩm biểu hiện của các gen có thể được xác định một cách dễ dàng [22]

Hình 1.2 Các bước chính trong việc xây dựng thư viện cDNA

Bạch đàn là một trong những loài cây quan trọng nhất mang lại giá trị kinh tế cao bởi những thuộc tính của gỗ Bạch đàn, cung cấp nguồn nguyên

Xây dựng thư viện cDNA

Tách chiết và thu thập mRNA

Enzyme phiên

mã ngược

Chèn vào plasmid

Đưa plasmid vào

vi khuẩn Sinh trưởng

Tách chiết plasmid và tinh sạch DNA

Giải trình tự

liệu trong công nghệ sản xuất giấy, dầu Năm 2008, Susana và cộng sự đã tiến

hành xây dựng một thư viện cDNA từ cây Bạch đàn E globulus được xử lý ở

điều kiện nhiệt độ thấp Tác giả đã chọn lọc được hơn 9913 dòng cDNA trong

số này thì đã định danh được 8737 trình tự biểu hiện ESTs [12] Thư viện này cung cấp nguồn nguyên liệu rất có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định các gen và các nhân tố tham gia vào các quá trình điều hòa sinh tổng hợp thành tế bào ở điều kiện nhiệt độ thấp

1.4 Một số kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu tạo thƣ viện cDNA

1.4.1 Kĩ thuật tách RNA tổng số

Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme là các ribonuclease (RNase) Hơn nữa, các RNase lại có mặt ở khắp mọi nơi (có rất nhiều trên đầu ngón tay của người thao tác…) có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme [3] Vì những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần… [6, 17]

Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA:

 Tế bào, mô được nghiền trong dung dịch gồm chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate), chất khử (2-mercaptoethanol) Hai loại hóa chất sau (guanidinium thiocyanate vaf 2- mercaptoethanol) có tác dụng ức chế hoạt động của RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA

và li tâm

nhận lại qua li tâm RNA có thể được bảo quản trên một năm dưới dạng tủa

trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -700C trong nước có chứa Rnasin (một chất ức chế RNase)

1.4.2 Kĩ thuật biến nạp plasmid vào E.coli

i) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt

Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5Kb) dạng vòng,

có khả năng tái bản độc lập, không phụ thuộc vào sự tái bản của bộ gen tế bào Trong sinh học phân tử, plasmid được ứng dụng trong tách dòng gen nhằm nhân nhanh một số lượng không hạn chế gen quan tâm của một khuẩn lạc đã được biến nạp

Một số plasmid được sử dụng nhiều trong tách dòng gen là plasmid pBR322, pUC18… [1, 2]

Năm 1982, Griffith đã mô tả quá trình biến nạp ở vi khuẩn trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về “nguyên lý biến nạp’’ Tuy nhiên, không phải tất

cả các vi khuẩn đều có khả năng biến nạp Để biến nạp có hiệu quả, các tế bào

vi khuẩn cần trở nên khả biến Để đạt được điều này, người ta giữ các tế bào

vi khuẩn trong dung dịch CaCl2 lạnh, khi đó các tế bào trở nên khả biến Các

tế bào vi khuẩn được cấy trải trên môi trường chọn lọc có kháng sinh và cơ chất tạo màu để nhân lên các tế bào có plasmid, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một dòng riêng biệt Trong quá trình biến nạp, chỉ có một lượng nhỏ tế bào khả biến được biến nạp Biến nạp là một kỹ thuật quan trọng có thể tạo ra khoảng 109

các tế bào biến nạp khi sử dụng 1μg DNA [1, 2]

ii) Biến nạp bằng phương pháp xung điện

Kỹ thuật biến nạp DNA plasmid bằng phương pháp xung điện là phương pháp biến nạp có hiệu quả cao đồng thời rút ngắn thời gian thí nghiệm Ở đây

tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên trong tế bào [2, 11]

1.4.3 Kĩ thuật PCR từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmid mang gen mong muốn hay không, như phương pháp colony- PCR, cắt plasmid bằng các enzyme hạn chế, hoặc PCR từ plasmid Trong đó phương pháp colony-PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mong muốn Phương pháp này có ưu điểm nhanh, ít tốn kém và đơn giản

Hiện nay, kỹ thuật này được ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử Nguyên tắc của kỹ thuật colony-PCR là dựa trên nguyên tắc PCR, chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng DNA plasmid giải phóng từ khuẩn lạc Ở nhiệt độ cao (940

-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu [16, 23]

1.4.4 Kỹ thuật Gateway

hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA Dựa vào điểm đặc hiệu trong hệ thống tái tổ hợp của pDONRTM222 Kĩ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn cDNA vào vector

quả [9, 13]

