Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia

Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải .... Chính vì thế mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật trong nước thải của của nhà máy sản xuất bia có khả

Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới và việt nam

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới

Bia là loại nước giải khát đã sản xuất từ rất lâu đời trên thế giới Từ thời cổ đại, bia đã đƣợc chế biến từ lúc mạch nhƣng phải đến thế kỷ 19, khi Louis Pasteur thành công trong những nghiên cứu về vi sinh vật và Christian Hansen (người Đan Mạch) phân lập được nấm men và áp dụng vào sản xuất bia thì bia mới thực sự trở thành một thứ đồ uống hảo hạng, được nhiều người khắp nơi trên thế giới ƣa chuộng Ƣớc tính sản lƣợng bia năm 2005 đạt 153 tỷ lít/năm Sản lƣợng bia thế giới trong một thập kỷ tăng 35,6% Có sản lƣợng lớn và luôn phát triển là Trung Quốc, kế đến là Nga và Brazil Trong khi đó năm 2001, Mỹ là nước dẫn đầu sản lượng bia thế giới với 23.300 triệu lít, đến năm 2011 giảm sản lƣợng còn 22.546 triệu lít đứng vị trí thứ hai Việt Nam, Ukraina và Trung Quốc có mức tăng trưởng cao trong mười năm qua, lần lượt là 240,4%, 132,9% và 118% [15, 21]

Trong năm 2011, mức tiêu thụ bia toàn cầu đạt 188,78 tỉ lít, tăng 3,8% so với năm 2010 Trong đó, lƣợng tiêu thụ của Châu Á đứng đầu thế giới ở mức 66,2 tỉ lít, tiếp đó là thị trường truyền thống Châu Âu 51,2 tỉ lít Khu vực Trung Đông là khu vực tiờu thụ ớt nhất, chỉ đạt 1,4 tỉ lớt dự dõn số bằng ẵ so với Chõu Âu Cỏc khu vực

Mĩ La Tinh, Bắc Mĩ, Châu Phi và Châu Đại Dương đạt 30,8; 26,1; 10,8 và 2,2 tỉ lít Tổng thu nhập của thị trường bia năm 2011 đạt 500,24 tỉ đô la Mĩ Mức tiêu thụ bia ở các châu lục khác nhau đƣợc thể hiện trên biểu đổ 1

Biểu đồ 1: Tỉ trọng tiêu thụ bia theo khu vực năm 2011

Lƣợng tiêu thụ bia ở Châu Á ghi nhận một mức tăng lớn 8.4% so với năm

2010 Châu Mĩ La Tinh và Châu Phi cũng tăng nhanh trong năm 2011 với mức tăng hàng năm 3.7% và 6.9% Sự tăng trưởng của Châu Mĩ La Tinh tăng 3.5% so với 2010 Tại Châu Phi, sự tăng trưởng chủ yếu là Nam Phi, với mức tăng hàng năm đạt 2.5% Mức tiêu thụ hàng năm tại Châu Âu tăng 0.4%, lần đầu tiên trong 4 năm Bắc Mĩ, do khủng hoảng kinh tế, giảm đi 1,2% so với 2010

Vào cuối năm 2017, thị trường bia của khu vực Châu Á càng ngày càng phát triển nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản Theo thông tin mới nhất Việt Nam đã chính thức lọt vào Top 10 thị trường lớn nhất thế giới xét về dung lượng bia tiêu thụ

Dự kiến với mức tăng trưởng kinh tế như hiện nay, mức sống của người dân trên thế giới ngày càng cao thì công nghiệp sản xuất bia sẽ phát triển mạnh, sản lƣợng tiêu thụ bia tiếp tục tăng cao trong những năm tới

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam

Bia đƣợc đƣa vào Việt Nam từ năm nhƣ vậy Bia Việt Nam đã có lịch sử hơn 100 năm Hiện nay, do nhu cầu của thị trường, chỉ trong một thời gian ngắn, ngành sản xuất bia có những bước phát triển mạnh mẽ Do tác động của nhiều yếu tố như tốc độ tăng trưởng GDP, tốc độ tăng dân sô, tốc độ đô thị hóa, tốc

1890 cùng với sự xuất hiện của nhà máy Bia Sài Gòn và nhà máy Bia Hà Nội, độ đầu tư Mà ngành công nghiệp bia phát triển với tốc độ tăng trưởng khá cao Chẳng hạn nhƣ năm 2003, sản lƣợng bia đạt 1290 triệu lít, tăng 20,7% [21]

Châu Á Châu Âu Mĩ La Tinh Bắc Mĩ Châu Phi Trung Đông Châu Đại Dương

Theo thống kê hiện nay, cả nước có khoảng trên 320 nhà máy bia và các cơ sở sản xuất bia với tổng năng lực sản xuất đạt trên 800 triệu lít/năm Sự phát triển thị trường tiêu thụ bia ở việt nam ngày càng tăng với con số lên tới hơn 2,41 tỷ lít đối với năm 2010 và phát triển theo chiều tăng đến năm 2016 là 37,9 tỷ Dưới đây là bẳng số liệu sản lượng tiêu thụ bia bia tăng đều theo các năm (hình 1.1)

Hình 1.1: Sản lƣợng tiêu thụ bia từ năm 2010 - 2016

Do mức sống ngày càng cao thị trường tiêu thụ bia theo đầu người rất cao do thói quen uông, chính vì thế mà thị trường tiêu thụ bia càng mở rộng và tăng theo các năm Hiện tại thì có 10 loại bia đƣợc tiêu thụ nhiều nhất ở việt nam điểm hình nhƣ bia Sài Gòn, Bia Hà Nội, Bia Tiger, Bia Habeco… Đƣợc phân bố dẫn đầu các thị trường tiêu thụ từ khu vực miền Bắc cho đến khu vực miền Nam, các thành phố lớn [15, 21]

Theo báo cáo của Hiệp hội Bia - rượu - nước giải khát Việt Nam, năm

2017 lượng bia các loại tiêu thụ trên cả nước đạt hơn 4 tỉ lít, tăng 6% so với năm

2016 Con số này đã sát mục tiêu đạt 4,1 tỉ lít bia vào năm 2020 trong quy hoạch phát triển ngành bia, rượu, nước giải khát VN do Bộ Công thương phê duyệt Với dân số 93,7 triệu người hiện nay, ước tính mỗi người dân Việt Nam uống gần 43 lít bia/năm Dự báo mức tiêu thụ này sẽ còn tiếp tục gia tăng theo các năm tiếp theo

Quy Trình Sản xuất bia

Quy trình sản xuất bia gồm có các giai đoạn chính:

Hình 1.2: Quy trình sản xuất bia

Các bước chính trong một quá trình sản xuất bia đó là: đường hóa, lọc, đun sôi, lên men, ủ phụ, lọc và chiết [18,24]

 Đường hóa là một quá trình trộn lẫn ngũ cốc đã ngiền (thường là ngũ cốc đã trải qua quá trình malt hóa) và đun nóng hỗn hợp này và chờ ở các vọng nhiệt độ nhất định để các enzymes trong malt phá vỡ tinh bột trong ngũ cốc thành đường mà chủ yếu là maltose

 Lọc là một quá trình phân tách chất chiết thu đƣợc trong quá trình đường hóa ra khỏi bã ngũ cốc (bã bia) Quá trình lọc gồm 2 giai đoạn: Dịch lọc đầu thu đƣợc chất chiết mà chƣa có sự pha loãng bã bia và dịch lọc sau chất chiết được tận thu bằng cách rửa bã bia với nước nóng

 Đun sôi: quá trình đun sôi chất chiết thu đƣợc gọi là dịch nha, nhằm giúp dịch nha trở nên vô trùng, tránh sự nhiễm khuẩn

 Làm lạnh nha: Quá trình lọc hoa, dịch nha đƣợc hạ lạnh xuống nhiệt độ lên men trước khi tiếp giống nấm men

 Lên men: quá trình lên men đƣợc thực hiện trong các tank lên men và đƣợc bắt đầu ngay khi nấm men đƣợc định lƣợng vào dịch nha lạnh Trong suốt quá trình này nấm men chuyển hóa các loại đường trong dịch nha thành cồn và CO2

 Ủ chín bia: Khi các loại đường được sử dụng gần hết trong quá trình lên men bia, quá trình lên men chậm dần và nấm men bắt đầu lắng xuống đáy tank

 Lọc bia: Quá trình loại bỏ nấm men, cặn, giúp ổn định hương, vị bia và mang đến cho bia sự trong sáng màu sắc bia