Kỹ thuật Gateway trong in vitro là phản ứng hợp nhất và loại bỏ Mục

đích là di chuyển cDNA vào hệ thống vector pDONRTM222 Kỹ thuật này gồm có 2 phản ứng tái tổ hợp cơ bản: phản ứng BP để tách dòng cDNA và phản ứng LR dùng để biểu hiện dòng cDNA Mục đích của nghiên cứu này là tách dòng thư viện cDNA nên chúng tôi chỉ phải tiến hành phản ứng BP

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng BP trong kỹ thuật Gateway

Các bước trong phản ứng BP:

điểm tái tổ hợp (adapter attB1 ở đầu 3’ và attB2 ở đầu 5’)

này chứa hai điểm tái tổ hợp (attP1 và attP2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB

điểm xác định theo thứ tự phân tử

 attB và attP là hai điểm để tái tổ hợp, vì vậy attB1 phản ứng với attP1, còn attB2 phản ứng với attP2

muốn và các sản phẩm phụ Plasmid mới có hai sự lựa chọn: kháng kháng sinh và chọn lọc âm tính

1.4.5 Kĩ thuật xác định trình tự nucleotide

Những phương pháp xác định trình tự acid nucleic đang được sử dụng hiện nay đều được cải tiến từ phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3’-OH được thay bằng H Điều này khiến cho các deoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester, do đó ngừng quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật xác định trình tự nucleotide tự động, mỗi dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluorchrome có màu khác nhau Như vậy, tất cả oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng màu [8] Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn DNA hơn kém nhau một

nucleotide Thiết bị phát sáng huỳnh quang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất được phát hiện trước Detector phát tín hiệu lên máy Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kết quả xác định trình tự sẽ được xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng [2, 5]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Vật liệu

Vật liệu là các mẫu gỗ cây Bạch đàn urô do Trung tâm cây rừng, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam cung cấp

- Vector pDONRTM222 (Invitrogen)

- Các dòng tế bào kháng phage Electro MAXTMDH10BTM T1 (Invitrogen)

Khóa luận được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

Thang ADN 1 kb (Fermentas); Kit tinh sạch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit), và tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) (QIAGEN); TA cloning Kit (Invitrogen); Sequencing Kit (Applied Biosystems); Các hóa chất thông dụng khác (ampicillin, IPTG, X- gal, agarose, ) của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech

+ Dung dịch tách chiết plasmid : dung dịch I bao gồm Tris HCl, 25mM,

pH 8.0; EDTA, 10mM, pH 8.0; Glucose 50 mM, dung dịch II bao gồm NaOH 0,2M; SDS 1%; dung dịch III bao gồm đệm Acetate kali 3M, pH 5.5; dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1); dung dịch TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0; 1mM EDTA)

+ Dung dịch điện di ADN: dung dịch đệm TAE 50X: Tris base: 121 g, Axit acetic lạnh: 28.6 ml; 0.5 M EDTA pH 8.0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ:

500 ml, Agarose 1%; Ethidium bromide (EtBr) Đệm kiểm tra mẫu ADN (Loading buffer) 5X: Tris- HCl 1 M pH8.0: 1ml; EDTA 0.5M pH8.0: 0.2 ml; Glycerol: 2.0 ml; Bromphenol Blue 1%: 2.0 ml

+ Môi trường LB, Yeast extract: Trypton: 10 g; NaCl: 10 g; pH = 7,4 (chuẩn bằng NaOH 1 N)

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac

300 (Bio- Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini- translluminatior, Bio- Rad, Mỹ ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát:

1 Bắt đầu với mRNA

2 Gắn với mồi oligo

dT-attB2-Biotin

3 Tổng hợp sợi thứ nhất

và sợi thứ 2 của cDNA

4 Gắn với adapter attB1

5 Tái tổ hợp cDNA đã biến đổi và vector pDONR TM 222 với enzyme BP Clonase

6 Tạo các dòng cDNA có vị trí attL; các sản phẩm tạo ra là các gen ccdB tự do

7 Biến nạp và E.coli và chọn các khuẩn lạc kháng

Thu 20 phân đoạn để

kiểm tra

2.2.1 Tách chiết RNA

Quy trình chiết tách RNA từ gỗ Bạch đàn gồm các bước sau:

- Nghiền nhanh mẫu gỗ trong Nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền triệt để và tránh enzym cắt RNA

- Chuyển ngay khoảng 400g mẫu vào ống eppendorf 2ml

- Hút 600µl dịch nổi phía trên vào ống I

- Thêm 700µl Chloroform: isoamyl (24:1)

- Lắc mạnh để ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Ly tâm 13000 vòng /phút trong 20 phút ở 40C

- Hút 50µl phần dịch phía trên sang ống I

- Thêm 150µl LiCl vào ống I sau đó ủ 40C qua đêm

- Li tâm thu cặn, sau đó rửa bằng cồn lạnh 2 lần

- Làm khô rồi bổ sung 50µl nước deion và bảo quản mẫu

2.2.2 Điện di trên gel agarose 1%

Quy trình:

- Chuẩn bị gel: cho 1g agarose vào 100ml TAE 1X Đun sôi đến khi agarose tan hoàn toàn Để cho agarose nguội xuống khoảng 55°C, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lược Sau 30-60 phút, khi gel agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X ngập bản gel agarose khoảng 2mm, tháo lược ra khỏi bản gel

- Tra mẫu: trộn mẫu theo tỷ lệ (2µl DNA/ 1μl đệm tra mẫu 10X: 7µl H2O) và tra vào giếng

- Điện di: điện thế dùng để điện di từ 60- 80V DNA chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát sự di chuyển của bromophenol (màu xanh) để biết lúc nào ngừng điện di

- Nhuộm DNA: nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide (EtBr) Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và đưa vào dung dịch EtBr 0,5 μg/ ml trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ

- Soi DNA: soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen-Doc

2.2.3 Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất

Trong kỹ thuật Gateway BP, vector pDONRTM

222 có trình tự attP bổ

sung với trình tự attB, chính vì vậy khi attB2 được gắn vào sợi thứ nhất, quá

trình tái tổ hợp giữa cDNA và vector nhận sẽ không cần sử dụng đến enzyme giới hạn

2.2.4 Tổng hợp sợi cDNA thứ 2 và gắn attB1

- Sợi thứ nhất cDNA đã gắn adapter attB2 ở đầu 3’ được tổng hợp tạo

thành cDNA mạch kép Các bước tiến hành như sau :

- Đặt ống eppendorf chứa 19µl cDNA trong đá Giữ ống trong đá khi thêm thành phần phản ứng:

E.coli DNA Polymerase I (10U/ µl) : 4µl

- Trộn hỗn hợp nhẹ nhàng bằng pipet và ly tâm trong 2 phút để mẫu

- Ly tâm mẫu ở 4oC trong 2 phút 14000 v/p Cẩn thận bỏ phần dịch nổi Rửa bằng cồn 70 % Làm khô cDNA bằng máy Speed-Vac trong 2-3 phút hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút

- Bổ sung 18µl nước khử DEPC

Gắn attB1

attB1 có kích thước ngắn, là các oligonucleotide sợi đôi mang một đầu

bằng (để gắn với cDNA sợi đôi) và một đầu dính (để gắn với đầu tận cùng

tương ứng trong vector)

Sau khi tổng hợp được sợi thứ 2, thu được cDNA mạch kép đã gắn một

adapter attB2 ở đầu 3’ Sau đó, tiến hành gắn một adapter attB1 vào đầu 5’

ii) Mix nhẹ nhàng bằng pipet và ủ ở 16oC trong 24 giờ

2.2.5 Phân đoạn kích thước cDNA bằng cột sắc kí ái lực

2.2.5.1 Phân đoạn cDNA

Quá trình rửa cột như sau :

- Dùng ethanol 20% để chảy hoàn toàn

- Bổ sung 0,8 ml buffer TEN Để cột chảy hoàn toàn

- Lặp lại bước rửa 3-4 lần

Quá trình phân đoạn cDNA :

- Đặt ống 1,5 ml dưới cột phân đoạn

- Bổ sung mẫu vào giữa cột và để chảy hoàn toàn

- Mỗi giọt xuống một ống 1,5 ml tương ứng với một phân đoạn

Để kiểm tra chất lượng và nồng độ của cDNA ta tiến hành thử nghiệm bằng phép thử đánh dấu trên đĩa thạch

2.2.5.2 Kiểm tra bằng phép thử đánh dấu trên đĩa thạch (Plate Spotting)

- Chuẩn bị dung dịch agarose 1% đun nóng để agarose tan hoàn toàn

- Bổ sung 10µl Ethidium Bromide (10μg/ml)

- Đổ ra đĩa petri để khô bề mặt

Dùng marker để xác định phân đoạn cDNA Đặt 1µl pEXP7 vào hàng trên của đĩa Chấm các mẫu nhỏ của dung dịch cDNA vào đĩa petri Soi dưới tia UV để xác định các nồng độ các phân đoạn cDNA

Ethidium Bromide có khả năng xen vào các liên kết đôi của mạch cDNA kép và có thể thấy được khi soi dưới ánh sáng của tia UV Phép thử này nhằm phát hiện kiểm tra cDNA là mạch đơn hay mạch kép, đồng thời xác định được hàm lượng của cDNA mạch kép tạo thành

2.2.5.3 Thực hiện phản ứng tái tổ hợp giữa attB-cDNA và vector

pDONR TM 222

Mạch cDNA kép đã được gắn adapter ở 2 đầu được thực hiện phản ứng