 Chiết chai là quá trình rót bia vào chai, keg, lon hoặc các đồ chứa khác có dung tích lớn hơn Ở các giai đoạn của quá trình sản xuất bia, nước sạch từ bên ngoài đi theo đường ống vào bên trong qua các quá trình nấu – đường hóa, lên men, các giai đoạn thành phẩm Các giai đoạn này, nước thừa được đưa ra ngoài đi theo đường ống đến bể xử lý Nước thải từ các quy trình sản xuất bia bao gồm nước lẫn theo bã man và bột sau khi lấy dịch còn sót lại, nước rửa các thiết bị lọc, nồi nấu, thùng lên men, nước nồi hơi, nước rửa chai, từ hệ thống làm lạnh đi theo đường ống ra môi trường bên ngoài Nước thải của các công đoạn sảm xuất bia có chứa hàm lƣợng cao giàu các chất hydroccacbon, cellulose, hemixenlulose, pentose trong vỏ trấu, các mảnh hạt và bột,… cùng với xác hoa, một ít tanin, các chất đắng, chất màu Ngoài nước thải đó còn chứa các chất dinh dưỡng giàu protein của các xác men, các chất khoáng, vitamin cùng với cặn bia

Đặc tính của nước thải nhà máy bia

1.3.1 Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải

Do đặc thù về công nghệ nên trong sản xuất lƣợng bia tiêu hao cao và nước thải phát sinh nhiều Với công nghệ thông thường, để sản xuất 1 lít bia cần sử dụng khoảng 4 -11 lít nước Trong đó, 2/3 lượng nước dùng quy trình công nghệ và 1/3 còn lại dùng cho hoạt động vệ sinh Từ những nguồn phát sinh trên, nước thải từ nhà máy sản xuất bia rất giàu chất hữu cơ rất cao, do đó là các chỉ số BOD, COD, SS tương đối lớn Do đó nước thải nếu không được xử lý sẽ làm mùi hôi thối, lắng cặn, giảm nồng độ oxy hòa tan trong nguồn nước [7,16]

Các thông đánh giá mức chất lượng nước thải bao gồm: pH: Chỉ số pH < 7 thì nước có môi trường axít; pH > 7 thì nước có môi trường kiềm, khi biết chỉ số Ph thì sẽ có phương pháp xử lý nước thải khác nhau Độ đục: Đánh giá độ bẩn trong nước thải, ngoài ra nước đục còn ngăn cản quá trình chiếu sán của mặt trời xuống đáy làm giảm quá trình quang hợp và nồng độ oxy hòa tan trong nước

Mùi: Các chất thải bị phân hủy có chứ NH3, các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh

SS (solid solved – chất rắn lơ lửng)

Chất rắn lơ lửng nói riêng và tổng chất rắn nói chung có ảnh hưởng đến chất lượng nước trên nhiều phương diện Hàm lượng chất rắn hoà tan trong nước thấp làm hạn chế sự sinh trưởng hoặc ngăn cản sự sống của thuỷ sinh Hàm lượng chất rắn hoà tan trong nước cao thường có vị

DO (dyssolved oxygen – ôxy hoà tan trong nước) Ôxy có mặt trong nước một mặt được hòa tan từ ôxy trong không khí, một mặt đƣợc sinh ra từ các phản ứng tổng hợp quang hoá của tảo và các thực vật sống trong nước Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan ôxy vào nước là nhiệt độ, áp suất khí quyển, dòng chảy, địa điểm, địa hình COD là tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá mức độ ô nhiễm của nước (nước thải, nước mặt, nước sinh hoạt) vì

8 nó cho biết hàm lượng chất hữu cơ có trong nước là bao nhiêu Hàm lượng COD trong nước cao thì chứng tỏ nguồn nước có nhiều chất hữu cơ gây ô nhiễm

BOD (Biochemical oxygen Demand): Nhu cầu ôxy sinh hoá

BOD là lƣợng ôxy cần cho vi sinh vật tiêu thụ để ôxy hoá sinh học các chất hữu cơ trong bóng tối ở điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ và thời gian Nhƣ vậy BOD phản ánh lượng các chất hữu cơ dễ bị phân huỷ sinh học có trong mẫu nước

Sau đây là các thông chỉ tiêu đánh giá độ ô nhiễm của nước thải bia (bảng 1.1)

Bảng 1.1: Các thông số của nước thải sản xuất bia

Trong bảng 1.1 đưa ra các chỉ tiêu thông số đánh giá thấy rằng nước thải sau khi sản xuất bia có các thông chỉ tiêu cao hơn các chỉ tiêu quy chuẩn việt nam ở cột B về nước thải ra môi trường bên ngoài, nước thải sau khi sản xuất gấp từ 6 cho đến 18 lần từng loại tiêu chuẩn quy định, có thể thấy các chỉ tiêu về nước thải đầu ra của quy sản xuất bia đang bị ô nhiễm hoàn toàn cần được xử lý trước khi đưa nước thải ra ngoài môi trường [14]

1.3.2 Các phương pháp xử lý nước thải

Hiện nay có rất nhiều phương pháp xử lý nước thải khác nhau nhưng có thể chia thành 4 phương pháp chính:

- Phương pháp hóa học và lý học

Việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào đặc tính của từng loại nước thải và mức độ cần làm sạch [1,18]

Phương pháp này thường dùng để xử lý sơ bộ, ít khi là quá trình kết thúc của quá trình xử lý công nghiệp Phương pháp này dùng để loại bỏ tạp chất không tan hay tạp chất cơ học trong nước thải Các tạp chất này có thể là vô cơ hay hữu cơ

Các phương pháp thường dùng là: Lọc qua lưới, lắng, xyclon thủy lực, lọc cát, ly tâm

Cơ sở của phản ứng hóa học là các phản ứng hóa học của các chất bẩn có trong nước thải và hóa chất cho thêm vào Những phản ứng diễn ra thường là phản ứng oxy hóa, trung hòa, keo tụ và nhiều hiện tƣợng vật lý khác Các phương pháp ozon hóa có khả năng đạt được hiệu suất cao do ozon là chất oxy hóa mạnh, dễ dàng nhường đi oxy nguyên tử

Thực chất của phương pháp hóa học là nhờ các phản ứng oxy hóa khử mà các chất bẩn chất độc hại trong nước được chuyển thành các chất không độc hại, một phần ở dạng cặn, một phần ở dạng khí Vì vậy để khử các chất độc hại trong nước thải thường dùng nhiều phương pháp nối tiếp: oxy hóa khử - lắng cặn- hấp phụ

Cơ sở của phương pháp này trong xử lý nước thải là dựa trên quá trình keo tụ, hấp phụ, trích ly, tuyển nổi, trao đổi ion, tinh thể hóa, màng bán thấm…

- Keo tụ: Là làm trong và khử màu nước thải bằng cách dùng các chất keo tụ để liên kết chất bẩn dạng lơ lửng và kết chúng thành các bông có khích thước lớn hơn, các bông này khi lắng xuống sẽ khéo theo các chất không tan trong nước xuống theo

- Hấp phụ: Là tách các chất bẩn và khí hòa tan khỏi nước thải bằng cách tập trung các chất đó trên bền mặt chất mang

- Trích ly: Là tách các chất bẩn hòa tan khỏi nước thải bằng dung môi, dung môi này không tan trong nước và độ hòa tan của chất bẩn trong dung môi phải cao hơn trong nước

- Chưng bay hơi: Chưng cất nước thải để các chất độc hòa tan trong đó phải bay hơi theo hơi nước

- Tuyển nổi: Dùng các tác nhân tuyển nổi để thu hút và kéo các chất bẩn lên mặt nước, sau đó loại tác nhân tuyển nổi và chất bẩn khỏi nước Khi tuyển nổi thường dùng các hạt khí nhỏ, phân tán và bão hòa trong nước thải Các hạt chất bẩn có bám bọt khí nhẹ dần sẽ nổi lên

- Thẩm tích dializ (màng bán thấm): Dùng màng xốp, bán thấm không cho các hạt keo đi qua để tách ta khỏi nước thải

1.3.2.4 Phương pháp xử lý sinh học:

Cở sở của phương pháp là dựa vào khả năng hoạt động sống của vi sinh vật Chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ có trong nước thải làm nguồn dinh dƣỡng nhƣ C, P, N… Trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật phân hủy và sử dụng các hợp chất hữu cơ để sinh năng lƣợng phục vụ cho hoạt động sống và xây dựng tế bào mới làm tăng sinh khối

Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải

Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải là quá trình sinh học phức tạp nhờ hoạt động của vi sinh vật Một lƣợng lớn chất hữu cơ bị phân giải và làm giảm trọng lƣợng Trong quá trình này các chất hữu cơ đƣợc phân giải thành những phần nhỏ hơn, sinh khối của si sinh vật mới đƣợc tạo thành đồng thời tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất và giải phóng năng lƣợng, các vi sinh vật đƣợc chia hay nhóm là tự dƣỡng và dị dƣỡng Các thành phần vi sinh vật đó là:

Chủng vi sinh vật cao nhất trong nước thải là vi khuẩn Thành phần hóa học của vi khuẩn gồm khoảng 80% nước, 20% chất khô (trong đó khoảng 90% hữu cơ và vô cơ) Công thức tương đối cho các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn là

C5H7O2N Theo công thức này thì 53% trọng lƣợng hợp phần hữu cơ là cacbon Khi xét cả photpho thì công thức chung của tế bào vi khuẩn là C5H87O23N12P Các hợp chất vô cơ gồm có P 2 O 5 (50%), SO 3 (15%), Na 2 O (11%), CaO (9%), MgO (8%), K2O (6%), Fe2O3 (1%) Tất cả các nguyên tố và hợp chất này vi khuẩn đều phải lấy từ môi trường nên vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các chất có trong nước thải Các nhà máy xử lý nước thải thông thường dựa trên sự thủy phân hủy sinh học của các chất hữu cơ không độc nhờ vi khuẩn Sự phân hủy sinh học này trong điều kiện có oxi có thể đƣợc biểu diễn theo phương trình :

Các chất thải hữu cơ + O2 CO2 + H2O + H2SO4 + NH4

Các vi sinh vật hóa dị dƣỡng chiếm ƣu thế vì vi sinh vật dị dƣỡng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng để thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp [1,11]

Vi nấm: Vi nấm có tầm quan trọng trong kỹ thuật môi trường, đó là các nấm dị dƣỡng, hầu hết các vi nấm là vi hiếu khí bắt buộc.Chúng có khả năng sinh trưởng ở điều kiện nhiệt độ thấp và có thể chịu được điều kiện pH tương đối thấp, pH tối ƣu cho các nấm là 5-6 mặc dù giới hạn pH là 2-9 Nấm có nhu cầu nitơ thấp, chỉ bằng nửa nhu cầu của vi khuẩn Khả năng sống ở pH thấp và điều kiện hạn chế về nguồn nitơ và đi cùng với khả năng phân giải cellulose của chúng Đặc điểm này khiến chúng trở nên quan trọng trong phân giải chất thải công ghiệp, chẳng hạn từ các nhà máy sản xuất gỗ, giấy… Động vật nguyên sinh: Động vật nguyên sinh là các cá thể đơn bào có khả năng di động Đa số động vật nguyên sinh là dị dưỡng hiếu khí, một số là kỵ khí Protozoa thường lớn hơn vi khuẩn và có khả năng thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng Trong các quá trình xử lý chất thải bằng phương pháp sinh học, protoza thường lớn hơn vi khuẩn và có khả nằn thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng Trong các quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học, Protozoa hoạt động nhƣ một yếu tố làm sạch dòng chảy do tiêu thụ vi khuẩn và các chất hữu cơ

Tảo và vi khuẩn lam là sinh vật đơn bào, tự dƣỡng Chúng có vai trò quan trọng đối với xử lý sinh học bởi hai lý do:

- Trong ao hồ chúng quang hợp tạo ra oxi cần thiếtcho hệ sinh thái nước

- Ở các bể oxi hóa hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc thì tảo cũng cần cung cấp oxi cho các vi khuẩn hiếu khí dị dƣỡng.

Các chất hữu cơ và các enzyme vi sinh vật phân giải

Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên là quá trình hóa sinh phức tạp Nhờ hoạt động sống của vi sinh vật, một lƣợng lớn hợp chất hữu

14 cơ bị phân giải Trong quá trình phân hủy các vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào và các hợp chất hữu cơ nhƣ xenlulose, tinh bột, protein…đƣợc phân giải thành những phần nhỏ như các axit hữu cơ, peptit, các đường đơn, các axit amin…đồng thời sinh khối vi sinh vật đƣợc tạo thành và các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất là CO2, CH4, H2O Các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên chủ yếu là xenlulose, hemi- xenlulose, tinh bột, protein…ƣu tiên các sinh vật có hoạt tính amylase, cellulose, protease [1,19]

1.5.1 Tinh bột và enzyme amylase

Tinh bột là polysaccarit dự trữ của thực vật, chủ yếu có trong hạt, phổ biến ở các loại lúa mỳ, khoai tây, sắn, gạo… Phân tử tinh bột có công thức cấu tạo là C 6 H 10 O 5

- Amylose có chứa liên kết -1,4-glucozit Phân tử cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh, dài khoảng 300-1000 gốc glucose, xoắn theo kiểu lò xo, cấu trúc xoắn đƣợc giữ vững nhờ liên kết hydro đƣợc tạo thành giữa các nhóm -OH tự do Amylase tạo thành màu xanh khi kết hợp với iốt

- Amylopectin có chứa cả liên kết -1,4-glucozit và -1,6-glucozit Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một nhánh trung tâm (chứa liên kiết 1,4-glucozit), từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose

Enzym amylase Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp amylase xúc tác cho quá trình thuỷ phân tinh bột, glycogen… thành các phân tử có khối lƣợng nhỏ hơn nhƣ: oligosaccarit, glucose, maltose… Amylase có ba loại:

- -amylase(amylo-1,4-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết - 1,4-glucozit trong chuỗi polysaccarit thành các dextrin phân tử thấp, nhƣng lại không phân giải đƣợc liên kết -1,6-glucozit và một số các liên kết -1,4- glucozit ở gần chỗ phân nhánh Dưới tác dụng của -amylase, tinh bột bị giảm khối lƣợng phân tử mạnh, đồng thời gây giảm tính nhớt, mất khả năng tạo màu với iốt

- -amylase (amylo-1,4glucozidase) có khả năng phân giải liên kết -1,4- glucozit nhƣng không có khả năng phân giải liên kết -1,6-glucozit Sản phẩm cuối cùng là maltose và glucose

- -amylase (amylo-1,6-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết - 1,6-glucozit, giúp thuỷ phân tinh bột thành các dextrin, glucose và maltose

Hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh amylase nhƣ: Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus, Aerobacillus macerans Trong đó Bacillus là một trong những nhóm đƣợc xét là có khả năng sinh amylaza mạnh

Hầu hết các chế phẩm xử lý ô nhiễm đều có thành các loài thuộc chi Bacillus.[1]

Cellulose là thành phần chính có trong lớp vỏ của tế bào thực vật Công thức cấu tạo chung của xenlulose là (C6H10O5)n Khác với tinh bột, hợp chất cao phân tử này đƣợc cấu tạo từ hàng trăm, hàng nghìn gốc -1,4-glucose liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit tại vị trí C1 của phân tử glucose này với vị trí C4 của phân tử glucose kế tiếp [6]

CMC (Cacboxymethyl cellulose) đƣợc tạo thành khi cho alcalixenlulose tác dụng với axit cloaxetic hoặc muối natri cloaxetat cho nên CMC có thể tồn tại ở hai dạng H hoặc Na Dạng H - CMC không tan trong nước, rượu, axeton nhƣng tan trong dung dịch kiềm cũng nhƣ trong các hệ dung môi dùng để hoà tan cellulose

Cellulose: Hàng loạt vi khuẩn và nấm có khả năng phân giải cellulose một cách tự nhiên nhờ hoạt động phối hợp của một tập hợp các enzyme Cellulose Ở một số vi khuẩn hoạt tính cellulose thường gặp trong một số phức hệ nhiều enzyme

- Endoglucanase (CMC-ase) có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và làm tăng các nhóm khử Chúng thuỷ phân liên kết -1,4-glucozit một cách tuỳ tiện và giải phóng

16 xenlodextrin, cellobiose và glucose Giúp phân giải mạnh các cellulose hoà tan nhất là dạng xenluloza vô định hình và hoạt động chủ yếu ở vùng kết tinh

- Exoglucanase (exo-1,4--D glucan-exolobiohydrolase) có khả năng tấn công chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng chủ yếu ra cellobiose, đôi khi là glucose Enzym này không phân giải cellulose kết tinh cũng nhƣ cellulose hoà tan khác, chúng tác dụng yếu lên CMC nhƣng hoạt động mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã phân giải một phần nhƣ cellodextrin

- -1,4-glucozidase(cellobiase) có khả năng thuỷ phân mạnh cellobiose hay các cellodextrin hoà tan trong nước giải phóng glucoza Hoạt tính giảm của chúng giảm dần theo chiều dài của chính sự tích luỹ các chất cảm ứng của enzyme cellulose

Các loại vi khuẩn sinh Cellulose chủ yếu thuộc hiếu khí nhƣ:

Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium, Sporocytophaga, Sorangium, Archangium, Promyxo bacterium Nấm sợi sinh xenlulaza nhiều hơn vi khuẩn Chúng tiết vào môi trường hệ enzym đầy đủ hơn nên thủy phân hoàn toàn cơ chất cellulose

Ví dụ một số chủng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ: Trichoderma reesei, T viride, Fusariumsolani, Penicillium pinophinum, Phanerochate chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum và Sclerolium rolfsii

1.5.3 Các chất protein và enzyme protease

Protein là những phân tử sinh học hay đại phân tử, chứa một hoặc nhiều mạch dài của các nhóm axit amin

MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn đƣợc một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia.

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập một số chủng vi sinh vật từ nước thải nhà máy sản xuất bia

- Xác định khả năng phân giải một số hợp chất hữu cơ của các chủng phân lập đƣợc

- Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng đã phân lập.

Phương pháp nghiên cứu

Các mẫu nước thải chưa qua xử lý dùng để nghiên cứu phân lập, tuyển chọn khả năng phân giải hợp chất hữu cơ đƣợc lấy từ nhà máy sản xuất bia Sài Gòn – Đồng Xuân, huyện Mê Linh, Hà Nội trong thời gian từ tháng 11 năm

Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thông dụng có ở Viện Công Nghệ sinh học Lâm Nghiệp ( Do Việt Nam, Trung Quốc sản xuất ); NaCl, H2PO4, MgSO4 , K2HPO4, …

Các hóa chất khác: Cao thịt men (Trung Quốc), peptone (Trung Quốc), agar, tinh bột, sodium carboxymethyl cellulose (CMC)

Các chất nhuộm màu: lugol, tím kết tinh, Fuchsin……

2.3.3 Các trang thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh- hóa sinh của Viện công nghệ sinh học

Dụng cụ: đĩa petri, bình scod, bình tam giác, ống nghiệm;

- Pipet malt, đầu côn, pipet thủy tinh;

- Cốc đong, ống đong, ống fancol, ống effendof;

- Que cấy ria, que chấm điểm, que chang mẫu thủy tinh

Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

Trung Quốc Cân phân tích Anh

Tủ sấy Đức Máy khuấy từ Đức

Tủa ấm Trung Quốc Máy đó pH Nhật

Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức

Máy lý tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn Quốc

Máy lắc Hàn Quốc Tủ lạnh Nhật

Máy Voxted Đức Lò vi sóng Mỹ

Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

STT Môi trường Thành phần

Peptone Cao nấm men NaCl Agar Nước cất

Môi trường phân lập vi khuẩn

Môi trường nuôi nấm mốc

Glucose Khoai tây ( lấy dịch khoai tây)

Môi trường phân lập nấm mốc

MgSO4.7H2O Peptone Agar Nước cất

Môi trường phân lập nấm men

Tinh bột Agar Nước cất

Thử khả năng phân giải emzyme amylase

Thử khả năng phân giải enzyme cellulose

Thử khả năng phân giải emzyme protease

Khả năng lên men đường pH = 7 - 7,4

Phenol red Đường (saccharose, lactose, glucose) Nước cất

Kiểm tra khả năng lên men đường của chủng vi sinh vật

1 và phản ứng Voges - Proskaeur

Môi phân giải Urease của vi sinh vật

Khả năng khử Nitrate của vi sinh vật

2.3.4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ nước thải nhà máy sản xuất bia

- Phương pháp lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản mẫu để phân tích các chất hóa lý cho nước thải, theo TCVN 4556-88 Mẫu được lấy trong các tháng 11,12 năm 2017 và tháng 1,3 năm 2018 tại công ty sản xuất bia Sài Gòn - Đồng Xuân tại huyện Mê Linh, Hà Nội

Phương pháp phân lập vi sinh vật

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên môi trường đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau

- Lấy 100 àl nước thải hũa tan vào ống eppendorf 900 à nước cất vụ trựng sau đó lắc đều dịch [3]

- Dựng micropipete hỳt 100àl từ dịch vừa hũa tan ta cú nồng độ 10 -1

- Lấy 100 àl ở nồng độ 10 -1 đưa vào ống nghiệm chứa 900 àl nước cất vụ trùng trộn đều đƣợc nồng độ pha loãng 10 -2 , tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng đƣợc nồng độ 10 -5

- Chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 dùng micropipete hỳt 50 àl từ mỗi nồng độ pha loóng cho lờn đĩa mụi trường LB (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó bao gói và bỏ vào tủ ấm ủ ở 30 o C - 32 o C nuôi 24 - 48 giờ

- Trên mỗi đĩa lựa chọn thích hợp các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ và cấy chuyển tiếp trên môi trường thạch dinh dưỡng trong đĩa peptri mới Quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ, thuần khiết

- Tiến hành tương tự để phân lập các chủng vi sinh vật trên môi trường

LB bằng môi trường PDA có bổ sung chloramphenicol (0,2%) mỗi nồng độ lặp lại 2 lần và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó bao gói và bỏ vào tủ ấm ủ ở 28 0 C – 30 0 C trong 48 – 72 giờ

- Tiến hành tương tự để phân lập các chủng vi sinh vật trên môi trường

LB bằng môi trường Hansen (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó bao gói và bỏ vào tủ ấm ủ ở 30 0 C trong 24 giờ

Yêu cầu : Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và phải có kí hiệu riêng biệt để nhận biết Tiến hành phân lập và thử nghiệm trên nhiều môi trường, bước đầu tìm ra chủng vi khuẩn, nấm mong muốn

2.3.4.2 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải một số hợp chất hữu cơ

 Xác đinh hoạt tính enzyme amylase

Nguyên tắc : Sử dụng phương pháp kuyếch tán trên thạch đĩa emzyme amylase thuỷ phân tinh bột trong môi trường sẽ tạo thành vòng không màu với

24 thuốc thử lugol quanh giếng chứa dịch enzym Hoạt lực enzym của VSV đƣợc biểu thị bằng giá trị D-d (mm) trong đó: D là đường kính vòng thuỷ phân và d là đường kính của lỗ khoa [1,2,5,6,8]

- Chuẩn bị môi trường thạch có bổ sung cơ chất 1% tinh bột được đổ lên đĩa peptri, sau khi môi trường đông cứng lại, tiến hành đực lỗ thạch bằng thanh kim loại vô trùng đường kính 10 mm

- Nuôi lắc các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc, nấm men ) trên môi trường dịch thể thích hợp tương ứng: LB, PDA, Hansen nuôi ở nhiệt độ nuôi ở

30 o C - 32 o C trong 36 - 48 giờ đối với các chủng vi sinh vật phân lập

- Lấy dịch canh vi khuẩn, nấm men ly tâm 8000 vòng/phút (15 phút), thu lấy dịch enzyme sau đú tra vào lỗ đó đục với lƣợng 100àl, để 1 lỗ đối chứng cú nhỏ 100àl nước cất đó khử trựng

- Lấy dịch nấm mốc ly tâm 6000 vòng/ phút (10 phút), thu lấy dịch enzyme sau đú tra vào lỗ đó đục với lƣợng 100àl, để 1 lỗ đối chứng cú nhỏ 100àl nước cất đó khử trựng

- Để vào tủ lạnh 4℃ trong tủ lạnh 2 – 4 giờ để enzyme khuếch tán và môi trường, sau đó để trong tủ tấm nuôi 30 o C - 32 o C với vi khuẩn, nấm mốc và nấm men

- Nhuộm bằng thuốc thử Lugol vào đĩa 15 phút, rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% Quan sát vòng tinh bột bị phân giải là vùng không màu bao quanh lỗ thạch

- Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòng ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch

- Đánh giá khả năng sinh enzyme: D-d ≥ 25 mm: rất mạnh: D-d ≥ 20 mm: mạnh, D-d ≥ 15 mm: trung bình, D-d < 10 mm: yếu

- Tiến hành lặp lại 3 lần mỗi thí nghiệm

 Xác đinh hoạt tính enzyme cellulose

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch đĩa emzyme cellulose thuỷ phân CMC trong môi trường sẽ tạo thành vòng không màu với thuốc thử Congo Red quanh giếng chứa dịch enzym Hoạt lực enzym của VSV

25 được biểu thị bằng giá trị D - d (mm) trong đó: D là đường kính vòng thuỷ phân và d là đường kính của lỗ khoa

- Tiến hành tương tự xác định hoạt tính emzyme amylase thay cơ chất trong môi trường thạch bằng CMC Sau đó nhuộm bằng thuốc thử Congo Red

 Xác đinh hoạt tính enzyme protease